Name: Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności ATPaz P-typu w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej. Bezpieczna alternatywa dla eksperymentów z radioizotopami umożliwia precyzyjną analizę kinetyki transportu jonów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Ernstowi Bambergowi (Max-Planck-Institute of Biophysics, Frankfurt, Niemcy) za hojne wsparcie podczas początkowej fazy rozwoju metody, Kazuhiro Abe (Uniwersytet w Kioto, Japonia) za liczne owocne dyskusje oraz Dr. Michaelowi Kohlowi (Analytik-Service, Woltersdorf, Niemcy) za wsparcie techniczne. Autorzy dziękują za dofinansowanie przez Niemiecką Fundację Badawczą DFG (Klaster Doskonałości "Unifying Concepts in Catalysis"), która sfinansowała również aparat Perkin Elmer AAnalyst 800 (SFB 498).

<ol><li>Tavraz, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+plasma+membrane+targeting+or+protein+stability+by+certain+ATP1A2+mutations+identified+in+sporadic+or+familial+hemiplegic+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Impaired plasma membrane targeting or protein stability by certain ATP1A2 mutations identified in sporadic or familial hemiplegic migraine.</a> Channels (Austin). 3, 82-87 (2009).</li>
<li>Castillo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscape+of+the+reactions+governing+the+Na%2B+deeply+occluded+state+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+in+the+giant+axon+of+the+Humboldt+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Energy landscape of the reactions governing the Na+ deeply occluded state of the Na+/K+-ATPase in the giant axon of the Humboldt squid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 20556-20561 (2011).</li>
<li>Friedrich, T., Bamberg, E., Nagel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2CK%2B-ATPase+pump+currents+in+giant+excised+patches+activated+by+an+ATP+concentration+jump%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Na+,K+-ATPase pump currents in giant excised patches activated by an ATP concentration jump.</a> Biophys J. 71, 2486-2500 (1996).</li>
<li>Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Dempski, R. E., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+E2+state+stabilization+by+specific+alpha%2Fbeta-subunit+interactions+of+Na%2CK-+and++H%2CK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional significance of E2 state stabilization by specific alpha/beta-subunit interactions of Na,K- and H,K-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 284, 3842-3854 (2009).</li>
<li>Dürr, K. L., Abe, K., Tavraz, N. N., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2P+state+stabilization+by+the+N-terminal+tail+of+the+H%2CK-ATPase+beta-subunit+is+critical+for+efficient+proton+pumping+under+in+vivo+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">E2P state stabilization by the N-terminal tail of the H,K-ATPase beta-subunit is critical for efficient proton pumping under in vivo conditions.</a> J. Biol. Chem. 284, 20147-20154 (2009).</li>
<li>Durr, K. L., Tavraz, N. N., Zimmermann, D., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Na%2CK-ATPase+and+H%2CK-ATPase+enzymes+with+glycosylation-deficient+beta-subunit+variants+by+voltage-clamp+fluorometry+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Na,K-ATPase and H,K-ATPase enzymes with glycosylation-deficient beta-subunit variants by voltage-clamp fluorometry in Xenopus oocytes.</a> Biochemistry. 47, 4288-4297 (2008).</li>
<li>Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gastric+H%2CK-ATPase+activity+by+cations%2C+voltage+and+intracellular+pH+analyzed+by+voltage+clamp+fluorometry+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control of gastric H,K-ATPase activity by cations, voltage and intracellular pH analyzed by voltage clamp fluorometry in Xenopus oocytes.</a> PLoS One. 7, e33645(2012).</li>
