Name: Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Naucz się przygotowywać chromosomy z hodowanych komórek do badań cytogenetycznych, w tym G-banding i FISH. Ta metoda umożliwia analizę niestabilności chromosomalnej w komórkach ludzkich i mysich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca opisana w tym manuskrypcie była możliwa dzięki finansowaniu z Fundacji Patricka F. Taylora.

1. Pobieranie chromosomów z przylegających komórek
<ol>
	<li>Protokół standardowy
	<ol>
		<li>Hoduj komórki zgodnie z określonymi warunkami hodowli komórek. Gdy komórki osiągną fazę logarytmiczną (80% konfluencji), dodać 10 μl/ml Colcemidu do kolby do hodowli komórkowej. Zalecane są co najmniej 2 x 106 komórek.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 45 minut. Za pomocą sterylnej pipety przenieś pożywkę z komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Uchylenie.</li>
		<li>Delikatnie przemyć komórki, dodając 2 ml buforu HBSS do kolby. Zakręć buforem, a następnie usuń go za pomocą pipety. Odrzucić.</li>
		<li>Dodać 1 ml trypsyny, upewniając się, że pokrywa ona całą powierzchnię kolby. Pozostaw komórki w trypsynie tylko na około 2 minuty. Gdy większość komórek się odłączy, odpipetuj pożywkę w stożkowej probówce z powrotem na komórki.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek w podwielokrotnościach o objętości 10 ml do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g przez 10 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad.</li>
		<li>Dodać 10 ml 0,075 M KCl, który został wstępnie podgrzany do 37 °C, do pozostałego osadu w stożkowej probówce. Rurka wirowa ze średnią prędkością, aby wymieszać KCl i komórki.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C. Usunąć supernatant (do momentu, aż pozostanie około 0,5 ml) i ponownie zawiesić osad.</li>
		<li>Ostrożnie dodaj 5 ml świeżego utrwalacza Carnoy's Fixative (stosunek 3:1 metanolu do lodowatego kwasu octowego) do komórek podczas wirowania. Następnie dodaj 5 ml więcej utrwalacza bez wirowania, co daje w sumie 10 ml.</li>
		<li>Wirować przy 200 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki. Dodać 5 ml utrwalacza do każdej probówki.</li>
		<li>Wirować przy 200 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki. Dodać 5 ml utrwalacza do każdej probówki. Ogniwa mogą być teraz przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do jednego roku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modyfikacja Protokołu: Pobieranie chromosomów z linii komórkowych limfoblastoidów
	<ol>
		<li>Hoduj komórki zgodnie z określonymi warunkami hodowli komórek. (Użyć kolby odpowiedniej do ilości hodowanych komórek). Gdy komórki osiągną fazę logarytmiczną (około 2 dni po podziale komórek), dodać 10 μl/ml Colcemidu do kolby do hodowli komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modyfikacja protokołu: Pobieranie chromosomów z krwi pełnej 
	Fitohemaglutynina (PHA), lektyna pochodząca z czerwonej fasoli, jest silnym mitogenem dla ludzkich limfocytów T16. 72 godziny po dodaniu PHA do hodowli około 45% komórek znajduje się w fazie S. Reprezentuje to szczytową aktywność mitotyczną i jest optymalnym punktem, w którym można zbierać plony do badań chromosomowych. Inne mitogeny, takie jak szkarłatka (1-10 μg/ml) mogą być używane podczas analizy limfocytów B17,18.
	<ol>
		<li>Zebrać co najmniej 1 ml krwi pełnej do zielonej górnej probówki z heparyną sodu. Zużyć w ciągu 3 dni po pobraniu. Przechowuj krew w temperaturze pokojowej do momentu, gdy będzie gotowa do użycia.</li>
		<li>Podwielokrotność 0,25 ml krwi pełnej w 10 ml kompletnej pożywki RPMI zawierającej L-glutaminę (20% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% fungizonu i 1% PHA). Hodowla w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modyfikacja protokołu: Pobieranie chromosomów ze szpiku kostnego Analiza cytogenetyczna szpiku kostnego jest pomocna w wielu złośliwych zaburzeniach hematologicznych, ponieważ obserwacja chromosomalnie nieprawidłowego klonu może być diagnostyczna dla określonego typu białaczki. Badania chromosomów są również wykorzystywane do oceny postępu choroby, takiej jak początek przełomu blastycznego i odpowiedź na leczenie. Ponieważ komórki szpiku kostnego aktywnie się dzielą, stymulacja mitogenem nie jest konieczna9,19. W przypadku ostrych białaczek zakłada się również posiewy po 24 i 48 godzinach.
