Name: Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii wideo żywych komórek do badania fagocytozy Candida albicans przez makrofagi. Technika umożliwia analizę etapów migracji, rozpoznawania i wchłaniania patogenu w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LPE jest Szkockim Starszym Pracownikiem Klinicznym i dziękuje za wsparcie Biura Głównego Naukowca (SCD/03). Praca ta została sfinansowana przez Wellcome Trust Project Grant dla LPE (089930). NARG został sfinansowany z grantu Wellcome Trust Programme (080088) i grantu na sprzęt (075470) (dla DeltaVision) oraz z grantu FP7-2007-2013 (HEALTH-F2-2010-260338-ALLFUN). Chcielibyśmy podziękować ośrodkowi obrazowania Uniwersytetu w Aberdeen, a w szczególności Kevinowi MacKenzie, za pomocne wsparcie i porady.

1. Wzrost i warunki C. albicans
<ol>
	<li>Przygotować płytki agarowe SC-Ura, dodając 6,9 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 1 ml 1 M NaOH, 10 ml 1% (w/v) soli hemisiarczanu adeniny i 20 g agaru technicznego (wcześniej opisanego szczegółowo w 11). Uzupełnić objętość do 900 ml destylowanym autoklawemH2O, pozostawić agar do ostygnięcia, ale nie na tyle do zestalenia, a następnie dodać 50 ml sterylnej 40% D-glukozy i 50 ml sterylnego 4% dropoutu SC-Ura w warunkach aseptycznych. Wymieszaj, przelej na szalki Petriego i pozostaw płytki agarowe do ostygnięcia i zestalenia. Przechowywać płytki agarowe w temperaturze 5 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Smuga C. albicans serotyp A szczep CAI4+CIp10 z zapasów glicerolu przechowywanych w temperaturze -80 °C na płytce agarowej SC-Ura.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C do momentu powstania kolonii i przechowywać w temperaturze 5 °C.</li>
	<li>Wyhodować pojedynczą kolonię C. albicans w 5 ml pożywki SC-Ura (receptura jak w 1.1, ale bez agaru technicznego) i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C, 200 obr./min w celu wytworzenia fazy stacjonarnej C. albicans.</li>
</ol>
2. Barwienie C. albicans za pomocą izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)
<ol>
	<li>Dodać 10 μl C. albicans przez noc do 990 μl PBS (pH 7,4) i przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Aby ułatwić wizualizację C. albicans podczas testów fagocytozy, wybarwić 1 ×10 8 C. albicans za pomocą 1 mg/ml FITC w 0,05 M buforze węglanowo-wodorowęglanowym (pH 9,6) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>W celu usunięcia niezwiązanego FITC, przemyć C. albicans w 1 ml 1 x PBS, odwirować przy 3 000 × g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1 x PBS. Powtórz 3 razy.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 × 106 komórek/μl w 1 x PBS.</li>
</ol>
3. Przygotowanie linii komórkowej makrofagów myszy J774.1
<ol>
	<li>Utrzymuj makrofagi J774.1 w kolbach do hodowli tkankowych o średnicy 75cm2 w pożywce DMEM uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS), 200 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Przygotowanie pierwotnych makrofagów opisano szczegółowo w innym miejscu 12, 13.</li>
	<li>Zeskrobać komórki J774.1 z kolby do hodowli tkankowej i przenieść do probówki Falcon o pojemności 50 ml. Wirować przy 600 × g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml wstępnie podgrzanej, uzupełnionej pożywki DMEM. Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytki 1 × 106 makrofagów J774.1 w 2 ml uzupełnionej pożywki DMEM w szklanej naczyniu obrazowym o średnicy 35 mm. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Przed przystąpieniem do obrazowania należy zastąpić uzupełnioną pożywkę DMEM 2 ml wstępnie podgrzanej, uzupełnionej pożywki niezależnej od CO2 (z 10% (v/v) płodową surowicą cielęcą (FCS), 200 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) zawierającą 1 μM LysoTracker Red DND-99.</li>
</ol>
4. Test fagocytozy w mikroskopii wideo na żywo
<ol>
	<li>Wybór mikroskopu będzie zależał od tego, co jest dostępne lokalnie, ale konfiguracja mikroskopu będzie musiała obejmować odwrócony stolik, komorę środowiskową podgrzaną do 37 °C oraz filtry wzbudzenia/emisji dla wybranych barwników (FITC i TRITC).</li>
	<li>Włączyć grzałkę mikroskopu przed eksperymentem i odczekać wystarczająco dużo czasu, aby komora kontroli środowiska nagrzała się do 37 °C. Czas potrzebny do ustabilizowania się temperatury w komorze będzie różny w zależności od konfiguracji mikroskopu.</li>
	<li>Włącz mikroskop i komputer, a następnie załaduj oprogramowanie do obrazowania. Zamontuj czaszę obrazowania na stoliku mikroskopu i dostosuj ostrość, aby znaleźć makrofagi J774.1. Zoptymalizuj wygląd obrazów TRITC i DIC, dostosowując procentowy udział światła przepuszczanego i czasy ekspozycji.</li>
	<li>Wyjmij naczynie do obrazowania i dodaj do naczynia 3 ×10 6 C. albicans barwionych FITC. Zapisz czas, w którym C. albicans jest dodawany do potrawy. Przywróć antenę na scenę i w razie potrzeby zoptymalizuj wygląd obrazów FITC. W razie potrzeby skonfiguruj listę punktów.</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie, gdy wszystkie punkty są ostre, a kanały są zoptymalizowane. Rejestruj obrazy FITC, TRITC i DIC co minutę przez 6 godzin.</li>
</ol>