<li>Tavraz, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functional+consequences+of+mutations+in+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+alpha2-subunit+causing+familial+hemiplegic+migraine+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Diverse functional consequences of mutations in the Na+/K+-ATPase alpha2-subunit causing familial hemiplegic migraine type 2.</a> J. Biol. Chem. 283, 31097-31106 (2008).</li>
<li>Lorenz, C., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li>
<li>Koenderink, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2CK-ATPase+mutations+in+familial+hemiplegic+migraine+lead+to+functional+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Na,K-ATPase mutations in familial hemiplegic migraine lead to functional inactivation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1669, 61-68 (2005).</li>
<li>Price, E. M. J., Lingrel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+the+Na%2CK-ATPase+alpha+subunit%3A+site-directed+mutagenesis+of+glutamine-111+to+arginine+and+asparagine-122+to+aspartic+acid+generates+a+ouabain-resistant+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme.</a> Biochemistry. 27, 8400-8408 (1988).</li>
<li>Richards, R., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+conformational+dynamics+of+membrane+proteins+in+situ+with+site-directed+fluorescence+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling.</a> J. Vis. Exp. (2627), e2627(2011).</li>
<li>Lafaire, A. V., Schwarz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+dependence+of+the+rheogenic+Na%2B%2FK%2B+ATPase+in+the+membrane+of+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Voltage dependence of the rheogenic Na+/K+ ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus laevis.</a> J. Membr. Biol. 91, 43-51 (1986).</li>
<li>Morth, J. P., Pedersen, B. P., Toustrup-Jensen, M. S., Sorensen, T. L., Petersen, J., Andersen, J. P., Vilsen, B., Nissen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+sodium-potassium+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the sodium-potassium pump.</a> Nature. 450, 1043-1049 (2007).</li>
<li>Toustrup-Jensen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+Na%2B%2CK%2B-ATPase+controls+Na%2B+affinity+on+both+sides+of+the+membrane+through+Arg935%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The C terminus of Na+,K+-ATPase controls Na+ affinity on both sides of the membrane through Arg935.</a> J. Biol. Chem. 284, 18715-18725 (2009).</li>
<li>Morth, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+Na%2B%2CK%2B-ATPase+and+mapping+of+isoform+differences+and+disease-related+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 364, 217-227 (2009).</li>
<li>Yaragatupalli, S., Olivera, J. F., Gatto, C., Artigas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Na%2B+transport+after+an+intracellular+alpha-subunit+deletion+reveals+strict+external+sequential+release+of+Na%2B+from+the+Na%2FK+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Altered Na+ transport after an intracellular alpha-subunit deletion reveals strict external sequential release of Na+ from the Na/K pump.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15507-15512 (2009).</li>
<li>Meier, S., Tavraz, N. N., Durr, K. L., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+inward+leakage+currents+caused+by+deletion+or+mutation+of+carboxy-terminal+tyrosines+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%7Balpha%7D+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated inward leakage currents caused by deletion or mutation of carboxy-terminal tyrosines of the Na+/K+-ATPase {alpha} subunit.</a> J. Gen. Physiol. 135, 115-134 (2010).</li>
