Name: Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów jonów wapnia i prądów błonowych. Technika ta umożliwia badanie fizjologii serca i chorób takich jak migotanie przedsionków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ponadto dziękujemy kardiochirurgom z Uniwersytetu w Heidelbergu za dostarczenie ludzkiej tkanki przedsionkowej oraz Claudii Liebetrau, Katrin Kupser i Ramonie Nagel za doskonałe wsparcie techniczne. Specjalne podziękowania należą się również Andy'emu W. Traffordowi za jego pomocne sugestie i rady podczas ustanawiania pomiarów stanów nieustalonych Ca2+. Autorzy pragną wyrazić najgłębszą wdzięczność pracownikom Katedry Farmakologii i Toksykologii (kierownik: Ursula Ravens) Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie za możliwość poznania podstawowych technik i umiejętności w zakresie elektrofizjologii komórkowej i izolacji kardiomiocytów.
Badania autorów są wspierane przez Niemiecką Fundację Badawczą (Do769/1-1-3), Niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań poprzez Sieć Kompetencyjną ds. Migotania Przedsionków (01Gi0204) oraz Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych, Unię Europejską poprzez Europejską Sieć Badań Translacyjnych nad Migotaniem Przedsionków (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, duży projekt integracyjny, Propozycja nr 261057) oraz Europejsko-Północnoamerykański Przedsionek Grant Stowarzyszenia Badań nad Fibrylacją (ENAFRA) przyznany przez Fundację Leducq (07CVD03).
Schemat pokazany w pliku wideo został wykonany przy użyciu grafiki medycznej Servier.

