Name: Wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym do określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj ilościową metodę PCR w czasie rzeczywistym do oceny wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu szpiku kostnego myszy. Technika ta jest czuła, ekonomiczna i niezależna od szczepu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Charlesowi Greenbergowi za korzystanie z jego urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym. Ta praca jest wspierana przez MUSC Hollings Cancer Center Startup Fund, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Career Development Award, NIH 1K08HL 103780-01A1 i NIH 3P30CA138313-01S3. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health lub innych podmiotów finansujących.

1. Izolacja komórek szpiku kostnego
<ol>
	<li>Eutanazja samców myszy FVB/NJ i samic myszy FVB/NJ przy użyciu metody CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Żeńskie komórki szpiku kostnego FVB / NJ zostaną wykorzystane jako komórki konkurencyjne.</li>
	<li>Użyj małych nożyczek i kleszczy, wypreparuj kości udowe i piszczelowe myszy i umieść je w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 60 mm zawierającym 6 ml lodowatego RPMI1640 z 5% inaktywowanym termicznie FBS. Użyj tkanki kimwipe, aby usunąć mięśnie i inne tkanki. Odetnij oba końce każdego trzonu kostnego w naczyniu.</li>
	<li>Połącz koniec kości igłą 23G na strzykawce o pojemności 3 cm3, wypłucz szpik kostny za pomocą RPMI1640 z 5% inaktywowanym termicznie FBS do naczynia. Dezagregacja tkanek szpiku kostnego przez wielokrotne aspiracje przy użyciu tej samej igły. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować komórki przez 5 minut przy 400 x g, usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek o temperaturze pokojowej (155 mM wodorowęglanu potasu, 10 mM chlorku amonu, 0,1 mM EDTA, PH=7,4) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie dodać 5-10 ml RPMI 1640 z 5% inaktywowanym termicznie FBS.</li>
	<li>Przepuść komórki przez sitko do komórek. Zebrać przepływ do nowej rurki. Wirować przez 5 minut przy 400 x g. Usunąć supernatant; Osad komórkowy nie powinien zawierać żadnego czerwonego koloru. Brak czerwonego koloru wskazuje na całkowite usunięcie czerwonych krwinek. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml RPMI1640 z 5% inaktywowanym termicznie FBS. Delikatnie wymieszaj, aby upewnić się, że zawiesina komórek jest całkowicie jednolita. Weź podwielokrotność i policz komórki w hemacytometrze. Oblicz, ile objętości komórek potrzeba do przeszczepu szpiku kostnego i podwielokrotność wystarczającej liczby komórek i wymieszaj męskie komórki dawcy z konkurencyjnymi komórkami żeńskimi w stosunku 5:2. Wirować przez 5 minut w 400 x g, przemyć PBS, ponownie zawiesić w PBS z końcowym stężeniem komórek dawcy w 5×106/ml i komórek konkurencyjnych w 2×106/ml.</li>
</ol>
2. Konkurencyjny przeszczep szpiku kostnego
<ol>
	<li>Napromieniować samice myszy biorców (w wieku 8-12 tygodni) promiennikiem promieniowania gamma 137Cs w pojedynczej dawce 11Gy 4-6 godzin przed przeszczepem szpiku kostnego.</li>
	<li>Umieść napromieniowane samice myszy w unieruchomieniu myszy. Wstrzyknąć mieszane komórki dawcy i konkurenta przez żyłę ogonową w 0,1 ml całkowitej objętości, tak aby każda mysz otrzymała 5×105 komórek dawcy i 2×105 konkurencyjnych komórek szpiku kostnego.</li>
</ol>
3. Pobieranie próbek
Pary tygodnie po przeszczepie szpiku kostnego, pobierają próbki krwi obwodowej (~50 μl) od samicy myszy biorczyni poprzez krwawienie zaoczodołowe w warunkach znieczulenia. Próbki pobiera się do probówek pokrytych EDTA. Próbki BM można również pobrać pod koniec eksperymentu, zwykle co najmniej 4 miesiące po przeszczepie, przy użyciu tych samych procedur, co opisano wcześniej (Krok 1); zwykle 20-40% komórek BM 1 kości piszczelowej wystarcza do wytworzenia wystarczającej ilości DNA. Pobiera się również próbki krwi lub BM od normalnych samic i samców myszy w tym samym wieku w celu przygotowania krzywej wzorcowej.
4. Izolacja genomowego DNA
<ol>