<li>Vedovato, N., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+C-terminal+tyrosines+stabilize+occluded+Na%2FK+pump+conformations+containing+Na+or+K+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The two C-terminal tyrosines stabilize occluded Na/K pump conformations containing Na or K ions.</a> J. Gen. Physiol. 136, 63-82 (2010).</li>
<li>Chakavarti, B., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+separation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic separation of proteins.</a> J. Vis. Exp. (16), e758(2008).</li>
<li>Kamsteeg, E. J., Deen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aquaporin-2+expression+levels+in+genotype+-phenotype+studies+in+nephrogenic+diabetes+insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aquaporin-2 expression levels in genotype -phenotype studies in nephrogenic diabetes insipidus.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279, 778-784 (2000).</li>
<li>Koenderink, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+analysis+of+the+mutated+Na%2CK-ATPase+cation+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological analysis of the mutated Na,K-ATPase cation binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 278, 51213-51222 (2003).</li>
<li>Gottardi, C. J., Caplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+requirements+for+the+cell-surface+expression+of+multisubunit+ion-transporting+ATPases.+Identification+of+protein+domains+that+participate+in+Na%2CK-ATPase+and+H%2CK-ATPase+subunit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular requirements for the cell-surface expression of multisubunit ion-transporting ATPases. Identification of protein domains that participate in Na,K-ATPase and H,K-ATPase subunit assembly.</a> J. Biol. Chem. 268, 14342-14347 (1993).</li>
<li>Mathews, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+and+functional+expression+of+the+mouse+and+frog+alpha-subunit+of+the+gastric+H%2B-K%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Primary structure and functional expression of the mouse and frog alpha-subunit of the gastric H+-K+-ATPase.</a> Am. J. Physiol. 268, 1207-1214 (1995).</li>
<li>Horisberger, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H%2CK-ATPase+beta-subunit+can+act+as+a+surrogate+for+the+beta-subunit+of+Na%2CK-pumps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The H,K-ATPase beta-subunit can act as a surrogate for the beta-subunit of Na,K-pumps.</a> J. Biol. Chem. 266, 19131-19134 (1991).</li>
<li>Guennoun-Lehmann, S., Fonseca, J. E., Horisberger, J. D., Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palytoxin+acts+on+Na%2B%2CK%2B-ATPase+but+not+nongastric+H%2B%2CK%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Palytoxin acts on Na+,K+-ATPase but not nongastric H+,K+-ATPase.</a> J. Membr. Biol. 216, 107-116 (2007).</li>
<li>Horisberger, J. D., Guennoun, S., Burnay, M., Geering, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation+stoichiometry+and+cation+pathway+in+the+Na%2CK-ATPase+and+nongastric+H%2CK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci.%22%5BJournal%5D)">Cation stoichiometry and cation pathway in the Na,K-ATPase and nongastric H,K-ATPase.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci.. 986, 127-132 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana metoda pomiaru ilości Rb+ (lub Li+) pobranych do poszczególnych oocytów Xenopus wykazujących ekspresję Na+,K+- lub H+,K+-ATPazy okazała się wszechstronną, elastyczną i dokładną techniką określania kinetycznych lub termodynamicznych parametrów transportu dla przeciwtransportujących kationy ATPaz typu P1,4,5,7,8. Jest to bezpieczna i niezawodna alternatywa dla testów strumienia znaczników promieniotwórczych i pozwala odpowiedzieć ...

