Name: Błony ER związane z mitochondriami (MAM) i mikrodomeny wzbogacone w glikosfingolipidy (GEM): izolacja od mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę izolacji błon ER związanych z mitochondriami (MAM) oraz mikrodomen wzbogaconych w glikosfingolipidy (GEM) z mózgu myszy. Technika ta umożliwia badanie metabolizmu komórkowego w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy wkład Renaty Sano w opracowanie wstępnego protokołu. A.d'A. posiada Katedrę Genetyki i Terapii Genowej Jewelers For Children (JFC). Praca ta została częściowo sfinansowana przez granty NIH GM60905, DK52025 i CA021764 oraz American Libańsko-Syryjskie Organizacje Charytatywne (ALSAC).

Następujący protokół jest przeznaczony do izolacji i oczyszczania MAM i GEM-ów z mózgu myszy.
Rozwiązania wymagane do izolacji mitochondriów, MAM i GEM.
Frakcjonowanie w celu uzyskania surowego preparatu mitochondrialnego:
Roztwór A: 0,32 M Sacharozy, 1 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2 + inhibitory proteazy (dodać świeże, w razie potrzeby).
Roztwór B: 0,32 M Sacharozy, 1 mM NaHCO3 + inhibitory proteazy (dodać świeże, w razie potrzeby).
Izolacja MAM:
Medium izolacyjne: 250 mM Mannitol, 5 mM HEPES pH 7.4, 0.5 mM EGTA, 0.1% BSA.
Bufor gradientowy: 225 mM Mannitol, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (stężenie końcowe).
Izolacja GEMs:
Bufor do ekstrakcji GEM: 25 mM HEPES pH 7.5, 0.15 M NaCl, 1% Triton X-100 + inhibitory proteazy (dodać świeże, w razie potrzeby).
GEM Bufor solubilizujący: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + inhibitory proteazy (dodać świeże, w razie potrzeby).
1. Pierwszy etap frakcjonowania subkomórkowego: usuwanie jąder, niezlizowanych komórek i resztek komórkowych
<ol>
 <li>Poddaj mysz eutanazji w komorze CO2.
 </li>
 <li>Natychmiast wyjąć mózg, przekroić na pół, umieścić w probówkach o pojemności 2 ml na lodzie i zważyć. </li>
</ol>
Uwaga: Utrzymuj połówki mózgu oddzielnie przez cały czas trwania procedury. Poniższe zasady dotyczą leczenia pojedynczej połówki mózgu. 
<ol start="3">
 <li>Umieść pół mózgu we wstępnie schłodzonym szklanym młynku do tkanek o pojemności 2 ml zawierającym 1 ml zimnego roztworu A. Homogenizuj za pomocą łącznie 15 pociągnięć dużym tłuczkiem do prześwitu. </li>
 <li>Przenieść do 15 ml probówki Falcon na lodzie i rozcieńczyć homogenaty do 10 objętości w/v, np. 0,225 g do 2,25 ml. </li>
 <li>Odwirować próbkę o masie 1 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
 </li>
 <li>Ostrożnie usunąć supernatant i przenieść na lód do 30 ml okrągłej szklanej probówki wirówkowej. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu. </li>
 <li>Zawiesić osad w tych samych 10 objętościach roztworu A. Homogenizować w tym samym młynku, wykonując 3-6 pociągnięć małym tłuczkiem do prześwitu, po 1 ml na raz. </li>
 <li>Przenieść do świeżej probówki sokoła o pojemności 15 ml i odwirowywać przy stężeniu 710 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. W ten sposób powstaje osad jąder i szczątków komórkowych. </li>
 <li>Ostrożnie usunąć supernatant i połączyć go z supernatantem zapisanym w kroku 1.6. </li>
</ol>
2. Drugi krok: Surowa izolacja mitochondriów
<ol>
 <li>Odwirować supernatanty przy 13 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. </li>
 <li>Przenieść supernatant do ultra-przezroczystej probówki wirówkowej Beckmana, na lodzie </li>
 <li>Zawiesić osad w 10 tomach Roztwór A. Homogenizować w tym samym młynku, wykonując 3-6 pociągnięć małym tłuczkiem do prześwitu, po 1 ml na raz. </li>
 <li>Odwirować jako krok 2.1. </li>
 <li>Powtórz kroki 2.2-2.4. </li>
 <li>Powstały osad jest wzbogaconą frakcją mitochondrialną. Zebrać supernatanty (cytozol i ER), przykryć parafilmem i trzymać na lodzie.</li>
 <li>Zawiesić osad za pomocą 6 pociągnięć małym tłuczkiem do prześwitywania w 4,8 ml/g (g odnosi się do pierwotnej masy mózgu) roztworu B, w świeżym homogenizatorze. </li>
 <li>Używając szklanych pipet Pasteura, przygotuj nieciągły gradient sacharozy w ultra-przezroczystej probówce wirówkowej Beckmana, dodając następnie na dno probówki w następujący sposób, ostrożnie, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki: 
 Granulat regenerowany (0,32 m sacharozy) 
 3 ml 850 mM Sacharozy (w 1 mM NaHCO3) 
 3 ml 1 M Sacharozy (w 1 mM NaHCO3) 
 3 ml 1,2 M Sacharozy (w 1 mM NaHCO3) </li>
 <li>Wirować przy 82 500 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Powstałe oddzielenie na końcu gradientu wytworzy trzy prążki i osad: 1) mielinę i inne zanieczyszczenia błonowe (granica faz 0,32 M - 0,85 M); 2) ER, Golgiego, błony plazmatyczne (interfejs 0,85 M - 1 M); 3) synaptosomy (interfejs 1 M - 1,2 M); 4) surowe mitochondria (osady), które są wykorzystywane do kolejnych etapów oczyszczania
 
