Wprowadzenie do elektrofizjologii opartej na membranach podpartych ciałem stałym

Elektrofizjologia oparta na wspieranej membranowo strukturze, w skrócie elektrofizjologia SSM, to nowe podejście elektrofizjologiczne. Oferuje ona znaczną poprawę w wielu zastosowaniach w porównaniu z metodami konwencjonalnymi.

Podstawowym narzędziem konwencjonalnej elektrofizjologii jest mikroelektroda wypełniona elektrolitem, podczas gdy elektrofizjologia oparta na SSM wykrywa translokację ładunku za pomocą elektrody z membraną osadzoną na stałym podłożu. Jest ona niezwykle użyteczna w przypadkach, gdy konwencjonalna elektrofizjologia nie może zostać zastosowana, na przykład w przypadku transporterów bakteryjnych, których – poza nielicznymi wyjątkami – nie można badać metodami voltage clamp lub patch clamp. W takich sytuacjach elektrofizjologia oparta na SSM okazała się bardzo skuteczna.

Można go również wykorzystać do badania fizjologicznie istotnych transporterów eukariotycznych w błonach wewnątrzkomórkowych. Istnieje wiele sposobów przeprowadzania eksperymentów elektrofizjologicznych opartych na SSM. W badaniach podstawowych metoda ta może być stosowana do wyznaczania parametrów kinetycznych i wyjaśniania mechanizmów transportu, natomiast jej odporność i potencjał do automatyzacji sprawiają, że jest ona idealna do zastosowań przesiewowych w odkrywaniu nowych celów terapeutycznych.

Elektroda SSM posiada złożony system błonowy składający się z podstawowej błony SSM oraz zaadoptowanych proteasomów lub fragmentów błon zawierających badaną białko transportowe. Właściwości elektryczne złożonej błony można opisać za pomocą obwodu zastępczego, w którym błony tworzą układ sprzężony pojemnościowo. Należy zauważyć, że zachowanie elektryczne układu jest w zasadzie takie samo, niezależnie od tego, czy zastosowano fragmenty błon, czy protealiposomy.

Przemieszczenie ładunku w białku transportowym jest przekazywane do obwodu pomiarowego poprzez pojemność membrany pęcherzyka. Zasada detekcji ta nazywa się sprzężeniem pojemnościowym. W typowym eksperymencie szybka wymiana roztworów w VSSM dostarcza substrat dla białka transportowego V, w wyniku czego następująca elektrogenna aktywność transportowa białka generuje prąd, który jest sprzężony z systemem pomiarowym poprzez pojemność SSM.

Jednocześnie aktywność białek elektrogennych stopniowo ładuje membranę liposomalną, co prowadzi do inhibicji białka transportowego i spadku natężenia prądu w obwodzie rejestrującym; mierzony prąd jest wynikiem jednoczesnych reakcji transportowych milionów proteoliposomów zaabsorbowanych do Enzo, z których każdy zawiera około 100 transporterów. Układ składa się z klatki Faradaya ze ścieżką przepływu roztworu, zewnętrznych obwodów sterowania zaworami, wzmacniacza sygnału oraz systemu akwizycji i analizy danych.

Klatka EC zawiera pojemniki, zawory i rurki niezbędne do kontroli przepływu roztworu, a także kubit z chipem XOR. Chip XOR przenosi elektrodę SSM oraz zaabsorbowane liposomy prot. Vete jest podłączony do wzmacniacza i generatora funkcji zewnętrznego obwodu elektrycznego.

Pomiary SSM, w których wykorzystuje się dwa roztwory: jeden aktywujący i jeden nieaktywujący, poza substratem, który znajduje się wyłącznie w roztworze aktywującym. W konfiguracji pojedynczej wymiany oba roztwory mają taki sam skład. Przepływ roztworów nieaktywujących i aktywujących jest kontrolowany przez dwa zawory dwudrożne.

Zawór końcowy, stanowiący mechanicznie sprzężony układ trzech zaworów trójdrożnych, służy do przełączania między roztworami nieaktywującymi a aktywującymi, kierując jeden z roztworów do pojemnika na odpady, a drugi do qve. Po przełączeniu zaworu końcowego przepływ roztworu nieaktywującego zostaje przekierowany do odpadów, a roztwór aktywujący przepływa do qve. Taka konfiguracja umożliwia jednoczesny, ciągły przepływ obu roztworów.