Protokoły eksperymentalne muszą zostać zatwierdzone przez lokalną komisję etyki, a wszyscy pacjenci muszą wyrazić pisemną świadomą zgodę. Nasze badania zostały zatwierdzone przez komisję etyki Wydziału Medycznego w Mannheimie Uniwersytetu w Heidelbergu (#2011-216N-MA) i przeprowadzono je zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu ludzi. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.
0. Pozyskiwanie tkanki przedsionkowej człowieka
Podczas rutynowych procedur kaniulacji u pacjentów poddawanych operacjom kardiochirurgicznym w celu wykonania pomostowania aortokoronarnego z wykorzystaniem krążenia pozaustrojowego, zazwyczaj usuwa się wierzchołek uszka prawego przedsionka, który może zostać wykorzystany do izolacji kardiomiocytów przedsionkowych. Po wycięciu próbkę tkanki przenosi się natychmiast do probówki Falcon o pojemności 50 ml z jałowym, wolnym od Ca2+ roztworem transportowym zawierającym monoksym 2,3-butanodionu (Tabela I; BDM, inhibitor skurczu, zapobiegający kurczeniu się miocytów). Przy czasie transportu wynoszącym od 30 do 45 min nie stwierdzono wyraźnej korzyści z chłodzenia lub napowietrzania w odniesieniu do liczby i jakości izolowanych kardiomiocytów przedsionkowych. Co do zasady transport do laboratorium powinien być jak najszybszy. Jeśli jednak nie można uniknąć dłuższego czasu transportu, korzystne może być przemieszczanie próbek w temperaturze 4 °C w roztworze napowietrzonym.
1. Przygotowania wstępne
<ol>
	<li>Włącz termocyklator, który kontroluje temperaturę zlewki z płaszczem grzewczym (Tabela II). Upewnij się, że temperatura wewnątrz zlewki wynosi 37 °C. Przykryj zlewkę szklaną pokrywką, aby utrzymać stałą temperaturę wewnątrz naczynia przez cały proces izolacji.</li>
	<li>Odważ kolagenazę I oraz proteazę XXIV do trzech szklanych zlewków i przechowuj je w temperaturze pokojowej. Enzymy zostaną rozcieńczone bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Przechowuj 20 ml roztworu wolnego od Ca2+ w szalce Petri w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przechowuj 250 ml roztworu wolnego od Ca2+ w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie tkanki
<ol>
	<li>Przenieść próbkę tkanki wraz z roztworem transportowym do szalki Petriego (~10 cm średnicy) i usunąć nożyczkami zbędną tkankę tłuszczową.</li>
	<li>Zważyć próbkę tkanki. Do izolacji komórek wykorzystuje się od 200 do 600 mg. Pozostałą tkankę można zamrozić w ciekłym azocie do późniejszych analiz biochemicznych.</li>
	<li>Przenieść próbkę tkanki do szalki Petriego zawierającej 20 ml roztworu wolnego od Ca2+ w temperaturze 4 °C (patrz krok 1.3) i posiekać tkankę na małe kawałki o rozmiarze około 1 mm3.</li>
	<li>Kolejne kroki należy przeprowadzić w temperaturze 37 °C przy ciągłym napowietrzaniu 100% O2. Na rurkę z tlenem można nałożyć końcówkę pipety, aby uniknąć silnego bąbelkowania i zapewnić ciągły przepływ powietrza.</li>
	<li>Przenieść kawałki tkanki wraz z roztworem wolnym od Ca2+ do zlewki z płaszczem grzewczym i ostrożnie mieszać przez około 3 min za pomocą magnetycznego mieszadła.</li>
	<li>Zatrzymać mieszanie i odczekać kilka sekund, aż kawałki tkanki opadną na dno. Ostrożnie odfiltrować nadsącz przez nylonowe sito (200 μm, Tabela II). Za pomocą pęsety przenieść zatrzymane na sicie kawałki tkanki z powrotem do zlewki.</li>
	<li>Ponownie napełnić zlewkę roztworem wolnym od Ca2+ i powtórzyć etapy płukania 2.4 oraz 2.5 dwukrotnie.</li>
</ol>
3. Pierwsze trawienie enzymatyczne
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić fragmenty tkanki w 20 ml roztworu enzymatycznego E1 (Tabela I) zawierającego kolagenazę i proteazę, a następnie ostrożnie mieszać przez 10 min.</li>
	<li>Dodać 40 μl 10 mM roztworu CaCl2, aby uzyskać stężenie końcowe 20 μM Ca2+.</li>
	<li>Po 35 min ostrożnie przefiltrować nadsącz przez nylonowe sito (200 μm, Tabela II) w taki sposób, aby większość fragmentów tkanki pozostała w zlewce. Zwrócić zatrzymane na sicie fragmenty tkanki do zlewki.</li>
</ol>
4. Druga digestia enzymatyczna
<ol>
	<li>Ponownie resuspender fragmenty tkanki w 20 ml roztworu enzymatycznego E2 zawierającego wyłącznie kolagenazę I (Tabela I). Natychmiast dodać 40 μl 10 mM roztworu CaCl2, aby uzyskać stężenie końcowe 20 μM Ca2+.</li>
	<li>Podczas drugiego trawienia sporadycznie rozdrabniać grudki tkanki za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Po 5 min pobrać próbkę za pomocą pipety Pasteura, aby sprawdzić stopień dysocjacji komórek. Powtarzać tę czynność co 2-3 min, aż pojawią się prążkowane kardiomiocyty w kształcie pręta.</li>
	<li>Przerwać mieszanie i pozwolić fragmentom tkanki opaść na dno przez około 20-30 s.</li>
	<li>Ostrożnie przefiltrować nadsącz przez nylonowe sito (200 μm, Tabela II) do probówki Falcon 50 ml (Probówka A). Pozostałe na sicie fragmenty tkanki przenieść z powrotem do zlewki.</li>
	<li>Ponownie resuspender fragmenty tkanki w zlewce w 20 ml roztworu do przechowywania (Tabela I)10 i dalej dysocjować komórki poprzez delikatną tryturację mechaniczną przy użyciu pipety serologicznej 20 ml z dozownikiem. Należy starać się unikać powstawania pęcherzyków powietrza, ponieważ są one szkodliwe dla przeżywalności i jakości komórek.</li>
	<li>Ostrożnie przefiltrować nadsącz przez nylonowe sito (200 μm, Tabela II) do probówki Falcon 50 ml (Probówka B).</li>
</ol>
5. Końcowe przygotowanie i dostosowanie końcowego stężenia Ca2+
<ol>
	<li>Odwiruj obie probówki Falcon A i B (patrz kroki 4.5 i 4.7) przy 95 x g przez 10 min.</li>
	<li>Ostrożnie usuń nadsącz z obu probówek poprzez aspirację. Upewnij się, że osad nie został naruszony. Odrzuć nadsącz.</li>
	<li>Resuspenduj oba osady, dodając do każdej probówki 1,5 ml roztworu do przechowywania (Table I) (temperatura pokojowa).</li>
	<li>Do każdej probówki Falcon dodaj dwukrotnie 7,5 μl roztworu 10 mM CaCl2 i dokładnie wymieszaj. Po każdym kroku inkubuj przez 10 min.</li>
	<li>Dodaj 15 μl roztworu 10 mM CaCl2, aby uzyskać końcowe stężenie Ca2+ wynoszące 0,2 mM.</li>
</ol>
6. Obciążanie miocytów fluorescencyjnym wskaźnikiem Ca2+ Fluo-3 AM (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Przenieś 1,5 ml zawiesiny komórkowej (probówka A i/lub probówka B) do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml (probówka typu Eppendorf).</li>
	<li>Kolejne kroki należy wykonywać z uwzględnieniem światłoczułości fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+ Fluo-3.</li>
	<li>Rozpuść 50 μg przepuszczalnej przez błony pochodnej estru acetoksymetylowego Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabela III) w 44 μl roztworu stokowego Pluronic F-127 (Tabela III) (20% w/v w bezwodnym DMSO), aby otrzymać 1 mM roztwór stokowy Fluo-3 AM, który można przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 1 tydzień.</li>
	<li>Dodaj 15 μl roztworu stokowego Fluo-3 AM do probówki do mikrowirówki zawierającej 1,5 ml zawiesiny komórkowej (patrz krok 6.1) i ostrożnie wymieszaj.</li>
	<li>Inkubuj zawiesinę komórkową przez 10 min w nieprzezroczystym pudełku.</li>
	<li>Krótko wiruj przy prędkości około 6 000 rpm.</li>
	<li>Odlaniu nadmiar nadsączu i zawiesić osad ponownie w 1,5 ml roztworu kąpielowego (Tabela IV).</li>
	<li>Pozostaw zawiesinę komórkową na około 30 min w celu deestryfikacji przed rozpoczęciem eksperymentów.</li>
</ol>
7. Jednoczesne pomiary techniką patch-clamp oraz epifluorescencyjne pomiary Ca2+
Ponieważ pomiary metodą patch-clamp nie są głównym tematem niniejszego przeglądu, odsyłamy zainteresowanego czytelnika do innych publikacji zawierających bardziej szczegółowy opis tej techniki.11-14 Dla zachowania kompletności przedstawiamy zwięzłe podsumowanie protokołu pomiaru potencjałów czynnościowych lub prądów Ca2+ typu L, w obu przypadkach wraz z jednoczesnym zapisem przejściowych zmian stężenia Ca2+.
Podczas eksperymentów miocyty są poddawane superfuzji w temperaturze 37 °C roztworem kąpieli (Tabela IV) przy użyciu systemu szybkiej perfuzji (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). W eksperymentach z zaciskiem napięciowym (voltage-clamp) prądy K+ są blokowane poprzez dodanie do roztworu kąpieli 4-aminopirydyny (5 mmol/L) oraz BaCl2 (0.1 mmol/L). Stosuje się borokrzemowe mikroelektrody szklane, których oporność końcówki po napełnieniu roztworem pipety (Tabela V) powinna wynosić 2-5 MΩ. Oprócz obciążania miocytów Fluo-3 AM (patrz krok 6), Fluo-3 jest również zawarty w roztworze pipety (Tabela V). Fluorescencję wzbudza się przy 488 nm, a emitowane światło (&lt;520 nm) konwertuje się na [Ca2+]i przy założeniu
<img alt="Równanie 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" />
 