<ol><li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li>
<li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li>
<li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li>
<li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li>
<li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li>
<li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578(2012).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen%2C+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , In Press (2012).</li>
<li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lytic+expulsion%2Fexocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li>
<li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li>
<li>Erwig, L. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+%28ERM%29+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. NG jest beneficjentem nieograniczonego wsparcia grantowego na badania podstawowe od Gilead Sciences. LE pracuje jako konsultant dla GSK we wczesnym etapie rozwoju leków.

W tym miejscu opisano metodę wykorzystania wideomikroskopii żywych komórek do badania fagocytozy makrofagów. Mikroskopia wideo oferuje wiele dodatkowych warstw informacji do analizy. Jedną z podstawowych zalet jest to, że dane dotyczące absorpcji mogą być generowane (z pojedynczego eksperymentu) dla dowolnego punktu czasowego przez 6-godzinny okres obserwacji. Co ważniejsze, opisana metoda umożliwia analizę różnicową poszczególnych etapów fagocytozy. Wykazaliśmy na przykład, że zmiany w ogólnym wychwytywaniu glikozylacji C . albicans i mutantów morfogenezy przez linie komórkowe makrofagów i pierwotne makrofagi mogą być albo konsekwencją zmian w migracji makrofagów w kierunku komórek docelowych, albo szybkości pochłaniania po nawiązaniu kontaktu komórka-komórka 7.
Istnieje wiele pułapek, których należy unikać podczas przeprowadzania tych eksperymentów. Po pierwsze, bardzo ważne jest zapewnienie stabilnych warunków środowiskowych przez cały czas trwania procedury doświadczalnej. Najlepiej osiągnąć to w komorze środowiskowej, która jest ustawiona na warunki eksperymentalne na kilka godzin przed rozpoczęciem eksperymentu. Jakość wideo jest w dużym stopniu zależna od zaawansowanych modułów, które wykorzystują lasery na podczerwień do automatycznego utrzymywania pozycji Z próbki niezależnie od zmian mechanicznych lub termicznych, eliminując w ten sposób potrzebę ręcznej korekty ostrości.
Biorąc pod uwagę rozszerzony charakter eksperymentów, ważne jest, aby ograniczyć ekspozycję na światło laserowe i związane z tym efekty fotowybielania i fotokonwersji, które można zminimalizować poprzez zastosowanie wysoce fluorescencyjnych markerów, które ułatwiają krótkie czasy naświetlania. Opisany tutaj protokół barwienia FITC jest szybki i niezawodny. Ponieważ FITC jest bardzo jasną i stabilną plamą, wymagane są krótkie czasy naświetlania, co sprawia, że FITC idealnie nadaje się do długich filmów poklatkowych. Jednak rutynowo używamy wielu różnych barwników docelowych, w tym barwników Calcofluor White i PKH, a także oznakowanych organizmów.
Większość naszych opublikowanych prac jest przeprowadzana przy użyciu mikroskopu szerokokątnego, ale ekspozycję można jeszcze bardziej zminimalizować, używając mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, a w naszych rękach jest to niezbędne do poklatkowej mikroskopii wideo 3D.
Podczas tego badania obrazy były rejestrowane w odstępach 1-minutowych w 6-godzinnym teście fagocytozy. Odstęp między obrazami można dostosować w zależności od badanego procesu. Na przykład odstęp ten można skrócić podczas badania szybkich procesów, takich jak transport pęcherzykowy. Minimalny odstęp czasu będzie ograniczony specyfikacją mikroskopu i kamery. Jest kilka kwestii, o których należy pamiętać podczas dostosowywania czasu. Po pierwsze, zmniejszenie odstępu między migawkami oznacza, że można zobrazować mniej punktów, a rozmiar pliku zostanie znacznie zwiększony. Wręcz przeciwnie, zbyt duże zwiększenie interwału między obrazami spowoduje, że film straci ciągłość.