	<li>Dodać 4× objętość buforu do lizy RBC o temperaturze pokojowej (~ 200 μl) do każdej próbki krwi. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 1 ml PBS, a następnie odwirować, aby usunąć większość zlizowanych RBC.</li>
	<li>Wyizoluj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA z krwi (zestaw do ekstrakcji krwi QIAmp DNA). Wstępnie podgrzać bufor elucyjny (AE) w temperaturze 37 °C, aby zwiększyć wydajność eluowanego DNA. Męskie i żeńskie DNA dla krzywej standardowej są izolowane podobnie.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Genomowe DNA można dalej oczyszczać lub zagęszczać metodą wytrącania EtOH w obecności 3 M octanu sodu (pH = 5,5). Granulki DNA są następnie ponownie zawieszane w 40-50 μl wody destylowanej w celu natychmiastowej analizy lub przechowywane w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą fotometru widmowego Nanodrop ND-1000. Do dalszej analizy wykorzystuje się próbki o OD 260/280 między 1,8-2,0.</li>
	<li>Rozcieńczyć DNA wolną od DNAazH2Odo 4 ng/μl w całkowitej objętości 50 μl.</li>
</ol>
5. Przygotowanie krzywej standardowej
Rozcieńczyć DNA męskie i żeńskie DNA do stężenia 4 ng/μl, a następnie przygotować mieszaninę DNA zgodnie z Tabelą1
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>% męskiego DNA w tle żeńskim</td>
			<td>Objętość (μl) męskiego DNA 4ng / μl</td>
			<td>Objętość (μl) żeńskiego DNA 4ng/μl</td>
			<td>Całkowita objętość (μl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2</td> pkt.
			<td>1</td>
			<td>Z numerem 499</td>
			<td>500</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5</td>
			<td>1</td>
			<td>Rozdział 199</td>
			<td>200</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>Rozdział 195</td>
			<td>200</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 12,5</td>
			<td>25</td>
			<td>175</td> Rozdział
			<td>200</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td> Rozdział
			<td>100</td> szt.
			<td>100</td> szt.
			<td>200</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>87,5</td> pkt.
			<td>175</td> Rozdział
			<td>25</td>
			<td>200</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td> szt.
			<td>200</td> szt.
			<td>0</td>
			<td>200</td> szt.
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Przygotowanie próbki do krzywej wzorcowej. Normalne samce i samice myszy FVB/NJ w wieku 8-12 tygodni zostały uśmiercone. Pobrano krew i komórki BM. DNA z komórek męskich i żeńskich wyizolowano i ponownie zawieszono w stężeniu 4ng/μl. Męskie i żeńskie DNA zmieszano w różnych proporcjach, aby wygenerować mieszaniny standardowych próbek DNA.
6. PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Ustawić płytkę reakcyjną PCR, mieszając odczynnik supermix SYBR Green ze starterami i genomowym DNA. Objętość reakcyjna (20 μl) zawiera 400 nM każdego startera i 5 μl genomowego DNA komórek krwi (4 ng/μl x5 μl = 20 ng) w każdej reakcji. Próbki DNA i wzorce ustalono w trzech egzemplarzach. Sekwencje starterów przedstawiono w tabeli 2.</li>
</ol>
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa genu</td>
			<td>naprzód</td>
			<td>rewers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl2</td> powiedział:
			<td>5′-AAGCTGTCACACAGAGGGGCTA</td>
			<td>5′- CAGGCTGGAAGGAGAAGATG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zfy1</td> powiedział:
			<td>5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA</td>
			<td>5'- CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Sekwencja startera RT-PCR dla mysich Bcl2 i Zfy1.
<ol start="2">
	<li>Przeprowadzić reakcję PCR za pomocą maszyny Biorad iQ5 PCR w następujących warunkach: 95 °C 3 min, 42 cykle amplifikacji 95 °C przez 10 sekund, 58 °C przez 25 sekund i 72 °C przez 15 sekund, a następnie krok krzywej topnienia.</li>
	<li>Uzyskaj wartości progu cyklu (Ct) za pomocą systemu optycznego Bio-Rad iQ5 2.1 Standard Edition. Obliczać wartość δCt (CtZfy1-Ct Bcl2), a poziom wyrażenia Zfy1 oblicza się jako wartość 2-δ Ct.</li>
	<li>Ustalić krzywe wzorcowe dla każdej serii reakcji, stosując odczyt 2-δCt ze znanych mieszanin wzorcowych męskich/żeńskich. Krzywe wzorcowe są generowane przez wykreślenie średniej wartości 2-δCt z trzech prób do znanego % męskiego DNA w mieszaninie z dopasowaniem regresji liniowej.</li>
</ol>

