Name: Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Naucz się izolować komórki macierzyste raka CD133+ z czerniaka przy użyciu sortowania magnetycznego MACS. Ta metoda pozwala uzyskać czyste populacje komórek do badań nad leczeniem spersonalizowanym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują prof. M. Dietelowi i Dirkowi Schumacherowi za wsparcie tej pracy i krytyczną lekturę rękopisu.
Badania prowadzące do tych wyników otrzymały wsparcie od Wspólnego Przedsięwzięcia Inicjatywy Innowacyjnych Leków na podstawie umowy o grant nr 115234, której środki składają się z wkładu finansowego z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) oraz wkładu rzeczowego firm EFPIA. Prace te były również wspierane przez Berliner Krebsgesellschaft (BKG).

Ogólny schemat eksperymentu, w tym przygotowanie pierwotnych pojedynczych komórek z tkanki nowotworowej, charakterystyka hodowli komórek pierwotnych, zubożenie fibroblastów i magnetyczne sortowanie komórek CD133+ i CD133- czerniaka jest pokazany na rysunku 1.
1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Sprawdź, czy nie ma zgody etycznej, zanim rozważysz kolejne kroki.</li>
	<li>Przygotować probówkę o pojemności 50 ml ze sterylnym PBS uzupełnionym 1% stężeniem końcowym penicyliny-streptomycyny i przekazać do zespołu chirurgicznego.</li>
	<li>Zorganizuj szybki transport tkanki nowotworowej z chirurgii do laboratorium hodowli komórkowej w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pojedynczych komórek pierwotnego czerniaka z tkanki nowotworowej
<ol>
	<li>Wszystkie kroki wykonuj w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Przed wycięciem guza należy przygotować mieszaninę dysocjacyjną. Wymagane jest 10 ml mieszanki dysocjacyjnej na 2-4 g tkanki. Mieszanina może być użyta natychmiast lub przechowywana w 10 ml porcji w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór zawierający 150 mM chlorku sodu. Mieszaj za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny. W razie potrzeby sterylny roztwór chlorku sodu przesączyć przy użyciu filtra 0,22 μm.</li>
		<li>Odważyć DNazę I i przygotować roztwór zawierający 10 mg/ml DNazy I w 150 mM chlorku sodu. Mieszaj, odwracając, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Przygotować roztwór zawierający 100 mg/ml kolagenazy dożylnej w PBS. Mieszaj, odwracając, aż roztwór będzie klarowny. Podwielokrotności roztworu kolagenazy można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę dysocjacyjną o końcowym stężeniu 1% penicyliny-streptomycyny, 1 mg/ml kolagenazy IV i 0,1 mg/ml DNazy I w pożywce Quantum 263. Wymieszaj za pomocą wiru. Opcjonalnie: w przypadku stosowania tkanki czerniaka pochodzącej ze skóry dodać roztwór amfoterycyny B do mieszaniny dysocjacyjnej do końcowego stężenia 1,5 μg/ml amfoterycyny B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podgrzej wymagane ilości mieszaniny dysocjacyjnej, PBS i pożywki Quantum 263 do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Umieść tkankę nowotworową na sterylnej szalce Petriego. Odessać nadmiar roztworu z tkanki i dodać 500 μl mieszaniny dysocjacyjnej. Zmiel guz na małe kawałki o wielkości 2-4 mm za pomocą świeżych, sterylnych skalpeli.</li>
	<li>Przenieś 2-4 g zmielonej tkanki nowotworowej do probówki GentleMACS C zawierającej 5 ml mieszanki dysocjacyjnej. Opłucz szalkę Petriego dodatkowymi 4,5 ml mieszaniny dysocjacyjnej i dodaj pozostałe fragmenty tkanek do probówki gentleMACS C.</li>
	<li>Zamknij rurkę gentleMACS C i przymocuj ją do góry nogami na tulei dysocjatora gentleMACS. Uruchom program gentleMACS "h_tumor_01".</li>
	<li>Odłączyć probówkę gentleMACS C od dysocjatora i inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciągłym obrocie za pomocą rotatora probówki MACSmix przy najwyższej prędkości obrotowej (12 obr./min) lub obracając probówkę ręcznie co 5 minut w celu ponownego zawieszenia osadzonych fragmentów tkanki.</li>
	<li>Przymocuj rurkę C gentleMACS do góry nogami na tulei dysocjatora gentleMACS i uruchom program gentleMACS "h_tumor_02".</li>
	<li>Odłączyć probówkę gentleMACS C od dysocjatora i inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciągłym obrocie za pomocą rotatora probówki MACSmix przy najwyższej prędkości obrotowej (12 obr./min) lub obracając probówkę ręcznie co 5 minut w celu ponownego zawieszenia osadzonych fragmentów tkanki.</li>
	<li>Przymocuj rurkę C gentleMACS do góry nogami na tulei dysocjatora gentleMACS i uruchom program gentleMACS "h_tumor_03".</li>
	<li>Odłączyć probówkę gentleMACS C od dysocjatora, ponownie zawiesić próbkę i nanieść zawiesinę komórek na sitko o wielkości 70 μm umieszczone na probówce o pojemności 50 ml. Jeśli dojdzie do zatkania filtra, należy mieszać zawiesinę komórek za pomocą sterylnej końcówki filtra, aż cała zawiesina zostanie przepuszczona.</li>
	<li>Przepłukać sitko komórkowe 5 ml pożywki Quantum 263.</li>