	<ol>
		<li>Zebrać co najmniej 1 ml szpiku kostnego w zielonej górnej probówce z heparyną sodu. Podwielokrotność 0,25 ml szpiku kostnego w 10 ml kompletnej pożywki RPMI zawierającej L-glutaminę (20% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicylina/streptomycyna, 1% fungizon). Hodowla w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie szkiełek i barwienie ciał stałych
Szybka ocena jednego reprezentatywnego preparatu dostarczy informacji na temat jakości zbiorów przed przejściem do dalszych procedur, takich jak G-banding, FISH, CGH lub SKY. Niektóre laboratoria wolą barwienie komórek na stałe w celu szybkiego pobrania i oceny chromosomów. Alternatywnie do tej analizy można użyć mikroskopu z kontrastem fazowym. Preparaty najlepiej przygotowywać się, gdy wilgotność wynosi około 50%, a temperatura otoczenia (20-25 °C).
<ol>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C. Usunąć supernatant do momentu, aż pozostanie tylko 0,3-0,5 ml.</li>
	<li>Po delikatnym ponownym wymieszaniu osadu, należy odpipetować trzy krople zawiesiny ogniwa z odległości około 2 cali na szkiełko przechylone pod kątem około 45° i pozwolić, aby zawiesina przetoczyła się po szkiełku. Dodaj jedną dużą kroplę świeżego utrwalacza Carnoy's do szkiełka.</li>
	<li>Osusz tył szkiełka na ręczniku papierowym, a następnie odłóż szkiełko do wyschnięcia na co najmniej 10 minut. Zjeżdżalnia powinna być całkowicie sucha.</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór barwiący Giemsa (proporcje 3:1 buforu Gurr i plamy Giemsa). Umieść szkiełka na stojaku do barwienia. Przykryj całe szkiełko roztworem barwiącym Giemsa. Pozostaw szkiełka w roztworze barwiącym na 5 minut. Opłucz szkiełka wodą destylowaną, odcedź i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Dodaj 4 krople Permount i szkiełko nakrywkowe do szkiełka. Upewnij się, że pod szkiełkiem nakrywkowym nie ma pęcherzyków powietrza. Nadmiar Permount można usunąć ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Analizuj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego pod 10-krotnym i 100-krotnym powiększeniem. Jeśli komórki metafazy są obfite i dobrze rozproszone, pozostałe szkiełka można wykorzystać do innych procedur eksperymentalnych.</li>
</ol>
3. G-Banding z użyciem trypsyny i Giemsy (GTG)
Trypsyna jest enzymem proteolitycznym, który denaturuje histony euchromatyczne w regionach DNA, co skutkuje wyższą aktywnością transkrypcyjną. Po barwieniu Giemsa obszary te pojawią się jako jasne pasma. Wysoce skondensowana chromatyna o małej lub zerowej aktywności transkrypcyjnej (heterochromatyna) będzie miała dużą część swoich histonów chronionych przed trypsyną i dlatego będzie się barwić ciemno po barwieniu Giemsa. Konieczne jest, aby początkowo wstęgę G obejmowała jeden slajd, aby monitorować warunki i w razie potrzeby dostosować czas trypsyny do kolejnych slajdów.
<ol>
	<li>Dodaj następujące roztwory do 4 słoików Coplin. Słoik #1 = 30 ml 1x HBSS i 4 ml 10x trypsyna (0,5%) 
	Słoik #2= 50 ml 1x HBSS 
	Słoik #3 = 45 ml 1x HBSS i 5 ml płodowej surowicy bydlęcej 
	Słoik #4 = 50 ml 1x HBSS</li>
	<li>Zanurz każde szkiełko w słoiku #1 na 5 sekund, szybko spłucz w słoiku #2, pozostaw każde szkiełko w słoiku #3 na co najmniej 30 sekund, szybkie spłucz w słoiku #4, a następnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia.</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór barwiący Giemsa (proporcje 3:1 buforu Gurr i plamy Giemsa). Umieść szkiełka na stojaku do barwienia. Przykryj całe szkiełko roztworem barwiącym Giemsa. Pozostaw szkiełka w roztworze barwiącym na 5 minut.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej w tej samej kolejności, w jakiej zostały poplamione. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na około 10 minut. Zjeżdżalnia powinna być całkowicie sucha.</li>
	<li>Dodaj 4 krople Permount i szkiełko nakrywkowe do szkiełka. Upewnij się, że pod szkiełkiem nakrywkowym nie ma pęcherzyków powietrza. Nadmiar Permount można usunąć ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Analizuj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego pod 10-krotnym i 100-krotnym powiększeniem. Dostosuj czas trypsyny pozostałych slajdów na podstawie wyników pierwszego slajdu.</li>
</ol>