<ol><li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells%2C+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li>
<li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316(2010).</li>
<li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li>
<li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FVB%2FN%3A+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li>
<li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li>
<li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum%3A+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li>
<li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894(2008).</li>
<li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li>
<li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li>
<li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+%28Zfy-1+and+Zfy-2%29+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes & development. 4, 63-74 (1990).</li>
<li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+PIM+serine%2Fthreonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Celem naszego obecnego badania jest dostarczenie publiczności techniki opartej na PCR do ilościowego określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego. Opisano kilka badań z wykorzystaniem RT-PCR do wykrywania komórek dawcy w modelach transplantacyjnych 9-10. Grupa dr Schwarzenbergera najpierw opracowała mysi model przeszczepu szpiku kostnego przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym do amplifikacji chromosomu Y 8. Metodę tę wykorzystano do badania funkcji...

Model przeszczepu mysiego szpiku kostnego (BM) został po raz pierwszy opracowany w latach 60. 1. Model ten był szeroko stosowany w badaniach biologii krwiotwórczych komórek macierzystych dawcy (HSC) u myszy biorcy gospodarza. Model przeszczepu szpiku kostnego u myszy dostarczył nam cennej wiedzy na temat funkcji HSC i ich regulacji oraz jest niezastąpiony w badaniach nad HSC. Allogeniczny model przeszczepu szpiku kostnego, taki jak C57Bl / 6JH2b-Balb / CH2d lub model przeszczepu kongenicznego, taki jak C56Bl / 6JCD45.2-B6. SJLCD45.1 są stosowane w wielu laboratoriach do badania funkcji genu na aktywność HSC2, wpływ leczenia farmakologicznego na funkcję HSC3 lub choroby związane z przeszczepem, takie jak choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD)4.
Markery powierzchni komórek, takie jak haplotyp MHC lub CD45.1, są powszechnie używane do odróżniania komórek pochodzących od dawcy od komórek pochodzących od biorcy. C57Bl/6JH2b, CD45.2, Balb/CH2d oraz B6. SJLCD45.1 są najczęściej stosowanymi szczepami myszy w przeszczepach szpiku kostnego, ponieważ wkład komórek dawcy można łatwo ocenić za pomocą cytometrii przepływowej mierzącej CD45.1 vs. CD45.2 lub H2b vs. H2d. Jednak wiele innych szczepów, takich jak FVB/NJ5 i C3H, jest również często wykorzystywanych do generowania genetycznie modyfikowanych myszy transgenicznych lub nokautujących. Myszy te mogą być krzyżowane wstecznie z linią wsobną i utrzymywane w mieszanym tle genetycznym / MHC. W takich przypadkach określenie wszczepienia komórek dawcy i funkcji HSC może być trudne, ponieważ markery powierzchniowe specyficzne dla dawcy mogą być niedostępne.