gdzie kd=stała dysocjacji Fluo-3 (864 nM), F=fluorescencja Fluo-3; Fmax=fluorescencja przy nasyceniu Ca2+ uzyskana na koniec każdego eksperymentu.12 Sygnały elektryczne oraz sygnały Ca2+ w epifluorescencji są rejestrowane jednocześnie. Potencjały czynnościowe są stymulowane z częstotliwością 0,5 Hz w trybie clampingu prądowego (current-clamp) przy użyciu 1 ms impulsów prądowych o sile 1,2x progu pobudzenia. Prądy Ca2+ typu L są mierzone w trybie clampingu napięciowego (voltage-clamp) przy potencjale spoczynkowym -80 mV i 100 ms impulsie rampowym do -40 mV w celu inaktywacji szybkich prądów Na+, a następnie 100 ms impulsie testowym do +10 mV z częstotliwością 0,5 Hz.

<ol><li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li>
<li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsation%2C+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li>
<li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+Med.+Assoc.+J%22%5BJournal%5D)">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-Protein+%CE%B23-subunit+825T+allele+is+associated+with+enhanced+human+atrial+inward+rectifier+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents.</a> Circulation. 102, 692-697 (2000).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phosphorylation-dependent+regulation+of+constitutively+active+and+muscarinic+receptor-activated+IK%2CACh+channels+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+IK%2CACh+current+may+contribute+to+clinical+efficacy+of+class+I+and+class+III+antiarrhythmic+drugs+in+patients+with+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn.+Schmiedebergs+Arch.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation.</a> Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-gated+potassium+current+IK%2CACh+is+constitutively+active+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 3697-3706 (2005).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-to-right+atrial+inward+rectifier+potassium+current+gradients+in+patients+with+paroxysmal+versus+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Arrhythm.+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation.</a> Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).</li>
<li>Amos, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+outward+currents+of+human+atrial+and+subepicardial+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).</li>
<li>Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrarapid+delayed+rectifier+current+inactivation+in+human+atrial+myocytes%3A+properties+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences.</a> Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).</li>
<li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+IK%2CACh+channels+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart.</a> Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).</li>
<li>Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca2%2B+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+in+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).</li>
<li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+and+increased+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125, 2059-2070 (2012).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circ Res. 26, 679-687 (1970).</li>
<li>Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+calcium+tolerant+myocytes+from+adult+rat+hearts%3A+review+of+the+literature+and+description+of+a+method%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method.</a> Life Sci. 33, 1-18 (1983).</li>
<li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li>
<li>Bielecki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+changes+in+pH+of+the+perfusion+fluid+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox+in+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart.</a> Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).</li>
<li>Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+taurine+on+calcium+paradox+and+ischemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure.</a> Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).</li>
<li>Rich, T. L., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+depletion+in+rabbit+myocardium.+Calcium+paradox+protection+by+hypothermia+and+cation+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution.</a> Circ. Res. 51, 131-141 (1982).</li>
<li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+%22KB+medium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).</li>
<li>Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).</li>
<li>Worthington, K., Worthington, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWorthington%2C+K+%22Worthington+Enzyme+Manual%22">Worthington Enzyme Manual</a>. , (1993).</li>
<li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology-specific+effects+of+the+IKur%2FIto%2FIK%2CACh+blocker+AVE0118+on+ion+channels+in+human+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+downregulation+of+G-protein-coupled+inward+rectifying+K%2B+current+IK%2CACh+in+chronic+human+atrial+fibrillation%3A+decrease+in+GIRK4+mRNA+correlates+with+reduced+IK%2CACh+and+muscarinic+receptor-mediated+shortening+of+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials.</a> Circulation. 104, 2551-2557 (2001).</li>
<li>Hatem, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+compartments+of+sarcoplasmic+reticulum+participate+in+the+excitation-contraction+coupling+process+in+human+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes.</a> Circ. Res. 80, 345-353 (1997).</li>
<li>Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+different+potassium+channels+in+human+atrium.+Contribution+to+the+basal+potassium+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance.</a> Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).</li>
<li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li>
<li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li>
</ol>