<ol><li>Driscoll, D., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+screening+for+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Prenatal screening for aneuploidy.</a> New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).</li>
<li>Nussbuam, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNussbuam%2C+R+%22Genetics+in+Medicine%3A+7th+Edition%22">Genetics in Medicine: 7th Edition</a>. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).</li>
<li>Ljunger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities+in+first-trimester+miscarriages%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Obstet.+Gynecol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages.</a> Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).</li>
<li>Kwinecka-Dmitri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+chromosomal+aberrations+in+material+from+abortions%5BTitle%5D)+AND+%22Ginecol.+Pol%22%5BJournal%5D)">Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions.</a> Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).</li>
<li>Reddy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stillbirth+classification%E2%80%94Developing+an+international+consensus+for+research%3A+Executive+summary+of+a+national+institute+of+child+health+and+human+development+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop.</a> Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).</li>
<li>Pierpoint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+congenital+heart+defects%3A+Current+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge.</a> Circulation. 115 (23), 3015 (2007).</li>
<li>Kaneshiro, N., Zieve, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Syndrome%3A+Trisomy+21.%5BTitle%5D)+AND+%22PubMed+Health%22%5BJournal%5D)">Down Syndrome: Trisomy 21.</a> PubMed Health. , (2010).</li>
<li>Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).</li>
<li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+in+cancer+cytogenetics+and+molecular+cytogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics.</a> Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).</li>
<li>Miura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulated+Chromosomal+Instability+in+Murine+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Leads+to+Malignant+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation.</a> Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).</li>
<li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+In+vitro+Expansion+Alters+the+Biology+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells.</a> Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).</li>
<li>Dekel-Naftali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+human+pluripotent+stem+cells+using+CGH+and+FISH+reveals+low-grade+mosaic+aneuploidy+and+a+recurrent+amplification+of+chromosome+1q%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q.</a> Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).</li>
<li>Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Technique+for+Chromosomal+Analysis+of+Human+ES+and+iPS+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev.+Rep%22%5BJournal%5D)">An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).</li>
<li>Bayani, J., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+banding+of+chromosomes+for+cytogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).</li>
<li>Speicher, M. R., Carter, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+cytogenetics%3A+blurring+the+boundaries+with+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lymphocyte+Culture+and+Chromosome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).</li>
<li>Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarch%2C+MJ+%22The+Association+of+Genetic+Technologists+Cytogenetics+Laboratory+Manual.+San+Francisco%3A+3rd+edition%22">The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition</a>. , ACT. Houston, TX. (1997).</li>
<li>Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+studies+in+neoplastic+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22In+Clinical+Laboratory+Medicine%2C+2nd+edition%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders.</a> In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).</li>
<li>Kibe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7R%CE%B1+deficiency+in+p53%28null%29+mice+exacerbates+thymocyte+telomere+erosion+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Different%22%5BJournal%5D)">IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis.</a> Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).</li>
<li>Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+of+a+boy+with+trisomy+of+16q22--%3Eqter+due+to+paternal+Y%3B+16+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Dysmorphol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation.</a> Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).</li>
<li>Tsien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+culture+of+normal+chorionic+villus+cells+yields+ICF+syndrome-like+chromatin+decondensation+and+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements.</a> Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li>
<li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+conventional+cytogenetics+%28G-banding%29%2C+comparative+genomic+hybridization+%28CGH%29+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+%28i-FISH%29+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykorzystaliśmy obecną procedurę do izolacji chromosomów z komórek różnych organizmów, w tym różnych typów komórek uzyskanych od ludzi, makaków rezusów, szczurów i myszy11,20-22. Dostępny jest standardowy protokół, ale niektóre kluczowe kroki i zmienne mogą wymagać dostosowania do tych różnych typów komórek. Zarówno w przygotowaniu chromosomów, jak i w prążku G kluczowe jest kilka konkretnych etapów, aby zapewnić najlepszą możliwą jakość wyników. Jedną ze zmiennych, które mogą mieć wpływ na wynik testu, jest c...

