Wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym do określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie techniki opartej na PCR w celu ilościowego oznaczenia przyjęcia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu transplantacji szpiku kostnego u myszy. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie transplantacji szpiku kostnego u samic myszy biorczych z wykorzystaniem komórek od samców dawców. Następnie z myszy biorczych w różnych punktach czasowych pobiera się krew obwodową i izoluje genomiczne DNA. Próbki są przygotowywane do sporządzenia krzywej wzorcowej.

Na koniec przeprowadza się reakcję real-time PCR z wykorzystaniem próbek standardowych i badawczych. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące przyjęcie komórek pochodzących od męskiego dawcy u samic myszy biorcy poprzez obliczenia w odniesieniu do krzywej standardowej z określoną zawartością DNA męskiego względem żeńskiego. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak metoda oparta na cytometrii przepływowej, jest jej większa czułość, niższy koszt oraz możliwość długotrwałego przechowywania próbek.

Co najważniejsze, nasza technika jest całkowicie niezależna od zastosowania markerów i może być wykorzystana dla dowolnego tła genomicznego myszy, bez konieczności stosowania ściśle określonych markerów powierzchniowych komórek w celu odróżnienia komórek dawcy od komórek biorcy. Po uśmierceniu samca dawcy oraz samic myszy szczepu FVB nj pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, za pomocą małych nożyczek i pęsety wyizolować kości udowe i piszczelowe, a następnie umieścić je w 60 mm szalce hodowlanej zawierającej 6 mL lodowatego medium RPMI 1640 z 5% dezaktywowaną termicznie FBS. Użyć chusteczki Kimwipe do usunięcia mięśni oraz innych tkanek, a następnie odciąć oba końce trzonu każdej kości w szalce. Następnie połączyć końce kości z igłą 23G przymocowaną do strzykawki 3 cc wypełnionej medium RPMI 1640 z 5% dezaktywowaną termicznie FBS i wypłukać szpik.

Za pomocą tej samej igły rozbij tkankę szpiku kostnego poprzez wielokrotne aspiracje. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wiruj przez pięć minut przy 400 G. Po usunięciu nadsączu resuspenduj komórki w 1 ml buforu do lizy erytrocytów o temperaturze pokojowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie dodaj od 5 do 10 ml pożywki RPMI 1640 z 5% nieaktywną termicznie FBS, przefiltruj komórki przez sitko komórkowe i zbierz filtrat do nowej probówki. Po wirowaniu komórek przez pięć minut przy 400 G i usunięciu nadsączu, osad nie powinien mieć czerwonego koloru, co wskazuje na całkowite usunięcie erytrocytów; resuspenduj osad w 10 ml pożywki RPMI 1640 z 5% nieaktywną termicznie FBS, a po delikatnym wymieszaniu w wirówce vorex dodaj niewielką alikwot do hemocytometru i policz komórki.

Oblicz objętość komórek wymaganą do zmieszania z konkurencyjnymi komórkami samic w stosunku pięć do dwóch na potrzeby przeszczepu szpiku kostnego. Jako ostatni etap przygotowania komórek do iniekcji, zmieszaj komórki dawcy i komórki konkurencyjne, zcentryfuguj komórki w celu otrzymania osadu, przemyj je PBS i resuspenduj w PBS do końcowego stężenia 5 × 10⁶ na mililitr dla komórek dawcy oraz 2 × 10⁶ na mililitr dla komórek konkurencyjnych, od czterech do sześciu godzin przed przeszczepem szpiku kostnego. Naświetl samice myszy biorców promieniowaniem gamma cezu 137 w pojedynczej dawce 11 Gy.

Umieść napromieniowane myszy żeńskie w ograniczniku i wstrzyknij mieszaninę komórek donora i komórek konkurencyjnych do żyły ogonowej w całkowitej objętości 0,1 ml, tak aby każda mysz otrzymała 5 × 10⁵ komórek donora oraz 2 × 10⁵ komórek szpiku kostnego konkurencyjnych w celu późniejszego pobrania próbek krwi. Po znieczuleniu myszy pobierz około 50 µl krwi do probówek powlekanych EDTA poprzez upust z zatoki zaocznej. Pobierz również próbki od samców i samic myszy w tym samym wieku.