Chcieliśmy opracować czułą, bezpieczną i tanią alternatywę dla eksperymentów z radioaktywnym znacznikiem, aby zbadać specyficzną aktywność transportową jonów translokujących białka błonowe w celu obejścia ograniczeń dotyczących dostępu do laboratoriów izotopowych, wymogów bezpieczeństwa lub stosowania kosztownych radioizotopów, które - jak w przypadku litu - mogą być nawet niedostępne ze względu na bardzo krótkie czasy rozpadu. Byliśmy szczególnie zainteresowani określeniem aktywności działającej elektroneutralnie gazowej H+,K+-ATPazy, ponieważ enzym ten nie wytwarza prądu, a zatem jego aktywność nie może być kontrolowana metodami elektrofizjologicznymi. Ponieważ transport Na+,K+- i H+,K+-ATPazy Rb+ jest równie wydajny jak K+ (i Li+ również), wysoka czułość techniki AAS dla rubidu lub litu powinna ułatwić czułe wykrywanie aktywności transportowej. Spektrofotometry absorpcji atomowej są powszechnymi urządzeniami analitycznymi, które są szeroko rozpowszechnione w laboratoriach chemicznych i powinny być dostępne dla dużej liczby zainteresowanych naukowców. Ponadto chcieliśmy wykorzystać system ekspresji oocytów Xenopus, który wykorzystuje duże pojedyncze komórki (o średnicy około 1,0-1,5 mm), co pozwala osiągnąć niezwykle niską zmienność między komórkami pod względem poziomu ekspresji białka w jednej partii. Proste obliczenia pokazują wykonalność testu AAS: Granica wykrywalności (masa charakterystyczna) dla rubidu techniką THGA-AAS wynosi 10 pg lub 1,2·10-13 mol (Rb: 85,47 g/mol), dla litu 5,5 pg lub 7,9·10-13 mol (Li: 6,94 g/mol). Przy heterologicznej ekspresji Na+,K+-ATPazy w oocytach Xenopus można osiągnąć prądy pompowania 100 nA (co odpowiada około 6,2·1011 ładunków elementarnych na sekundę, czyli 1,03·10-12 mol s-1), co skutkuje transportem 6·10-6 C ładunku w ciągu 1 minuty. Ponieważ transport jednego ładunku netto odpowiada wychwytowi dwóch jonów Rb+ (ze względu na stechiometrię 3Na+/2K+), prąd 100 nA przez 1 minutę odpowiada poborowi 1,2·10-10 mol Rb+. Tak więc, nawet po 1000-krotnym rozcieńczeniu (homogenizacja oocytu o objętości około 1 μl w 1 ml wody), typowa próbka THGA-AAS (20 μl) zawiera 2,4·10-12 mol Rb+ (lub 204 pg), co jest znacznie powyżej progu wykrywania. W związku z tym nawet transportery o ponad 100-krotnie niższej aktywności transportowej lub ekspresji błony plazmatycznej mogą być testowane za pomocą tej techniki, odpowiednio dostosowując czas strumienia w eksperymencie.
Ponieważ szybkość pompowania jest wrażliwie zależna od temperatury (typowe energie aktywacji dla Na+,K+-ATPazy są w zakresie od 90 kJ/mol do 130 kJ/mol1-3, co powoduje około 30% wzrost prędkości obrotu przy zmianie z 20 °C na 22 °C), obowiązkowe jest przeprowadzanie pomiarów strumienia pod precyzyjną kontrolą temperatury (klimatyzacja) z dobrze zbalansowanymi roztworami buforowymi. Ponadto oocyty powinny być starannie dobrane pod kątem jednorodnej wielkości pod kątem ekspresji transportera jonów. Dzięki tym środkom ostrożności możliwe jest rutynowe osiąganie eksperymentalnych błędów standardowych mniejszych niż 10 procent przy około 10 komórkach na warunki eksperymentalne. Za pomocą tej techniki udało nam się określić m.in. pozorne powinowactwo Rb+ do transportu kationów4-6, wpływ zewnątrz- i wewnątrzkomórkowego pH7 oraz wpływ mutacji reszt zaangażowanych w koordynację kationów podczas transportu4,8. Zaletą tej techniki jest to, że strumienie jonów mogą być również wyznaczane w połączeniu z dwuelektrodowym zaciskaniem napięcia oocytów, co z jednej strony zapewnia dokładną kontrolę potencjału błonowego podczas transportu, a z drugiej pozwala skorelować strumień jonów z prądem błonowym. W ten sposób udało się zweryfikować stechiometrię 3Na+/2K+ ATPazy Na+,K+ (patrz przykładowe wyniki poniżej) oraz określić zależność napięciową transportu kationów przez żołądkową H+/K+-ATPazę7.