	<li>Opcjonalnie: jeśli w filtrze pozostały jeszcze fragmenty tkanek, należy je ponownie zawiesić w pożywce Quantum 263 i umieścić w odpowiednim naczyniu do hodowli komórkowych. Inkubować fragmenty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Odrzucić sitko do komórek i zamknąć probówkę o pojemności 50 ml z zawiesiną strawionych komórek. Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 300 x g i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Opcjonalnie: jeśli osad komórkowy wydaje się czerwony z powodu dużej ilości erytrocytów, przygotuj 1x roztwór do lizy czerwonych krwinek, rozcieńczając 10x roztwór 1:10 w wodzie podwójnie destylowanej, ponownie zawieś osad komórkowy w 500 μl PBS i dodaj 5 ml 1x roztwór do lizy czerwonych krwinek. Wirować przez 5 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wirować przez 5 minut przy 300 x g i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki nowotworowe za pomocą Quantum 263 i wysiać komórki w odpowiedniej kolbie do hodowli komórek. Hoduj komórki nowotworowe w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i rutynowo pasażuj komórki, gdy osiągną 80% konfluencji.</li>
</ol>
3. Charakterystyka pierwotnej hodowli komórkowej i zubożenia fibroblastów
<ol>
	<li>Analizuj fenotypowo pierwotną hodowlę komórkową za pomocą mikroskopu.</li>
	<li>Zbierz niewielką ilość (0,5 x 106 komórek) pierwotnej hodowli komórkowej i przeprowadź RT-PCR ze starterami dla genów markerów komórek nowotworowych, czerniaka, komórek macierzystych i zrębu. Najważniejszymi genami do analizy są CD90 (marker fibroblastów), TYR (marker czerniaka/melanocytów), CD133 (marker rakowych komórek macierzystych), CD83 (marker dojrzałych komórek dendrytycznych) i gen porządkowy (np. HPRT lub GAPDH).</li>
	<li>Jeśli analiza mikroskopowa i wysoka ekspresja CD90 podczas RT-PCR ujawniły wysokie zanieczyszczenie pierwotnej hodowli czerniaka fibroblastami, należy zubożyć fibroblasty za pomocą mikrokulek antyfibroblastów i kolumn D firmy Miltenyi.</li>
</ol>
4. Magnetyczne sortowanie komórek czerniaka CD133+ i CD133- za pomocą kolumn LS
<ol>
	<li>Przygotuj bufor MACS zawierający 2 mM EDTA i 5% FCS w PBS. Wymieszać przez odwrócenie i sterylny bufor filtratu za pomocą jednostki filtrującej Steritop-GP 0,22 μm. Schłodzić bufor do temperatury 4-8 °C i odgazować przed użyciem.</li>
	<li>Wstępnie podgrzane Accutase, PBS i Quantum 263 medium do 37 °C.</li>
	<li>Umyj 80% zlewających się komórek za pomocą PBS. Dodać odpowiednią ilość Accutase i inkubować, aż komórki oderwą się od powierzchni hodowli. Zebrać komórki w probówce o pojemności 50 ml za pomocą pożywki Quantum 263.</li>
	<li>Określ liczbę komórek i odwiruj wymaganą liczbę komórek (Zgodnie z protokołem Miltenyi można załadować maksymalną liczbę 2x 109 komórek na kolumnę LS. Należy określić optymalne liczby specyficzne dla linii komórkowej, które mogą być znacznie niższe.) przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4-8 °C. Całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić maksymalnie 1x 108 komórek z buforem MACS 350 μl (w przypadku większej liczby komórek należy odpowiednio zwiększyć wszystkie następujące objętości bufora MACS, odczynnika blokującego FcR, CD133/1-Biotyny i mikrokulek anty-biotyny).</li>
	<li>Dodać 100 μl odczynnika blokującego FcR.</li>
	<li>Dodać 50 μl CD133/1-Biotyny. Dobrze wymieszać za pomocą wiru i inkubować w temperaturze 4-8 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 10 ml buforu MACS i odwirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4-8 °C. Całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Powtórzyć etap prania (4.8)</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą buforu MACS o pojemności 400 μl.</li>
	<li>Dodaj 100 μl mikrokulek antybiotyny. Dobrze wymieszać za pomocą wiru i inkubować w temperaturze 4-8 °C przez 15 minut.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj separator MACS do separacji magnetycznej. Podłącz QuadroMACS do MACS Separator Multi Stand. Włóż wymaganą liczbę kolumn LS ze skrzydłami kolumny do przodu w polu magnetycznym QuadroMACS. Umieść filtr wstępnej separacji (z siatką nylonową 30 μm) w każdej kolumnie LS i odpowiednią probówkę zbiorczą (15 ml lub 50 ml) pod każdą kolumną. Przygotować filtr i kolumnę, przepłukując 3 ml buforu MACS. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 10 ml buforu MACS i odwirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4-8 °C. Całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu MACS o pojemności 500 μl i nałożyć zawiesinę komórek na kolumnę LS za pomocą filtra wstępnej separacji.</li>
	<li>Przemyć trzykrotnie 3 ml buforu MACS na kolumnę. Dodaj nowy bufor tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty.</li>
	<li>Zebrany ściek całkowity zawiera nieznakowaną frakcję komórkową CD133.</li>
	<li>Wyrzuć filtr wstępnej separacji, wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na odpowiedniej probówce zbiorczej.</li>
	<li>Nałożyć 5 ml buforu MACS. Natychmiast wypłukać oznakowane ogniwa CD133+, mocno wciskając tłok do kolumny.</li>
	<li>Aby zwiększyć czystość frakcji ujemnej, należy nałożyć zawiesinę komórek na nową zrównoważoną kolumnę LS umieszczoną w QuadroMACS. Ścieki zawierają frakcję CD133-.</li>
	<li>Odrzuć kolumny.</li>
</ol>