Użycie sondy DNA specyficznej dla chromosomu Y do wykrywania komórek męskich dawcy za pomocą southern blot w przeszczepie szpiku kostnego o niedopasowanej płci zostało po raz pierwszy opracowane przez grupę 6 dr Miwy. Następnie stwierdzono, że PCR w czasie rzeczywistym dla regionu Y determinującego płeć jest dokładną i wysoce specyficzną metodą ilościowego oznaczania męskich komórek płodowych w układzie krwionośnym matki7. Koncepcja ta została zaadaptowana przez grupę dr Schwarzenbergera do opracowania techniki PCR w czasie rzeczywistym w mysim modelu przeszczepu szpiku kostnego w celu określenia wszczepienia komórek dawcy 8. Zmodyfikowaliśmy tę metodę do pomiaru wszczepienia komórek dawcy w modelu przeszczepu szpiku kostnego myszy FVB / NJ. Metoda ta jest obecnie szeroko stosowana w naszej grupie do badania roli kinazy Pim1 w biologii HSC.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30255.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16140-017</td><td>Inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>chlorek amonu</td><td>MP Biomedicaals</td><td>194806</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu</td><td>Fisher</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood minikit</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>BD bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green supermix</td><td>Biorad</td><td>170-8882</td><td></td></tr><tr><td>iQ5 maszyna do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Fotometr Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra</td><td>Nanodrop ND-1000</td><td>ND-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie ilościowej reakcji pcr w czasie rzeczywistym do określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Modele przeszczepu szpiku kostnego u myszy stanowią ważne narzędzie do pomiaru funkcji hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) i określania genów/cząsteczek regulujących HSC. W tych modelowych systemach przeszczepów funkcja HSC jest determinowana przez zdolność tych komórek do wszczepiania i odtwarzania śmiertelnie napromieniowanych myszy biorców. Zazwyczaj wkład/wszczepienie komórki dawcy mierzy się za pomocą przeciwciał przeciwko białkom powierzchniowym komórek specyficznych dla dawcy za pomocą cytometrii przepływowej. Jednak metoda ta w dużym stopniu zależy od specyficzności i zdolności markera powierzchni komórki do różnicowania komórek pochodzących od dawcy od komórek pochodzących od biorcy, co może nie być dostępne dla wszystkich szczepów myszy. Biorąc pod uwagę różne tła genetycznie modyfikowanych szczepów myszy dostępnych na rynku, ta metoda oparta na cytometrii powierzchniowej/przepływowej komórek ma znaczne ograniczenia, szczególnie w szczepach myszy, które nie mają dobrze zdefiniowanych markerów powierzchniowych do oddzielania komórek dawcy od kongenicznych komórek biorcy. W tym miejscu opisaliśmy technikę opartą na PCR w celu określenia wszczepienia/wkładu komórek dawcy u myszy po przeszczepie. Przeszczepiliśmy HSC szpiku kostnego samca dawcy śmiertelnie napromieniowanym kongenicznym samicom myszy. Próbki krwi obwodowej pobierano w różnych punktach czasowych po przeszczepie. Próbki szpiku kostnego pobrano pod koniec eksperymentów. Wyizolowano genomowe DNA, a gen specyficzny dla chromosomu Y, Zfy1, amplifikowano za pomocą ilościowego Real Time PCR. Wszczepienie męskich komórek pochodzących od dawcy u samic myszy biorcy obliczono w odniesieniu do krzywej standardowej ze znanym odsetkiem męskiego i żeńskiego DNA DNA. Bcl2 został użyty jako gen referencyjny do normalizacji całkowitej ilości DNA. Nasze dane sugerują, że podejście to wiarygodnie określa wszczepienie komórek dawcy i zapewnia użyteczną, ale prostą metodę pomiaru rekonstytucji komórek krwiotwórczych w mysich modelach przeszczepu szpiku kostnego. Nasza metoda może być rutynowo wykonywana w większości laboratoriów, ponieważ nie jest wymagany kosztowny sprzęt, taki jak cytometria przepływowa.