<table><tbody><tr><td>4.0 Materiał szwowy Ethicon Vicryl</td><td>Johnson Johnson</td><td>V633H</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 1A od Clostridium hystolyticum</td><td>Sigma</td><td>Aldrich C9891</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania produktu PCR o wysokiej czystości Roche</td><td>Applied Science</td><td>11732676001</td><td> </td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Kit SP6/ T7</td><td>Ambion</td><td>1340, 1344</td><td></td></tr><tr><td>Oktahydrat Ouabainy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3125</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina (sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny typu III-O z białka jaja kurzego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2011</td><td></td></tr><tr><td>SCH28080</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4443</td><td></td></tr><tr><td>AAnalyst 800</td><td>Perkin Elmer</td><td>0993-5256</td><td></td></tr><tr><td>WinLab32TM Perkin</td><td>Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000.012</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemianowe</td><td>Produkty naukowe</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>Rurki hematokrytowe 3,5 "</td><td>Drummond Scientific</td><td>3 000-203-G / X</td><td></td></tr><tr><td>Lampa z pustą katodą Lit</td><td>Photron</td><td>P929LL</td><td></td></tr><tr><td>Lampa z pustą katodą Rubidium</td><td>Photron</td><td>P945</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet </td><td>Narishige</td><td>Model PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Komora do zapisu oocytów RC-10</td><td>Warner Instr.</td><td>W4 64-0306</td><td></td></tr><tr><td>Pompa wtryskowa Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie pCLAMP</td><td>Urządzenia</td><td></td><td></td>molekularne</tr><tr><td>Polipropylenowy kubek na próbkę (1,2 ml)</td><td>Perkin Elmer</td><td>B0510397</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac - Koncentrator model 5301</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.210</td><td> </td></tr><tr><td>Rurka THGA</td><td>Perkin Elmer</td><td>B3000641</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz Turbo TEC-10CX</td><td>NPI Electronics</td><td>TEC-10CX</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar transportu kationów przez na,k- i h,k-atpazę w oocytach xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Podczas gdy transport kationów przez elektrogeniczny transporter błonowy Na+,K+-ATPaza może być mierzony przez elektrofizjologię, elektroneutralnie działająca w żołądku H+,K+-ATPaza jest trudniejsza do zbadania. Wiele testów transportowych wykorzystuje izotopy promieniotwórcze w celu osiągnięcia wystarczającego stosunku sygnału do szumu, jednak niezbędne środki bezpieczeństwa nakładają surowe ograniczenia dotyczące narażenia ludzi lub projektu testu. Co więcej, na transport jonów przez błony komórkowe krytyczny wpływ ma potencjał błonowy, który nie jest bezpośrednio kontrolowany w hodowli komórkowej lub w preparatach proteoliposomowych. Wykorzystujemy tutaj wyjątkową czułość atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej (AAS) na śladowe ilości pierwiastków chemicznych do pomiaru transportu Rb+ lub Li+ przez Na+,K+- lub H+,K+-ATPazę żołądkową w pojedynczych komórkach. Wykorzystując oocyty Xenopus jako system ekspresji, określamy ilość Rb+ (Li+) transportowanego do komórek, mierząc próbki homogenatów pojedynczych oocytów w urządzeniu AAS wyposażonym w poprzecznie podgrzewany piec z atomizerem grafitowym (THGA), który jest ładowany z automatycznego podajnika próbek. Ponieważ tło nieswoistego wychwytu Rb+ do oocytów kontrolnych lub podczas stosowania inhibitorów specyficznych dla ATPazy jest bardzo małe, możliwe jest wdrożenie złożonych schematów testów kinetycznych obejmujących jednocześnie dużą liczbę warunków eksperymentalnych lub porównanie zdolności transportowej i kinetyki specyficznie zmutowanych transporterów swoistych dla miejsca z dużą precyzją. Ponadto, ponieważ wychwyt kationów jest określany na pojedynczych ogniwach, eksperymenty ze strumieniem można przeprowadzić w połączeniu z dwuelektrodowym zaciskaniem napięcia (TEVC) w celu uzyskania dokładnej kontroli potencjału i prądu membrany. Pozwoliło to m.in. na ilościowe określenie stechiometrii transportu 3Na+/2K+ ATPazy Na+,K+-ATPazy i umożliwiło po raz pierwszy zbadanie zależności napięciowej transportu kationów przez elektroobojętnie działającą w żołądku H+,K+-ATPazę. Zasadniczo test nie ogranicza się do białek błonowych transportujących K+, ale może działać równie dobrze w przypadku aktywności transporterów metali ciężkich lub przejściowych lub wychwytu pierwiastków chemicznych w procesach endocytotycznych.

