Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca²⁺ i prądów błonowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych nadających się do jednoczesnych pomiarów wapnia, stanów przejściowych oraz prądów błonowych. Próbkę prawego przedsionka pobiera się od pacjentów poddawanych operacjom kardiochirurgicznym w otwartym dostępie i szybko transportuje w celu rozpoczęcia procedury. Pierwszym krokiem procedury jest oczyszczenie tkanki i pocięcie jej na małe fragmenty.

Drugim krokiem jest dwuetapowe trawienie tkanki enzymami proteolitycznymi, co prowadzi do izolacji miocytów przedsionkowych. Ostatni etap obejmuje obciążenie miocytów fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na wapń. W rezultacie, łączna analiza z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej i techniki patch clamp umożliwia jednoczesną rejestrację przejściowych zmian stężenia wapnia wraz z prądami błonowymi lub potencjałami czynnościowymi.

Niniejsza metoda może pomóc w zrozumieniu molekularnych podstaw nieprawidłowości w gospodarce wapniowej komórek, które leżą u podstaw chorób serca, takich jak migotanie przedsionków; metodę tę zaprezentuje Claudia Lira, starsza technik naszego laboratorium. Tkanka przedsionków ludzkich, pobrana od pacjentów poddawanych operacjom kardiochirurgicznym w celu pomostowania tętnic wieńcowych lub wymiany zastawki mitralnej, powinna zostać szybko przetransportowana do laboratorium w roztworze transportowym. Po dostarczeniu do laboratorium przenieść próbkę tkanki wraz z roztworem do szalki o średnicy 10 cm. Następnie za pomocą nożyczek wstępnie usuń tkankę tłuszczową.

Następnie zważ próbkę tkanki. Odważ od 200 do 600 mg do izolacji komórek, a pozostałą część zamroź w ciekłym azocie w celu przeprowadzenia analizy biochemicznej. Przenieś tkankę do izolacji komórek do naczynia z chłodnym roztworem wolnym od wapnia i posiekaj ją na kawałki o wielkości 1 mm³, aby wypłukać tkankę.

Przenieść go wraz z roztworem pozbawionym wapnia do zlewki z płaszczem grzewczym. Podgrzać do 37 °C. Doprowadzać tlen z linii zakończonej końcówką pipety, aby zapobiec intensywnemu bąbelkowaniu.

Ostrożnie mieszaj tkankę przez około trzy minuty za pomocą magnetycznego mieszadła. Następnie pozostaw tkankę do osadzenia. Teraz ostrożnie przefiltruj nadsącz przez nylonowy sitem o oczkach 200 micron.

Większość tkanki powinna pozostać w zlewce. Napełnij ponownie zlewkę ogrzanym do 37°C roztworem wolnym od wapnia. Następnie, używając pincety, przenieś odcedzone fragmenty tkanki z siatki z powrotem do zlewki i powtórz procedurę płukania dwukrotnie.

Rozpocznij tę część procedury od przygotowania 20 ml podgrzanego do 37 °C roztworu enzymatycznego E1 zawierającego kolagenazę i proteazę. Po ostatnim etapie płukania ostrożnie odcedź roztwór wolny od wapnia i ponownie zawieś wypłukaną tkankę w roztworze E1. Przenieś tkankę zebraną na siatce z powrotem do zlewki.

Ostrożnie mieszaj zawiesinę przez 10 minut. Następnie dodaj 40 µL 10 mM chlorku wapnia i kontynuuj mieszanie przez 35 minut. Następnie ostrożnie przefiltruj nadsącz przez nylonowe sito.

Większość tkanki powinna pozostać w zlewce. Przygotuj 20 mililitrów roztworu enzymu E dwa zawierającego wyłącznie kolagenazę jedną i użyj go do uzupełnienia zlewki. Przenieś tkankę zebraną na sicie z powrotem do zlewki.

Następnie, podczas drugiego trawienia, natychmiast dodaj 40 µL 10 mM roztworu chlorku wapnia, okazjonalnie używając nożyczek do rozdrabniania skrzepów tkanki. Po pięciu minutach pobierz próbkę zawiesiny, aby sprawdzić stopień dysocjacji komórek pod mikroskopem. Kontynuuj pobieranie próbek co dwie do trzech minut, aż do momentu, gdy wyraźnie widoczne będą prętowate prążkowane kardiomiocyty.

Następnie przerwać mieszanie, aby tkanka mogła osiąść. Po osiąknięciu tkanki ostrożnie przefiltrować nadsącz przez nylonową siatkę do plastikowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie zawiesić tkankę w 20 ml roztworu do przechowywania i przenieść przefiltrowane fragmenty tkanki z siatki z powrotem do zlewki.

Dalszo dysocjuj komórki poprzez delikatną agitację mechaniczną. Używając pipety 20 mililitrów, staraj się unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie ostrożnie przefiltruj nadsącz przez nylonową siatkę, a po filtracji odwiruj obie kolekcje nadsączu przy 90 5G przez 10 minut.