</li>
</ol>
3. Izolacja błony ER związanej z mitochondriami, MAM
<ol>
 <li>Zawiesić świeżo wyizolowane surowe mitochondria z jednej połówki mózgu w 2 ml pożywki izolacyjnej zawierającej świeżo dodane inhibitory proteazy. 
 </li>
 <li>Przygotuj 30% gradient Percoll z buforem gradientowym 8 ml na pół mózgu i umieść w ultra-przezroczystej probówce wirówkowej Beckmana. </li>
</ol>
* Uwaga: Zwiększ stężenie gradientu (1,43 razy), aby osiągnąć prawidłowe stężenie końcowe po rozcieńczeniu Percollu do 30%.
<ol start="3">
 <li>Nakładaj zawiesinę mitochondrialną na przygotowany gradient POWOLI, aby uniknąć pęcherzyków.</li>
 <li>Wirować przy 95 000 x g przez 30 min, 4 °C.
 </li>
 <li><ol class="lroman">
 <li> Najpierw usuń frakcję ciężką (dolny pasek) szklaną pipetą Pasteura i przenieś do świeżej szklanej probówki z okrągłym dnem na lodzie.</li>
 <li> Usunąć lekką frakcję (górny pasek) DRUGĄ za pomocą kolejnej szklanej pipety Pasteura i przenieść do oddzielnej świeżej szklanej probówki z okrągłym dnem na lodzie. </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Rozcieńczyć obie frakcje zebrane w kroku 3.5 10 ml pożywki izolacyjnej i odwirować przy 6 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
 </li>
 <li>Odrzucić supernatant z frakcji ciężkiej otrzymanej w kroku 3.6, ponownie zawiesić osad z kolejnym 10 ml pożywki izolacyjnej i ponownie odwirować, zgodnie z krokiem 3.6. Powstała osadka będzie czystą frakcją mitochondrialną. </li>
 <li>Przenieść supernatant z frakcji lekkiej otrzymanej w kroku 3.6 do ultra-przezroczystej probówki wirówkowej Beckmana na lodzie. Wyrzuć granulkę. </li>
 <li>Dodać wystarczającą ilość pożywki izolacyjnej do supernatantu otrzymanego w kroku 3.8, aby napełnić probówkę i odwirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Powstały osad będzie frakcją MAM. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. </li>
</ol>
Uwaga: Na tym etapie możesz również odwirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę, 4 °C supernatant zapisany w kroku 2.6. Osad będzie frakcją ER, a supernatant frakcją cytozolową.
4. Ekstrakcja mikrodomen wzbogaconych glikosfingolipidami, GEM-y 
<ol>
 <li>Lizować czyste mitochondria i/lub frakcje MAM w 500 μl-1 ml buforu ekstrakcyjnego przez 20 minut na lodzie.</li>
 <li>Odwirować lizaty przy 15 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. </li>
 <li>Zebrać supernatanty (materiał rozpuszczalny Triton X-100) i ponownie odwirować granulki przez 2 minuty, aby usunąć pozostały rozpuszczalny materiał. (Mitochondria wyekstrahowane Triton X-100 i/lub MAM wyekstrahowane Triton X-100).</li>
 <li>Rozpuszczaj granulki w buforze do rozpuszczania. Ten rozpuszczony materiał reprezentuje frakcje GEM i może być wykorzystany do dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2%2B+signaling+in+smooth+muscle%3A+why+two+membranes+are+better+than+one%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li>
<li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+%28SOCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li>
<li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum%3A+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li>
<li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca%282%2B%29-dependent+mitochondrial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li>
<li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot%3A+The+mitochondria-associated+membrane+%28MAM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li>
<li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li>
<li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li>
<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+with+high+Ca2%2B+close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li>
<li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li>
<li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li>
<li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER-mitochondria+interface%3A+the+social+network+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li>
<li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li>
<li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li>
<li>Pizzo, P., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+lipid+rafts%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte lipid rafts: structure and function.</a> Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Miejsca kontaktu między błonami wewnątrzkomórkowymi lub między organellami a błoną plazmatyczną komórek reprezentują dynamiczne platformy sygnalizacyjne dla podstawowych procesów komórkowych. Dokładna charakterystyka ich funkcji i składu zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych wymaga wiarygodnych i powtarzalnych protokołów oczyszczania. Opisane tutaj metody zostały specjalnie zoptymalizowane przez nasze laboratorium do izolacji i oczyszczania MAM i odpowiadających im GEM z mózgu dorosłej myszy. Protokół...

