Name: Mysi model implantacji stentu w tętnicy szyjnej do badania restenozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Poznaj technikę implantacji stentu w tętnicę szyjną myszy do badania remodelowania naczyń i mechanizmów restenozy. Ta metoda minimalizuje powikłania chirurgiczne i umożliwia analizę powstawania płytki miażdżycowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Pani Angeli Freund za doskonałą pomoc techniczną w sekcji plastikowych stentów. Dziękujemy również Pani Royi Soltan i Pani Angeli Freund za profesjonalną pomoc przy barwieniu immunohistochemicznym.

1. Przygotowanie stentu i implantacja
<ol>
 <li>Rozpórki stentu (Fort Wayne Metals, Castlebar, Irlandia) zostały splecione, a następnie przycięte do pożądanego rozmiaru w Instytucie Technologii Włókienniczej i Inżynierii Mechanicznej Uniwersytetu RWTH Aachen w Niemczech (ryc. 1A).</li>
 <li>Przed implantacją stenty należy przenieść do silikonowej rurki o średnicy 2 cm za pomocą kleszczyków i umieścić 2 mm na jednym końcu końcowym, skierowanym do przodu końcem (ryc. 1A).</li>
 <li>Przedni koniec powinien być przycięty ukośnie, aby zapewnić ostrą końcówkę do implantacji.</li>
 <li>Przed implantacją stent powinien być obficie podlewany, aby zapewnić poślizg</li>.
</ol>
2. Implantacja stentu
<ol>
 <li>10-12 tygodniowe samce myszy typu dzikiego C57Bl/6, 25-27 g, są znieczulane za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Prawidłowe znieczulenie potwierdza przed zabiegiem brak odruchów i ruchów brody. Aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia, oczy myszy są pokryte filmem kremu bepantenowego.</li>
 <li>Po goleniu i odpowiedniej dezynfekcji brzusznej części szyi wykonuje się małe środkowe nacięcie o długości 1 cm pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu nożyczek. Po oddzieleniu 2 ciał tłuszczowych za pomocą sterylnych zakrzywionych kleszczy, można zobaczyć lewą tętnicę szyjną wspólną pulsującą wraz z tchawicą.</li>
 <li>1 cm lewej tętnicy szyjnej wspólnej i rozwidlenie powinny być swobodnie przygotowane. 1 węzeł przy użyciu nici jedwabnej 5/0 zostanie zawiązany wokół lewej tętnicy szyjnej wspólnej, 2 węzły przy użyciu nici jedwabnych 7/0 zostaną związane wokół lewej tętnicy szyjnej zewnętrznej, a 1 węzeł przy użyciu nici jedwabnej 7/0 zostanie zawiązany wokół tętnicy szyjnej wewnętrznej (ryc. 1B).</li>
 <li>Przepływ krwi jest następnie przerywany przez mocne zawiązanie węzłów na tętnicy szyjnej wewnętrznej i bliższej tętnicy szyjnej zewnętrznej, a także przez pociągnięcie węzła otaczającego tętnicę szyjną wspólną. Naczynie powinno być zamocowane w taki sposób, aby tętnica szyjna wspólna i zewnętrzna znajdowały się w linii prostej.</li>
 <li>Małe nacięcie na tętnicy szyjnej zewnętrznej wykonuje się w pobliżu węzła proksymalnego za pomocą nożyczek Vannas. Rurkę silikonową zawierającą stent wprowadza się do tętnicy szyjnej zewnętrznej, z ostrym końcem z przodu, za pomocą prowadnika. Po tym, jak stent osiągnie pożądaną pozycję, rurka silikonowa jest naciągana z powrotem na drut prowadnikowy i umożliwia rozszerzenie stentu z pamięcią kształtu (ryc. 1B).</li>
 <li>Węzeł dystalny na tętnicy szyjnej zewnętrznej jest ściśle wiązany, aby zamknąć miejsce nacięcia, a węzły na tętnicy szyjnej wewnętrznej i wspólnej są usuwane, przywracając w ten sposób przepływ krwi.</li>
 <li>Nacięcie skóry zamyka się za pomocą 3-4 klipsów do szwów Michela i kleszcza Michela. Mysz umieszcza się pod czerwonym światłem do momentu pełnego wyzdrowienia. Leczenie przeciwbólowe nie jest konieczne.</li>
 <li>Płytkę nazębną można przeanalizować po 1-3 tygodniach. Aby zbadać ponowną endotelializację, konieczny jest wcześniejszy punkt czasu końcowego (3-4 dni). Zaobserwowaliśmy w naszym modelu implantacji stentu, że 4 tygodnie po tej interwencji chirurgicznej, zwłaszcza dzięki zastosowaniu specjalnych powłok do biofunkcjonalizacji zminiaturyzowanych stentów, neoangiogeneza występuje w około 30% próbki. Jest to łania dla procesów przebudowy i regeneracji, o różnych mechanizmach i stanowiących kolejny patologiczny problem. Aby skoncentrować się na tworzeniu neointima, zwężeniu w stencie i/lub analizie mechanizmów leżących u podstaw tych skutków ubocznych po implantacji stentu, korzystne byłoby zastosowanie punktu końcowego wynoszącego 3 tygodnie, aby nie mylić go z efektami regeneracyjnymi wywołanymi początkiem neoangiogenezy.</li>
</ol>
3. Analiza powstawania płytki nazębnej 
<ol>
 <li>W punkcie końcowym zwierzęta są znieczulane za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Prawidłowe znieczulenie potwierdza przed zabiegiem brak odruchów i ruchów brody.</li>
 <li>Zwierzęta są zabijane przez wykrwawienie wewnątrzsercowe. Surowica krwi jest pobierana do dalszej analizy.</li>
 <li>Po otwarciu jamy klatki piersiowej i przemyciu PBS poprzez nakłucie śródsercowe, przez 5 minut przeprowadza się perfuzję ciała z 4% roztworem paraformaldehydu (PFA). Lewa tętnica szyjna zawierająca stent jest preparowana, bezpośrednio umieszczana w 4% roztworze PFA, a następnie co najmniej 16 godzin później zanurzana w plastiku.</li>
 <li>Przekroje o grubości 50 μm są wykonywane z próbek osadzonych w tworzywie sztucznym za pomocą diamentowej piły taśmowej.</li>
 <li>Aby zmierzyć rozmiar płytki nazębnej, wykonuje się barwienie Giemsa.</li>
 <li>Aby przeanalizować szybkość reendotelializacji w obrębie stentowanego obszaru naczynia, przeprowadza się immunohistochemię czynnika von Willebranda (vWF).</li>
</ol>