Firma Worthington Biochemical Corp. wsparła tę publikację, pokrywając koszty produkcji pliku wideo. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

W tym artykule opisano metodę izolacji ludzkich miocytów przedsionków z przydatków prawego przedsionka uzyskanych od pacjentów poddawanych operacji na otwartym sercu. Aby wykorzystać te miocyty do pomiarów cytozolowego Ca2+ , dostosowaliśmy wcześniej opisaną metodę4-11 , pomijając EGTA w roztworze magazynowym.
Już w 1970 roku zaobserwowano, że chociaż miocyty dysocjują w obecnościCa2+ podczas trawienia, wszystkie z nich były w przykurczu i nie były zdolne do życia. 16,17 Dlatego izolację komórek przeprowadza się w roztworze wolnym odCa2+. Jednak ponowne wprowadzenie fizjologicznych stężeńCa2+ spowodowało szybki napływCa2+ i śmierć komórek. Zostało to opisane jako zjawisko paradoksu Ca2+, które zostało pierwotnie zaobserwowane w perfuzjach serc przez Zimmermana i Hulsmana. 18 Sugeruje się modyfikacje pożywki izolacyjnej, w tym obniżenie pH do 7,0,19, dodanie tauryny20 lub niewielkich ilości Ca2+ (patrz kroki 3.2 i 4.1),21 a także przechowywanie wyizolowanych miocytów w EGTA zawierającym roztwór magazynowy22 w celu zapobieżenia paradoksowi Ca2 +. 17 Wiadomo jednak, że buforowanie Ca2+ przez EGTA zmniejsza amplitudę amplitudy przejściowychCa 2+ indukowanych prądem Ca 2+ typu L i powoduje dwufazowy rozpad stanów nieustalonychCa2+. 23 W związku z tym pominęliśmy EGTA w całym procesie izolacji, aby uzyskać stany nieustalone Ca2+ o typowych właściwościach i rozpadach jednofazowych. Aby chronić komórki przed paradoksem Ca2+, stopniowo zwiększaliśmy końcowe stężenie Ca2+ w roztworze magazynującym do 0,2 mM.
Wybór kolagenazy jest prawdopodobnie najważniejszym krokiem dla udanej izolacji miocytów. Konwencjonalne kolagenazy są surowymi preparatami otrzymywanymi z Clostridium histolyticum i zawierają kolagenazę wraz z wieloma innymi proteinazami, polisacharydazami i lipazami. Ze względu na ich ogólny skład kolagenazy dzielą się na różne typy. 24 Kolagenaza Worthington typu I i II jest z powodzeniem stosowana do izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych. 4-10,15,25-30 W naszym obecnie opisanym protokole zalecamy stosowanie kolagenazy typu I, chociaż udało nam się również uzyskać akceptowalne ilości żywotnych komórek przy użyciu kolagenazy typu II. Jednak nawet w obrębie jednego rodzaju kolagenazy istnieje znaczna różnica między partiami pod względem aktywności enzymu. Różnice te wymagają starannego doboru partii i testowania różnych partii w celu optymalizacji procedury izolacji. Dostępne online narzędzie do wyboru partii firmy Worthington Biochemical Corp. (<a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php</a>) może być wykorzystane do znalezienia dostępnych partii o składzie, który okazał się odpowiedni do izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych. Obecnie używamy kolagenazy typu I o aktywności kolagenazy 250 U/mg, aktywności kazeinazy 345 U/mg, aktywności klostripainy 2,16 U/mg i aktywności tryptycznej 0,48 U/mg (partia # 49H11338).
 
 
Komórki uzyskane przy użyciu procedury opisanej w tym manuskrypcie mogą być wykorzystane w ciągu 8 godzin do badań typu patch-clamp, pomiarów przejściowych Ca2+ i kombinacji obu. 15 Ponadto komórki te umożliwiają pomiary skurczu komórek w odpowiedzi na stymulację polem elektrycznym lub stymulację elektryczną za pomocą pipety typu patch-clamp (obserwacje niepublikowane).

Badanie właściwości elektrofizjologicznych kanałów jonowych serca za pomocą techniki patch-clamp oraz badanie nieprawidłowości w obsłudze komórkowych Ca2+ wymaga izolowanych kardiomiocytów. Są one zwykle uzyskiwane po ekspozycji in vitro próbek tkanki serca na działanie enzymów trawiennych (kolagenazy, hialuronidazy, peptydazy itp.). Od czasu pierwszego doniesienia o izolacji żywotnych miocytów serca w 1955 r.opracowano dużą liczbę protokołów w celu pobrania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od różnych gatunków, w tym myszy, szczura, królika, psa, świnki morskiej i człowieka. W niniejszym przeglądzie skupiono się na izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych. Jeśli chodzi o procedury izolacji miocytów od innych gatunków, odsyłamy do "Przewodnika dysocjacji tkanek Worthington" dostarczonego przez Worthington Biochemical Corp., USA (<a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a>).
Protokoły izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych są zazwyczaj oparte na metodzie opisanej przez Bustamante i wsp.3 W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku opis techniki, która jest zaadaptowana z wcześniej opublikowanej metody, w celu uzyskania miocytów przedsionkowych odpowiednich nie tylko do eksperymentów typu patch-clamp, ale także do jednoczesnych wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+. 4-11 Rozdział