Podejście to można zasadniczo zastosować do badania innych patogenów i wychwytu umierających komórek gospodarza. Na przykład niedawno wykazaliśmy, że makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego od myszy z niedoborem sialoadhezyny wykazują znacznie zmniejszone wiązanie i fagocytozę sjalowanego Campylobacter jejuni 8. Jednak rozmiar docelowy jest ważnym wyznacznikiem wykonalności, ponieważ analiza obrazu staje się coraz trudniejsza wraz ze zmniejszeniem rozmiaru komórki docelowej. Zaawansowane oprogramowanie do analizy obrazu jest niezbędne do szybkiej analizy mikroskopii wideo, a to powinno być połączone z odpowiednim wsparciem bioinformatycznym, aby ułatwić generowanie algorytmów do badania migracji pojedynczych komórek i całych populacji komórkowych 7. Mikroskopia wideo z żywymi komórkami w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do analizy obrazu do analizy minuta po minucie migracji i interakcji poszczególnych makrofagów z C. albicans zapewnia unikalny wgląd w złożoność fagocytozy C. albicans przez makrofagi. Istnieje ogromny potencjał rozszerzenia tych metod w celu badania innych patogenów i fagocytów (komórek dendrytycznych, neutrofili) oraz opracowania mikroskopii wideo 3D w celu bardziej szczegółowego obrazowania interakcji komórka-komórka lub na bardziej fizjologicznych powierzchniach, takich jak warstwy komórek nabłonka i śródbłonka. Technika ta należy do nowej generacji narzędzi do badania interakcji gospodarz-patogen i pomoże w generowaniu szczegółowych informacji przestrzennych i czasowych na temat szerokiego zakresu procesów dynamicznych.

<table><tbody><tr><td>Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów</td><td>Formedium</td><td>CYN0402</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sól hemisiarczanu adeniny</td><td>Sigma</td><td>A3159-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agar techniczny (nr 3)</td><td>Oxoid</td><td>LP0013</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SC-Ura dropout</td><td>Formedium</td><td></td><td></td>DSCK102</tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma</td><td>F7250-1G</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>BDH</td><td>301215M</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>BDH</td><td>102475W</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Life Technologies</td><td>10106169</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/ streptomycyna </td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia szklane 35 mm</td><td>PAA</td><td>PAA12305160X</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Usuwanie patogenów grzybowych i ogólnie mikroorganizmów można uznać za składające się z czterech odrębnych etapów: (i) migracji fagocytów do miejsca, w którym znajdują się patogeny; (ii) rozpoznawanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP) za pomocą receptorów rozpoznawania wzorców (PRR); (iii) pochłanianie mikroorganizmów związanych z błoną komórkową fagocytów oraz (iv) przetwarzanie pochłoniętych komórek w dojrzewających fagosomach i trawienie połkniętej cząstki. Badania, które oceniają fagocytozę w całości, mają charakter informacyjny1, 2, 3, 4, 5, ale są ograniczone, ponieważ zwykle nie dzielą procesu na migrację, pochłanianie i dojrzewanie fagosomów, na które może wpływać w różny sposób. Co więcej, takie badania oceniają absorpcję jako pojedyncze zdarzenie, a nie jako ciągły proces dynamiczny. Niedawno opracowaliśmy zaawansowane technologie obrazowania żywych komórek i połączyliśmy je z genetyczną analizą funkcjonalną zarówno komórek patogenu, jak i gospodarza, aby stworzyć interdyscyplinarną platformę do analizy funkcji wrodzonych komórek odpornościowych i patogenezy grzybów. Badania te ujawniły nowe aspekty fagocytozy, które można było zaobserwować tylko przy użyciu systematycznej analizy czasowej interakcji molekularnych i komórkowych między ludzkimi fagocytami a patogenami grzybiczymi i ogólnie mikroorganizmami zakaźnymi. Na przykład, zaczęliśmy definiować następujące elementy: (a) składniki powierzchni komórki wymagane na każdym etapie procesu rozpoznawania, pochłaniania i zabijania komórek grzyba1, 6, 7, 8; b) w jaki sposób geometria powierzchni wpływa na skuteczność wychwytu i zabijania makrofagów przez drożdże i strzępkikrwi 7; oraz (c) w jaki sposób pochłanianie prowadzi do zmiany cyklu komórkowego i zachowania makrofagów 9, 10.
W przeciwieństwie do pojedynczych migawek punktu czasowego, mikroskopia wideo żywych komórek umożliwia badanie szerokiej gamy komórek gospodarza i patogenów jako ciągłych sekwencji przez długie okresy czasu, dostarczając przestrzennych i czasowych informacji na temat szerokiego zakresu dynamicznych procesów, w tym migracji komórek, replikacji i transportu pęcherzykowego. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak przygotować komórki gospodarza i grzyba oraz przeprowadzić eksperymenty z mikroskopią wideo. Metody te mogą stanowić przewodnik dla przyszłych badań z innymi fagocytami i mikroorganizmami.

Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki pobierania C. albicans przez mysią linię komórkową makrofagów J774.1 podczas 6-godzinnego eksperymentu z wykorzystaniem wideomikroskopii żywych komórek. Rysunek 1 to reprezentatywny film z wideomikroskopii żywych komórek, ukazujący fagocytozę C. albicans przez mysie makrofagi J774.1. Wideomikroskopia żywych komórek umożliwia wizualizację internalizacji C. albicans bez konieczności barwienia zewnętrznych komórek Candida. Jednak w trakcie tych eksperymentów C. albicans barwiono za pomocą wrażliwego na pH barwnika FITC (zielony), który ulega wygaszeniu podczas zakwaszania fagosomu makrofaga, co ułatwia potwierdzenie, że Candida została zinternalizowana (Rysunek 1). Aby dodatkowo wspomóc wizualizację pochłoniętych C. albicans, makrofagi barwiono czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym LysoTracker red DND-99, który barwi przedziały kwaśne i służy jako nieswoisty marker dojrzewania fagosomu. Rysunek 2 to klatka z eksperymentu wideomikroskopii żywych komórek, ilustrująca zmienność w liczbie pochłoniętych C. albicans przez poszczególne makrofagi J774.1. W tym eksperymencie 82% makrofagów J774.1 pochłonęło co najmniej jedną komórkę C. albicans pod koniec 6-godzinnego testu fagocytozy. Na Rysunku 3 przedstawiono liczbę zinternalizowanych komórek C. albicans na makrofag. Średnia liczba pobranych C. albicans na makrofag wynosi 3,4, lecz co ciekawe, makrofagi mogą pochłonąć do 16 komórek grzyba. Rysunek 4 to sekwencja zdjęć z reprezentatywnego eksperymentu wideomikroskopii żywych komórek, pokazująca makrofag fagocytujący komórki C. albicans, wzrost strzępek wewnątrz makrofaga i ostatecznie lizę makrofaga. Rysunek 4 ilustruje, że wideomikroskopia umożliwia analizę zdarzeń następujących po pochłonięciu komórek docelowych, tj. można generować dane dotyczące zabijania makrofagów przez strzępki C. albicans w odniesieniu do liczby i morfogenezy pochłoniętych komórek docelowych oraz badać w czasie rzeczywistym, jak zabijanie makrofagów wiąże się z dojrzewaniem fagosomu.
Rysunek 1. Film z mikroskopii wideo żywych komórek przedstawiający fagocytozę C. albicans przez mysie makrofagi J774.1. Makrofagi zostały zabarwione czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym LysoTracker red DND-99, a C. albicans zostały zabarwione FITC (zielony). Makrofagi i C. albicans były hodowane wspólnie przez okres 6 hr w temperaturze 37 °C w pełnym medium niezależnym od CO2. Obrazy były rejestrowane w odstępach 1 min przez 6 hr. Widoczne jest nawiązywanie kontaktu międzykomórkowego makrofagów z C. albicans, po czym następuje pochłanianie C. albicans do fagosomów makrofagów. Strzałki wskazują C. albicans przed pochłonięciem przez makrofagi J774.1. Film pokazuje również, że fluorescencja FITC zostaje wygaszona po pochłonięciu C. albicans. Pasek skali, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić film</a>.
<img alt="Komórki drożdżaków i strzępki pod mikroskopem; podkreślenie struktury w badaniu wzrostu grzybów." src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Reprezentatywny kadr z wideomikroskopii żywych komórek, pokazujący zróżnicowanie liczby komórek C. albicans pochłoniętych przez poszczególne makrofagi. Makrofagi (barwione LysoTracker red DND-99) były hodowane wspólnie z C. albicans barwionymi FITC (kolor zielony). Widoczne jest zróżnicowanie liczby pochłoniętych komórek C. albicans (liczba przy strzałce wskazuje liczbę pochłoniętych komórek C. albicans) oraz morfologii C. albicans (t.j. forma drożdżakowa versus strzępkowa). Pasek skali, 20 μm.
<img alt="Wchłanianie Candida albicans przez makrofagi J774.1; wykres słupkowy rozkładu ilości pochłoniętych komórek." src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Wykres przedstawiający liczbę pochłoniętych komórek C. albicans na jeden mysi makrofag J774.1 po zakończeniu 6-godzinnych testów fagocytozy. Dane reprezentują 2 niezależne eksperymenty. W każdym eksperymencie zliczano łącznie 100 makrofagów z 3 pól widzenia, co dało łącznie 600 pojedynczych makrofagów.
<img alt="Obrazy z mikroskopii konfokalnej pokazujące struktury komórkowe C i M w komórkach drożdży, znakowanie fluorescencyjne." src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Seria obrazów z reprezentatywnego eksperymentu z mikroskopii wideo żywych komórek, przedstawiająca makrofag (M) i C. albicans (C) przed rozpoznaniem i w jego trakcie (A, B), a także w trakcie i po wchłonięciu (C, D). Strzępki C. albicans kontynuują wzrost wewnątrz makrofaga (E, F), co może prowadzić do lizy makrofaga (G). Inne makrofagi są rekrutowane do miejsca pęknięcia i próbują pochłonąć uwolnione komórki C. albicans (H). Makrofagi zabarwiono czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym LysoTracker red DND-99, a C. albicans zabarwiono FITC (zielony). Należy zauważyć, że sygnał FITC ulega wygaszeniu po wchłonięciu C. albicans przez makrofagi J774.1 (C). Pasek skali, 10 μm.

