Wprowadzenie do elektrofizjologii opartej na membranach podpartych ciałem stałym

Tak wspierana elektrofizjologia oparta na błonach w skrócie do elektrofizjologii opartej na SSM. To nowe podejście elektrofizjologiczne. Oferuje ona w wielu zastosowaniach znaczną poprawę w porównaniu z konwencjonalnymi metodami.

Podstawowym narzędziem konwencjonalnej elektrofizjologii jest elektroda mikrocząsteczkowa wypełniona elektrolitem, podczas gdy elektrofizjologia oparta na M wykrywa translokację ładunku za pomocą elektrody membranowej podpartej ciałem stałym. Jest to niezwykle przydatne w przypadkach, w których nie można zastosować konwencjonalnej elektrofizjologii, na przykład w przypadku transporterów bakteryjnych, których poza kilkoma rzadkimi wyjątkami nie można badać za pomocą metod cęgów napięciowych lub krosówek. W takich przypadkach elektrofizjologia oparta na SSM okazała się bardzo skuteczna.

Można go również wykorzystać do badania fizjologicznie istotnych transporterów eukariotycznych w błonach wewnątrzkomórkowych. Istnieje wiele sposobów przeprowadzania eksperymentów elektrofizjologicznych opartych na SSM. W badaniach podstawowych może być stosowany do określania parametrów kinetycznych i wyjaśniania mechanizmu transportu, ale jego solidność i potencjał automatyzacji sprawiają, że idealnie nadaje się do zastosowań przesiewowych w odkrywaniu ścieżek.

Elektroda SSM przenosi złożony system membranowy składający się z leżącego poniżej SSM i przyjmowanych proteasomów lub fragmentów błony zawierających białko transportowe, które jest przedmiotem zainteresowania. Właściwości elektryczne membrany złożonej można opisać za pomocą równoważnego obwodu, w którym membrany tworzą układ sprzężony pojemnościowo. Należy zauważyć, że zachowanie elektryczne systemu jest zasadniczo takie samo, niezależnie od tego, czy używane są fragmenty błony, czy liposomy protei.

Przemieszczenie ładunku w białku transportowym jest przenoszone do obwodu pomiarowego poprzez pojemność błony pęcherza moczowego. Zasada detekcji zwana sprzężeniem pojemnościowym. W typowym eksperymencie szybka wymiana roztworu w VSSM dostarcza substratu dla białka transportowego V, w wyniku czego aktywność transportowa białka elektrogenicznego generuje prąd, który jest sprzężony z układem pomiarowym za pośrednictwem pojemności SSM.

W tym samym czasie aktywność białka elektrogenicznego stopniowo ładuje błonę liposomalną, prowadząc do zahamowania białka transportowego i spadku prądu w obwodzie rejestrującym, zmierzony prąd jest wynikiem jednoczesnych reakcji transportu milionów liposomów protei wchłoniętych do Enzo. Każdy z nich zawiera około 100 transporterów. Konfiguracja składa się z klatki Faradaya ze ścieżką roztworu, zewnętrznych obwodów do sterowania zaworami, wzmocnienia sygnału oraz akwizycji i analizy danych.

Klatka EC zawiera pojemniki, zawory i rurki wymagane do kontroli przepływu roztworu, a także sześcian z chipem XOR. Chip XOR przenosi elektrodę SSM i wchłonięte liposomy prot. Vete jest podłączony do wzmacniacza i generatora funkcyjnego zewnętrznego obwodu elektrycznego.

Pomiary SSM, sianie ognia, dwa roztwory, jeden aktywujący i jeden nieaktywujący oprócz substratu, który jest obecny tylko w roztworze aktywującym. Oba rozwiązania mają ten sam skład w konfiguracji z pojedynczą centralą. Dwa zawory dwudrogowe sterują przepływem roztworów niereaktywujących i aktywujących.

Zawór końcowy, mechanicznie sprzężony zawór trójdrogowy, służy do przełączania między roztworem nieaktywującym i aktywującym, kierując jeden z roztworów do pojemnika na odpady, a drugi roztwór do qve. Gdy zawór końcowy jest przełączany, przepływ roztworu nieaktywującego jest przekierowywany do odpadu, a roztwór aktywujący przepływa do qve. Taka konfiguracja pozwala na jednoczesny ciągły przepływ obu rozwiązań.