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Roztwór transportowy&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;Roztwór do przechowywania&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;Roztwór transportowy&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>Kwas DL-β-hydroksymaślanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;Roztwór do przechowywania&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Roztwór transportowy&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;roztwór wolny od jonów Ca2+&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwory enzymów E1 i E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwór do przechowywania&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;Roztwór do przechowywania&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Roztwór transportowy&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;roztwór wolny od jonów Ca2+&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwory enzymów E1 i E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwór do przechowywania&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;Roztwór transportowy&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;roztwór wolny od jonów Ca2+&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwory enzymów E1 i E2&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwór do przechowywania&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;Roztwór transportowy&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;roztwór wolny od jonów Ca2+&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwory enzymów E1 i E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;Roztwór transportowy&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;roztwór wolny od jonów Ca2+&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwór enzymu E1 i E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Roztwór transportowy&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;roztwór wolny od jonów Ca2+&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwory enzymów E1 i E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;Roztwór transportowy&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;roztwór wolny od jonów Ca2+&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwory enzymów E1 i E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwór do przechowywania&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Kolagenaza I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;Roztwory enzymów E1 i E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>Proteaza XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;Roztwory enzymów E1 i E2&lt;/em&gt;5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Roztwór transportowy&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;roztwór pozbawiony jonów Ca2+&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwory enzymów E1 i E2&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwór do przechowywania&lt;/em&gt;: 7.40</td></tr><tr><td>skorygowany za pomocą</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Roztwór transportowy&lt;/em&gt;1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;roztwór wolny od jonów Ca2+&lt;/em&gt;1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwory enzymów E1 i E2&lt;/em&gt;1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Roztwór do przechowywania&lt;/em&gt;1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">Stężenia podano w mM, chyba że zaznaczono inaczej. BDM, 2,3-butanodionomonoksym. *Proteaza XXIV znajduje się wyłącznie w roztworze enzymu E1.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela I. Roztwory.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Germany</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka reakcyjna z płaszczem grzewczym</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela II. Specjalistyczny sprzęt.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfoksyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (specjalne opakowanie)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela III. Substancje do ładowania miocytów barwnikiem Fluo-3 AM.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopirydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;Roztwór kąpieli&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;Roztwór kąpielowy&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;Roztwór do kąpieli&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Roztwór kąpieli&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Roztwór kąpielowy&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Roztwór do kąpieli&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl2 &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;Roztwór kąpieli&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Roztwór kąpielowy&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>Probenecyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;Roztwór kąpielowy&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Roztwór do kąpieli&lt;/em&gt;: 7.35</td></tr><tr><td>skorygowano za pomocą</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Roztwór kąpielowy&lt;/em&gt;1 M HCl</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela IV. Roztwór kąpielowy do metody patch-clamp.&lt;/strong&gt; *4-aminopirydyna i BaCl zostały uwzględnione wyłącznie w eksperymentach z metodą clampy napięciowej.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sól potasowa kwasu DL-asparaginowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;Odpipetuj roztwór&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;Pipetuj roztwór&lt;/em&gt;: 0.02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;Pipetuj roztwór&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Odmierz roztwór pipetą&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Pipetuj roztwór&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;Pipetuj roztwór&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;Pipetuj roztwór&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;Pipetować roztwór&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7.20</td></tr><tr><td>skorygowano za pomocą</td><td></td><td></td><td>1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela V. Roztwór do pipety dla techniki patch-clamp*. &lt;/strong&gt;*W dniach przeprowadzania eksperymentów roztwór pipetujący przechowuje się w lodzie do momentu użycia. **W dniach przeprowadzania eksperymentów Fluo-3 dodaje się z roztworu stokowego o stężeniu 1 mM.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych ca2+ i prądów błonowych

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Badanie właściwości elektrofizjologicznych kanałów jonowych serca za pomocą techniki patch-clamp oraz badanie nieprawidłowości w radzeniu sobie z nieprawidłowościami w działaniu komórek sercowych Ca2+ wymaga izolowanych kardiomiocytów. Ponadto możliwość badania miocytów od pacjentów przy użyciu tych technik jest nieocenionym wymogiem dla wyjaśnienia molekularnych podstaw chorób serca, takich jak migotanie przedsionków (AF). 1 W tym miejscu opisano metodę izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych, która nadaje się zarówno do badań typu patch-clamp, jak i jednoczesnych pomiarów wewnątrzkomórkowych stężeń Ca2+. Po pierwsze, przydatki prawego przedsionka uzyskane od pacjentów poddawanych operacji na otwartym sercu są cięte na małe kawałki tkanek ("metoda fragmentów") i myte w roztworze wolnym od Ca2+. Następnie fragmenty tkanek są trawione w roztworach zawierających kolagenazę i proteazę o zawartości 20 μM Ca2+. Następnie wyizolowane miocyty są zbierane przez filtrację i odwirowanie zawiesiny tkankowej. Na koniec stężenie Ca2+ w roztworze do przechowywania komórek dostosowuje się stopniowo do 0,2 mM. Pokrótce omawiamy znaczenie buforowania Ca2+ i Ca2+ podczas procesu izolacji, a także zapewniamy reprezentatywne zapisy potencjałów czynnościowych i prądów błonowych, zarówno wraz z jednoczesnymi pomiarami przejściowymiCa2+, wykonanymi w tych izolowanych miocytach.