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów. Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie eksperymentu z mikroskopią wideo na żywych komórkach w celu zbadania fagocytozy ludzkiego patogenu grzybowego Candida albicans. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę u Candida albicans w nocy, więc wchodzą one w fazę stacjonarną. Następnym krokiem jest umieszczenie makrofagów J 7 74 w 35-milimetrowych naczyniach obrazowych ze szklanym dnem i hodowla ich przez noc.Następnego dnia Candida albicans jest barwiona wrażliwym na pH Zi, a kwaśne organelle makrofagów są barwione za pomocą czerwonego liso trackera. Ostatnim krokiem jest nakręcenie filmu z testu fagocytozy, w którym makrofagi J 7, 7, 4 są hodowane z Candida albicans. Ostatecznie, uzyskany w ten sposób film może pokazać etap analizy pacyficznej rozpoznawania migracji makrofagów, pochłaniania i dojrzewania strefy FGA.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak chemia immunocytologiczna, jest to, że mikroskopia wideo na żywo może być wykorzystana do rozbicia, obserwowanych różnic, na poszczególne etapy, takie jak migracja, pochłanianie i dojrzewanie fagosomów, na które może to mieć wpływ. Różnicowo, chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w fagocytozę Canada Acan. Może być również stosowany do innych układów, takich jak inne patogeny, fagocyty, w tym komórki dendrytyczne i neutrofile.Ta hodowla wymaga zaawansowanego przygotowania płytek agarowych SC minus U. Można je przechowywać w lodówce, zaczynając od smugowania serotypu Candida albican, szczepu CI four plus CLP 10 z zapasów glicerolu przechowywanych w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na płytce agarowej SC U. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż utworzą się kolonie, zwykle 48 godzin.W tym momencie płytkę można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do użycia. Teraz wybierz pojedynczą kolonię i hoduj ją w pięciu mililitrach, SCU lub pożywce przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza na bujaku ustawionym na 200 obr./min. Spowoduje to wytworzenie fazy stacjonarnej Candida albicans.Dodaj 10 mikrolitrów nocnej hodowli Candida albicans do 990 mikrolitrów PBS o pH 7,4 i wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru, aby uwidocznić Candida albicans podczas testów fagocytozy, wybarwić 100 milionów candida za pomocą Zi przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie usuń niezwiązany fitzy, myjąc Candida albicans trzy razy w PBS, aby umyć odwirować candida w temperaturze 3000 razy G przez pięć minut. Usuń osad sup i ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze PBS Reese.Zawiesić końcowy osad w PBS w stężeniu 1 miliona komórek na mikrolitr. Dla tego protokołu przygotowano hodowlę makrofagów J 7 7 4 0,1 w kolbach do hodowli tkankowych o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w uzupełnionym DMEM w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla z kolby. Zezłomuj makrofagi i przenieś je do 50-mililitrowej wirówki z rurką Falcona.Użyj makrofagów w temperaturze 600 razy G przez pięć minut, aby uzyskać podniebienie komórkowe. Usunąć supinat i ponownie zawiesić granulat w 10 mililitrach przedwojennego dmm uzupełnionego. Teraz policz komórki za pomocą