W dowolnym momencie protokołu przepływu ścieżka przepływu może zostać zoptymalizowana zgodnie z potrzebami. Należy jednak pamiętać, że odległość między SSM a punktem połączenia roztworów nieaktywujących i aktywujących powinna być jak najmniejsza, ponieważ określa ona czas wymiany roztworów.

Wzmacniacz prądowy znajdujący się poza klatką pokładu zasilania jest połączony z chipem sensorycznym. Zazwyczaj ustawia się go na wzmocnienie od 10⁸ do 10⁹ V/A oraz czas spoczynku od 1 do 10 ms. Generator funkcji jest połączony z elektrodą odniesienia, a system uzupełnia komputer z oprogramowaniem do sterowania zaworami i akwizycji danych oraz skrzynka interfejsu.

Obudowa interfejsu zawiera system akwizycji danych sterowników zaworów, a przepływ sprzętowego rozwiązania wyjścia cyfrowego jest utrzymywany przez sprężone powietrze o ciśnieniu 0,22 bar. Ciśnienie jest monitorowane za pomocą cyfrowego manometru. Można je utrzymywać poprzez napełnianie stalowego zbiornika zainstalowanego pomiędzy zasilaniem powietrzem a pojemnikami z roztworem w klatce EC za pomocą zaworu iglicowego.

CVIC składa się z czterech części. Chip zen znajduje się pomiędzy podstawą vet a głowicą vet. Cylindryczne złącze wylotowe jest przykręcone do głowicy vet i utrzymuje zestaw elektrody odniesienia.

Elektroda odniesienia składa się z chlorkowanego drutu srebrnego z miniaturowym złączem SMC i jest odizolowana od drogi przepływu za pomocą solnego mostka z żelu poliakrylowego. Gdy nie jest używany, zespół mostka żelowego jest przechowywany w 100 mM roztworze fosforanu potasu o pH 7 zawierającym 100 mM chlorku potasu. W pierwszej kolejności elektrodę odniesienia należy zamontować w zestawie elektrody odniesienia zawierającym mostek żelowy.

Podczas instalacji elektrody odniesienia należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Obecnie ta część układu jest mocowana do złącza wylotowego, które zostało uprzednio napełnione roztworem buforowym. Wszystkie połączenia muszą zostać uszczelnione za pomocą pierścieni O-ring.

Ten SM jest utworzony na chipie zor, który stanowi ustrukturyzowaną szklaną płytkę pokrytą powłoką kozią. Ta droga semantyczna ma średnicę jednego milimetra i jest połączona z polem kontaktowym za pomocą białego paska kontaktowego o szerokości 0,2 milimetra. Sprężynowy pin kontaktowy zapewnia połączenie ze wzmacniaczem.

Chip zen przechowuje się w ciemności w 10 LAR roztworze thiol etanolu Okta Deccan. Aby zachować warstwę arcane thi i usunąć niezaabsorbowane cząsteczki wirusowe Okta deccan, elektrodę płucze się czystym etanolem, a następnie suszy w strumieniu azotu. Teraz można przystąpić do tworzenia monowarstwy fosfocholiny.

Roztwór lipidowy zawiera 15 mg/mL chloryny DFI oraz 250 µg/mL oktaetyloaminy w dekanylu i jest przechowywany w temperaturze -20 °C. Elektroda zostaje teraz precyzyjnie umieszczona u podstawy SA cubit.

Jeden 1 µL roztworu nanosi się na elektrodę SSM, unikając dotykania warstwy złota. Bezpośrednio po dodaniu roztworu lipidów można zmontować vete. Objętość vete uszczelniona pierścieniem O-ring ma kształt cylindra o objętości wewnętrznej 17 µL po zamontowaniu.

Moduł SSM powinien znajdować się centralnie pod otworem wlotowym. Przed podłączeniem urządzenia system płynowy należy wypełnić 100 millimolarnym roztworem buforu fosforanowego potasu. Ważne jest upewnienie się, że w przewodach i zaworach nie ma pęcherzyków powietrza.