<ol><li>Garibyan, L., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+sunlight+causes+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">How sunlight causes melanoma.</a> Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).</li>
<li>Radovic-Kovacevic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+analysis+in+patients+with+cutaneous+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Srp.+Arh.+Celok.+Lek%22%5BJournal%5D)">Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma.</a> Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).</li>
<li>Lens, M. B., Eisen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+chemotherapy+in+the+treatment+of+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma.</a> Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).</li>
<li>Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma%3A+an+evidence-based+overview+of+the+state-of-the-art+in+daily+routine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Eur.+Acad.+Dermatol.+Venereol%22%5BJournal%5D)">Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine.</a> J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).</li>
<li>Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEigentler%2C+TK+%22Der+Onkologe%22">Der Onkologe</a>. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).</li>
<li>Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemische+Therapie+des+metastasierten+Melanoms%3A+Ergebnisse+randomisierter+Studien+der+letzten+zehn+Jahre%5BTitle%5D)+AND+%22Deutsches+%C3%84rzteblatt%22%5BJournal%5D)">Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre.</a> Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).</li>
<li>Chapman, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+with+vemurafenib+in+melanoma+with+BRAF+V600E+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.</a> N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).</li>
<li>Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines: friend or foe.</a> Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).</li>
<li>Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+differences+among+MCF-7+human+breast+cancer+cell+lines+from+different+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).</li>
<li>Hiorns, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA+expression+and+genomic+DNA+content+acquired+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture.</a> Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).</li>
<li>Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-contamination+of+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-contamination of cells in culture.</a> Science. 212, 446-452 (1981).</li>
<li>MacLeod, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+intraspecies+cross-contamination+of+human+tumor+cell+lines+arising+at+source%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source.</a> Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).</li>
<li>Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cancer+cell+lines%3A+fact+and+fantasy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human cancer cell lines: fact and fantasy.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).</li>
<li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Neural+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).</li>
<li>Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermis-derived+stem+cells%3A+a+source+of+epidermal+melanocytes+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
<li>Ieta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+characteristics+of+tumor-initiating+cells+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer.</a> Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).</li>
<li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133%2B+cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).</li>
<li>Monzani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+contains+CD133+and+ABCG2+positive+cells+with+enhanced+tumourigenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential.</a> Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).</li>
<li>Gedye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer%2Ftestis+antigens+can+be+immunological+targets+in+clonogenic+CD133%2B+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy+%3A+CII%22%5BJournal%5D)">Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).</li>
<li>Kobari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+cell+selection+is+an+alternative+to+CD34%2B+cell+selection+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hematother.+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).</li>
<li>Quirici, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+expansion+of+endothelial+cells+from+human+bone+marrow+CD133%28%2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells.</a> Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).</li>
<li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone%2C+but+on+embryonic+neural+stem+cells%2C+ependymal+cells%2C+and+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).</li>
<li>Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbody+and+primary+cilium+of+neural+progenitors+release+extracellular+membrane+particles+enriched+in+the+stem+cell+marker+prominin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1.</a> J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).</li>
<li>Florek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+neural+and+hematopoietic+stem+cell+marker%2C+is+expressed+in+adult+human+differentiated+cells+and+certain+types+of+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer.</a> Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+Mouse+Lymph+Nodes+Using+Miltenyi+MACS+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification.</a> J. Vis. Exp. (9), e409(2007).</li>
<li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Immune+Cells+from+Primary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Immune Cells from Primary Tumors.</a> J. Vis. Exp. (64), e3952(2012).</li>
<li>Mollamohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+cryopreservation+method+for+feeder-free+dissociated+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W celu usunięcia zanieczyszczeń erytrocytami z osadu komórek nowotworowych zdecydowanie zalecamy użycie roztworu do lizy czerwonych krwinek firmy Miltenyi. Zaletą lizy erytrocytów w porównaniu z tradycyjnym wirowaniem w gradiacji gęstości Ficoll jest to, że jest szybsze i prostsze. Ponadto unika się zanieczyszczeń Ficollem lub czerwonymi krwinkami i utraty komórek nowotworowych. Kiedy obserwuje się wzrost fibroblastów w pierwotnej hodowli komórkowej, należy je natychmiast usunąć, ponieważ zwykle przerastają one komórki n...