cytometru hemologicznego i umieść 1 milion komórek w 35-milimetrowym szklanym naczyniu do obrazowania z dwoma mililitrami uzupełnionego podłoża DMM.Inkubuj danie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i z 5% dwutlenkiem węgla następnego dnia. Przed obrazowaniem należy zastąpić uzupełnioną pożywkę DMM dwoma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki niezależnej od dwutlenku węgla, zawierającej jeden mikromolowiec Liso tracker red DND 99 i te same suplementy co DMM. Konfiguracja mikroskopu musi zawierać odwrócony stolik i komorę środowiskową podgrzaną do 37 stopni Celsjusza oraz filtry emisji wzbudzenia dla wybranych plam, które są fitzy i trixy.W tym przykładzie zastosowano precyzyjny rdzeń wizyjny delta. Najpierw włącz grzałkę mikroskopu, aby komora kontrolna była ciepła do 37 stopni Celsjusza. Następnie włącz mikroskop i komputer i załaduj oprogramowanie do obrazowania, zamontuj czaszę obrazowania na stoliku mikroskopu i dostosuj ostrość, aby znaleźć makrofagi J 7 74 0,1.Zoptymalizuj wygląd obrazów trixi i DIC, dostosowując procentowy udział światła przepuszczanego i czasy ekspozycji. Wyjmij naczynie do obrazowania i dodaj do naczynia 3 miliony fitsy barwionych Candida albicans. Nagraj czas i przywróć antenę na scenę, w razie potrzeby zoptymalizuj wygląd niestabilnych obrazów i w razie potrzeby ustaw interesujące miejsca w oprogramowaniu do obrazowania.Teraz rozpocznij obrazowanie, gdy wszystkie punkty są ostre, a kanały są zoptymalizowane. Rejestruj obrazy fitzy, trixi i DIC co minutę przez sześć godzin. Jest to najbardziej krytyczny etap procedury.Prawidłowe ustawienie mikroskopu wymaga czasu. Jeśli filmy są niedoświetlone lub prześwietlone lub jeśli są nieostre, nie będą nadawały się do użytku i eksperyment będzie musiał zostać powtórzony. Ten reprezentatywny film pokazuje wychwyt Candida albicans przez mysią linię komórkową makrofagów J 7 74 0,1.Podczas sześciogodzinnego eksperymentu z mikroskopią wideo na żywo na komórkach, Candida albicans w kolorze zielonym został wybarwiony przy użyciu barwnika fitsi wrażliwego na pH, który został wygaszony podczas zakwaszania fagosomu makrofagowego. Potwierdzając w ten sposób, kiedy candida została zinternalizowana, kwaśne przedziały makrofagów zostały zabarwione czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym. Zwróć uwagę na różnice w liczbie Candida albicans spożytych przez poszczególne makrofagi J 7 74 0,1 w tym eksperymencie, 82% makrofagów J 7 74 0,1 pochłonęło co najmniej jedną komórkę Candida albican w ciągu sześciu godzin.Średnia liczba Candida albicans pobranych na makrofagi wynosiła 3,4, ale co ciekawe, makrofagi mogły połknąć do 16 komórek grzybów. Dane pozwalają na obserwację makrofagów i Candida albicans przed i w trakcie rozpoznawania i wychwytu. Candida albicans hyer może nadal rosnąć w makrofagach, co może powodować lizę makrofagów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty z mikroskopią wideo na żywo przy użyciu Candida albicans na linii komórkowej podobnej do mikrofagów J 7 7 4 0,1. Powinieneś być w stanie skonfigurować nocne hodowle obu typów komórek i wykonać test fagocytozy, który umożliwi specyficzną dla danego etapu analizę rozpoznawania migracji i pochłaniania, a także dojrzewania fagosomu.