Analiza chromosomów jest konwencjonalną techniką stosowaną na całym świecie do diagnozowania niestabilności chromosomów i rearanżacji prowadzących do zaburzeń genetycznych i nowotworów złośliwych1,2,8,9. Ponadto, wyższa rozdzielczość dla diagnozy i badań konstytucyjnych i nabytych przez raka nieprawidłowości genetycznych może być osiągnięta dzięki połączeniu klasycznych procedur cytogenetycznych i metodologii cytogenetyki molekularnej, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY)14,15. Ostatnio techniki te zostały wykorzystane do oceny niestabilności chromosomów związanej z badaniami nad komórkami macierzystymi. Nieprawidłowości kariotypowe, takie jak aneuploidia długotrwale hodowanych komórek embrionalnych (ES) i dorosłych komórek macierzystych różnych organizmów, zostały zgłoszone przez wiele laboratoriów. Najnowsze dowody potwierdzają, że niektóre linie komórkowe są z natury bardziej skłonne do niestabilności chromosomów, niezależnie od warunków hodowli. Z tego powodu przy tworzeniu i/lub utrzymywaniu linii komórek macierzystych ludzkich, mysich lub rezusów zaleca się analizę chromosomów jako część procesu kontroli jakości. Wiele doniesień opisuje rosnące zainteresowanie stosowaniem cytogenetyki rutynowej i molekularnej do monitorowania stabilności chromosomalnej komórek macierzystych i komórek nowotworowych lub różnych organizmów w hodowli10-13. Protokoły te są coraz częściej wykorzystywane przez laboratoria niegenetyczne do szybkiej oceny chromosomów hodowanych komórek13. Przedstawiamy nasze podstawowe procedury preparacji chromosomów z różnych typów komórek, które mogą być stosowane zarówno do celów klinicznych, jak i badawczych oraz komórek pochodzących z różnych organizmów.