Złośliwe czerniaki skóry są najmniej powszechnym, a jednocześnie najbardziej śmiertelnym rodzajem raka skóry. Ze względu na rosnącą zachorowalność, wysoki stopień złośliwości i szybkie rozprzestrzenianie się, czerniak stanowi obecnie 75% zgonów związanych ze złośliwymi nowotworami skóry1,2. Oprócz chirurgicznego wycięcia guza pierwotnego, chemioterapia, radioterapia, immunoterapia oraz skojarzona chemio- i immunoterapia czerniaka z przerzutami są najnowocześniejszymi strategiami leczenia czerniaka3,4. Jednak czerniak złośliwy charakteryzuje się słabą odpowiedzią na chemioterapeutyki (5-12%)5,6 i tylko te 50-70% pacjentów z czerniakiem z mutacją genu BRAF V600E korzysta z obiecujących nowych terapii celowanych w ramach leczenia wemurafenibem7 Aby poprawić całkowite przeżycie, potrzebne jest znacznie lepsze zrozumienie mechanizmów nowotworzenia czerniaka.
Do badania tych mechanizmów w przeszłości używano dobrze znanych, komercyjnie dostępnych linii komórkowych. Nowsze podejścia do badania molekularnych zdarzeń inicjacji i progresji raka wykorzystują pierwotne hodowle pochodzące bezpośrednio z tkanki nowotworowej - strategia ta przynosi wielorakie korzyści: badacz ma pełną kontrolę nad selekcją pacjenta i tkanki. Pobrane próbki komórek uzyskanych z fachowo dobranej tkanki nowotworowej przypominają guz z całą jego niejednorodnością i danymi kontrolnymi pacjenta, a szczegółowa patologia jest dostępna, aby umożliwić porównanie cech hodowli z cechami oryginalnego guza8.
Dla kontrastu, użycie ustalonych linii komórkowych jako odpowiednich systemów modelowych w badaniach nad rakiem jest dyskutowane kontrowersyjnie. Już w 1987 roku Osborne i współpracownicy opisali znaczące różnice biologiczne między liniami komórkowymi ludzkiego raka piersi MCF-7 z różnych laboratoriów9. Ta rozległa niestabilność genomu i zmienność w ekspresji RNA podczas subhodowli została potwierdzona przez Hiorns i wsp. i dostarczyła danych wspierających dowody na to, że linie komórkowe ewoluują w hodowli, osłabiając w ten sposób bezpośrednie znaczenie takich ustalonych kultur jako modeli ludzkiego raka10.
Innym ważnym czynnikiem, który przez lata był w dużej mierze ignorowany, jest ryzyko zanieczyszczenia lub przerostu kultur z niepowiązanymi 'fałszywymi' komórkami, co po raz pierwszy zostało podkreślone ponad dwadzieścia lat temu, pokazując, że duża liczba linii komórkowych została skażona przez komórki HeLa8,11. Błędna interpretacja danych z "fałszywych" linii komórkowych pojawiła się ostatnio ponownie w literaturze. Korzystając z połączenia profilowania DNA i cytogenetyki molekularnej, MacLeod i in. ujawnili, że spośród 252 nowych linii komórek ludzkich pochodzących z nowotworów zdeponowanych w Niemieckiej Kolekcji Mikroorganizmów i Kultur Komórkowych (DSMZ), prawie 18% okazało się być wewnątrzgatunkowymi lub międzygatunkowymi zanieczyszczeniami krzyżowymi12,13.
Aby uniknąć tych problemów i skorzystać z zalet wymienionych powyżej, zdecydowaliśmy się stworzyć niskopasażowe linie komórkowe czerniaka ze świeżo wyciętych przerzutów.
Solidne technologie separacji i analizy komórek wymagają wytwarzania preparatów jednokomórkowych, jednocześnie ograniczając śmierć komórek i niszczenie charakterystycznych białek powierzchniowych. Laboratoryjnym instrumentem do automatycznej dysocjacji tkanek na zawiesiny jednokomórkowe jest dysocjator gentleMACS firmy Miltenyi. W połączeniu z probówkami GentleMACS C i zoptymalizowanymi roztworami dysocjacyjnymi uzyskuje się skuteczną i delikatną dysocjację tkanki nowotworowej w systemie zamkniętym przy jednoczesnym zachowaniu epitopów antygenowych i zmniejszeniu utraty komórek. Urządzenie oferuje zoptymalizowane, wstępnie ustawione programy do różnych specyficznych zastosowań i gwarantuje standaryzowane przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z tkanki czerniaka14.
Ostatnie raporty ujawniły, że większość nowotworów zawiera małą subpopulację tak zwanych rakowych komórek macierzystych (CSC), które wykazują wyłącznie zdolność do inicjowania i samoodnawiania się nowotworu. Identyfikacja komórek macierzystych wytwarzających melanocyty w skórze właściwej doprowadziła do hipotezy, że komórki te mogą być źródłem rakowych komórek macierzystych (CSC) w czerniaku, ponieważ ekspozycja na promieniowanie UVA może przygotować te komórki do złośliwej transformacji15. Wynikiem takiej zmiany genetycznej byłyby komórki, które zawierają kombinację cech guza i komórek macierzystych.
Jednym z kluczowych wskaźników proponowanych do reprezentowania subpopulacji CSC w czerniaku jest CD13316-20. CD133 (znany również jako Prominin 1), członek transbłonowych glikoprotein pentaspanu, ulega ekspresji w krwiotwórczych komórkach macierzystych, śródbłonkowych komórkach progenitorowych, neuronalnych i glejowych komórkach macierzystych21-23. Ekspresja CD133 jest skorelowana z asymetrycznym podziałem komórki24, a glikozylowany epitop CD133 okazał się być regulowany w dół po różnicowaniu komórki25. Ostatnio wykazano, że komórki czerniaka CD133 + mają zdolność do samoodnawiania się i inicjacji guza19,20.
Aby zbadać funkcję CSC domniemanego czerniaka CD133+, zmodyfikowaliśmy i zoptymalizowaliśmy system Magnetyczno-Aktywowanego Sortowania Komórek (MACS) firmy Miltenyi Biotech, aby uzyskać wysoce wzbogacone i żywotne populacje komórek CD133+ i CD133-.
Magnetyczna separacja komórek oparta na koralikach pozwala na wybór negatywny, jak pokazano przez Matheu i wsp.26 lub selekcja pozytywna, jak pokazujemy tutaj. Podczas selekcji pozytywnej określony typ komórek docelowych, np. komórki wykazujące ekspresję CD133, jest znakowany magnetycznie za pomocą MicroBeads, superparamagnetycznych cząstek o długości 50 nm, które są sprzężone z wysoce specyficznymi przeciwciałami przeciwko określonemu antygenowi powierzchniowemu komórki. Podczas separacji znakowane magnetycznie komórki są zatrzymywane w kolumnie w polu magnetycznym separatora, podczas gdy nieznakowane komórki przepływają przez. Po etapach mycia kolumna jest usuwana z pola magnetycznego separatora, a komórki docelowe są eluowane z kolumny. Kolumny LS lub MS używane podczas selekcji pozytywnej dają frakcje znakowanych i nieznakowanych komórek o wysokiej czystości. Z kolei kolumny LD, używane do selekcji negatywnej, skutkują nieco niższą czystością znakowanej frakcji. Ze względu na gęstsze upakowanie ich matrycy, natężenie przepływu w tych kolumnach jest niższe, co powoduje większe ryzyko uwięzienia nieoznakowanych komórek w kolumnie. Kolumny LD powinny być zatem używane tylko do rygorystycznego uszczuplania niepożądanej subpopulacji komórek. Selekcję pozytywną można przeprowadzić przez bezpośrednie (przeciwciało sprzężone z mikrokulkami) lub pośrednie znakowanie magnetyczne (inkubacja z mikrokulkami po inkubacji z przeciwciałem pierwotnym). Dostępne są specyficzne mikrogranulki MACS do pozytywnej selekcji wielu typów komórek pierwotnych komórek nowotworowych, takich jak prostata lub czerniak27.