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mikroskopia wideo żywych komórek połknięcia patogennych grzybów

Przedstawiamy sposób wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do obserwacji dynamiki granulocytów neutrofilnych w zainfekowanych płucach podczas fagocytowania patogenów lub wytwarzania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs).

Bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia sieciy z neutrofili (NET) w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii dwufotonowej

Opisano metodę indywidualnego wyboru, manipulowania i obrazowania żywych patogenów przy użyciu pułapki optycznej sprzężonej z mikroskopem dyskowym (spinning disk). Pułapka optyczna zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad organizmami i pozwala na umieszczenie ich w bezpośrednim sąsiedztwie komórek gospodarza. Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na rejestrację dynamicznych interakcji międzykomórkowych przy minimalnym zaburzeniu stanu komórek.

Wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Tutaj pokazujemy, jak cytometria obrazowa może być wykorzystana do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza w hodowli.  Ta technika może być używana jako alternatywa dla wyliczania CFU.

Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

Opisujemy, jak wizualizować interakcje makrofagów-C. neoformansów (Cn) w czasie rzeczywistym, ze szczególnym naciskiem na proces egzocytozy nielitycznej za pomocą cyfrowej mikroskopii świetlnej. Za pomocą tej techniki można badać indywidualnie zakażone makrofagi w celu ustalenia różnych aspektów tego zjawiska.

Wizualizacja egzocytozy nielitycznej Cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej

Tutaj opisujemy technikę opartą na mikroskopie, aby wizualizować i kwantyfikować wczesne kaskady zdarzeń podczas fagocytozy patogenów, takich jak grzyby Candida albicans i cząstki większe niż 0,5 μm, w tym kulki pokryte zymozanem i IgG.

Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy

Tutaj opisujemy protokół oceny aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus w połączeniu z mikroskopią wideo żywych komórek i cytometrią przepływową. Wygenerowane dane dostarczają informacji na temat interakcji między komórką gospodarza a Aspergillus, takich jak działanie grzybobójcze, fagocytoza, migracja komórek i hamowanie wzrostu grzybów.

Obrazowanie na żywo aktywności przeciwgrzybiczej przez ludzkie pierwotne neutrofile i monocyty w odpowiedzi na A. fumigatus

Defensyny roślinne odgrywają ważną rolę w obronie roślin przed patogenami. Aby skutecznie wykorzystać te peptydy przeciwgrzybicze jako środki przeciwgrzybicze, zrozumienie ich sposobów działania (MOA) ma kluczowe znaczenie. W tym miejscu opisano metodę obrazowania żywych komórek w celu zbadania krytycznych aspektów MOA tych peptydów.

Obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Mechanizm związany z fagocytozą w zakażeniu Leishmania pozostaje słabo poznany. W tym miejscu opisujemy metody oceny wczesnych zdarzeń zachodzących podczas interakcji Leishmania z komórkami gospodarza.

Badanie fagocytozy Leishmania za pomocą mikroskopii konfokalnej

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Poznaj metodę mikroskopii wideo żywych komórek do badania fagocytozy Candida albicans przez makrofagi. Technika umożliwia analizę etapów migracji, rozpoznawania i wchłaniania patogenu w czasie rzeczywistym.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Przeglądaj więcej filmów