Rysunki 1 i 2 przedstawiają przykłady krzywych wzorcowych z naniesionymi średnimi wartościami 2-δCt w funkcji procentowej zawartości męskiego DNA. Rysunek 1A przedstawia specyficzne temperatury topnienia dla amplikonów Bcl2 i Zfy1, które wynoszą odpowiednio 78.5 °C i 88.5 °C. Bcl2 jest wykorzystywane jako gen referencyjny do normalizacji całkowitej ilości DNA naniesionego w każdej reakcji PCR. Krzywe amplifikacji Bcl2 (widok logarytmiczny) dla każdej próbki wzorcowej pokrywają...

Określenie wszczepienia komórek dawcy stanowi wyzwanie w modelach przeszczepu szpiku kostnego u myszy, które nie mają dobrze zdefiniowanych markerów fenotypowych. Opisaliśmy metodologię ilościowego oznaczania wszczepienia męskich komórek dawcy u samic myszy biorców przeszczepu. Metoda ta może być stosowana u wszystkich szczepów myszy do badania funkcji HSC.

Wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym do określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie techniki opartej na PCR w celu ilościowego oznaczenia przyjęcia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu transplantacji szpiku kostnego u myszy. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie transplantacji szpiku kostnego u samic myszy biorczych z wykorzystaniem komórek od samców dawców. Następnie z myszy biorczych w różnych punktach czasowych pobiera się krew obwodową i izoluje genomiczne DNA. Próbki są przygotowywane do sporządzenia krzywej wzorcowej.Na koniec przeprowadza się reakcję real-time PCR z wykorzystaniem próbek standardowych i badawczych. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące przyjęcie komórek pochodzących od męskiego dawcy u samic myszy biorcy poprzez obliczenia w odniesieniu do krzywej standardowej z określoną zawartością DNA męskiego względem żeńskiego. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak metoda oparta na cytometrii przepływowej, jest jej większa czułość, niższy koszt oraz możliwość długotrwałego przechowywania próbek.Co najważniejsze, nasza technika jest całkowicie niezależna od zastosowania markerów i może być wykorzystana dla dowolnego tła genomicznego myszy, bez konieczności stosowania ściśle określonych markerów powierzchniowych komórek w celu odróżnienia komórek dawcy od komórek biorcy. Po uśmierceniu samca dawcy oraz samic myszy szczepu FVB nj pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, za pomocą małych nożyczek i pęsety wyizolować kości udowe i piszczelowe, a następnie umieścić je w 60 mm szalce hodowlanej zawierającej 6 mL lodowatego medium RPMI 1640 z 5% dezaktywowaną termicznie FBS. Użyć chusteczki Kimwipe do usunięcia mięśni oraz innych tkanek, a następnie odciąć oba końce trzonu każdej kości w szalce. Następnie połączyć końce kości z igłą 23G przymocowaną do strzykawki 3 cc wypełnionej medium RPMI 1640 z 5% dezaktywowaną termicznie FBS i wypłukać szpik.Za pomocą tej samej igły rozbij tkankę szpiku kostnego poprzez wielokrotne aspiracje. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wiruj przez pięć minut przy 400 G. Po usunięciu nadsączu resuspenduj komórki w 1 ml buforu do lizy erytrocytów o temperaturze pokojowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie dodaj od 5 do 10 ml pożywki RPMI 1640 z 5% nieaktywną termicznie FBS, przefiltruj komórki przez sitko komórkowe i zbierz filtrat do nowej probówki. Po wirowaniu komórek przez pięć minut przy 400 G i usunięciu nadsączu, osad nie powinien mieć czerwonego koloru, co wskazuje na całkowite usunięcie erytrocytów; resuspenduj osad w 10 ml pożywki RPMI 1640 z 5% nieaktywną termicznie FBS, a po delikatnym wymieszaniu w wirówce vorex dodaj niewielką alikwot do hemocytometru i policz komórki.Oblicz objętość komórek wymaganą do zmieszania z konkurencyjnymi komórkami samic w stosunku pięć do dwóch na potrzeby przeszczepu szpiku kostnego. Jako ostatni etap przygotowania komórek do iniekcji, zmieszaj komórki dawcy i komórki konkurencyjne, zcentryfuguj komórki w celu otrzymania osadu, przemyj