<table><tbody><tr><td colspan="4">odczynnik</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B roztwór 250 &mu; g/ml w wodzie dejonizowanej</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A2942-50ml</td><td></td></tr><tr><td>mikrogranulki antyfibroblastów</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>CD133/1 (W6B3C1)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-395</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem GmbH</td><td>A3778.0050</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS bez Ca, Mg </td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego odwadniana (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>E-7889</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Pośredni zestaw mikrokulek CD133 dla ludzi</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-091-895</td><td>Zawiera: CD133/1(AC133)-Biotyna, mikrokulki anty-biotyny i odczynnik blokujący FcR</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, płyn (100x)</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Quantum 263 </td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>U15-815</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do lizy czerwonych krwinek (10x)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cell sitko (70 &mu; m)</td> <td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Rurki</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>dysocjator gentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Separator MACS Multi Stand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny separacyjne MACS 25 Kolumny LS </td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck KGaA</td><td>567440-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do wstępnej separacji</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td> Separator QuadroMACS </td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe Rotilabo (0,22 &mu; m, PES)</td><td>Carl Roth GmbH Co. KG</td><td>P668.1</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Steritop-GP 500 ml</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka cd133+ z czerniaka

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Pomimo dostępnych obecnie ulepszonych metod leczenia czerniaka, pacjenci z zaawansowanym czerniakiem złośliwym nadal mają złe rokowania co do wolnego od progresji i całkowitego przeżycia. W związku z tym badania translacyjne muszą dostarczyć dalszych dowodów molekularnych, aby udoskonalić celowane terapie czerniaków złośliwych. W przeszłości mechanizmy onkogenne związane z czerniakiem były szeroko badane w ustalonych liniach komórkowych. Na drodze do bardziej spersonalizowanych schematów leczenia opartych na indywidualnych profilach genetycznych proponujemy stosowanie linii komórkowych pochodzących od pacjentów zamiast ogólnych linii komórkowych. Wraz z wysokiej jakości danymi klinicznymi, zwłaszcza dotyczącymi obserwacji pacjenta, komórki te będą miały zasadnicze znaczenie dla lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za progresję czerniaka.
Tutaj informujemy o założeniu pierwotnych kultur czerniaka z wypreparowanej świeżej tkanki nowotworowej. Procedura ta obejmuje rozdrobnienie i dysocjację tkanki na pojedyncze komórki, usunięcie zanieczyszczeń erytrocytami i fibroblastami, a także hodowlę pierwotną i wiarygodną weryfikację pochodzenia komórek z czerniaka.
Ostatnie raporty ujawniły, że czerniaki, podobnie jak większość nowotworów, zawierają małą subpopulację rakowych komórek macierzystych (CSC), które wydają się wyłącznie napędzać inicjację guza i postęp w kierunku stanu przerzutowego. Jednym z kluczowych markerów identyfikacji i izolacji CSC w czerniaku jest CD133. Aby wyizolować CSC CD133+ z pierwotnych kultur czerniaka, zmodyfikowaliśmy i zoptymalizowaliśmy procedurę sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) z Miltenyi, co skutkuje wysoką czystością sortowania i żywotnością CSC CD133+ i CD133- luzem, które można następnie hodować i analizować funkcjonalnie.

Przygotowanie pojedynczych komórek z tkanki nowotworowej
Rycina 2 przedstawia wyciętą przerzut do węzła chłonnego u pacjenta z czerniakiem w stadium zaawansowanym przed (A) i po (B) mechanicznym rozdrobnieniu na fragmenty o wielkości 2-4 mm. Po dysocjacji enzymatycznej tkanki i filtracji przez nylonowy sitko o oczkach 70 μm, komórki odwirowano, a nadsącz usunięto. Na tym etapie zaobserwowano wysokie zanieczyszczenie erytrocytami, na co wskazuje czerwony kolor osadu komórkowego na...