<table><tbody><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Gibco</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Trypsyna EDTA 10x</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr> Tabletki buforowe <tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>"GURR"</td><td>Gibco</td><td>10580-013</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa Stain</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3250-16</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5810</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>6700130</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Krackeler Scientific Inc.</td><td>Numer katalogowy: 11-9508-05</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Analiza chromosomów (cytogenetyczna) jest szeroko stosowana do wykrywania niestabilności chromosomów. Po zastosowaniu pasm G i technik molekularnych, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), test ten ma potężną zdolność do analizowania pojedynczych komórek pod kątem aberracji, które obejmują zyski lub straty części genomu oraz rearanżacje obejmujące jeden lub więcej chromosomów. U ludzi nieprawidłowości chromosomowe występują u około 1 na 160 żywych urodzeń1,2, 60-80% wszystkich poronień3,4, 10% martwych urodzeń2,5, 13% osób z wrodzonymi wadami serca6, 3-6% przypadków niepłodności2 oraz u wielu pacjentów z opóźnieniem rozwoju i wadami wrodzonymi7. Analiza cytogenetyczna nowotworu złośliwego jest rutynowo stosowana przez badaczy i klinicystów, ponieważ wykazano, że obserwacje klonalnych nieprawidłowości chromosomowych mają znaczenie zarówno diagnostyczne, jak i prognostyczne8,9. Izolacja chromosomów jest nieoceniona w terapii genowej i badaniach nad komórkami macierzystymi organizmów, w tym naczelnych i gryzoni10-13.
Chromosomy mogą być izolowane z komórek żywych tkanek, w tym limfocytów krwi, fibroblastów skóry, amniocytów, łożyska, szpiku kostnego i próbek nowotworów. Chromosomy są analizowane na etapie metafazy mitozy, kiedy są najbardziej zagęszczone, a zatem wyraźniej widoczne. Pierwszy etap techniki izolacji chromosomów polega na rozerwaniu włókien wrzeciona poprzez inkubację z Colcemidem, aby zapobiec przejściu komórek do kolejnego etapu anafazy. Komórki są następnie traktowane roztworem hipotonicznym i konserwowane w stanie spuchniętym za pomocą utrwalacza Carnoya. Komórki są następnie umieszczane na szkiełkach i mogą być następnie wykorzystywane do różnych procedur. G-banding polega na leczeniu trypsyną, a następnie barwieniu Giemsa w celu stworzenia charakterystycznych jasnych i ciemnych pasm. Ta sama procedura izolacji chromosomów może być stosowana do przygotowania komórek do procedur takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY)14,15.

Wysokiej jakości preparaty rozprzestrzenionych metafaz są niezbędne do analizy chromosomów. Prawidłowo przeprowadzony test pozwala uzyskać chromosomy, które są dobrze rozdzielone i posiadają odpowiednią morfologię. Prawidłowo opasione chromosomy (G-banding) wykazują charakterystyczne jasne i ciemne wzory prążkowania.
<img alt="Schemat preparatu chromosomów, analiza kariotypu, wizualizacja badania genetycznego." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upl...

Chromosomy mogą być izolowane z żywych komórek, takich jak limfocyty czy fibroblasty skóry, oraz z organizmów, w tym ludzi i myszy. Te preparaty chromosomowe mogą być dalej wykorzystywane do rutynowych prążków G i procedur cytogenetyki molekularnej, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY).

Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbioru i przygotowania chromosomów do barwienia prążkowego GB oraz molekularnych testów cytogenetycznych. W pierwszej kolejności należy hodować komórki do fazy logarytmicznej. Następnie chromosomy zbiera się z wykorzystaniem smid, roztworu hipotonicznego oraz utrwalacza.Nanieś zawiesinę komórkową na szkiełka przedmiotowe. Zabarw jedno szkiełko. W celu monitorowania preparacji chromosomowej, pozostałe szkiełka poddaj pasmowaniu GB lub technikom molekularnym.W ramach ostatniego etapu barwienia GB należy przeanalizować chromosomy za pomocą mikroskopii świetlnej i kariotypowania. Ostatecznie chromosomy i jądra będą dostępne do kariotypowania lub hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH). Pomysł opublikowania tej metody pojawił się u mnie ze względu na duże zapotrzebowanie ze strony innych badaczy proszących o pomoc w wykrywaniu niestabilności chromosomowej w różnych typach komórek z różnych organizmów oraz w późniejszych badaniach cytogenetyki molekularnej.Technika ta jest niezbędna w diagnostyce i ostatecznie w prognozowaniu wielu wrodzonych zaburzeń genetycznych, w tym nowotworów, ponieważ umożliwia wizualizację diagnostycznych rearanżacji chromosomowych. W przypadku tych schorzeń metoda ta może dostarczyć informacji o rearanżacjach chromosomowych występujących w różnych typach ludzkich komórek. Może być ona również stosowana do komórek innych organizmów, takich jak kultury komórek makaków rezusa, szczurów i myszy.2 miliony przylegających komórek do 80% konfluencji i dodanie 10 µL stężenia 10 µg/mL na 1 mln komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 45 minut.Następnie, używając sterylnej pipety, przenieś pożywkę z hodowli do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i zachowaj ją do późniejszego użycia. Aby wypłukać komórki, dodaj do kolby dwa mililitry HBSS, zamieszaj i usuń bufor. Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny, upewniając się, że pokrywa ona całą powierzchnię kolby. Gdy większość komórek się odłączy, przenieś pipetą pożywkę z probówki stożkowej z powrotem na komórki.Przenieś 10 ml zawiesiny komórkowej do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Wirowkuj przy 200 Gs przez 10 minut. Usuń nadosad.Resuspenduj osad w 10 ml 75 mM chlorku potasu, który należy uprzednio podgrzać do 37 °C, po 10-minutowej inkubacji w temperaturze 37 °C. Centryfuguj z prędkością 200 ×g przez pięć minut. W temperaturze 25 °C usuń cały nadsącz poza 0,5 ml i ostrożnie resuspenduj osad.Do komórek należy dodać pięć mililitrów świeżego utrwalacza car noise. Następnie należy dodać kolejne pięć mililitrów utrwalacza i odwirować w wirówce typu vortex przy 200 Gs przez pięć minut. Każdy osad komórkowy należy zawiesić w pięciu mililitrach utrwalacza.Przechowywać komórki w temperaturze 4°C do jednego roku. Wirować komórki z przeciążeniem 200 ×g przez pięć minut. W temperaturze 25°C.Usunąć nadsącz, aż po delikatnym resuspensowaniu osadu pozostanie jedynie 0,3 do 0,5 mililitra. Nanieść pipetą trzy krople zawiesiny komórkowej z odległości około dwóch cali na szkiełko podstawowe nachylone pod kątem około 45 stopni, a następnie pozwolić zawiesinie rozpłynąć się po powierzchni szkiełka.Nanieś jedną dużą kroplę świeżego utrwalacza na szkiełko. Osusz tył szkiełka ręcznikiem papierowym, a następnie pozostaw szkiełko do całkowitego wyschnięcia. Przygotuj świeży roztwór podtrzymujący.Umieść preparaty na statywie do barwienia. Całkowicie pokryj preparaty roztworem podtrzymującym GIM. Po pięciu minutach opłucz preparaty wodą destylowaną, odlej nadmiar płynu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.Nanieś cztery krople medium montażowego Perm Mount na preparat i nałóż szkiełko cover slip, upewniając się, że pod szkiełkiem nie ma pęcherzyków powietrza. Usuń nadmiar medium montażowego za pomocą ręcznika papierowego. Przeanalizuj komórki pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 10x i 100x.Jeśli komórki w metafazie są liczne i dobrze rozprzestrzenione, pozostałe szkiełka mogą zostać wykorzystane do innych procedur eksperymentalnych. Do czterech słoików Copelanda należy dodać po 50 milliliters roztworów traktujących. Następnie każde szkiełko zanurza się w słoiku numer jeden na pięć sekund.Szybko opłucz preparat w słoiku numer dwa. Pozostaw go w słoiku numer trzy na co najmniej 30 seconds. Opłucz w słoiku numer cztery, a następnie pozwól preparatom wyschnąć.Przygotuj świeży roztwór podtrzymujący GIM. Umieść preparaty na statywie do barwienia. Przykryj cały preparat roztworem podtrzymującym GIM na pięć minut.Opłucz preparaty wodą destylowaną w tej samej kolejności, w jakiej były barwione. Następnie susz przez co najmniej 10 minut. Nałóż szkiełko cover slip, używając medium montażowego perm mount, zgodnie z wcześniejszą instrukcją.Następnie przeanalizować komórki na pozostałych preparatach pod mikroskopem świetlnym. Dostosować czas inkubacji z trypsyną na podstawie wyników otrzymanych z pierwszego preparatu.Prawidłowo przeprowadzony test pozwala na uzyskanie dobrze rozprzestrzenionych chromosomów o odpowiedniej morfologii. Prawidłowo prążkowane metodą GB chromosomy wykazują charakterystyczne jasne i ciemne prążki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak preparować chromosomy do prążkowania GB oraz dalszych badań cytogenetycznych metodą molekularną w celu wyjaśnienia niestabilności chromosomowej.Po opanowaniu techniki, proces zbierania może zająć około trzech godzin, jeśli zostanie przeprowadzony prawidłowo. W przypadku procedury prążkowania GB ważne jest, aby początkowo przetestować czas inkubacji z trypsyną na jednym szkiełku przed przejściem do prążkowania GB na pozostałych szkiełkach.

chromosome-preparation-from-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie chromosomów z hodowli komórek

Kariotypowanie jest prostą i użyteczną techniką powszechnie stosowaną do wykrywania zmian genetycznych. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowy protokół przygotowania preparatów rozprzestrzeniających chromosomy z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w celu monitorowania stanu chromosomowego tych komórek utrzymywanych w hodowli.

Przygotowanie rozprzestrzenionego preparatu chromosomów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do analizy kariotypu

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Szlaki naprawy DNA są niezbędne do utrzymania integralności genomu oraz zapobiegania mutacjom i nowotworom. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie niestabilności genomu poprzez bezpośrednią obserwację aberracji chromosomowych w rozprzestrzenianiu się metafazy z mysich komórek B przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) dla powtórzeń telomerowego DNA.

Szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B przez PNA-FISH

Molekularne mechanizmy dekondensacji wysoce zagęszczonej chromatyny mitotycznej są źle zdefiniowane. Przedstawiamy bezkomórkowy test oparty na mitotycznych klastrach chromatyny wyizolowanych z komórek HeLa i ekstraktu z jaj Xenopus laevis, który wiernie odtwarza proces dekondensacji in vitro.

Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

Opisano protokół przygotowania wysokiej jakości rozsiewów mitotycznych chromosomów roślinnych metodą szybkiego upuszczania na sucho, odpowiednią do wykrywania FISH pojedynczych i wysokokopijnych sond DNA.

Szybka metoda przygotowania chromosomów do opadania na powietrzu odpowiednia dla RYB w roślinach

Ten protokół opisuje techniki kwantyfikacji i charakterystyki aberracji chromosomowych in vitro w makrofagach myszy RAW264.7 po leczeniu cząstkami powietrza atmosferycznego.

Analiza aberracji chromosomowych wywołanych przez pył zawieszony w otoczeniu przy użyciu systemu in vitro

To jest metoda identyfikacji nowych białek oddziałujących z DNA w określonych docelowych loci, polegająca na specyficznym dla sekwencji wychwytywaniu usieciowanej chromatyny do kolejnych analiz proteomicznych. Nie jest wymagana żadna wcześniejsza wiedza na temat potencjalnych białek wiążących ani modyfikacji komórek. Początkowo opracowana dla drożdży, technologia została obecnie zaadaptowana do komórek ssaków.

Adaptacja wychwytywania hybrydyzacji białek związanych z chromatyną do proteomiki komórek ssaków

Połączenie preparatów halo DNA z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ umożliwia analizę interakcji genomowych z nukleoszkieletem w wysokiej rozdzielczości. Przyłączony genom prowadzi do zhybrydyzowanych sygnałów fluorescencyjnych zlokalizowanych w resztkowych wyekstrahowanych jądrach, podczas gdy nieprzyłączony genom znajduje się w halo DNA otaczającym resztkowe jądra.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ na preparatach DNA Halo w celu ujawnienia całych chromosomów, telomerów i loci genów

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Naucz się przygotowywać chromosomy z hodowanych komórek do badań cytogenetycznych, w tym G-banding i FISH. Ta metoda umożliwia analizę niestabilności chromosomalnej w komórkach ludzkich i mysich.

Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Przeglądaj więcej filmów