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Frakcjonowanie</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu, sześciowodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia, dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">MAM </td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9546-250G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378-250G</td><td></td></tr><tr><td>BSA, frakcja V, szok cieplny, liofilizat</td><td>Roche</td><td>03-116-964-001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">GEM </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Roche</td><td>03-118-142-001</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silne>powszechne</silne> </td></tr><tr><td>tabletki inhibitorów proteazy, kompletne wolne od EDTA</td><td>Roche</td><td>11-873-580-001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>SPRZĘT</silny> </td></tr><tr><td>2 ml Douce Młynki do tkanek All-Glass</td><td>Kimble Chase</td><td>885300-0002</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu, BD Falcon</td><td>BD</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Probówki wirówkowe ze szkła okrągłodennego</td><td>Kimble Chase</td><td>45500-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki wirówkowe ze szkła okrągłodennego</td><td>Kimble Chase</td><td>45500-15</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek, Ultra-Clear, cienkościenne, 14x89 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Cole-Parmer</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego, 9"</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr></tbody></table>

błony er związane z mitochondriami (mam) i mikrodomeny wzbogacone w glikosfingolipidy (gem): izolacja od mózgu myszy

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Wewnątrzkomórkowe organelle to wysoce dynamiczne struktury o różnym kształcie i składzie, które są poddawane specyficznym dla komórki sygnałom wewnętrznym i zewnętrznym. Ich błony są często zestawione w określonych miejscach kontaktu, które stają się węzłami wymiany cząsteczek sygnałowych i składników błony1,2,3,4. Mikrodomeny błony międzyorganellarnej, które powstają między retikulum endoplazmatycznym (ER) a mitochondriami przy otwarciu wrażliwego na IP3 kanału Ca2 +, są znane jako błony ER związane z mitochondriami lub MAM4,5,6. Skład białkowo-lipidowy i właściwości biochemiczne tych miejsc kontaktu z błoną zostały szeroko zbadane, szczególnie w odniesieniu do ich roli w regulacji wewnątrzkomórkowego Ca2 + 4,5,6. ER służy jako główny magazyn wewnątrzkomórkowego Ca2 + i w tym charakterze reguluje niezliczone procesy komórkowe poniżej sygnalizacji Ca2 +, w tym potranslacyjne fałdowanie białek i dojrzewanie białek7. Z drugiej strony mitochondria utrzymują homeostazęCa2+, buforując stężenie Ca2+ w cytozolu, zapobiegając w ten sposób inicjacji szlaków apoptotycznych poniżej nierównowagi Ca2+ 4,8. Dynamiczna natura MAM sprawia, że są one idealnymi miejscami do analizy podstawowych mechanizmów komórkowych, w tym sygnalizacji Ca2 + i regulacji stężenia mitochondrialnego Ca2 +, biosyntezy i transportu lipidów, metabolizmu energetycznego i przeżycia komórek 4,9,10,11,12. Opisano kilka protokołów oczyszczania tych mikrodomen z tkanki wątroby i hodowanych komórek13,14. 
 Biorąc pod uwagę wcześniej opublikowane metody, dostosowaliśmy protokół izolacji mitochondriów i MAM od mózgu dorosłej myszy. Do tej procedury dodaliśmy dodatkowy etap oczyszczania, a mianowicie ekstrakcję Triton X100, która umożliwia wyizolowanie frakcji mikrodomen wzbogaconych glikosfingolipidami (GEM) w MAM. Te preparaty GEM mają kilka wspólnych składników białkowych z kaweolami i tratwami lipidowymi, pochodzącymi z błony plazmatycznej lub innych błon wewnątrzkomórkowych, i proponuje się, aby działały jako punkty gromadzenia się białek receptorowych i interakcji białko-białko4,15.