W dowolnym momencie podczas protokołu przepływu ścieżka przepływu może być zoptymalizowana w zależności od potrzeb. Należy jednak pamiętać, że odległość między SSM a skrzyżowaniem rozwiązań nieaktywujących i aktywujących powinna być jak najmniejsza. Ponieważ określa rozwiązanie czasowe wymiany roztworu.

Wzmacniacz prądowy na zewnątrz klatki pokładu zasilającego jest podłączony do układu czujnika. Zazwyczaj jest to ustawione na wzmocnienie od 10 do potęgi od ośmiu do 10, do mocy dziewięciu woltów na amper i czas odpoczynku od jednej do 10 milisekund. Generator funkcyjny jest podłączony do elektrody referencyjnej, a komputer z oprogramowaniem do sterowania zaworami i akwizycji danych oraz skrzynka interfejsu uzupełniają system.

Skrzynka interfejsu zawiera akwizycję danych sterowników zaworów, a przepływ cyfrowego rozwiązania sprzętowego wyjścia jest utrzymywany przez sprężone powietrze o wartości 0,22. Ciśnienie jednego bara jest monitorowane za pomocą cyfrowego milimetra. Można go utrzymać poprzez napełnianie stalowego pojemnika zainstalowanego między dopływem powietrza a pojemnikami z roztworem w klatce EC za pomocą zaworu iglicowego.

CVIC składa się z czterech części. Chip zen jest umieszczony między podstawą weterynarza a głowicą weterynarza. Cylindryczne złącze wylotowe jest przykręcone do głowicy weterynarza i przenosi zespół elektrody referencyjnej.

Elektroda referencyjna składa się z drutu z chlorowanego srebra z miniaturowym złączem SMC i jest odizolowana od ścieżki przepływu mostkiem solnym z żelu poliakry. Nieużywany zespół mostka żelowego jest przechowywany w 100-milimolowym roztworze fosforanu potasu o pH siedem zawierającym 100-milimolowy chlorek potasu. Po pierwsze, elektroda referencyjna musi zostać zamontowana w zespole elektrody referencyjnej zawierającym mostek geo.

Ważne jest, aby unikać pęcherzyków powietrza podczas montażu elektrody referencyjnej. Teraz ta część vete jest przymocowana do złącza wylotowego, które zostało wstępnie napełnione roztworem buforowym. Wszystkie połączenia muszą być uszczelnione za pomocą O-ringów.

Ten SM jest uformowany na wiórze zor, strukturalnym świetle ze szkła pokrytego kozą. Ta droga sematyczna ma jeden milimetr i średnicę i jest połączona z podkładką kontaktową za pomocą białej listwy stykowej o grubości 0,2 milimetra. Kołek styku sprężynowego tworzy styk ze wzmacniaczem.

Chip zen jest przechowywany w ciemności w roztworze etanolu tiolowego 10 LAR Okta Deccan. Aby zachować swoją tajemną warstwę w celu usunięcia cząsteczek wirusa dekan Okta, które nie zostały wchłonięte, elektroda jest płukana czystym etanolem, a elektroda suszona w gazowym azocie. Teraz można zmontować monowarstwę fosfocholiny.

Roztwór lipidów zawiera 15 miligramów choliny DFI na mililitr i 250 mikrogramów na mililitr. Okta dwa Kopalnia w stanie rozkładu i jest przechowywana w temperaturze minus 20 stopni. Elektroda jest teraz umieszczona dokładnie na podstawie łokcia SA.

Jeden mikrolitr roztworu dodaje się do elektrody SSM bez dotykania warstwy złota. Natychmiast po dodaniu roztworu lipidowego vete można złożyć. Objętość vete uszczelniona O-ringiem jest cylindryczna o wewnętrznej objętości 17 mikrolitrów po zamontowaniu.