Następnie należy wyizolować DNA genomiczne z myszy badawczych i myszy kontrolnych. W celu przygotowania krzywej wzorcowej do każdej próbki krwi dodać około 200 µL buforu do lizy RBC o temperaturze pokojowej i inkubować przez pięć minut. Dodać 1 mL PBS i odwirować, aby usunąć większość lizowanych RBC.

Następnie należy użyć zestawu do ekstrakcji DNA z krwi w celu wyizolowania DNA, uprzednio podgrzewając bufor elucyjny do 37°C. Aby zwiększyć wydajność, należy zmierzyć stężenie DNA w każdej próbce. Do dalszych analiz wykorzystuje się próbki z wartością absorbancji OD 260/280 w zakresie od 1,8 do 2,0.

Aby przygotować krzywą wzorcową, należy rozcieńczyć DNA samca i samicy do stężenia 4 ng/µL, a następnie sporządzić mieszaninę DNA zgodnie z powyższymi wytycznymi. Płytkę do reakcji PCR przygotowuje się poprzez zmieszanie odczynnika Cyber Green Super Mix z przedstawionymi tutaj starterami oraz genomicznym DNA. Każda reakcja o objętości 20 µL zawiera 400 nM każdego startera oraz 5 µL genomicznego DNA z komórek krwi, wykonaną w trzech powtórzeniach.

Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z warunkami opisanymi w protokole tekstowym i wyznaczyć wartości progu cyklu lub wartości CT. Obliczyć delta CT pomnożone przez ilość CT do potęgi ZY 1 minus CT do potęgi BCL 2 oraz poziomy ekspresji ZY 1 lub 2 do potęgi minus delta CT; krzywe wzorcowe generuje się poprzez naniesienie średniej z trzech powtórzeń wartości 2 do potęgi delta CT względem znanego procentowego udziału męskiego DNA w mieszaninie wraz z naniesioną linią regresji liniowej. Poniżej przedstawiono przykłady krzywych wzorcowych wykreślonych dla średnich wartości 2 do potęgi delta CT w zależności od procentowej zawartości męskiego DNA.

Wykres ten przedstawia specyficzną temperaturę topnienia dla amplikonów BCL two oraz ZFY one, która wynosi odpowiednio 78,5 i 88,5 °C. BCL two jest wykorzystywany jako gen referencyjny do normalizacji całkowitej ilości naniesionego DNA w każdej reakcji PCR. Krzywe amplifikacji BCL two dla każdej próbki standardowej pokrywają się ze sobą niezależnie od stężenia DNA męskiego, co wskazuje na naniesienie równych ilości DNA.

Jednakże krzywe amplifikacji ZFY przesunęły się w lewo wraz ze zwiększającą się ilością męskiego DNA w próbkach; komórki macierzyste krwi z myszy PIM TKO wykazują defekty w rekonstytucji myszy poddanych naświetlaniu letalnemu i, zgodnie z oczekiwaniami, myszy biorcy przeszczepione komórkami PIM TKO miały znacznie niższy odsetek komórek męskich w porównaniu z myszami przeszczepionymi komórkami typu dzikiego. Aby zwalidować naszą metodę, przetestowaliśmy przyjęcie męskich komórek dawcy u przeszczepionych myszy żeńskich, które otrzymały komórki szpiku kostnego od myszy typu dzikiego lub myszy z potrójnym nokautem PIM (TKO) w różnych punktach czasowych po transplantacji; analizowano zarówno krew obwodową w szóstym tygodniu, jak i próbki szpiku kostnego w 16. tygodniu. Po obejrzeniu tego filmu.

Należy posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania metody opartej na PCR do ilościowego oznaczania przyjęcia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu transplantacji szpiku kostnego u zwierząt morskich.