W oparciu o nasze doświadczenia z zastosowaniem tego protokołu, możemy go bezpiecznie zarekomendować do izolacji i oczyszczania MAM, GEM oraz frakcji mitochondrialnych z mózgu myszy. Opisana procedura jest wysoce powtarzalna i spójna. Na Rysunku 1 przedstawiamy reprezentacyjny obraz tego, w jaki sposób czyste mitochondria i MAM układają się w gradiencie Percoll (krok 3.4). Wyraźny, mleczny prążek zawierający oczyszczone mitochondria (Mito-P) wydziela się na dnie probówki do ultrawirówki, podczas gdy frak...

Ta procedura ilustruje, jak wyizolować z mózgu dorosłej myszy błony ER związane z mitochondriami lub MAM oraz frakcje mikrodomen wzbogacone glikosfingolipidami z MAM i preparatów mitochondrialnych.

Błony ER związane z mitochondriami (MAM) i mikrodomeny wzbogacone w glikosfingolipidy (GEM): izolacja od mózgu myszy

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja mitochondriów, błon retikulum endoplazmatycznego, mikrodomen lub MAM z mózgu myszy; następnie z oczyszczonych MAM ekstrahuje się frakcje mikrodomen wzbogacone w lipidy glyco-finger lub GEM. Jest to osiągane poprzez najpierw wycięcie mózgu myszy, który następnie homogenizuje się w specyficznym buforze przy użyciu homogenizatora Dounce. Otrzymany homogenat poddaje się wirowaniu z niską prędkością w celu usunięcia jąder komórkowych, niezniszczonych komórek oraz resztek komórkowych.Drugim krokiem jest przygotowanie surowej frakcji mitochondrialnej. Poprzez dalsze wirowanie nadsądu otrzymany osad zostaje resuspendowany i dalej rozdzielany z wykorzystaniem nieciągłego gradientu sacharozy. Następnie surową frakcję mitochondrialną nanosi się na gradient Percoll.Po wirowaniu i kilku etapach przemywania otrzymuje się czystą frakcję mitochondrialną oraz MAMs. Ostatnim krokiem jest potraktowanie MAMs roztworem zawierającym TRITTON X 100 w celu wyodrębnienia frakcji mikrodomen wzbogaconych w lipidy glyco finger. Ostatecznie czystość frakcji jest weryfikowana za pomocą analiz western blot z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko markerom białkowym charakterystycznym dla poszczególnych frakcji organelli.Główną zaletą tej procedury w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że została ona dostosowana do izolacji frakcji mitochondriów, MAM oraz GEM z mózgu dorosłych myszy przy użyciu stosunkowo niewielkiej ilości materiału badawczego. Ta zoptymalizowana procedura jest bardzo powtarzalna i umożliwia izolację wystarczających ilości różnych frakcji organellowych do wykorzystania przez badaczy, zwłaszcza w dziedzinie neurobiologii, do analizy interesujących ich białek. Procedurę tę zaprezentuje technik z mojego laboratorium.Po wyjęciu mózgu myszy uśmierconej dwutlenkiem węgla, rozpocząć procedurę od przecięcia mózgu na pół. Umieścić każdą połowę w osobnej probówce o pojemności 2 ml na lodzie. Zważyć probówki, używając pustej, schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 2 ml do wytarowania wagi, a następnie przechowywać je na lodzie.Przenieś połowę mózgu do schłodzonego szklanego homogenizatora o pojemności dwóch mililitrów zawierającego jeden mililitr zimnego roztworu do frakcjonowania. Homogenizuj za pomocą tłuczka o dużym prześwicie, wykonując łącznie 15 pociągnięć. Umieść homogenizat w sterylnej probówce typu Falcon o pojemności 15 mililitrów na lodzie i rozcieńcz do 10 objętości zimnego roztworu do frakcjonowania A, w zależności od masy próbki.Następnie odwiruj próbkę z prędkością 1 400 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usuń nadsącz, dbając o to, aby nie naruszyć osadu, i przenieś go do szklanej probówki wirówkowej o okrągłym dnie o pojemności 30 ml, umieszczonej w lodzie. Następnie resuspenduj osad w 10 objętościach roztworu do frakcjonowania.Uhomogenizować zawiesinę z osadu w tym samym homogenizatorze, przetwarzając po 1 ml materiału. Tym razem wykonać od trzech do sześciu ruchów tłuczkiem o małym prześwicie. Połączyć homogenizat w probówce typu Falcon o pojemności 15 ml i odwirować z siłą 710 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.Powoduje to powstanie jąder komórkowych oraz szczątków komórkowych. Ostrożnie usuń nadsącz i połącz go z poprzednim nadsączem zachowanym z wcześniejszego wirowania; aby rozpocząć izolację mitochondriów, odwiruj nadsącze z prędkością 13 800 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie przenieś nadsącz do probówki do wirówki UltraClear Beckman w lodzie.Resuspenduj osady zawierające frakcję mitochondriów w 10 objętościach roztworu do frakcjonowania A i homogenizuj po jednym mililitrze