<ol><li>Ross, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+injury+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Response to injury and atherogenesis.</a> Am. J. Pathol. 86, 675-684 (1977).</li>
<li>Virmani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+the+vulnerable+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Pathology of the vulnerable plaque.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 47, 13-18 (2006).</li>
<li>Farb, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+acute+and+chronic+coronary+stenting+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathology of acute and chronic coronary stenting in humans.</a> Circulation. 99, 44-52 (1999).</li>
<li>Weber, C., Noels, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%3A+current+pathogenesis+and+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis: current pathogenesis and therapeutic options.</a> Nat. Med. 17, 1410-1422 (2011).</li>
<li>Lenzen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+and+outcome+of+patients+with+established+coronary+artery+disease%3A+the+Euro+Heart+Survey+on+coronary+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Management and outcome of patients with established coronary artery disease: the Euro Heart Survey on coronary revascularization.</a> Eur. Heart J. 26, 1169-1179 (2005).</li>
<li>Babapulle, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchical+Bayesian+meta-analysis+of+randomised+clinical+trials+of+drug-eluting+stents%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A hierarchical Bayesian meta-analysis of randomised clinical trials of drug-eluting stents.</a> Lancet. 364, 583-591 (2004).</li>
<li>Wiviott, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+oral+antiplatelet+therapy+for+reduction+of+ischaemic+events+including+stent+thrombosis+in+patients+with+acute+coronary+syndromes+treated+with+percutaneous+coronary+intervention+and+stenting+in+the+TRITON-TIMI+38+trial%3A+a+subanalysis+of+a+randomised+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Intensive oral antiplatelet therapy for reduction of ischaemic events including stent thrombosis in patients with acute coronary syndromes treated with percutaneous coronary intervention and stenting in the TRITON-TIMI 38 trial: a subanalysis of a randomised trial.</a> Lancet. 371, 1353-1363 (2008).</li>
<li>van Werkum, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+coronary+stent+thrombosis%3A+the+Dutch+Stent+Thrombosis+Registry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Predictors of coronary stent thrombosis: the Dutch Stent Thrombosis Registry.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 1399-1409 (2009).</li>
<li>Finn, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+responses+to+drug+eluting+stents%3A+importance+of+delayed+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vascular responses to drug eluting stents: importance of delayed healing.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 27, 1500-1510 (2007).</li>
<li>Joner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+drug-eluting+stents+in+humans%3A+delayed+healing+and+late+thrombotic+risk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Pathology of drug-eluting stents in humans: delayed healing and late thrombotic risk.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 48, 193-202 (2006).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91, 3527-3561 (1998).</li>
<li>Hristov, M., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+characterization%2C+pathophysiology%2C+and+possible+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: characterization, pathophysiology, and possible clinical relevance.</a> J. Cell Mol. Med. 8, 498-508 (2004).</li>
<li>Rabelink, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+more+than+an+inflammatory+response%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: more than an inflammatory response?</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 834-838 (2004).</li>
<li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+drug-eluting+stents+for+peripheral+applications%3A+recommendations+from+an+expert+consensus+group%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group.</a> Circulation. 110, 2498-2505 (2004).</li>
<li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+neointimal+response+to+coronary+artery+injury+in+pigs+and+dogs.+Implications+for+restenosis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb%22%5BJournal%5D)">Differential neointimal response to coronary artery injury in pigs and dogs. Implications for restenosis models.</a> Arterioscler. Thromb. 14, 395-400 (1994).</li>
<li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restenosis+and+the+proportional+neointimal+response+to+coronary+artery+injury%3A+results+in+a+porcine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 19, 267-274 (1992).</li>
<li>Ali, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+in-stent+stenosis+in+ApoE+knockout+mice%3A+insights+from+a+novel+mouse+model+of+balloon+angioplasty+and+stenting%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27, 833-840 (2007).</li>
<li>Chamberlain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+in+situ+stenting%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of in situ stenting.</a> Cardiovasc. Res. 85, 38-44 (2010).</li>
<li>Rodriguez-Menocal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+in-stent+restenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of in-stent restenosis.</a> Atherosclerosis. 209, 359-366 (2010).</li>
<li>Costa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+immobilization+of+antimicrobial+peptides+%28AMPs%29+onto+biomaterial+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Covalent immobilization of antimicrobial peptides (AMPs) onto biomaterial surfaces.</a> Acta Biomaterialia. 7, 1431-1440 (2011).</li>
<li>Soehnlein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cathelicidin+protects+from+neointimal+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cathelicidin protects from neointimal hyperplasia.</a> Science Translational Medicine. 3, 103ra198(2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Aby zmniejszyć ryzyko zakrzepicy i restenozy w stencie oraz utrzymać rozwój nowych powłok dla stentów uwalniających leki, potrzebna jest łatwa, prosta i dostępna metoda implantacji stentu w modelu zwierzęcym. Myszy dostarczają idealny system do badania złożonych mechanizmów przebudowy tętnic po implantacji stentu i skuteczności takich leków. Istniejące modele restenozy w stencie u myszy są trudne, wymagają wysokich umiejętności chirurgicznych i implikują wysokie ryzyko powikłań, takich jak krwawienie lub paraliż17-19. Na przykład w modelu implantacji stentu do aorty piersiowej myszy dawcy po dylatacji balonowej naczynia, a następnie przeszczepieniu stentowanego segmentu do tętnicy szyjnej myszy biorcy17, na badanie mechanizmów patologicznych ma wpływ nie tylko reakcja biorcy na materiał dawcy, ale także masywne uszkodzenie naczynia krwionośnego i przydanki. Wszczepienie stentu ze stali nierdzewnej bezpośrednio do aorty brzusznej po poszerzeniu balonem19 powoduje wysoką śmiertelność (35%) z powodu paraliżu tylnej nogi po zakrzepicy lub krwawienia z aorty brzusznej w miejscu arteriantomii. Wszczepienie spiralnego, samorozprężalnego stentu nitinolowego do aorty brzusznej przez tętnicę udową18 wymaga wysokich umiejętności chirurgicznych, głównie ze względu na ślepe skierowanie stentu wzdłuż rozgałęzienia od tętnicy udowej do aorty, aby umieścić stent we właściwej pozycji. Po tej procedurze występuje duże ryzyko uszkodzenia nerwu udowego, a tym samym paraliżu tylnej nogi. W porównaniu z tymi procedurami, nasz model implantacji stentu u myszy nie wymaga wysokich umiejętności chirurgicznych.
Nasz model oferuje prostą, łatwą i wydajną metodę analizy wpływu różnych powłok lekowych na przebudowę tętnic, umieszczenie stentu odbywa się pod okiem i nie ma ryzyka uszkodzenia nerwów lub innych struktur. Złożone mechanizmy molekularne mogą być łatwiej badane w naszym modelu stentowania tętnicy szyjnej myszy, nie tylko ze względu na bezpośrednią dostępność naczynia, ale także ze względu na istnienie różnych szczepów myszy z nokautem.
Jednym z ograniczeń, w porównaniu z procedurą kliniczną, jest to, że nasz model wykorzystuje zdrowe myszy/tętnice i nie wykonuje stentowania na wcześniej istniejących blaszkach miażdżycowych (nie restenoza w stencie, ale zwężenie w stencie). Nie wykonujemy również dylatacji balonu przed implantacją stentu. Jednak ze względu na ogromne uszkodzenia ściany naczynia w obu modelach, procesy naprawcze są podobne. Niestety, ze względu na artefakty pochodzące z metali, monitorowanie wzrostu nowozewnętrznej błony wewnętrznej in vivo nie jest możliwe przy użyciu istniejących metod obrazowania, takich jak ultrasonografia lub tomografia komputerowa. Innym czynnikiem ograniczającym jest cienki przekrój stentów na bazie metalu, co wymaga pewnej wiedzy specjalistycznej w zakresie obróbki metali.
Korzystając z tej metody, byliśmy w stanie wykazać, że biofunkcjonalizowane zminiaturyzowane stenty nitinolowe pokryte LL-37 instruują neutrofile, zmniejszają restenozę w stencie, zapewniając nowatorską koncepcję promowania gojenia naczyń krwionośnych po terapii interwencyjnej21.
Pomimo tych ograniczeń, model ten wydaje się być do tej pory najodpowiedniejszym systemem, a tym samym oszczędzającym pieniądze i czas, do badania nowych powłok leków do stentów i ich wpływu na zdarzenia molekularne podczas przebudowy tętnic. Co więcej, model ten można łatwo dostosować do chomika, który jest bardziej podobny do człowieka, dzięki czemu każdą hipotezę terapeutyczną można zweryfikować przed zastosowaniem u większych zwierząt lub człowieka, aby uniknąć nieprzyjemnych i nieoczekiwanych efektów.