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Ogólnym celem tej procedury jest utworzenie hodowli komórkowych pochodzących od pacjentów z czerniakiem złośliwym oraz izolacja domniemanych komórek macierzystych nowotworu wykazujących pozytywną ekspresję CD 1 33. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie pierwotnych pojedynczych komórek czerniaka z tkanki guza po usunięciu erytrocytów z osadu komórkowego. W razie potrzeby należy scharakteryzować pierwotną hodowlę komórkową i usunąć fibroblasty.Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie magnetycznego sortowania komórek czerniaka CD 1 33 pozytywnych i CD 1 33 negatywnych. W efekcie ta zoptymalizowana procedura max stanowi doskonałą metodę pozyskiwania silnie wzbogaconych i żywotnych populacji komórek CD 1 33 pozytywnych i CD 1 33 negatywnych. Metodę tę zastosowaliśmy najpierw do walidacji danych insco w medycynie personalizowanej, w której dążymy do przewidzenia odpowiedzi pacjentów onkologicznych na lek, a do której celu nie można wykorzystać żadnej dostępnej komercyjnie linii komórkowej.Główną zaletą tej techniki jest szybki dostęp do komórek CD 1 33 dodatnich, które są domniemanymi komórkami macierzystymi nowotworu w czerniaku złośliwym. Technikę zaprezentuje Catherine Davis, technik laboratoryjny z mojego laboratorium. Przenieś świeżo wyizolowaną tkankę nowotworową z bloku operacyjnego do laboratorium hodowli tkankowych w sterylnym PBS zawierającym 1% penicyliny i streptomycyny.Przenieś tkankę guza do sterylnej szalki Petriego i odessij nadmiar roztworu. Następnie dodaj 500 µL mieszaniny dysocjującej i posiekaj guz na małe kawałki o wielkości od dwóch do czterech milimetrów, używając nowych sterylnych skalpeli. Teraz przenieś od dwóch do czterych gramów posiekanej tkanki guza do probówki GentleMax C zawierającej 5 mL mieszaniny dysocjującej.Opłucz szalkę Petriego dodatkowymi 4,5 ml mieszaniny dysocjującej i przenieś pozostałe fragmenty tkanki do probówki gentle max C. Zamknij probówkę, zamocuj ją do końca dysocjatora w pozycji odwróconej i uruchom program H tumor zero one. Następnie inkubuj próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy ciągłym obracaniu z maksymalną prędkością pracy.Teraz przymocuj probówkę do góry dnem do tulei urządzenia do dysocjacji i uruchom program H tumor zero two. Następnie inkubuj próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy ciągłym obrocie z prędkością 12 RPM. Następnie uruchom program gentle max H tumor zero three.Resuspend próbkę i przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm do probówki o pojemności 50 ml. W razie potrzeby wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą sterylnego końcówki filtra, aż cała zawiesina zostanie przefiltrowana. Przepłucz sitko komórkowe za pomocą 5 ml pożywki quantum 2 6 3, odwiruj zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 300 ×g i odlej nadsącz.Jeśli osad komórkowy wydaje się czerwony z powodu dużej ilości tkanek i śluzu, należy przemyć komórki krwi zgodnie z instrukcją zawartą w towarzyszącym protokole tekstowym. Ponownie odwiruj komórki nowotworowe w ilości 2 6 3 i zasiaj kulturę, rutynowo pasażując komórki, gdy osiągną 80% konfluencji. Przeanalizuj fenotypowo pierwotną kulturę komórek za pomocą mikroskopu.Następnie pobierz niewielką ilość pierwotnej hodowli komórkowej w celu ekstrakcji RNA zgodnie z procedurą syntezy cDNA i przeprowadź R-T-P-C-R z użyciem starterów dla genów markerowych czerniaka nowotworowego, komórek macierzystych i komórek zdomy. Najważniejszymi genami do analizy są marker fibroblastów CD 90, marker czerniaka i melanocytów, marker nowotworowych komórek macierzystych CD 1 33, marker dojrzałych komórek dendrytycznych CD 83 oraz gen housekeepingowy, taki jak HPRT lub GAPDH. Jeśli połączona analiza mikroskopowa i R-T-P-C-R wykazała wysoką kontaminację fibroblastami w pierwotnej hodowli czerniaka, przejdź do usuwania fibroblastów przy użyciu przeciwciał anty-fibroblast, mikrokulek i kolumn LD.Komórki przy 80% konfluencji przemyć podgrzanym wcześniej PBS, dodać odpowiednią ilość Accutane i inkubować do momentu odklejenia się komórek od powierzchni hodowlanej. Zebrać komórki w medium quantum 2 6 3 i przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Policzyć komórki, a następnie odwirować wymaganą liczbę komórek przez pięć minut przy 300 G w temperaturze od czterech do ośmiu °C.Całkowicie odessać supernatant i resuspendować. Zawiesić do 1 × 10⁸ komórek w maksymalnie 350 µL buforu, dodać 100 µL odczynnika blokującego Fc oraz 50 µL CD133.1 biotyny.Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Przemyć komórki 10 ml buforu max, a następnie odwirować przez pięć minut przy 300 g w temperaturze od 4 do 8 °C. Po drugim przemyciu całkowicie odessać nadsącz.Resuspender osad komórkowy w 400 µL buforu max. Dodać 100 µL mikrokulek anty-biotynowych, dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze od 4 do 8 °C przez 15 minut. W międzyczasie, aby przygotować separator max do separacji magnetycznej, zamocować quadro max do wielopozycyjnego statywu separatora max.Włóż wymaganą liczbę kolumn LS, ustawiając skrzydełka kolumny z przodu, w polu magnetycznym urządzenia quadro max. Do każdej kolumny LS włóż filtr do wstępnej separacji oraz odpowiednią probówkę zbiorczą. Przepłucz filtr i kolumnę trzema mililitrami buforu max, a następnie odrzuć przelywat.Po przemyciu komórek w buforze max, zgodnie z wcześniejszym opisem, resuspenduj komórki w 500 µL buforu max i nanieś zawiesinę komórkową na przygotowaną kolumnę LS. Przemyj trzy razy, używając trzech mL buforu max na kolumnę. Zbierz cały effluent frakcji komórek negatywnych cd 1 33 nieoznaczonych.Następnie należy wyrzucić filtr do wstępnej separacji. Wyjąć kolumnę z separatora i umieścić ją na odpowiedniej probówce do zbierania frakcji. Nalać 5 mL buforu maksymalnego (max buffer).Natychmiast wypłucz komórki wyznakowane jako CD 1 33 pozytywne, mocno wciskając tłok do kolumny, aby zwiększyć czystość frakcji negatywnej. Nanieś zawiesinę komórkową na nową, równoważoną kolumnę LS i zbierz eluat zawierający frakcję CD 1 33 negatywną. Ta wycięta przerzut do węzła chłonnego została pobrana od pacjenta z czerniakiem w stadium zaawansowanym.Po mechanicznej i enzymatycznej dysocjacji tkanki osad przefiltrowanych komórek zawierał wysoką kontaminację erytrocytami. Następujące po tym usunięcie krwinek czerwonych doprowadziło do uzyskania osadu komórkowego o jasnobrązowym kolorze. Komórki te hodowano w medium quantum 2 6 3, a następnie wykonano R-T-P-C-R dla markerów melanocytów i melanomy, fibroblastów, komórek dendrytycznych oraz komórek macierzystych.Geny wykorzystano do weryfikacji, czy komórki pochodzą z guza, a nie z otaczającego zrębu. Dorosłe melanocyty posłużyły jako normalne komórki kontrolne dla tear, a linia komórkowa raka zarodkowego N-C-C-I-T jako kontrola pozytywna dla markera komórek macierzystych CD 1 33. Dane te wykazują, że niektóre komórki pierwotne są rzeczywiście pozytywne pod kątem tear i w związku z tym mają pochodzenie melanocytarne.Kultura jest również negatywna pod kątem CD 83, markera dojrzałych komórek dendrytycznych. Co ciekawe, ta linia komórkowa czerniaka wykazuje ekspresję CD 1 33, genu kluczowego dla asymetrycznego podziału komórek i znanego markera komórek macierzystych nowotworu. Przedstawiona tutaj mikrofotografia w jasnym polu obrazuje pierwotną kulturę komórek silnie zanieczyszczoną fibroblastami po zastosowaniu procedury usuwania fibroblastów; kultury te reprezentują pierwotne komórki czerniaka.Pierwotne komórki czerniaka zostały posortowane na komórki CD 1 33 dodatnie oraz CD 1 33 ujemne. Dane uzyskane z analizy immunofluorescencyjnej, barwienia i western blot wskazują na wysoką skuteczność sortowania i czystość frakcji. Podejście to ma istotne znaczenie dla medycyny personalizowanej, ponieważ pozwala obecnie na wykorzystanie tkanek i komórek pochodzących od pacjentów do lepszego przewidywania odpowiedzi na leki u każdego pacjenta z osobna.Ta metoda pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak: skąd wywodzi się guz? W jaki sposób można leczyć pacjentów? Pomoże ona również lepiej zdefiniować podejścia biologii systemowej poprzez walidację przeprowadzanych eksperymentów.