na raz. Tym razem wykonaj od trzech do sześciu pociągnięć tłokiem homogenizatora z niewielkim prześwitem, łącząc homogenaty w nowej 30 mililitrowej szklanej probówce wirówkowej o okrągłym dnie w lodzie. Dalszą puryfikację próbki przeprowadź, powtarzając te kroki jeszcze raz.Odwiruj homogenat. Pobierz supernatranty S i ponownie zhomogenizuj osad komórkowy, przetwarzając go po 1 ml po zawieszeniu w 10 objętościach roztworu A. Następnie resuspenduj osad zawierający wzbogaconą frakcję mitochondrialną w 4,8 ml roztworu do frakcjonowania B na gram pierwotnej masy mózgu; zhomogenizuj go, wykonując sześć ruchów tłuczkiem o małym prześwicie w nowym homogenizatorze, a następnie przechowuj ten homogenat na lodzie. Następnie przygotuj nieciągły gradient sacharozy w probówce wirówki UltraClear firmy Beckman.Najpierw dodaj resuspenderowany osad, a następnie trzy mililitry 850 mM sacharozy, trzy mililitry 1 M sacharozy i na koniec trzy mililitry 1,2 M sacharozy. Należy dodawać roztwór powoli od dna, aby zapobiec powstaniu pęcherzyków powietrza. Na koniec wiruj przy 82 500 ×g przez dwie godziny w temperaturze 4 °C.W wyniku rozdziału powstaną trzy frakcje oraz osad. Osad zawiera surowe mitochondria, które zostaną wykorzystane w kolejnych etapach oczyszczania. Resuspenduj świeżo wyizolowane surowe mitochondria z jednej połowy mózgu w 2 mL medium izolacyjnego.Następnie do nowej probówki wirówki UltraClear Beckman należy dodać osiem mililitrów gradientu 30%per core. Zawiesinę mitochondriów należy bardzo powoli nanieść na wierzch przygotowanego gradientu, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie próbkę wiruje się przy 95 000 ×g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsius, aby uzyskać separację gradientową.Najpierw, za pomocą szklanej pipety Pasteura, należy usunąć frakcję ciężką, która stanowi dolny prążek, i przenieść ją do nowej szklanej probówki z okrągłym dnem. Probówkę należy przechowywać w lodzie. Następnie, nową szklaną pipetą Pasteura, należy usunąć frakcję lekką, która stanowi górny prążek, i przenieść ją do oddzielnej nowej szklanej probówki z okrągłym dnem.Tę probówkę należy również umieścić w lodzie. Obie frakcje rozcieńczyć 10 mililitrami medium izolacyjnego i odwirować przy 6 300 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadsącz z frakcji ciężkiej i resuspender osad w kolejnych 10 mililitrach medium izolacyjnego.Ponownie odwiruj próbkę w tych samych warunkach. Otrzymany osad będzie stanowił czystą frakcję mitochondrialną. Następnie przenieś nadsącz z frakcji lekkiej do probówki wirówkowej UltraClear firmy Beckman w lodzie.Osad z tej frakcji jest odrzucany, ponieważ zawiera zanieczyszczające mitochondria. Do nadsączu z frakcji lekkiej należy dodać odpowiednią ilość medium izolacyjnego, aby wypełnić probówkę, a następnie wirować z prędkością 100, 000 ×g przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsius. Powstały osad będzie zawierał błony retikulum endoplazmatycznego powiązane z mitochondriami, czyli MAMs.Ostrożnie odlej i zutylizuj nadsącz. Rozpocznij ekstrakcję glikolipidowych mikrodomen wzbogaconych w lipidy (gemm), inkubując frakcję MAM w 500 µL do 1 mL buforu do ekstrakcji na lodzie przez 20 minut. Następnie odwiruj lizat z prędkością 15 300 ×g przez dwie minuty w temperaturze 4 °C.Zebrać nadsącz i odwirować osad przez dwie minuty, aby usunąć pozostały materiał rozpuszczalny w Triton X-100, a następnie zawiesić osad w buforze solubilizującym. Ten zsolubilizowany materiał stanowi frakcje GEM i może być wykorzystany do dalszych analiz. Wykonano analizę Western blot w celu sprawdzenia czystości oraz rozkładu markerów retikulum endoplazmatycznego, białek cytozolowych i markerów mitochondrialnych w frakcji cytozolowej.Frakcja retikulum endoplazmatycznego, czysta frakcja mitochondrialna oraz frakcja MAMs. Analizy Western blot wykazały również, że gems były dodatnie w odniesieniu do cavi in one, markera cli, oraz ujemne dla białek retikulum endoplazmatycznego i białek mitochondrialnych. Z kolei MAMs ekstrahowane Tritonem X 100 były dodatnie dla markerów retikulum endoplazmatycznego i mitochondrialnego oraz wykazywały niewielką obecność cavi in one podczas przeprowadzania tej procedury.Należy pamiętać o wykorzystaniu świeżo wypreparowanej tkanki mózgowej oraz o późniejszym przechowywaniu wszystkich roztworów, próbek i probówek w lodzie. Zaleca się również pobranie niewielkiej ilości próbki z każdego etapu frakcjonowania, aby za pomocą immunoblottingu móc ocenić ogólną skuteczność procedury oczyszczania.