Choroby sercowo-naczyniowe spowodowane postępem miażdżycy są główną przyczyną zgonów w krajach uprzemysłowionych. Miażdżyca jest ogniskową, zapalną reakcją włóknisto-proliferacyjną ściany naczynia krwionośnego na uszkodzenie śródbłonka1, powodującą tworzenie się przedłużonej blaszki miażdżycowej w świetle naczynia, wpływającą na przepływ krwi przez tętnice wieńcowe. Ponad 75% zawałów mięśnia sercowego wynika z pęknięcia cienkiej włóknistej czapeczki zapalnej blaszki miażdżycowej2. Ponieważ to powikłanie może być śmiertelne, przezskórna angioplastyka przezświetlna (wieńcowa) (PTCA) z implantacją stentu stała się terapią pierwszego wyboru w obecnej praktyce medycznej. Metoda pozwala na poszerzenie zwężonej tętnicy wieńcowej, a tym samym przywrócenie przepływu krwi. Jednocześnie powoduje rozległe uszkodzenie śródbłonka i ściany naczynia3. Jednak długotrwały efekt tej terapii jest ograniczony przez nadmierną przebudowę tętnic i restenozy4.
Dzięki zastosowaniu stentów, PTCA stał się bardziej skuteczny w leczeniu skomplikowanych zmian, umożliwiając rewaskularyzację po ostrym zamknięciu naczynia5. Ta metoda zmniejsza częstość występowania restenozy w stencie do mniej niż 10%6. Oprócz tych korzyści, ta terapia pierwszego wyboru w rewaskularyzacji naczyń wieńcowych niesie ze sobą również zagrażające życiu ryzyko zakrzepicy w stencie i restenozy.
Zakrzepica w stencie jest spowodowana deendotelializacją naczynia, po której następuje masywne przyleganie płytek krwi i fibryny do uszkodzonego miejsca. 26% pacjentów cierpi na zakrzepicę w stencie, a 63% umiera z powodu zawału mięśnia sercowego7. Retenoza odnosi się do procesu gojenia się ran po mechanicznym urazie ściany naczynia, obejmującym przerost neointimy (migracja i proliferacja komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC), odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i przebudowa naczynia. Często konieczna staje się inwazyjna ponowna interwencja w celu rozszerzenia poważnie zwężonych naczyń miażdżycowych z powodu zakrzepicy w stencie i restenozy.
Aby zapobiec zakrzepicy w stencie, konieczne jest długotrwałe leczenie lekami przeciwzakrzepowymi8. Aby zapobiec restenozy, stenty uwalniające leki nowej generacji wymywają środki antyproliferacyjne, takie jak leki immunosupresyjne (np. syrolimus, ewerolimus, zotarolimus) i leki przeciwnowotworowe (np. paklitaksel) z powłoki polimerowej przez kilka miesięcy9,10. Chociaż leki te zmniejszają powstawanie neointimy i restenozy, utrzymują wysokie ryzyko zakrzepicy w stencie poprzez hamowanie reendotelializacji.
Po uszkodzeniu tętnicy, utrzymanie przedziału śródbłonka jest niezbędne, aby zapobiec powikłaniom zakrzepowym. W warunkach fizjologicznych śródbłonek człowieka wykazuje niewielką rotację11. Jednak w warunkach patologicznych integralność śródbłonka jest upośledzona, tak że wymagana jest szybka regeneracja poprzez otoczenie dojrzałych komórek śródbłonka i krążących komórek progenitorowych śródbłonka (EPC)12,13.
Badanie tych skomplikowanych mechanizmów molekularnych u większych zwierząt14-16 lub w tętnicy aortalnej myszy jest bardzo trudną procedurą, oferującą ograniczone dane17-19. Aby przetestować skuteczność nowatorskich powłok stentowych w celu zmniejszenia zakrzepicy i restenozy w stencie, niezbędne są nowe modele.
Nitinol stanowi idealną platformę dla stentów ze względu na jego wysoką elastyczność, efekt pamięci kształtu i dobrą tolerancję u pacjentów, będąc z powodzeniem stosowany jako stenty z gołego metalu w zastosowaniach klinicznych. Stop ten umożliwił stworzenie zminiaturyzowanego stentu o średnicy zewnętrznej 500 μm, który można pokryć20 i wszczepić do tętnicy szyjnej myszy. Opracowanie zminiaturyzowanego stentu nitinolowego do tętnicy szyjnej myszy pozwala na badanie precyzyjnych mechanizmów molekularnych indukowanych przez implantację stentu i daje możliwość szybkiego i skutecznego przetestowania działania różnych powłok lekowych w celu zapobiegania restenozy. Co więcej, istnienie różnych szczepów myszy z nokautem stanowi ogromną zaletę w wyjaśnianiu roli różnych cząsteczek zaangażowanych we wzrost neointimy i zakrzepicę w stencie.

<table><tbody><tr><td>stenty nitinolowe (wykonane samodzielnie z rozpórek nitinolowych)</td><td>Fort Wayne Metals, Castlebar, Irlandia NiTi#1, superelastyczne, wyżarzane prosto, lekki tlenek, średnica 500 &#956; m</td><td>produkt na zamówienie</td><td>Instytut Technologii Włókienniczej i Inżynierii Mechanicznej</td></tr><tr><td>Rura silikonowa</td><td>IFK Isofluor, Niemcy</td> średnica <td>produktu na zamówienie</td><td>500 &mu; m, grubość przekroju 100 &mu; m, cewnik z politetrafluoroetylenu</td></tr><tr><td>stereomikroskop Olympus</td><td></td><td>SZ/X9</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>FST, Niemcy</td><td>91197-00</td><td>standardowa końcówka zakrzywiona 0,17 mm</td></tr><tr><td>Ketamina 10%</td> <td>CEVA, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna 2%</td> <td>Medistar, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthene</td><td>Bayer, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>FST, Niemcy</td><td>91460-11</td><td>Proste</td></tr><tr><td>nożyczki Vannas</td><td>Aesculap, Niemcy</td><td>OC 498 R</td><td></td></tr><tr><td>5/0 Silk</td><td>Seraflex</td><td>IC 108000</td><td></td></tr><tr><td>7/0 Silk</td><td>Seraflex</td><td>IC 1005171Z</td><td></td></tr><tr><td>prowadnik</td><td>Abbott Vascular</td><td>1001782-HC</td><td>0,014-calowy prowadnik angioplastyki</td></tr><tr><td>Klipsy do szwów Michel</td><td>Aesculap, Niemcy</td><td>BN507R</td><td>Wymiary: 7,5 x 1,75 mm</td></tr><tr><td>Michel Kleszcz</td><td>Aesculap, Niemcy</td><td>BN730R</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model implantacji stentu w tętnicy szyjnej do badania restenozy

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Pomimo znacznego postępu, jaki dokonał się w rozwoju stentów w ostatnich dziesięcioleciach, choroby sercowo-naczyniowe pozostają główną przyczyną zgonów w krajach zachodnich. Oprócz korzyści płynących z opracowania różnych stentów uwalniających leki, rewaskularyzacja naczyń wieńcowych niesie ze sobą również zagrażające życiu ryzyko zakrzepicy w stencie i restenozy. Badania nad nowymi strategiami terapeutycznymi są utrudnione przez brak odpowiednich metod badania procesów implantacji stentów i restenozy. W tym miejscu opisujemy szybki i przystępny zabieg implantacji stentu w tętnicy szyjnej myszy, który daje możliwość zbadania w wygodny sposób molekularnych mechanizmów przebudowy naczyń i efektów działania różnych powłok lekowych.

<ol>
	<li>Implantacja zminiaturyzowanego stentu z nitinolu do lewej tętnicy szyjnej myszy trwa 25-30 min, a wskaźnik śmiertelności wynosi 10%, co wynika głównie z uszkodzenia naczynia podczas interwencji. Lepszy wskaźnik przeżywalności obserwuje się u myszy o masie ciała powyżej 25 g w momencie implantacji stentu (wskaźnik śmiertelności 5%). W związku z tym do implantacji wybrano myszy o masie od 25-27 g. Po zabiegu myszy budzą się z narkozy w ciągu 2-5 min i nie obserwuje się u nich żadnych upośledzeń fizycznych, takich np. jak paraliż. Obrazowanie mikrotomografią komputerową (Micro-CT) wykonane tydzień po implantacji stentu wykazało, że stenty nie uległy przemieszczeniu pod wpływem przepływu krwi (Rycina 1C). Niestety, analiza tworzenia neointimy na tych obrazach nie jest możliwa ze względu na artefakty pochodzące od metalu (Rycina 1D, 1E).</li>
	<li>Nie zaobserwowaliśmy żadnych uszkodzeń naczynia ani śródbłonka w obszarze naczynia bez stentu, bezpośrednio poniżej stentu, co potwierdzono badaniem histologicznym (Rycina 2A) oraz specyficznym barwieniem śródbłonka (Rycina 2B, przeciwciało anty-CD31 przeciwko myszy). Aby uzyskać lepszy przegląd, przekrój został przeskanowany przy użyciu dwufotonowej mikroskopii laserowej (Rycina 2B, 2C).</li>
	<li>W naczyniu ze stentem u myszy o masie od 25-27 g wykryto trwałe rozszerzenie o 15% (stosunek stent:tętnica, 1,15:1). Tworzenie neointimy oraz formowanie zakrzepów można analizować za pomocą klasycznych barwień histologicznych (np. hematoksylina i eozyna, Giemsa, Movat, błękit toluidyny, Masson-Trichrom-Goldner, Rycina 3A, 3B). Ponieważ błona zewnętrzna i wewnętrzna nie są już widoczne, wielkość blaszki miażdżycowej obliczono jako różnicę między powierzchnią zewnętrzną a światłem naczynia (średnia powierzchnia blaszki: 234566 ± 3315 μm2, średnia powierzchnia światła: 12036 ± 2662 μm2). Zmierzono również obwód zewnętrzny (średnia: 1799 ± 14 μm). Do analizy składu komórkowego przekroje muszą zostać poddane deplastyfikacji i zabarwione specyficznymi markerami. Do oceny reendotelizacji zastosowano przeciwciało anty-CD31 sprzężone z Cy3, a do oceny proliferacji komórek mięśni gładkich przeciwciało anty-SMA sprzężone z FITC (Rycina 3C). Reendotelizację obliczono jako procent powierzchni zabarwionej pozytywnie na CD-31 w stosunku do całkowitej powierzchni światła naczynia (średnia: 23,07 ± 3,14 %) tydzień po implantacji stentu.</li>
</ol>
Oczywiście, w zależności od doświadczenia danego laboratorium, możliwe jest zastosowanie nieograniczonej liczby specyficznych barwień. W zależności od celu badania można również przeprowadzić analizę ciężkiego łańcucha miozyny w celu lepszej charakterystyki SMC, a także analizę komórek naciekających (monocytów, limfocytów) lub barwienia na różne cytokiny zapalne.
<img alt="Schemat wprowadzania stentu szyjnego i obrazowanie rentgenowskie; pozycjonowanie drutu prowadzącego, dostęp naczyniowy w badaniach." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50233/50233fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50233/50233fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny przegląd procedury chirurgicznej (A). Przepływ krwi zostaje przerwany poprzez mocne zawiązanie węzłów na tętnicy szyjnej wewnętrznej oraz proksymalnej części tętnicy szyjnej zewnętrznej, a także poprzez zaciśnięcie węzła otaczającego tętnicę szyjną wspólną. Silikonowa rurka zawierająca stent zostaje wprowadzona do tętnicy szyjnej zewnętrznej poprzez małe nacięcie w tej tętnicy. Po osiągnięciu przez stent pożądanej pozycji, rurka silikonowa jest cofnięta po drucie prowadzącym, co umożliwia ekspansję stentu z pamięcią kształtu. Obrazy mikro-CT przedstawiające pozycję stentu tydzień po implantacji chirurgicznej (B). Ze względu na artefakty wynikające z zastosowanego materiału, analiza wzrostu neointimy nie jest możliwa (C,D).
<img alt="Analiza histologiczna; barwione przekroje tkanek A, B, C; obrazy mikroskopowe struktury komórkowej." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50233/50233fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50233/50233fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Obszar naczynia bez stentu nie jest dotknięty procedurą chirurgiczną, co wykazuje barwienie błękitem toluidyny (A) oraz barwienie CD31 swoiste dla śródbłonka (B, C).
<img alt="Obrazy mikroskopowe: histologiczne przekroje tkanek A, B; immunofluorescencja C z markerami komórkowymi." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50233/50233fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50233/50233fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analizę blaszki miażdżycowej można przeprowadzić za pomocą klasycznych barwień histologicznych (np. Masson-Trichrom-Goldner) (A). Zorganizowany zakrzep można wykryć poprzez czarne złogi fibryny wewnątrz neointimy; w niektórych przypadkach obserwuje się całkowite zamknięcie naczynia (B). Reendotelializację (Cy3, czerwony) lub proliferację komórek mięśni gładkich (FITC, zielony) wykryto za pomocą podwójnego barwienia immunofluorescencyjnego z użyciem specyficznych markerów. Kontrastowanie wykonano przy użyciu 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI, niebieski) (C). Zauważono pełną reendotelializację zastrzałów stentu (lewa, podwójna strzałka) w porównaniu do niepełnej reendotelializacji światła naczynia (prawa, pojedyncza strzałka).

Opisano model implantacji stentu w tętnicy szyjnej myszy. W porównaniu z innymi podobnymi metodami, procedura ta jest bardzo szybka, prosta i dostępna, oferując możliwość zbadania w wygodny sposób reakcji ściany naczyniowej na różne stenty uwalniające leki oraz molekularnych mechanizmów restenozy.

Mysi model implantacji stentu w tętnicy szyjnej do badania restenozy

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Ogólnym celem tej procedury jest implantacja stentu do tętnicy szyjnej myszy, co umożliwia badanie przebudowy naczynia lub efektów stosowania różnych powłok lekowych. Najpierw stent przygotowuje się do implantacji poprzez przeniesienie go do rurki silikonowej. Następnie izoluje się tętnicę wspólną i zakłada szwy w celu przerwania przepływu krwi.Następnie stent wprowadza się poprzez niewielkie nacięcie w tętnicy szyjnej zewnętrznej. Po jego umieszczeniu usuwa się rurkę silikonową oraz drut prowadzący, pozostawiając stent w tętnicy szyjnej wspólnej. Ostatecznie próbki barwi się metodą Gemsy w celu analizy tworzenia się blaszki miażdżycowej.Istniejące modele natychmiastowej restenozy są trudne w realizacji, ponieważ wymagają precyzyjnych umiejętności chirurgicznych, a częstymi powikłaniami są pęknięcia lub paraliż. Ryzyko wystąpienia powikłań zostało zminimalizowane w naszym modelu poprzez utrzymanie stentu w polu widzenia przez cały proces implantacji. Części tej procedury zostaną zaprezentowane przez dr. Simseka, postdoka z naszego laboratorium.Zaprezentuję proces implantacji stentu do tętnicy w kartridżu. Rozpocznij od przeniesienia stentu pęsetą do dwucentymetrowej rurki silikonowej. Odcinając rurkę pod kątem 2 mm przed jej przednim końcem, należy ułatwić proces implantacji. Przed implantacją zwilż stent, aby ułatwić jego wprowadzenie.Następnie należy potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia u dorosłego samca myszy. Po nałożeniu maści ochronnej na oczy, wygolić brzuszny obszar szyi. Następnie, pracując pod mikroskopem stereoskopowym, oczyścić miejsce zabiegu poprzez wielokrotne przecieranie Betadyną i alkoholem.Za pomocą nożyczek wykonaj niewielkie nacięcie pośrodku nad odpowiednim obszarem. Rozdziel tkankę tłuszczową i inne tkanki, aż do wyizolowania lewej tętnicy szyjnej wspólnej. Po jej uwidocznieniu zawiąż szew wokół tętnicy wspólnej, około jednego centymetra od miejsca rozwidlenia.Zwiąż dwa szwy wokół tętnicy szyjnej zewnętrznej, pozostawiając dystalny węzeł luźny, aby umożliwić implantację stentu. Następnie zawiąż szew wokół tętnicy szyjnej wewnętrznej. Po zabezpieczeniu szwów wykonaj małe nacięcie w tętnicy zewnętrznej w pobliżu proksymalnego węzła.Używając drutu prowadzącego, wprowadź rurkę silikonową zawierającą stent. Po umieszczeniu w odpowiednim miejscu usuń rurkę silikonową, aby umożliwić rozszerzenie stentu. Następnie zaciśnij dystalny węzeł na tętnicy szyjnej zewnętrznej i usuń szwy na tętnicy szyjnej wewnętrznej oraz wspólnej, aby przywrócić przepływ krwi.Zamknąć nacięcie za pomocą klipsów do szwów i umieścić zwierzę pod lampą grzewczą do czasu pełnego powrotu do sprawności. Powstawanie blaszki miażdżicowej bada się w różnych punktach czasowych po implantacji stentu.Najpierw, po eutanazji i perfuzji przezsercowej, wyizoluj lewą tętnicę szyjną i usuń odcinek zawierający stent. Umieść próbkę w 4% PFA. Po co najmniej 16 godzinach zatop próbkę w plastiku, jak pokazano tutaj.Po wycięciu przekrojów o grubości 50 µm za pomocą diamentowej piły taśmowej przeprowadzono ocenę stabilności w celu analizy tworzenia się blaszek miażdżycowych. Obrazowanie mikrotomografią komputerową wykonane tydzień po implantacji stentu wykazało, że stent nie został przesunięty przez przepływ krwi. W obszarach naczynia bez stentu nie stwierdzono uszkodzeń naczyniowych ani endotelialnych, co potwierdzono barwieniem Odin blue oraz barwieniem specyficznym dla endotelium CD 31; barwienie histologiczne zostało wykorzystane do zbadania zakresu tworzenia się blaszek miażdżycowych.Tutaj stent jest widoczny jako czarno barwiona fibryna wewnątrz neointimy. W niektórych przypadkach obserwuje się całkowite zamknięcie naczynia. Reendotelizację prętów stentu zaznaczono po lewej stronie podwójną strzałką, natomiast niepełną reendotelizację światła naczynia zaznaczono po prawej stronie pojedynczą strzałką.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że obszar operacyjny powinien być stale nawilżany, aby zapobiec wysychaniu i ułatwić manipulowanie stentem.

a-murine-model-stent-implantation-carotid-artery-for-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Muryny model implantacji stentu w tętnicy szyjnej w celu badania nad nadmiernym rozrostem tkanki w ścienie naczynia (restenoza)

W niniejszym materiale wideo przedstawiono sposób wykorzystania niedrogiego i niezawodnego modelu przedklinicznego do badania procesów patobiologicznych i patofizjologicznych rozwoju restenozy wewnątrzstentowej. Zaprezentowano również podłużny monitoring in vivo z wykorzystaniem OCT (optycznej koherentnej tomografii) oraz analizę obrazów OCT.

Obrazowanie restenozy wewnątrzstentowej: niedrogi, niezawodny i szybki model przedkliniczny

Niniejszy film przedstawia model służący do badania rozwoju hiperplazji intimy po implantacji stentu z wykorzystaniem ludzkiego naczynia (IMA) w modelu szczura z niedoborem odporności.

Przeszczepianie i stentowanie ludzkiej tętnicy piersiowej wewnętrznej (IMA): model ludzki do badania rozwoju restenozy wewnątrzstentowej

Modyfikacje histologiczne i biochemiczne po wykluczeniu endoprzeszczepu tętniaka są nadal niejasne. Opisujemy nowy model implantacji endprzeszczepu na tętniaku myszy. Dzięki analizie skrzepliny z utrzymującym się interfejsem krążącego krwiobiegu i bez niego oraz ocenie nowych biomateriałów wewnątrznaczyniowych, model ten pomoże lepiej zrozumieć patobiologię wykluczenia tętniaka wewnątrznaczyniowego.

Nowy mysi model wewnątrznaczyniowej naprawy tętniaka aorty

Opisany poniżej model uszkodzenia balonu szyjnego u szczura pozwala badaczom ocenić leki lub terapie, które negują przerost tętnic wywołany urazem. Opisano szczegółowe przygotowanie przedoperacyjne, zabieg chirurgiczny i opiekę pooperacyjną nad zwierzęciem.

Model uszkodzenia balonu szyjnego szczura do testowania terapii przeciwnaczyniowej

To badanie opisuje inwazyjną procedurę indukcji przyspieszonej miażdżycy u myszy. W porównaniu z innymi metodami wykorzystującymi urazy wywołane elektrycznością lub kriogenicznością, uraz wywołany mechanicznie naśladuje ludzki stan restenozy po terapiach rewaskularyzacyjnych i jest idealny do badania zaangażowanych mechanizmów molekularnych.

Indukcja przyspieszonej miażdżycy u myszy: model "urazu drutowego"

Restenoza po zabiegach sercowo-naczyniowych (operacja pomostowania, angioplastyka lub stentowanie) jest poważnym problemem zmniejszającym trwałość tych procedur. Idealna terapia hamowałaby proliferację komórek mięśni gładkich (VSMC), jednocześnie promując regenerację śródbłonka. Opisano model jednoczesnej oceny proliferacji VSMC i funkcji śródbłonka in vivo.

Mysi uraz zmiażdżenia aorty: skuteczny model in vivo proliferacji komórek mięśni gładkich i funkcji śródbłonka

Powtarzalne eksperymentalne modele zwierzęce są potrzebne do testowania nowych materiałów embolizacyjnych, które zostały zaprojektowane do leczenia wewnątrznaczyniowej niedrożności tętniaków wewnątrzczaszkowych (IA). Niniejsze badanie ma na celu opracowanie bezpiecznej i ustandaryzowanej techniki chirurgicznej embolizacji tętniaków worka w stentach w modelu zwierzęcym szczura.

Biodegradowalny stent magnezowy Leczenie tętniaków worka workowego na modelu szczurzym - wprowadzenie techniki chirurgicznej

Uszkodzenie balonu tętnicy szyjnej szczura naśladuje zabieg angioplastyki klinicznej wykonywany w celu przywrócenia przepływu krwi w naczyniach miażdżycowych. Model ten indukuje reakcję na uszkodzenie tętnicy poprzez rozdęcie ściany tętnicy i obnażenie warstwy wewnętrznej komórek śródbłonka, ostatecznie powodując przebudowę i reakcję hiperplastyczną błony wewnętrznej.

Segmentowe uszkodzenie balonu tętnicy szyjnej szczura z kontrolowanym ciśnieniem z okołoprzybytkowym zastosowaniem terapeutycznym

Ten protokół opisuje wszczepianie ludzkich stentów wieńcowych do aorty brzusznej szczurów z tłem apoE-/- przy użyciu dostępu przezudowego. W porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi, modele mysie mają zalety wysokiej przepustowości, odtwarzalności, łatwości obsługi i utrzymania oraz szerokiej dostępności markerów molekularnych.

Implantacja stentów wieńcowych wielkości człowieka do aorty brzusznej szczura przy użyciu dostępu przezudowego

Niniejszy protokół opisuje standaryzowaną metodę chirurgiczną indukcji tętniaków szyjnych w modelu mysim poprzez pojedynczą operację chirurgiczną.

Model myszy powstawania tętniaka szyjnego

Poznaj technikę implantacji stentu w tętnicę szyjną myszy do badania remodelowania naczyń i mechanizmów restenozy. Ta metoda minimalizuje powikłania chirurgiczne i umożliwia analizę powstawania płytki miażdżycowej.

Mysi model implantacji stentu w tętnicy szyjnej do badania restenozy

Przeglądaj więcej filmów