Aby zgranulować komórki, odpiąć nadsącz poprzez aspirację, nie naruszając osadu. Każdy osad zawiesić w 1,5 milliliters roztworu do przechowywania w temperaturze pokojowej. Następnie do każdej probówki dodać 7,5 microliters 10 millimolar roztworu chlorku wapnia i odczekać 10 minut.

Następnie dodaj kolejne 7,5 µL chlorku wapnia i odczekaj kolejne 10 minut. Po tym czasie dodaj trzecią porcję 15 µL 10 mM chlorku wapnia, aby końcowe stężenie chlorku wapnia w roztworze wyniosło 0,2 mM. Celem tej izolacji jest uzyskanie komórek odpowiednich do pomiarów wapnia wewnątrzkomórkowego.

W związku z tym niezbędne jest wyeliminowanie z roztworu do przechowywania wszelkich buforów wapniowych, takich jak EGGA. Przenieś 1,5 milliliters zawiesiny komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności dwóch milliliters. Kolejne kroki należy wykonywać z uwzględnieniem światłoczułości fluorescencyjnego wskaźnika wapnia.

Fluo-3. Najpierw należy przygotować 1 mM roztwór zapasowy Fluo-3 AM. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C do jednego tygodnia.

Następnie dodaj 15 µL roztworu stokowego flu oh 3:00 AM do 1,5 ml zawiesiny komórkowej. Ostrożnie wymieszaj i inkubuj zawiesinę przez 10 minut w temperaturze pokojowej w nieprzezroczystym pudełku. Po inkubacji krótko wiruj tkankę z prędkością około 6 000 RPM.

Następnie odlej supernatant i resuspenduj osad w 1,5 milliliters roztworu kąpieli. Pozostaw zawiesinę komórkową na około 30 minutes w celu odesteryfikacji przed rozpoczęciem eksperymentów. Następnie przystąp do jednoczesnych pomiarów patch clamp i fluorescencji wapniowej epi zgodnie z opisanym protokołem.

Miocyty wyizolowano z tkanki przedsionkowej i policzono na szkiełku przedmiotowym mikroskopu z systemem wyszukiwania komórek. Średnie wydajności izolacji wyraźnie wskazują na tendencję do uzyskiwania mniejszej liczby komórek w próbkach pobranych od pacjentów z przewlekłym migotaniem przedsionków. Miocyty załadowane barwnikiem Flu-3 stymulowano z częstotliwością 0,5 Hz w konfiguracji clamp prądowy w celu wywołania potencjałów czynnościowych; około 90% badanych komórek wykazywało regularne skurcze.

W odpowiedzi na tę stymulację, przejście na mikroskopię fluorescencyjną pozwala zwizualizować uwalnianie wapnia z retikulum sarkoplazmatycznego wywołane potencjałem czynnościowym, co inicjuje skurcz komórkowy. Reprezentatywne zapisy potencjałów czynnościowych pacjentów z rytmem zatokowym i migotaniem przedsionków pokazują, że typowe potencjały czynnościowe mają kształt z kolcem i kopułą, podczas gdy triangulacja i skrócenie potencjału czynnościowego są typowymi oznakami przebudowy przedsionków.

U pacjentów z migotaniem przedsionków jednoczesny pomiar przejściowych zmian stężeń wapnia wewnątrzkomórkowego wykazał zwiększone poziomy wapnia rozkurczowego oraz zmniejszoną amplitudę tych zmian w miocytach pacjentów z migotaniem przedsionków w celu rejestracji prądów wapniowych typu L. Prądy potasowe zablokowano za pomocą czteriamino-pirydyny i chlorku baru. Komórki stymulowano z częstotliwością 0,5 Hz w konfiguracji voltage clamp, stosując potencjał spoczynkowy -80 mV z rampą trwającą 100 ms do -40 mV oraz impulsem testowym trwającym 100 ms do 10 mV.

Reprezentatywne zapisy wskazują, że migotanie przedsionków wiąże się z redukcją prądu wapniowego typu L. Ponownie odnotowano wzrost poziomu wapnia rozkurczowego, podczas gdy amplituda przejściowego wzrostu stężenia wapnia była niższa. W przypadku migotania przedsionków.

Zastosowanie nieselektywnego agonisty beta-adrenoreceptorów, izoprenalu, zwiększyło amplitudę prądów wapniowych typu L oraz przejściowych zmian stężenia wapnia w cytozolu. W obu grupach sugeruje to, że komórki posiadają nienaruszoną kaskadę transdukcji sygnałów beta-adrenergicznych. Wyniki wykazują, że metoda ta pozwala na uzyskanie wysokiej jakości miocytów odpornych na wapń, które nadają się do jednoczesnych pomiarów metodą patch-clamp oraz pomiarów przejściowych zmian stężenia wapnia.

Dodatkowo, otrzymane miocyty mogą być przydatne do pomiarów skracania się komórek, barwienia immunologicznego lub barwienia TTU.