SSM powinien być wyśrodkowany pod otworem wlotowym. Przed podłączeniem weterynarza układ płynów musi być wstępnie napełniony 100-milimolowym roztworem buforowym fosforanu potasu. Ważne jest, aby upewnić się, że w rurkach i zaworach nie ma pęcherzyków powietrza.

Teraz weterynarza można zamontować w klatce dziennej tarczycy, podłączyć amplifier, wlot i wylot ścieżki przepływu roztworu oraz generator funkcji. Na koniec łokieć można przepłukać 100-milimetrowym buforem fosforanu potasu. Prowadzi to do spontanicznego tworzenia SSM w celu sprawdzenia jakości SSM.

Pojemność i przewodność są mierzone za pomocą generatora funkcyjnego do pomiaru przewodności, stosuje się napięcie prądu stałego 100 miliwoltów. Zanik prądu pokazuje ładowanie kondensatora membranowego po pełnym naładowaniu kondensatora. Zmierzony prąd daje przewodność membrany zgodnie z prawem M'S.

Tutaj obserwujemy przewodność o wartości 0,17 nano Siemensa. Pojemność można zmierzyć za pomocą trójkątnego napięcia przemiennego o amplitudzie szczytowej 50 miliwoltów i częstotliwości oh 0,5 herca. Amplituda wynikowego prądu fali prostokątnej reprezentuje prąd oceniający kondensatora.

Pojemność jest równa przeniesionemu ładunkowi podzielonemu przez przyłożone napięcie. Membrana ta wykazuje pojemność 2,3 nano, wysoka przewodność i niska pojemność wskazują, że SSM nie jest prawidłowo uformowany. W takich przypadkach membranę należy wyrzucić i przygotować kolejny SSM za pomocą nowego chipa elektrody.

Zwykle liposomy prot są przechowywane w stanie zamrożonym w temperaturze minus 80. TRE Próbka podczas sonikacji lodu jest niezbędna, ponieważ zagregowana próbka absorbuje koło pasowe do SSM w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny liposomów prot. Trzy dziesięciosekundowe cykle sonikacji są przeplatane dziesięciosekundowymi przerwami na chłodzenie na lodzie.

Przepłukać ich SSM roztworem nieaktywującym. Następnie odkręć złącze wylotowe wraz z próbką elektrody referencyjnej. Za pomocą pipety wstrzyknąć 30 mikrolitrów próbki białka przez wylot vete do objętości ette.

Najpierw zamontuj końcówkę pipety w otworze wylotowym. Następnie otwórz powyższą instrukcję w ścieżce nieaktywującej i wstrzyknij liposomy protei. Przed obniżeniem końcówki pipety.

Zamknij powyższą instrukcję, aby zapobiec dalszemu przepływowi roztworu. Pozwól liposomom protei wchłonąć się do SSM przez czas inkubacji od jednej do dwóch godzin. Użyj okna protokołu przepływu w oprogramowaniu do sterowania zaworami i akwizycji danych, aby zdefiniować protokół przepływu.

Jeśli chcesz dokonywać pomiarów w warunkach symetrycznych, na przykład w celu określenia specyficzności substratu, wartości KM lub zależności pH, wybierz protokół wymiany pojedynczego roztworu. Ustaw czas przepływu dla każdego roztworu na oh 0,5 do jednej sekundy. Prąd jest rejestrowany w całym protokole przepływu.

Wzmocnienie jest zwykle ustawione na 10 do potęgi dziewięciu, a jako częstotliwość próbkowania wybieramy 2000 punktów danych na sekundę. Na koniec zapisz swój nowy protokół pod tytułem NA a i a. W drugim dotknięciu okna protokołu przepływu można zdefiniować stan otwarty lub zamknięty określonych zaworów, aby kontrolować przepływ roztworu nieaktywującego lub aktywującego Przez kubit.

Tutaj pokazujemy pomiar liposomów protei, importu protonów cukrowych, takich jak Y z E. coli. Roztwór aktywujący zawiera transportowany substrat laktozę, podczas gdy roztwór nieaktywujący zawiera taką samą ilość nietransportowanej glukozy jako związek kompensacyjny. Oprócz cukrów roztwory zawierają 100 milimolowy fosforan potasu o pH 7,6 i jeden milimolowy DTT.