Rycina 2A przedstawia trzy reprezentatywne przykłady wyizolowanych miocytów prawego przedsionka człowieka. Aby określić liczbę uzyskanych komórek, nanosimy pipetą 10 μl zawiesiny komórkowej (krok 5.5) na szkiełko do mikroskopu CellFinder (<a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a>). Średnie liczby uzyskanych komórek na Rycynie 2B wyraźnie wskazują na tendencję do niższej wydajności komórkowej w próbkach pobranych od pacjentów z przewlekłym migotaniem przedsionków (cAF) (probówka A: 16,5±3,1 komórek/10 μl (n=29) w SR vs. 5,1±2,3 komórek/10 μl (n=10) w cAF, p&lt;0,05; probówka B: 17,9±3,9 komórek/10 μl (n=29) w SR vs. 5,9±2,0 komórek/10 μl (n=9) w cAF, p=0,107).
Reprezentatywne przykłady pomiarów potencjałów czynnościowych oraz jednoczesnych rejestracji przejściowych zmian stężenia Ca2+ w cytozolu przedstawiono na Rysunku 3. W około 90% badanych komórek uwolnienie Ca2+ wywołane potencjałem czynnościowym powoduje wyraźne i regularne skurcze komórek. Jak raportowano wcześniej, spoczynkowy potencjał błonowy, będący uznanym wskaźnikiem integralności komórek, wynosił średnio około -73,9±2,7 mV (n = 23/10 miocytów/pacjentów) w SR oraz -77,7±1,8 mV (n = 19/8 miocytów/pacjentów) w cAF (p&gt;0,05).15 Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne jednoczesne rejestracje napięciozależnych prądów Ca2+ typu L oraz przejściowych zmian stężenia Ca2+ w cytozolu. Zastosowanie nieselektywnego agonisty β-adrenoreceptorów, izoprenaliny (1 μM), zwiększa amplitudy zarówno ICa,L, jak i przejściowych zmian stężenia Ca2+ w cytozolu, co sugeruje nienaruszoną kaskadę transdukcji sygnałów β-adrenergicznych.
<img alt="Rycina 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> 
Rycina 1. Schemat protokołu ładowania miocytów Fluo-3 AM (patrz kroki 6.1-6.5). m/v, masa/objętość.
<img alt="Rycina 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> 
Rycina 2. A, Izolowane miocyty prawego przedsionka ludzkiego po jednej godzinie w roztworze do przechowywania. B, Średnia±SEM wydajności komórek policzonych w 10 μl komórek w roztworze do przechowywania (patrz krok 5.5). n oznacza liczbę preparatów w każdej grupie. *p&lt;0.05.
<img alt="Rysunek 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> 
Rysunek 3. Reprezentatywne zapisy wywołanych potencjałem czynnościowym przejściowych wzrostów stężenia Ca2+ (CaT) w miocycie przedsionkowym pacjenta z rytmem zatokowym oraz pacjenta z przewlekłym migotaniem przedsionków. Góra: Wstrzyknięty prąd błonowy (IM) użyty do stymulacji (0.5 Hz). Dół: Jednoczesny zapis potencjału błonowego (VM) oraz wywołanego CaT (na dole). (Wykresy przerysowane za zgodą Voigt et al. 2012)15
<img alt="Figure 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> 
Rysunek 4. Reprezentatywne zapisy działania izoprenaliny (1 &mu;M) wpływ na kanały wapniowe typu L2+ uwolnienie $\text{Ca}^{2+}$ indukowane prądem2+-przejściowe (CaT) w miocycie przedsionkowym pacjenta z rytmem zatokowym oraz pacjenta z przewlekłym migotaniem przedsionków. Góra: Protokół zaciskania napięcia (voltage-clamp) (0,5 Hz). Dół: Jednoczesny pomiar całkowitego wypadkowego prądu błonowego (IM), odzwierciedlające głównie prądy Ca2+ typu L2+ bieżący (środkowy) oraz wywołany CaT (dolny). (Przedrysowano za zgodą Voigta, i wsp. 2012)15

<img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tabela 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> 
Tabela I. Roztwory. 
<img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tabela 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> 
Tabela II. Specjalistyczny sprzęt. 
<img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tabela 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> 
Tabela III. Substancje do obciążania miocytów Fluo-3 AM. 
<img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tabela 4" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg"/> 
Tabela IV. Roztwór kąpielowy do techniki patch-clamp. 
<img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tabela 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> 
Tabela V. Roztwór do pipety dla techniki patch-clamp*.

