Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Ogólnym celem tej procedury jest pobranie i przygotowanie chromosomów do prążkowania GB i molekularnych testów cytogenetycznych. Najpierw hoduj komórki do fazy logarytmicznej. Następnie zbierz chromosomy za pomocą smidu, hipotonicznego i utrwalającego.

Upuść zawiesinę komórek na szkiełka. Plamić jedno szkiełko. Jako monitor przygotowania chromosomów przejdź do prążków GB lub technik molekularnych pozostałych szkiełek.

Ostatnim krokiem w prążkowaniu GB jest analiza chromosomów za pomocą mikroskopii świetlnej i kariotypowania. Ostatecznie chromosomy i jądra będą dostępne do kariotypowania lub ryb. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł opublikowania tej metody ze względu na duże zapotrzebowanie ze strony innych badaczy proszących o pomoc w wykrywaniu niestabilności chromosomów w różnych typach komórek z różnych organizmów oraz w późniejszych badaniach cytogenetycznych molekularnych.

Technika ta jest niezbędna w diagnostyce i ostatecznie prognozowaniu wielu wrodzonych zaburzeń genetycznych, w tym raka, ponieważ pozwala na wizualizację rearanżacji chromosomów, które są diagnostyczne. W przypadku tych zaburzeń, Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w rearanżacje chromosomów występujące w różnych typach komórek ludzkich. Może być również stosowany do komórek innych organizmów, takich jak Resus Maca, szczury i myszy Hodowla.

2 miliony przylegających komórek do 80% płynności i dodaj 10 mikrolitrów po 10 mikrogramów na mililitr. Kol na mililitr komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% CO2 przez 45 minut.

Następnie za pomocą sterylnej pipety przenieś pożywkę z hodowli do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odłóż na później Aby umyć komórki, dodaj dwa mililitry HBSS do kolby, zawiruj i usuń bufor. Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny, upewniając się, że pokrywa ona całą powierzchnię kolby. Gdy większość komórek się odłączy, odpipetuj pożywkę w stożkowej probówce z powrotem na komórki.

Porcję 10 mililitrów zawiesiny komórek do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Wirować w temperaturze 200 g przez 10 minut. Usuń supernat.

Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach 75 milimolowego chlorku potasu, który zostanie wstępnie ogrzany do 37 stopni Celsjusza po 10 minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wirować przy 200 gs przez pięć minut. W temperaturze 25 stopni Celsjusza usuń wszystkie oprócz 0,5 mililitra supernatantu i ostrożnie ponownie zawieś osad

Dodaj do komórek pięć mililitrów świeżego utrwalacza hałasu samochodowego. Następnie dodaj pięć mililitrów, więcej utrwalacza i wirówki wirowej o stężeniu 200 g przez pięć minut. Resus, zawiesić każdą komórkę w pięciu mililitrach utrwalacza.

Przechowuj komórki w czterech stopniach przez okres do jednego roku. Odwirować komórki w temperaturze 200 g przez pięć minut. W 25 stopniach Celsjusza.

Usuń natant sup, aż pozostanie tylko 0,3 do 0,5 mililitra po delikatnym ponownym zawieszeniu granulatu. Odpipetować trzy krople zawiesiny komórek z odległości około dwóch cali na szkiełko, które jest przechylone pod kątem około 45 stopni. I pozwól, aby zawieszenie przetoczyło się po zjeżdżalni.

Dodaj jedną dużą kroplę świeżego odgłosu samochodu, utrwalającą do zjeżdżalni. Przesuń tylną część szkiełka na ręczniku papierowym, a następnie pozostaw prowadnicę do całkowitego wyschnięcia. Przygotuj świeży roztwór podtrzymujący gim.

Umieść szkiełka na stojaku do barwienia. Przykryj cały szkiełko roztworem podtrzymującym gim. Po pięciu minutach spłucz szkiełka wodą destylowaną, odcedź i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

Dodaj cztery krople uchwytu do trwałej ondulacji na szkiełko i umieść szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że pod szkiełkiem nakrywkowym nie ma pęcherzyków. Usuń nadmiar na mocowanie ręcznikiem papierowym. Analizuj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego pod powiększeniem 10x i 100x.

Jeśli komórki metafazy są obfite i dobrze rozproszone, pozostałe szkiełka można wykorzystać do innych procedur eksperymentalnych. Dodaj 50 mililitrów roztworów leczniczych do czterech słoików Copeland. Zanurz każde szkiełko w słoiku numer jeden na pięć sekund.

Szybkie płukanie szkiełka w słoiku numer dwa. Pozostaw go w słoiku numer trzy na co najmniej 30 sekund. Opłucz w słoiku numer cztery, a następnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia.

Przygotuj świeży roztwór podtrzymujący GIM. Umieść szkiełka na stojaku do barwienia. Przykryj całe szkiełko roztworem podtrzymującym gim na pięć minut.

Opłucz szkiełka i wodę destylowaną w tej samej kolejności, w jakiej zostały poplamione. Następnie suszyć przez co najmniej 10 minut. Umieść szkiełko nakrywkowe za pomocą trwałego montażu, jak pokazano wcześniej.

Następnie przeanalizuj komórki pod mikroskopem świetlnym pod kątem pozostałych szkiełek. Dostosuj czas inkubacji podróży. Na podstawie wyników pierwszego slajdu.

Udany test daje chromosomy, które są dobrze rozproszone i mają odpowiednią morfologię chromosomów. Odpowiednio. Chromosomy z prążkami GB zawierają charakterystyczne jasne i ciemne wzory prążków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać chromosomy do prążków GB i dalszych badań cytogenetycznych molekularnych w celu wyjaśnienia niestabilności chromosomów.

Po opanowaniu tę technikę zbioru można wykonać w około trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. W przypadku procedury pasmowania GB ważne jest, aby wstępnie przetestować czas inkubacji tripsin na jednym szkiełku przed przejściem do pasma GB. Reszta slajdów.