Po zmianie roztworów użyj zaworu ręcznego, aby upewnić się, że pęcherzyki powietrza zostały usunięte. Przed rozpoczęciem protokołu przepływu należy wyregulować ciśnienie tuż przed rozpoczęciem pomiaru. Rutynowo stosujemy ciśnienie O 0,6 bara, które przy naszej specyficznej konfiguracji zaworów i rur daje natężenie przepływu około jednego mililitra na sekundę.

Następnie wybierz tutaj protokół bezpiecznego przepływu, protokół NAA, i naciśnij przycisk start Aby rozpocząć każdy pomiar. Podczas pierwszych kilku pomiarów luźno wchłoniętych, liposomy protei są usuwane, a zatem prąd szczytowy może się zmniejszyć. Powtarzaj pomiar, aż prąd szczytowy pozostanie stały.

W pierwszej fazie przepływu roztworu, który nie aktywuje, prąd wynosi zero. Wymiana z roztworu nieaktywującego na roztwór aktywujący, który zawiera laktozę, indukuje aktywność transportową błony elektrogennej. Dodatni ładunek białka gromadzi się wewnątrz liposomów ochronnych, a wzmacniacz wykrywa dodatni prąd przejściowy z powodu dodatniego sprzężenia za pośrednictwem SSM.

Ten dodatni prąd sprzężony dodatnio nazywa się wymianą sygnału V z roztworu aktywującego. Powrót do roztworu nieaktywującego indukuje transport kodu cukru protonowego z liposomów. W tym przypadku ujemny prąd sprzężony z LY jest wyświetlany jako tak zwany sygnał wyłączenia do analizy kinetycznej białek.

Używany jest tylko sygnał włączania, ponieważ sygnał wyłączenia jest słabo zdefiniowany ze względu na stan naładowania zaworu membranowego, przełączanie powoduje artefakty mechaniczne i elektryczne. Na szczęście są one ograniczone do pewnego zakresu czasu, zanim zaobserwuje się sygnały indukowane białkiem. Należy zauważyć, że 50-milisekundowe opóźnienie między artefaktami przełączania zaworu a sygnałami transportera to czas, w którym roztwór musi rozejść się z zaworu terminala na powierzchnię szybkiej wymiany roztworów SSM, takich jak te przeprowadzone na SSM, które stanowią typowy eksperyment relaksacyjny.

W takich eksperymentach prąd rozluźnia się poprzez zależną od czasu fazę stanu ustalonego do stałego stanu ustalonego. Aktualne szczegóły kinetyczne cyklu reakcji można wyprowadzić z kształtu i wielkości prądu przed stanem ustalonym. Podczas gdy prąd w stanie ustalonym dostarcza informacji o ciągłym obrocie białek błonowych.

W układzie sprzężonym z ly, w którym liposomy protei są absorbowane do ich SSM, prądy stanu ustalonego są praktycznie niezmienione. Podczas gdy stały prąd w stanie ustalonym nigdy nie jest uzyskiwany, zamiast tego w wyniku ładowania liposomów mierzony prąd stopniowo maleje. Prąd transportera można obliczyć na podstawie zmierzonego prądu sprzężonego za pomocą analizy obwodu.

Tutaj pokazujemy reprezentatywne wyniki przy użyciu kotransportera protonów cukrowych, takich jak Y w zakresie PA od 8,5 do 7,6. Prąd transportera jest zdominowany przez reakcję elektrogeniczną w późnym cyklu reakcji. W tych warunkach powierzchnia przed stanem ustalonym składa się z prostego wzrostu prądu do jego wartości w stanie ustalonym.

To następnie zanika z powodu sprzężenia pojemnościowego. Interesuje nas prąd transportowy w stanie ustalonym. W przypadku braku potencjału błonowego jest on reprezentowany z dobrym przybliżeniem przez prąd szczytowy.