je PBS i resuspenduj w PBS do końcowego stężenia 5 × 10⁶ na mililitr dla komórek dawcy oraz 2 × 10⁶ na mililitr dla komórek konkurencyjnych, od czterech do sześciu godzin przed przeszczepem szpiku kostnego. Naświetl samice myszy biorców promieniowaniem gamma cezu 137 w pojedynczej dawce 11 Gy.Umieść napromieniowane myszy żeńskie w ograniczniku i wstrzyknij mieszaninę komórek donora i komórek konkurencyjnych do żyły ogonowej w całkowitej objętości 0,1 ml, tak aby każda mysz otrzymała 5 × 10⁵ komórek donora oraz 2 × 10⁵ komórek szpiku kostnego konkurencyjnych w celu późniejszego pobrania próbek krwi. Po znieczuleniu myszy pobierz około 50 µl krwi do probówek powlekanych EDTA poprzez upust z zatoki zaocznej. Pobierz również próbki od samców i samic myszy w tym samym wieku.Następnie należy wyizolować DNA genomiczne z myszy badawczych i myszy kontrolnych. W celu przygotowania krzywej wzorcowej do każdej próbki krwi dodać około 200 µL buforu do lizy RBC o temperaturze pokojowej i inkubować przez pięć minut. Dodać 1 mL PBS i odwirować, aby usunąć większość lizowanych RBC.Następnie należy użyć zestawu do ekstrakcji DNA z krwi w celu wyizolowania DNA, uprzednio podgrzewając bufor elucyjny do 37°C. Aby zwiększyć wydajność, należy zmierzyć stężenie DNA w każdej próbce. Do dalszych analiz wykorzystuje się próbki z wartością absorbancji OD 260/280 w zakresie od 1,8 do 2,0.Aby przygotować krzywą wzorcową, należy rozcieńczyć DNA samca i samicy do stężenia 4 ng/µL, a następnie sporządzić mieszaninę DNA zgodnie z powyższymi wytycznymi. Płytkę do reakcji PCR przygotowuje się poprzez zmieszanie odczynnika Cyber Green Super Mix z przedstawionymi tutaj starterami oraz genomicznym DNA. Każda reakcja o objętości 20 µL zawiera 400 nM każdego startera oraz 5 µL genomicznego DNA z komórek krwi, wykonaną w trzech powtórzeniach.Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z warunkami opisanymi w protokole tekstowym i wyznaczyć wartości progu cyklu lub wartości CT. Obliczyć delta CT pomnożone przez ilość CT do potęgi ZY 1 minus CT do potęgi BCL 2 oraz poziomy ekspresji ZY 1 lub 2 do potęgi minus delta CT; krzywe wzorcowe generuje się poprzez naniesienie średniej z trzech powtórzeń wartości 2 do potęgi delta CT względem znanego procentowego udziału męskiego DNA w mieszaninie wraz z naniesioną linią regresji liniowej. Poniżej przedstawiono przykłady krzywych wzorcowych wykreślonych dla średnich wartości 2 do potęgi delta CT w zależności od procentowej zawartości męskiego DNA.Wykres ten przedstawia specyficzną temperaturę topnienia dla amplikonów BCL two oraz ZFY one, która wynosi odpowiednio 78,5 i 88,5 °C. BCL two jest wykorzystywany jako gen referencyjny do normalizacji całkowitej ilości naniesionego DNA w każdej reakcji PCR. Krzywe amplifikacji BCL two dla każdej próbki standardowej pokrywają się ze sobą niezależnie od stężenia DNA męskiego, co wskazuje na naniesienie równych ilości DNA.Jednakże krzywe amplifikacji ZFY przesunęły się w lewo wraz ze zwiększającą się ilością męskiego DNA w próbkach; komórki macierzyste krwi z myszy PIM TKO wykazują defekty w rekonstytucji myszy poddanych naświetlaniu letalnemu i, zgodnie z oczekiwaniami, myszy biorcy przeszczepione komórkami PIM TKO miały znacznie niższy odsetek komórek męskich w porównaniu z myszami przeszczepionymi komórkami typu dzikiego. Aby zwalidować naszą metodę, przetestowaliśmy przyjęcie męskich komórek dawcy u przeszczepionych myszy żeńskich, które otrzymały komórki szpiku kostnego od myszy typu dzikiego lub myszy z potrójnym nokautem PIM (TKO) w różnych punktach czasowych po transplantacji; analizowano zarówno krew obwodową w szóstym tygodniu, jak i próbki szpiku kostnego w 16. tygodniu. Po obejrzeniu tego filmu.Należy posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania metody opartej na PCR do ilościowego oznaczania przyjęcia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu transplantacji szpiku kostnego u zwierząt morskich.