patient-derived-cell-culture-isolation-cd133-putative-cancer-stem

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Kultura komórek pochodzenia pacjenta i izolacja CD133+ rzekomych komórek macierzystych raka z czerniaka

Komórki macierzyste nowotworu (CSCs) zidentyfikowano w wielu typach zmian złośliwych. W niniejszym protokole opisujemy metodę cytometrii przepływowej wykorzystującą aktywność dehydrogenazy aldehydowej oraz ekspresję CD44 i CD24 do izolacji CSCs z ksenoprzeszczepów gruczolakoprzewodowego raka trzustki człowieka. Te żywe komórki mogą być następnie wykorzystane w badaniach funkcjonalnych i analitycznych.

Izolacja komórek macierzystych z ksenoprzeszczepów raka trzustki człowieka

Opisujemy tutaj izolację wykazujących ekspresję CD133 komórek macierzystych wątroby oraz nowotworowych komórek macierzystych z całej wątroby mysiej, co jest procesem wymagającym trawienia tkanki, wzbogacania frakcji komórkowej oraz izolacji metodą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy metody zaawansowanej izolacji pojedynczych komórek oraz ekspansji klonalnej.

Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ do ekspansji klonalnej

Ten artykuł opisuje technikę izolowania komórek macierzystych raka trzustki (CSC) z ludzkiej tkanki gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC). Te CSC są wykorzystywane do badania funkcjonalnego wpływu leczenia farmakologicznego na zdolność CSC do samoodnawiania się in vitro w celu opracowania bardziej skutecznych metod leczenia raka.

Izolacja komórek macierzystych PDAC: metoda izolowania rakowych komórek macierzystych z guzów trzustki

Ten film opisuje technikę izolowania komórek macierzystych czerniaka CD133 ujemnych i dodatnich z pierwotnej linii komórkowej czerniaka za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie. CD133-dodatnie CSC czerniaka są dalej badane w celu zrozumienia mechanizmów nowotworzenia czerniaka.

Izolacja komórek macierzystych czerniaka: metoda uzyskiwania dodatnich i ujemnych komórek czerniaka CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie

Zrozumienie roli nowotworowych komórek macierzystych w nawrotach nowotworów i oporności na terapie stało się tematem wielkiego zainteresowania w ostatniej dekadzie. W artykule opisano izolację i charakterystykę subpopulacji nowotworowych komórek macierzystych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC).

Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Celem tej metodologii jest identyfikacja komórek macierzystych raka (CSC) w liniach komórek rakowych i pierwotnych próbkach guzów ludzkich za pomocą protokołu formowania kuli, w solidny sposób, przy użyciu testów funkcjonalnych i charakterystyki fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot.

Pozyskiwanie kulek komórek macierzystych raka z guzów ginekologicznych i raka piersi

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Ten artykuł opisuje protokół namnażania komórek nowotworowych krążących w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF-CTC) pobranych od pacjentów z chorobą oponowo-rdzeniową związaną z czerniakiem (M-LMD) w celu opracowania modeli przedklinicznych do badania M-LMD.

Ex vivo Hodowla krążących komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z czerniakiem w celu zbadania choroby opon mózgowo-rdzeniowych związanej z czerniakiem

Tutaj prezentujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem poprzez hodowlę oddzielonych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek czerniaka. Organoidy te wiernie odwzorowują specyficzne dla pacjenta nowotwory in vitro, oferując innowacyjne podejście do badania mechanizmów immunosupresyjnych nowotworów, badań przesiewowych leków, mechanizmów oporności na leki i podejść do nadzoru nad rakiem.

Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Naucz się izolować komórki macierzyste raka CD133+ z czerniaka przy użyciu sortowania magnetycznego MACS. Ta metoda pozwala uzyskać czyste populacje komórek do badań nad leczeniem spersonalizowanym.

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133⁺ z czerniaka

Przeglądaj więcej filmów