Kinetykę Ali Mein można zatem analizować, wymazując prądy szczytowe dla różnych stężeń substratu, ale należy wziąć pod uwagę, że szczytowe amplitudy prądu można rygorystycznie porównać tylko wtedy, gdy zostaną uzyskane z jednego czujnika w jednym eksperymencie. Jednym z powodów jest zmienność wydajności absorpcji. Gdy pH jest dalej obniżane, sygnał jednofazowy staje się dwufazowy.

I wreszcie, szybki stan przejściowy pozostaje dla mutanta Y z niedoborem transportu. Po szybkim stanie nieustalonym następuje mały, wolniejszy składnik ujemny. Składowa ujemna jest charakterystyczna dla szybkich prądów przejściowych mierzonych w układach sprzężonych i jest spowodowana wyładowaniem pojemnościowym membrany.

W tym przypadku prąd szczytowy nie reprezentuje transportu w stanie ustalonym, ale raczej elektrogeniczne potwierdzenie przejścia na wczesnym etapie cyklu jonowego, co staje się widoczne, ponieważ mutant la y nie wykazuje transportu w stanie ustalonym, a w przypadku opóźnienia typu dzikiego transport w stanie ustalonym y jest hamowany przez niskie pH. Dowody eksperymentalne dostarczają mechanistycznej interpretacji translokacji ładunku w cyklu reakcji lag y, co pokazano w modelu kinetycznym. Szybki stan przejściowy obserwowany dla mutanta z niedoborem transportu lub w przypadku opóźnienia Y typu dzikiego w warunkach kwaśnych jest spowodowany szybką tygodniową reakcją elektrogeniczną po związaniu laktozy przy wyższych wartościach pH, sygnał jest zdominowany przez główną reakcję elektrogenną pod koniec cyklu reakcji, która została zaproponowana jako reprezentująca pseudoplazmatyczne uwalnianie protonów w układzie sprzężonym pojemnościowo.

Prowadzi to do prądów przejściowych reprezentujących transport w stanie ustalonym Lag y ze względu na silne oddziaływanie Utes. Dzięki SSM artefakty elektryczne są generowane, gdy wymieniane są roztwory o różnym składzie. Upewnij się, że roztwory nieaktywujące i aktywujące są tak podobne, jak to tylko możliwe, zwłaszcza pod względem ich pH i siły jonowej.

Należy przeprowadzić kontrolę, ponieważ substraty mogą również wytwarzać artefakty. Zawsze testuj określony system buforowy i protokół przepływu pod kątem artefaktów przy użyciu samego SSM przed dodaniem próbki białka. Po dodaniu próbki białka pomiary kontrolne można przeprowadzić z roztworami zawierającymi substancje niebędące substratami, które są strukturalnie podobne do substratu.

Co więcej, istnieje możliwość przetestowania substratu pod kątem artefaktów za pomocą liposomów lub fragmentów błony bez interesującego nas białka. Można również dodawać inhibitory do roztworów lub pipetować je. Po eksperymencie bezpośrednio do wylotu weterki w celu zmierzenia hamowania sygnału transportera, sygnały specyficzne dla białka znikną, pozostawiając tylko artefakty wymiany roztworu.

Sygnał białkowy można wtedy łatwo skorygować. Upewnij się, że utrata wchłoniętego prot, liposomów lub degradacja białek nie wpływa na pomiar. Wykonując powtarzające się pomiary kontrolne w identycznych warunkach, dopuszczalny jest spadek sygnału do 20%, który można skorygować, przyjmując liniową zależność biegu w czasie.

Ta konfiguracja jest wynikiem 20 lat rozwoju technicznego w naszym laboratorium. Dostępne są również specjalistyczne systemy z wyższym timerem do analizy kinetycznej i niższym zużyciem roztworu dla drogich podłoży. Do badań przesiewowych leków używamy w pełni automatycznych konfiguracji o większej przepustowości.

Do tej pory za pomocą tej metody scharakteryzowano ponad 20 transporterów. Należą do nich transportowe APA, kompleksy łańcuchów oddechowych, transportery chłodu, wymienniki, a nawet kanały żelazne. Jeśli więc nie jesteś w stanie rozwiązać swojego problemu za pomocą standardowej elektrofizjologii, rozważ użycie elektrofizjologii SS Mase.