Ilościowe oznaczenie pobierania Rb+ przez ATPazy typu P z przeciwtransportem K+ (lub Rb+) za pomocą AAS w systemie ekspresyjnym w oocytach Xenopus pozwala na wiarygodne wyznaczenie parametrów kinetycznych enzymu.
Wyznaczenie stechiometrii transportu pompy Na+/K+-ATPase
W przypadku elektrogennej Na+/K+-ATPase przepływy Rb+ można oznaczać w eksperymentach z wykorzystaniem met...

Opisujemy metodę ilościowego określania aktywności przeciwtransportujących K+ ATPaz typu P poprzez heterologiczną ekspresję enzymów w oocytach Xenopus i mierzenie absorpcji Rb+ lub Li+ do pojedynczych komórek za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej. Metoda ta stanowi czułą i bezpieczną alternatywę dla eksperymentów ze strumieniem radioizotopów, ułatwiając złożone badania kinetyczne.

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Procedura wykorzystuje żabie oocyty jako system ekspresji in vivo. Aby określić aktywność transportową potasowych antyporterów typu P, TP, ais lub innych transporterów śladowych pierwiastków błonowych, należy najpierw wyekspresować białko transportera w oocytach. Następnie indukuje się pobieranie kationów poprzez inkubację komórek w roztworze przepływowym zawierającym określone stężenie transportowanego kationu przez ustalony czas i w określonej temperaturze.Alternatywnie, przeprowadź eksperyment poboru pod kontrolą potencjału błonowego, stosując technikę dwuelektrodowego zacisku napięciowego (two electrode voltage clamp). Po przemyciu komórek zhomogenizuj poszczególne oocyty w jednym mililitrze wody Millipore. Następnie zmierz próbki na spektrofotometrze absorpcyjnym z atomizacją w piecu grafitowym z poprzecznym ogrzewaniem.W ostateczności analiza strumienia znacznika za pomocą spektrometrii absorpcyjnej atomowej może zostać wykorzystana do określenia kinetyki transportu lub inhibitorów, zależności transportu od napięcia oraz stechiometrii transportu, a w dalszej kolejności może służyć do przesiewów farmakologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona dokładną, ta

measuring-cation-transport-nak-hk-atpase-xenopus-oocytes-atomic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazy w komórkach Xenopus przy użyciu spektrofotometrii absorpcyjnej atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

In planta pomiar strumieni składników odżywczych i toksycznych jest niezbędny do badania odżywiania i toksyczności roślin. W tym miejscu omawiamy protokoły radioznacznikowe do oznaczania napływu i odpływu w nienaruszonych korzeniach roślin, używając jako przykładów strumieni potasu (K+) i amoniaku/amonu (NH3/NH4+). Omówiono zalety i ograniczenia takich technik.

Pomiar strumieni mineralnych składników odżywczych i substancji toksycznych w roślinach z radioaktywnymi znacznikami

Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na+/H+ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Transportery w błonach komórkowych umożliwiają różnicową segregację jonów przez błony komórkowe lub warstwy komórkowe i odgrywają kluczową rolę podczas fizjologii, naprawy i patologii tkanek. Opisujemy jonoselektywną, samoreferencyjną mikroelektrodę, która umożliwia pomiar określonych strumieni jonów w pojedynczych komórkach i tkankach in vivo.

Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

Mechanizmy skalowania komórkowego i wewnątrzkomórkowego pozostają nieuchwytne. Stosowanie ekstraktów z zarodków Xenopus staje się coraz bardziej powszechne w celu wyjaśnienia mechanizmów regulacji wielkości organelli. Metoda ta opisuje przygotowanie ekstraktu z zarodka i nowatorski test skalowania jądrowego, za pomocą którego można zidentyfikować mechanizmy regulacji wielkości jądra.

Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

Ten artykuł opisuje ulepszenie konwencjonalnej fluorometrii zaciskowej (VCF), gdzie zamiast barwników maleimidowych stosuje się fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy (fUAA), aby badać strukturalne przegrupowania w kanałach jonowych. Procedura obejmuje iniekcję DNA oocytów Xenopus, koiniekcję RNA/fUAA oraz jednoczesne pomiary prądu i fluorescencji.

Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania po fizjologię i farmakologię.

Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Obecny protokół podkreśla zastosowanie techniki western blotting do badania funkcji i aktywności kotransportera neuronalnego K-Cl KCC2. Protokół opisuje badanie fosforylacji KCC2 w miejscach regulatora kinazy Thr906/1007 poprzez western blot. W tym tekście pokrótce omówiono również dodatkowe metody potwierdzania aktywności KCC2.

Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting

Poznaj metodę pomiaru aktywności ATPaz P-typu w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej. Bezpieczna alternatywa dla eksperymentów z radioizotopami umożliwia precyzyjną analizę kinetyki transportu jonów.

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Przeglądaj więcej filmów