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych nadających się do jednoczesnych pomiarów wapnia, stanów przejściowych oraz prądów błonowych. Próbkę prawego przedsionka pobiera się od pacjentów poddawanych operacjom kardiochirurgicznym w otwartym dostępie i szybko transportuje w celu rozpoczęcia procedury. Pierwszym krokiem procedury jest oczyszczenie tkanki i pocięcie jej na małe fragmenty.Drugim krokiem jest dwuetapowe trawienie tkanki enzymami proteolitycznymi, co prowadzi do izolacji miocytów przedsionkowych. Ostatni etap obejmuje obciążenie miocytów fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na wapń. W rezultacie, łączna analiza z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej i techniki patch clamp umożliwia jednoczesną rejestrację przejściowych zmian stężenia wapnia wraz z prądami błonowymi lub potencjałami czynnościowymi.Niniejsza metoda może pomóc w zrozumieniu molekularnych podstaw nieprawidłowości w gospodarce wapniowej komórek, które leżą u podstaw chorób serca, takich jak migotanie przedsionków; metodę tę zaprezentuje Claudia Lira, starsza technik naszego laboratorium. Tkanka przedsionków ludzkich, pobrana od pacjentów poddawanych operacjom kardiochirurgicznym w celu pomostowania tętnic wieńcowych lub wymiany zastawki mitralnej, powinna zostać szybko przetransportowana do laboratorium w roztworze transportowym. Po dostarczeniu do laboratorium przenieść próbkę tkanki wraz z roztworem do szalki o średnicy 10 cm. Następnie za pomocą nożyczek wstępnie usuń tkankę tłuszczową.Następnie zważ próbkę tkanki. Odważ od 200 do 600 mg do izolacji komórek, a pozostałą część zamroź w ciekłym azocie w celu przeprowadzenia analizy biochemicznej. Przenieś tkankę do izolacji komórek do naczynia z chłodnym roztworem wolnym od wapnia i posiekaj ją na kawałki o wielkości 1 mm³, aby wypłukać tkankę.Przenieść go wraz z roztworem pozbawionym wapnia do zlewki z płaszczem grzewczym. Podgrzać do 37 °C. Doprowadzać tlen z linii zakończonej końcówką pipety, aby zapobiec intensywnemu bąbelkowaniu.Ostrożnie mieszaj tkankę przez około trzy minuty za pomocą magnetycznego mieszadła. Następnie pozostaw tkankę do osadzenia. Teraz ostrożnie przefiltruj nadsącz przez nylonowy sitem o oczkach 200 micron.Większość tkanki powinna pozostać w zlewce. Napełnij ponownie zlewkę ogrzanym do 37°C roztworem wolnym od wapnia. Następnie, używając pincety, przenieś odcedzone fragmenty tkanki z siatki z powrotem do zlewki i powtórz procedurę płukania dwukrotnie.Rozpocznij tę część procedury od przygotowania 20 ml podgrzanego do 37 °C roztworu enzymatycznego E1 zawierającego kolagenazę i proteazę. Po ostatnim etapie płukania ostrożnie odcedź roztwór wolny od wapnia i ponownie zawieś wypłukaną tkankę w roztworze E1. Przenieś tkankę zebraną na siatce z powrotem do zlewki.Ostrożnie mieszaj zawiesinę przez 10 minut. Następnie dodaj 40 µL 10 mM chlorku wapnia i kontynuuj mieszanie przez 35 minut. Następnie ostrożnie przefiltruj nadsącz przez nylonowe sito.Większość tkanki powinna pozostać w zlewce. Przygotuj 20 mililitrów roztworu enzymu E dwa zawierającego wyłącznie kolagenazę jedną i użyj go do uzupełnienia zlewki. Przenieś tkankę zebraną na sicie z powrotem do zlewki.Następnie, podczas drugiego trawienia, natychmiast dodaj 40 µL 10 mM roztworu chlorku wapnia, okazjonalnie używając nożyczek do rozdrabniania skrzepów tkanki. Po pięciu minutach pobierz próbkę zawiesiny, aby sprawdzić stopień dysocjacji komórek pod mikroskopem. Kontynuuj pobieranie próbek co dwie do trzech minut, aż do momentu, gdy wyraźnie widoczne będą prętowate prążkowane kardiomiocyty.Następnie przerwać mieszanie, aby tkanka mogła osiąść. Po osiąknięciu tkanki ostrożnie przefiltrować nadsącz przez nylonową siatkę do plastikowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie zawiesić tkankę w 20 ml roztworu do przechowywania i przenieść przefiltrowane fragmenty tkanki z siatki z powrotem do zlewki.Dalszo dysocjuj komórki poprzez delikatną agitację mechaniczną. Używając pipety 20 mililitrów, staraj się unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie ostrożnie przefiltruj nadsącz przez nylonową siatkę, a po filtracji odwiruj obie kolekcje nadsączu przy 90 5G przez 10 minut.Aby zgranulować komórki, odpiąć nadsącz poprzez aspirację, nie naruszając osadu. Każdy osad zawiesić w 1,5 milliliters roztworu do przechowywania w temperaturze pokojowej. Następnie do każdej probówki dodać 7,5 microliters 10 millimolar roztworu chlorku wapnia i odczekać 10 minut.Następnie dodaj kolejne 7,5 µL chlorku wapnia i odczekaj kolejne 10 minut. Po tym czasie dodaj trzecią porcję 15 µL 10 mM chlorku wapnia, aby końcowe stężenie chlorku wapnia w roztworze wyniosło 0,2 mM. Celem tej izolacji jest uzyskanie komórek odpowiednich do pomiarów wapnia wewnątrzkomórkowego.W związku z tym niezbędne jest wyeliminowanie z roztworu do przechowywania wszelkich buforów wapniowych, takich jak EGGA. Przenieś 1,5 milliliters zawiesiny komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności dwóch milliliters. Kolejne kroki należy wykonywać z uwzględnieniem światłoczułości fluorescencyjnego wskaźnika wapnia.Fluo-3. Najpierw należy przygotować 1 mM roztwór zapasowy Fluo-3 AM. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C do jednego tygodnia.Następnie dodaj 15 µL roztworu stokowego flu oh 3:00 AM do 1,5 ml zawiesiny komórkowej. Ostrożnie wymieszaj i inkubuj zawiesinę przez 10 minut w temperaturze pokojowej w nieprzezroczystym pudełku. Po inkubacji krótko wiruj tkankę z prędkością około 6 000 RPM.Następnie odlej supernatant i resuspenduj osad w 1,5 milliliters roztworu kąpieli. Pozostaw zawiesinę komórkową na około 30 minutes w celu odesteryfikacji przed rozpoczęciem eksperymentów. Następnie przystąp do jednoczesnych pomiarów patch clamp i fluorescencji wapniowej epi zgodnie z opisanym protokołem.Miocyty wyizolowano z tkanki przedsionkowej i policzono na szkiełku przedmiotowym mikroskopu z systemem wyszukiwania komórek. Średnie wydajności izolacji wyraźnie wskazują na tendencję do uzyskiwania mniejszej liczby komórek w próbkach pobranych od pacjentów z przewlekłym migotaniem przedsionków. Miocyty załadowane barwnikiem Flu-3 stymulowano z częstotliwością 0,5 Hz w konfiguracji clamp prądowy w celu wywołania potencjałów czynnościowych; około 90% badanych komórek wykazywało regularne skurcze.W odpowiedzi na tę stymulację, przejście na mikroskopię fluorescencyjną pozwala zwizualizować uwalnianie wapnia z retikulum sarkoplazmatycznego wywołane potencjałem czynnościowym, co inicjuje skurcz komórkowy. Reprezentatywne zapisy potencjałów czynnościowych pacjentów z rytmem zatokowym i migotaniem przedsionków pokazują, że typowe potencjały czynnościowe mają kształt z kolcem i kopułą, podczas gdy triangulacja i skrócenie potencjału czynnościowego są typowymi oznakami przebudowy przedsionków.U pacjentów z migotaniem przedsionków jednoczesny pomiar przejściowych zmian stężeń wapnia wewnątrzkomórkowego wykazał zwiększone poziomy wapnia rozkurczowego oraz zmniejszoną amplitudę tych zmian w miocytach pacjentów z migotaniem przedsionków w celu rejestracji prądów wapniowych typu L. Prądy potasowe zablokowano za pomocą czteriamino-pirydyny i chlorku baru. Komórki stymulowano z częstotliwością 0,5 Hz w konfiguracji voltage clamp, stosując potencjał spoczynkowy -80 mV z rampą trwającą 100 ms do -40 mV oraz impulsem testowym trwającym 100 ms do 10 mV.Reprezentatywne zapisy wskazują, że migotanie przedsionków wiąże się z redukcją prądu wapniowego typu L. Ponownie odnotowano wzrost poziomu wapnia rozkurczowego, podczas gdy amplituda przejściowego wzrostu stężenia wapnia była niższa. W przypadku migotania przedsionków.Zastosowanie nieselektywnego agonisty beta-adrenoreceptorów, izoprenalu, zwiększyło amplitudę prądów wapniowych typu L oraz przejściowych zmian stężenia wapnia w cytozolu. W obu grupach sugeruje to, że komórki posiadają nienaruszoną kaskadę transdukcji sygnałów beta-adrenergicznych. Wyniki wykazują, że metoda ta pozwala na uzyskanie wysokiej jakości miocytów odpornych na wapń, które nadają się do jednoczesnych pomiarów metodą patch-clamp oraz pomiarów przejściowych zmian stężenia wapnia.Dodatkowo, otrzymane miocyty mogą być przydatne do pomiarów skracania się komórek, barwienia immunologicznego lub barwienia TTU.

isolation-human-atrial-myocytes-for-simultaneous-measurements-ca2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów zmian stężenia Ca2+ i prądów błonowych

Dysfunkcja kanału Kv jest związana z zaburzeniami rytmu serca. W celu zbadania mechanizmów molekularnych, które prowadzą do takich arytmii, stosujemy systematyczny protokół izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od myszy z nokautem podjednostki pomocniczej kanału Kv. Wyizolowane kardiomiocyty można następnie natychmiast wykorzystać do komórkowych badań elektrofizjologicznych, testów biochemicznych lub immunofluorescencyjnych (IF).

Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Metody izolacji miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego (SAM) od dorosłych myszy do elektrofizjologii lub badań obrazowych. Wyizolowane komórki mogą być wykorzystywane bezpośrednio lub mogą być utrzymywane w hodowli, aby umożliwić ekspresję interesujących białek, takich jak genetycznie kodowane reportery.

Metody izolacji, hodowli i charakterystyki funkcjonalnej miocytów węzłów zatokowo-przedsionkowych od dorosłych myszy

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.

Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

Poznaj metodę izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów jonów wapnia i prądów błonowych. Technika ta umożliwia badanie fizjologii serca i chorób takich jak migotanie przedsionków.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca²⁺ i prądów błonowych

Przeglądaj więcej filmów