Teraz można zamontować układ w klatce tarczycy, podłączyć wzmacniacz, wlot i wylot ścieżki przepływu roztworu oraz generator funkcji. Na koniec należy przepłukać komorę 100 mililitrami buforu fosforanowego potasu. Prowadzi to do spontanicznego tworzenia się SSM w celu sprawdzenia jakości SSM.

Pojemność i przewodnictwo mierzy się przy użyciu generatora funkcji; w celu pomiaru przewodnictwa stosuje się napięcie stałe 100 mV. Spadek natężenia prądu obrazuje ładowanie kondensatora błonowego po jego pełnym naładowaniu. Zmierzone natężenie prądu pozwala wyznaczyć przewodnictwo błony zgodnie z prawem Ohma.

Tutaj obserwujemy przewodność wynoszącą 0,17 nS. Pojemność można zmierzyć, stosując trójkątne napięcie AC o amplitudzie 50 mV od szczytu do szczytu i częstotliwości 0,5 Hz. Amplituda wynikającego z tego prądu w postaci fali prostokątnej reprezentuje prąd ładujący kondensatora.

Pojemność jest równa ładunkowi przeniesionemu podzielonemu przez przyłożone napięcie. Ta membrana wykazuje pojemność 2.3 nano; wysoka przewodność i niska pojemność wskazują, że SSM nie została prawidłowo utworzona. W takich przypadkach membranę należy odrzucić i przygotować kolejną SSM, używając nowego chipu z elektrodą.

Zazwyczaj liposomy białkowe przechowuje się w zamrożeniu w temperaturze -80°C. Odmrożenie próbki na lodzie i sonikacja są niezbędne, ponieważ zagregowana próbka pochłania zbyt dużo energii, aby uzyskać homogeniczną zawiesinę liposomów białkowych. Trzy dziesięciosekundowe cykle sonikacji są przeplatane dziesięciosekundowymi przerwami na chłodzenie na lodzie.

Przepłucz ich SSM roztworem nieaktywującym. Następnie odkręć złącze wylotowe wraz z próbką elektrody odniesienia. Za pomocą pipety wstrzyknij 30 µL próbki białka przez wylot vete do objętości ette.

Najpierw zamocuj końcówkę pipety do otworu wylotowego. Następnie otwórz powyższy zawór ręczny w ścieżce nieaktywującej i wstrzyknij liposomy protea. Na koniec zdejmij końcówkę pipety.

Zamknij powyższy zawór ręczny, aby zatrzymać przepływ roztworu. Pozostaw liposomy protea do absorpcji na SSM przez czas inkubacji od jednej do dwóch godzin. Użyj okna protokołu przepływu w oprogramowaniu do sterowania zaworami i akwizycji danych, aby zdefiniować swój protokół przepływu.

Jeśli chcesz przeprowadzić pomiary w warunkach symetrycznych, na przykład w celu określenia specyficzności substratowej, wartości KM lub zależności od pH, wybierz protokół pojedynczej wymiany roztworów. Ustaw czas przepływu dla każdego roztworu na od 0,5 do 1 sekundy. Natężenie prądu jest rejestrowane przez cały czas trwania protokołu przepływu.

Wzmocnienie jest zazwyczaj ustawiane na 10 do potęgi dziewiątej, a jako częstotliwość próbkowania wybieramy 2000 punktów danych na sekundę. Na koniec zapisz nowy protokół pod nazwą NA a and a. W drugiej zakładce okna protokołu przepływu można zdefiniować stan otwarty lub zamknięty konkretnych zaworów, aby kontrolować przepływ roztworu nieaktywującego lub aktywującego przez qubit.

W niniejszej pracy demonstrujemy pomiar liposomów z białkiem, importem protonów cukrów LacY z E coli. Roztwór aktywujący zawiera transportowany substrat — laktozę, natomiast roztwór nieaktywujący zawiera taką samą ilość nietransportowanej glukozy jako związku kompensacyjnego. Oprócz cukrów, roztwory zawierają 100 mM fosforanu potasu o pH 7,6 oraz 1 mM DTT.

Po zmianie roztworów należy użyć zaworu ręcznego, aby upewnić się, że pęcherzyki powietrza zostały usunięte. Przed rozpoczęciem protokołu przepływu należy dostosować ciśnienie bezpośrednio przed rozpoczęciem pomiaru. Rutynowo stosujemy ciśnienie O 0,6 bar, co przy naszej konkretnej konfiguracji zaworu i rurek zapewnia szybkość przepływu wynoszącą około jeden mililitr na sekundę.

Następnie należy wybrać tutaj protokół bezpiecznego przepływu, protokół NAA, i nacisnąć przycisk start, aby rozpocząć każdy pomiar. Podczas pierwszych kilku pomiarów luźno zaabsorbowane liposomy proteowe są usuwane, przez co prąd szczytowy może ulec zmniejszeniu. Pomiar należy powtarzać do momentu, aż prąd szczytowy pozostanie stały.

Podczas pierwszej fazy przepływu roztworu nieaktywującego prąd wynosi zero. Wymiana roztworu nieaktywującego na aktywujący, zawierający laktozę, indukuje aktywność transportu elektrogennego błony. Dodatni ładunek białek gromadzi się wewnątrz proteoliposomów, a wzmacniacz wykrywa dodatni prąd przejściowy wynikający z dodatnego sprzężenia poprzez SSM.

Ten dodatni prąd sprzężony nazywany jest sygnałem „on”, wynikającym z wymiany V z roztworu aktywującego. Powrót do roztworu nieaktywującego indukuje transport protonów i cukrów z liposomów. W tym przypadku rejestrowany jest ujemny prąd sprzężony LY, czyli tak zwany sygnał „off” służący do analizy kinetyki białek.

Wykorzystuje się wyłącznie sygnał włączenia (on), ponieważ sygnał wyłączenia (off) jest słabo zdefiniowany z powodu stanu naładowania zaworu membranowego, którego przełączanie generuje artefakty mechaniczne i elektryczne. Na szczęście są one ograniczone do przedziału czasowego poprzedzającego zaobserwowanie sygnałów indukowanych przez białko. Należy zauważyć, że 50 milisekundowe opóźnienie między artefaktami przełączania zaworu a sygnałami transportera to czas potrzebny na dotarcie roztworu z zaworu końcowego do powierzchni SSM Rapid Solution Exchange. Eksperyment taki, jak ten przeprowadzony na SSM, stanowi typowy eksperyment relaksacyjny.

W tego rodzaju eksperymentach prąd przechodzi przez zależną od czasu fazę stanu przedstacjonarnego, aż do osiągnięcia stałego stanu stacjonarnego. Szczegółowe dane kinetyczne cyklu reakcji można wyprowadzić z kształtu i wartości prądu w stanie przedstacjonarnym. Prąd w stanie stacjonarnym dostarcza natomiast informacji o ciągłym obrocie białek błonowych.

W systemie sprzężonym z ly, w którym liposomy białkowe są adsorbowane do ich SSM, prądy stanu przedstacjonarnego pozostają praktycznie niezmienione. Ponieważ ze względu na ładowanie liposomów nigdy nie uzyskuje się stałego prądu stanu stacjonarnego, mierzony prąd stopniowo maleje. Prąd transportera można obliczyć z zmierzonego prądu sprzężonego z ly za pomocą analizy obwodów.

Prezentujemy tutaj reprezentatywne wyniki z wykorzystaniem kotransportera protonów i cukrów, takiego jak Y, w zakresie pH od 8,5 do 7,6. Prąd transportera jest zdominowany przez reakcję elektrogenną w późnej fazie cyklu reakcyjnego. W tych warunkach faza przedstanowa polega na prostym wzroście prądu do jego wartości stanowej.

Następnie wartość ta zanika z powodu sprzężenia pojemnościowego. Interesuje nas prąd transportowy w stanie ustalonym. W przypadku braku potencjału błonowego jest on reprezentowany z dobrym przybliżeniem przez prąd szczytowy.

Kinetykę według równania Ali Meina można zatem analizować poprzez wykreślenie prądów szczytowych dla różnych stężeń substratu, należy jednak pamiętać, że amplitudy prądu szczytowego można porównywać rygorystycznie tylko wtedy, gdy zostały uzyskane z jednego sensora w ramach jednego eksperymentu. Jedną z przyczyn jest zmienność wydajności absorpcji. Przy dalszym obniżeniu pH sygnał monofazowy staje się bifazowy.

I na koniec, w przypadku mutanta lag Y z zaburzonym transportem, pozostaje szybki stan przejściowy. Za szybkim stanem przejściowym następuje niewielka, wolniejsza składowa ujemna. Składowa ujemna jest charakterystyczna dla szybkich prądów przejściowych mierzonych w systemach sprzężonych i jest spowodowana rozładowaniem pojemności błony.

W tym przypadku prąd szczytowy nie reprezentuje transportu w stanie stacjonarnym, lecz stanowi elektrogenne potwierdzenie przejścia we wczesnej fazie cyklu jonowego, co staje się widoczne, ponieważ mutant lacy nie wykazuje transportu w stanie stacjonarnym, a dla typu dzikiego lag Y transport w stanie stacjonarnym jest hamowany przez niskie pH. Dowody eksperymentalne dostarczają mechanistycznej interpretacji translokacji ładunku w cyklu reakcyjnym lag Y, co zostało przedstawione w modelu kinetycznym. Szybki stan przejściowy zaobserwowany dla mutanta z defektem transportu, lub w przypadku typu dzikiego lag Y w warunkach kwasowych, wynika z szybkiej, słabo elektrogennej reakcji następującej po związaniu laktozy; przy wyższych wartościach pH sygnał jest zdominowany przez główną reakcję elektrogenną w późnej fazie cyklu reakcyjnego, która w założeniu reprezentuje pseudoplazmiczne uwalnianie protonów w systemie sprzężonym pojemnościowo.

Prowadzi to do powstania prądów przejściowych reprezentujących transport stanu stacjonarnego Lag y ze względu na silną interakcję Utes. W przypadku SSM artefakty elektryczne powstają podczas wymiany roztworów o różnym składzie. Należy upewnić się, że roztwory nieaktywujące i aktywujące są możliwie jak najbardziej zbliżone, zwłaszcza pod względem pH i siły jonowej.

Należy przeprowadzić kontrolę, ponieważ substraty również mogą generować artefakty. Zawsze należy testować konkretny system buforowy i protokół przepływu pod kątem artefaktów, używając czystego SSM przed dodaniem próbki białka. Po dodaniu próbki białka pomiary kontrolne można wykonać z użyciem roztworów zawierających substancje niebędące substratami, które są strukturalnie podobne do substratu.

Ponadto istnieje możliwość przetestowania podłoża pod kątem artefaktów, wykorzystując liposomy lub fragmenty błony bez białka będącego przedmiotem zainteresowania. Do roztworów można również dodać inhibitory lub nanieść je pipetą bezpośrednio do wylotu urządzenia w celu zmierzenia inhibicji sygnału transportera; w takim przypadku sygnały specyficzne dla białka znikną, pozostawiając jedynie artefakty związane z wymianą roztworu.

Sygnał białkowy można następnie łatwo skorygować. Należy upewnić się, że utrata zaabsorbowanego białka, liposomów lub degradacja białka nie wpływa na pomiar. Przy wielokrotnych pomiarach kontrolnych w identycznych warunkach dopuszczalny jest spadek sygnału do 20%, który można skorygować, zakładając liniową zależność spadku od czasu.

Niniejsza konfiguracja jest wynikiem 20 lat rozwoju technicznego w naszym laboratorium. Dostępne są również wyspecjalizowane systemy z bardziej zaawansowanymi rozwiązaniami czasowymi do analizy kinetycznej oraz mniejszym zużyciem roztworów w przypadku kosztownych substratów. Do screeningu leków wykorzystujemy w pełni zautomatyzowane układy o wyższej przepustowości.

Do tej pory za pomocą tej metody scharakteryzowano ponad 20 transporterów. Należą do nich transportowe APA, kompleksy łańcucha oddechowego, transportery chłodu, wymienniki, a nawet kanały żelazowe. Jeśli zatem nie są Państwo w stanie rozwiązać problemu za pomocą standardowej elektrofizjologii, warto rozważyć zastosowanie elektrofizjologii SS Mase.