using-quantitative-real-time-pcr-to-determine-donor-cell-engraftment

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zastosowanie ilościowej bieżącej reakcji PCR w celu określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym mysim modelu przeszczepu szpiku kostnego

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Przeszczep szpiku kostnego umożliwia zmianę genotypu komórek pochodzących ze szpiku. Jeśli interesujący nas gen jest ekspresowany zarówno w komórkach pochodzących ze szpiku, jak i w komórkach niepochodzących ze szpiku, przeszczep szpiku kostnego pozwala na zmianę genotypu komórek pochodzących ze szpiku bez zmiany genotypu komórek niepochodzących ze szpiku.

Różnicowanie funkcjonalnych ról ekspresji genów w komórkach immunologicznych i nieimmunologicznych w zapaleniu jelita grubego u myszy za pomocą transplantacji szpiku kostnego

Ten film demonstruje indukcję choroby jelitowej przeszczep przeciwko gospodarzowi, GvHD, u śmiertelnie napromieniowanej myszy biorcy przy użyciu allogenicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i indukujących GvHD alloreaktywnych limfocytów T indukujących śledzionę. Protokół ten pomaga w ustaleniu modelu ciężkiej ostrej choroby jelitowej GvHD, aby zrozumieć mechanizm choroby i opracować innowacyjne opcje terapeutyczne.

Indukcja choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w modelach mysich za pomocą allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego i komórek śledziony

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Przedstawiamy szybki i elastyczny protokół dla systemu ekspresji in vivo opartego na pojedynczym receptorze limfocytów T (TCR).  Wektory retrowirusowe są wykorzystywane do transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu zbadania rozwoju i funkcji pojedynczych komórek T in vivo jako alternatywy dla myszy transgenicznych TCR.

Transdukcja retrowirusowa komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia myszy retrogenicznych receptora komórek T

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania konkurencyjnych eksperymentów z przeszczepem szpiku kostnego myszy w celu zbadania funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych bez wcześniejszego oczyszczania komórek macierzystych przez sortowanie komórek.

Konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych

Ten manuskrypt zawiera opis metodologii użytej do ustanowienia modeli myszy transdukcyjno-transplantacyjnych. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat błędów technicznych, których należy unikać podczas wykonywania przeszczepów szpiku kostnego. Należy uzyskać jasne zrozumienie znaczenia wysokiego miana wirusa, transfekcji/transdukcji i napromieniania.

Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Tutaj prezentujemy protokół do wywoływania i oceniania choroby w modelu xenoGVHD (xenoGVHD) ksenogenicznej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. xenoGVHD dostarcza model in vivo do badania immunosupresji ludzkich limfocytów T. Dodatkowo opisujemy, jak wykrywać ludzkie limfocyty T w tkankach za pomocą cyfrowego PCR jako narzędzia do ilościowego określania immunosupresji.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Opisujemy trzy metody przeszczepu szpiku kostnego (BMT): BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem ekranowanym oraz metoda BMT bez wstępnego kondycjonowania (adoptywna BMT) do badania hematopoezy klonalnej w modelach mysich.

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Poznaj ilościową metodę PCR w czasie rzeczywistym do oceny wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu szpiku kostnego myszy. Technika ta jest czuła, ekonomiczna i niezależna od szczepu.

Wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym do określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym do określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów