Analiza cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila przy użyciu cytometru akustycznego Attune i barwienia Vybrant DyeCycle Violet DNA

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar względnej fazy cyklu komórkowego i wielkości komórek tkanek z populacjami komórek genetycznie zmodyfikowanymi i znakowanymi GFP lub RFP u Drosophila. Najpierw należy skonfigurować krzyżówki genetyczne w celu wygenerowania potomstwa zawierającego komórki znakowane pożądanymi białkami fluorescencyjnymi i z pożądanymi manipulacjami genetycznymi w określonej tkance lub populacji komórek. W trakcie badania należy czysto wyizolować pożądaną tkankę od potomstwa w odpowiednim stadium rozwoju, a następnie zdysocjować tkankę do zawiesiny pojedynczej komórki i wybarwić żywym barwnikiem DNA w celu zmierzenia zawartości DNA.

Analizować barwione, zdysocjowane próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie wyniki in vivo mierzą zmiany w wielkości komórek i fazie cyklu komórkowego spowodowane badanymi manipulacjami genetycznymi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą cytometrii przepływowej na żywych tkankach Drosophila przy użyciu barwników ultrafioletowych jest to, że fioletowy barwnik o cyklu barwnikowym jest kompatybilny z tańszymi cytometrami laboratoryjnymi zawierającymi fioletowy laser 4:0,5, który można kupić przy niewielkim budżecie i utrzymywać w jednej skali laboratoryjnej.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie cyklu komórkowego, dostarczając informacji na temat fazy cyklu komórkowego i wielkości komórki, które są bardziej szczegółowe niż tylko pomiar ogólnego rozmiaru tkanki i szybkości proliferacji. Procedurę zademonstrują Kagel i Dan Sun, doktoranci z mojego laboratorium oraz Olga Guko. Nasz technik zbiera dojrzałe larwy w trzecim stadium larwalnym po około 110 do 120 godzinach od złożenia jaj w celu rozbioru larw.

Dokładna ocena źrenicy jest niezbędna do badań podczas metamorfozy w tym celu zbieraj białą poczwarkę pre pupa na początku metamorfozy, jeśli to konieczne, zapieczętowałem szalkę Petriego poczwarki lub fiolkę z larwami w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby aktywować ciepło. Chuck flip base do klonów śledzących rodowód. Po rozszczelnieniu szalki Petriego umieść ją w inkubatorze w celu dojrzewania do pożądanego etapu rozwoju w celu rozwarstwienia źrenicy.

Delikatnie chwyć poczwarkę za przedni koniec obudowy źrenicy, w której znajduje się pęcherzyk powietrza, aby uniknąć uszkodzenia poczwarki w środku, ustaw pływającą poczwarkę w celu prawidłowego uchwycenia. Następnie za pomocą mikronożyczek czysto przetnij tylny koniec poczwarki pod niewielkim kątem w kierunku grzbietowej części zwierzęcia, aby uwolnić ciśnienie wewnętrzne bez wtłaczania tłuszczu hist do pożądanych tkanek w klatce piersiowej i głowie, ostrożnie przeciąć wzdłuż środkowej części grzbietu, unikając uszkodzenia skrzydeł i kompleksu mózgu przedniego oka w celu usunięcia tłuszczu. Następnie wyjmij źrenicę z etui źrenicy, chwytając kleszczami tylną krawędź naskórka źrenicy i wyciągając ją z obudowy źrenicy.

Przenieś wypreparowaną poczwarkę do czystego naczynia rozbiorowego. Zrób mały otwór w naskórku przed kompleksem mózgu oka za pomocą kleszczy. Za pomocą szklanej pipety do makaronu z gumową gruszką.

Delikatnie przemyj roztwór preparacyjny PBS przez częściowo wypreparowaną poczwarkę, aby usunąć wszelkie pozostałe resztki tłuszczu i tkanki jelitowej. Aby uzyskać skrzydła źrenicy, przytrzymaj poczwarkę za głowę jednym kleszczem za pomocą drugiego kleszcza. Chwyć najbardziej wysunięty do tyłu koniec naskórka skrzydła, pociągnij i oderwij go od boku tuszy.

Następnie odetnij lub oderwij skrzydło przy zawiasie, aby usunąć je z ciała i ułóż w stosie z dala od tusz i innego materiału, aby uzyskać źrenicę, oczy lub mózg. Myj poczwarkę, aż kompleks oko-mózg zostanie usunięty i wolny od poczwarki. Za pomocą kleszczyka delikatnie odciągnij źrenicę od mózgu i uratuj pożądaną tkankę Za pomocą nasmarowanej pipety ostrożnie przenieś wypreparowane tkanki.

Inkubować probówki, wstrząsając w temperaturze 23 stopni Celsjusza przy 500 obr./min przez 70 minut. Następnie delikatnie wirować przez pięć sekund ze średnią prędkością i umieścić próbki z powrotem w wytrząsarce na dodatkowe 15 do 20 minut. Ponownie wiruj próbki przez pięć sekund ze średnią prędkością dla mózgu i źrenic.

Starsze niż 36 godzin. PF dysocjuje tkanki w roztworze barwienia DNA w temperaturze 23 stopni Celsjusza przy 500 obr./min przez 45 do 60 minut. Następnie jeden po drugim ręcznie dysocjuj duże kawałki tkanki, przenosząc je do naczynia preparacyjnego wraz z około 50 mikrolitrami roztworu barwienia DNA.

Szybko pipetuj w górę i w dół, ręcznie przeciągając obok pipety o otworze około 100 do 150 mikrometrów. Zbierz zdysocjowane próbki w pięciomililitrowej probówce. Inkubuj dodatkowe 30 minut w temperaturze 23 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 500 obr./min.

Sprawdź wzrokowo, czy próbki są w pełni zdysocjowane. Pamiętaj, że bezkomórkowy przezroczysty naskórek skrzydła źrenicy nie będzie się kojarzyć. Rozpocznij analizę faksu od załadowania próbki do cytometru.

Następnie wybierz kanały, aby wykryć rozproszenie do przodu i rozproszenie boczne, wskazując rozmiar komórki i złożoność błony. Aby wykryć fioletowe zabarwienie DNA w cyklu D, należy zmierzyć VL o jedną wysokość, szerokość i powierzchnię od wzbudzenia laserem fioletowym. Wybierz również kanał niebieskiego lasera w jednym obszarze, aby zmierzyć fluorescencję GFP.

Do analizy zapytania ofertowego używamy trzeciego kanału niebieskiego lasera. Ten kanał na attune jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania zapytania ofertowego. Ustaw bramki w celu ograniczenia analizy do wybranej populacji i ograniczenia szczątków oraz sprzedaży grudek z analizy, która generuje wykresy zatrzymania z bramką pierwszą, wyklucz szczątki i grudki na wykresie SSC w porównaniu z FSC na wykresie VL jeden obszar kontra VL jeden obszar z użyciem GA dwa, aby wykluczyć niebarwione komórki sub G one komórki apoptotyczne i skupiska komórek na podstawie identyfikacji singletów.

GA trzy obejmuje komórki w obrębie bramek pierwszej i drugiej, które są ujemne GFP na wykresie fluorescencji w funkcji zawartości DNA na podstawie VE L o jednej wysokości. Następny chód czwarty obejmuje komórki w bramkach pierwszej i drugiej, które są GFP dodatnie na wykresie fluorescencji w funkcji zawartości DNA. Można również wygenerować bramki piątą i szóstą z wykresów punktowych o wielkości komórki mierzonej za pomocą GFP w porównaniu z rozproszeniem do przodu.

Aby zbadać fazowanie cyklu komórkowego, użyj dwóch histogramów, które wykreślają zawartość DNA na osi x i liczbę komórek na Y ais dla populacji zdefiniowanych przez bramkę trzecią i bramkę czwartą. Dla rozmiaru komórki histogramy ustawiają populacje na bramki piątą i szóstą i kreślą FSC na osi x i zlicza na osi Y podczas uruchamiania próbek ustawiają zapis tak, aby zatrzymał się na 10 000. Pozytywne wydarzenia GFP ustaliły również wolumen akwizycji na poziomie 300 mikrolitrów.

Odpowiednie ustawienia progu i napięcia są zawarte w dostarczonych szablonach. Uruchomić próbki ze standardową lub wysoką czułością 100 mikrolitrów na minutę i zarejestrować. Nagrane pliki danych generowane przez oprogramowanie Attune są w formacie FCS, który jest kompatybilny z większością programów do modelowania cykli komórkowych.

Ta reprezentatywna przestrzeń robocza zawierająca cztery wykresy kropkowe i dwa histogramy pokazuje próbkę skrzydeł larwy wyrażającą GFP i cyklinę D w tylnym skrzydle, napędzaną przez transgen Grailed gal four. Pierwszy wykres punktowy wielkości komórki z chodem pierwszym wyklucza szczątki i grudki. Drugi wykres punktowy rozróżnia podkoszulki o chodzie drugim, aby wykluczyć niebarwione komórki poniżej zawartości G 1D NA i grudek na wykresie GFP w porównaniu z zawartością DNA.

Można rozróżnić komórki ujemne i dodatnie GFP, a zawartość dwóch N i czterech NDNA jest widoczna na podstawie położenia wzdłuż osi x. Ten wykres rozmiaru komórki mierzony za pomocą GFP w funkcji rozproszenia do przodu służy do generowania bramek piątej i szóstej. Uzyskane analizy prowadzą do histogramów zawartości DNA w porównaniu z liczbami dla populacji ujemnej GFP lub RFP, a także komórek GFP lub RFP dodatnich.

Korzystając z dostarczonego szablonu zapytania ofertowego. Podobne wyniki uzyskuje się przy tym samym typie tkanki i wzorcu ekspresji. W przypadku zapytania ofertowego dostarczone szablony i napięcia są odpowiednie do analizy oczu larw, mózgów i skrzydeł, a także oczu źrenic, mózgów i skrzydeł.

W dostrojonym oprogramowaniu. Korzystanie z funkcji automatycznego skalowania dla histogramów cyklu komórkowego lub rozmiaru komórki umożliwia określenie globalnego maksimum dla każdej populacji. Te profile cyklu komórkowego reprezentują komórki dodatnie i ujemne GFP w oczach larw, wyrażające GFP w tylnej części ciała.

Wykorzystując cztery transgeny U-A-S-G-F-P GM GM G, nakładka ujawnia różnice w fazach cyklu komórkowego komórek eksprymujących tylną część GFP. Można również wykreślić względną zmianę rozmiaru komórki między komórkami dodatnimi i ujemnymi GFP. Ten profil cyklu komórkowego uzyskano z mózgów źrenic po 46 godzinach A PF. Komórki GFP dodatnie to klony śledzące linię wyrażającą regulator G jeden S, cyklinę D i E dwa F, które zakłócają spoczynek i prowadzą do wejścia w fazę S.

Jest to przeciwieństwo komórek ujemnych bez ekspresji GFP, które na tym etapie są zwykle zatrzymywane. W G one oprogramowanie attune generuje zdefiniowane przez użytkownika obszary na histogramach, wyznaczając dwie fazy G one s i G. Tabela statystyk dla każdego przebiegu określa bezwzględną liczbę komórek w zdefiniowanych przez użytkownika regionach i wartościach procentowych.

Alternatywnie, oprogramowanie do modelowania, takie jak mod fit, może być używane do oszacowania procentów w każdej fazie, a także komórek apoptotycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować i oznaczyć kilka tkanek Drosophila do analizy cyklu komórkowego.