mitochondria-associated-er-membranes-mams-glycosphingolipid-enriched

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Membrany związane z mitochondriami z siateczką endoplazmatyczną (MAM) i mikrodomeny wzbogacone w glikosfingolipidy (GEM): izolacja z mózgu myszy

Wizualizacja i analiza mitochondriów z tkanki mózgowej ssaków to trudne zadanie. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób trójwymiarowa (3D) analiza rekonstrukcji z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM) może być wykorzystana do uzyskania wglądu w morfologiczną i wolumetryczną analizę tego krytycznego organcelli generującej energię.

Analiza mitochondriów mózgowych z wykorzystaniem seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z obrazowaniem powierzchni bloku (SBF-SEM)

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Tutaj opisujemy pomiar szybkości transportu aksonów konstytutywnych stabilizatorów błon retikulum endoplazmatycznego (ER) związanych z mitochondriami (MAM) poprzez zwiększanie lub utrzymywanie neurotoksycznego generowania β-amyloidu (Aβ) z neuronów choroby Alzheimera (AD) w czasie rzeczywistym, aby służyć jako bezpośredni i ilościowy wskaźnik do pomiaru stabilizacji MAM i wspomagania rozwoju terapii AD.

Analiza ilościowa stabilizacji błony retikulum endoplazmatycznego powiązanej z mitochondriami (MAM) w neuronalnym modelu choroby Alzheimera (AD)

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Protokół został opracowany do przygotowania oczyszczonych mitochondriów z komórek mikrogleju, izolacji białek mitochondrialnych do uwalniania N-glikanów oraz szybkiego wykrywania subkomórkowych, mitochondrialnych glikanów za pomocą desorpcji laserowej wspomaganej matrycą w podczerwieni, jonizacji elektrorozpylanej w połączeniu z precyzyjnym analizatorem mas o wysokiej rozdzielczości.

Preparat mitochondrialny z mikrogleju do analizy glikanów

Poznaj metodę izolacji błon ER związanych z mitochondriami (MAM) oraz mikrodomen wzbogaconych w glikosfingolipidy (GEM) z mózgu myszy. Technika ta umożliwia badanie metabolizmu komórkowego w neurobiologii.

Błony ER związane z mitochondriami (MAM) i mikrodomeny wzbogacone w glikosfingolipidy (GEM): izolacja od mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów