Name: Analiza cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila przy użyciu cytometru akustycznego Attune i barwienia Vybrant DyeCycle Violet DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę analizy cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila przy użyciu cytometru akustycznego Attune i barwienia DNA. Technika ta umożliwia jednoczesną ocenę wielkości komórek, zawartości DNA i typów komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Aida de la Cruz za opracowanie i nauczanie oryginalnego protokołu, na którym opiera się ta wersja10. Prace w Buttitta Lab są wspierane przez GM086517 grantu NIH.

1. Hodowla much
<ol>
 <li>Krzyżuj muchy o pożądanych genotypach w wąskich plastikowych fiolkach z 10 ml pożywki drożdżowo-glukozowej3 lub innej wybranej pożywki bogatej w białko. Obszerne narzędzia transgeniczne Drosophila dostępne do ekspresji specyficznej dla tkanek i śledzenia linii z ekspresją białek fluorescencyjnych in vivo opisano szczegółowo w innym miejscu4,5. Codziennie przenosić rodziców do świeżych fiolek, aby uzyskać serię 24-godzinnych zbiorów potomstwa lub, w celu dokładniejszego stopniowania, zebrać zarodki na płytkach agarowych i przenieść nowo wyklute larwy do fiolek zgodnie z opisem10. Aby zapewnić jednolite warunki we wszystkich doświadczeniach i uniknąć przeludnienia, całkowita liczba potomstwa F1 w jednej fiolce nie powinna przekraczać 100. W zależności od projektu genetycznego eksperymentu, fiolki należy przechowywać w odpowiednim inkubatorze do pożądanego etapu rozwoju.</li>
 <li>Zbieraj zwierzęta doświadczalne: będziesz potrzebować dojrzałych larw w 3. stadium larwalnym (L3) po około 110-120 godzinach rozwoju do sekcji larw lub białej poczwarki (WPP) do dokładnej oceny stadium poczwarki. Dramatyczne zmiany w cyklu komórkowym, w tym przejście do stanu nieproliferacyjnego, zachodzą w różnych punktach czasowych podczas metamorfozy12,13. Dlatego prawidłowa ocena stopnia zaawansowania poczwarki (w ciągu 1 godziny od rozwoju) jest niezbędna do uzyskania powtarzalnych danych dotyczących cyklu komórkowego podczas metamorfozy. WPP odpowiada 0 godzinom po utworzeniu poczwarki (0 godzin APF), jak pokazano na rysunku 1, panel I. Zbierz WPP na szalce Petriego o średnicy 35 mm na złożonym Kimwipe zwilżonym 2,5 ml wody, aby utrzymać pewną wilgotność. Poczwarkę należy owiekzić do pożądanego etapu (godziny APF) w odpowiedniej temperaturze. Należy pamiętać, że wywoływanie przebiega 1,2 raza szybciej w temperaturze 29 °C i 2,2 razy wolniej w temperaturze 18 °C niż w standardowej temperaturze 25 °C14.</li>
 <li>Zwierzęta poddane szokowi cieplnemu w celu aktywacji rekombinacji indukowanej przez flipazę szoku cieplnego (hs-flp) dla klonów śledzących linię, jeśli zajdzie taka potrzeba9,11. W celu wywołania szoku cieplnego u larw należy zanurzyć fiolki w łaźni wodnej (nastawionej na 37 °C) i upewnić się, że larwy są całkowicie zanurzone. W celu doprowadzenia do szoku cieplnego poczwarki, należy uszczelnić szalkę Petriego Parafilmem i całkowicie zanurzyć ją w łaźni wodnej. Pamiętaj, aby usunąć Parafilm po szoku cieplnym, aby umożliwić wystarczającą wymianę tlenu do przeżycia zwierzęcia. Czas trwania szoku cieplnego zależy od aktywności użytego transgenu flipazy i liczby pożądanych klonów. Rutynowo używamy 7-8 minut na indukcję "flipout" linii śledzenia klonów15 u larw z transgenem hs-flp na pierwszym chromosomie i 2-4 minuty na szok cieplny poczwarek w szalkach 35 mm, podczas gdy transgen hs-flp na drugim chromosomie wymaga 20 minuty szoku cieplnego, aby uzyskać podobną liczbę klonów.</li>
</ol>
Szybkość podziału komórki i czas sekcji determinują rozmiar klonu w każdej tkance. W normalnych warunkach stwierdzamy, że klony indukowane w skrzydle larwalnym z 20-minutowym szokiem cieplnym (przy użyciu transgenu hs-flp na drugim chromosomie) i preparowane 48 godzin później, zawierają około 20-30 dobrze oddzielonych klonów o rozmiarach od 10 komórek na klon do dwóch komórek na klon, ze średnią około czterech komórek na klon. W przeciwieństwie do tego, 7-minutowy szok cieplny z tym samym transgenem hs-flp poczwarek na szalce Petriego w 0 godz. APF wypreparowanym 36 godzin później, daje dobrze oddzielone klony (około 15-25) w zakresie od jednej do czterech komórek ze średnią 2,2 komórki na klon. Takie dane można wykorzystać do określenia średniego czasu podwajania komórek dla badanej tkanki.
2. Sekcja
<ol>
 <li>Delikatnie przenieś larwy/poczwarki do przezroczystego szklanego naczynia rozwarstwiającego zawierającego 1X PBS.</li>
 <li>Używając mikroskopu preparacyjnego i dużej ilości światła, delikatnie chwyć larwę za brzuch ostrym kleszczem Inox #5, przetnij przednią trzecią część mikronożyczkami i odwróć przednią trzecią, popychając obszar ust do wewnątrz w kierunku tylnej, trzymając stabilnie naskórek larwy (ryc. 1A). Ostrożnie usuń nieprzezroczyste ciało tłuszczowe i wszelkie pozostałe jelita, aby zwiększyć widoczność pożądanych tkanek, takich jak skrzydło, oko lub mózg. Wypreparuj pożądane tkanki; czyste usuwanie skrzydeł z tchawicy i naskórka za pomocą kleszczy, oczu z haczyków na usta lub mózgu z oczu (ryc. 1G).</li>
 <li>Do preparowania poczwarki należy użyć kleszczyka, aby delikatnie chwycić poczwarkę za przedni koniec obudowy poczwarki, w której znajduje się pęcherzyk powietrza, aby uniknąć uszkodzenia poczwarki wewnątrz (ryc. 1C). Kleszcze lub mikronożyczki w przeciwnej ręce mogą być użyte, aby pomóc ustawić pływającą poczwarkę w celu prawidłowego uchwycenia. Czysto przetnij tylny koniec poczwarki mikronożyczkami. To cięcie w przekroju poprzecznym powinno być wykonane pod niewielkim kątem w kierunku grzbietowej części zwierzęcia, aby uwolnić ciśnienie wewnętrzne bez wtłaczania tkanki tłuszczowej do pożądanych tkanek klatki piersiowej i głowy. Ciąć ostrożnie wzdłuż środkowej części grzbietu, unikając skrzydeł i przedniego kompleksu oko-mózg. Ostrożnie wyjmij poczwarkę z obudowy poczwarki, chwytając tylną krawędź naskórka poczwarki i wyciągając ją z obudowy poczwarki (ryc. 1D). Zrób mały otwór w naskórku przed kompleksem oko-mózg za pomocą kleszczy. Używając szklanej pipety Pasteura z gumową gruszką, delikatnie przemyj roztwór preparacyjny PBS przez częściowo wypreparowaną poczwarkę, aby usunąć histolizowany tłuszcz i pozostałą tkankę jelitową. To również skutecznie smaruje szklaną pipetę lipidami i białkami, co zmniejsza częstość przywierania wypreparowanych tkanek do wnętrza szklanej pipety w późniejszym czasie.</li>
 <li>Aby uzyskać skrzydła poczwarki, naskórek otaczający skrzydło i samo skrzydło muszą zostać oderwane od poczwarki (ryc. 1E). Można to zrobić, przytrzymując poczwarkę za głowę jednym kleszczem, podczas gdy używając innego kleszcza do uchwycenia najbardziej tylnego końca naskórka skrzydła i wyciągając lub manewrując kleszczem pod skrzydłem w pobliżu zawiasu przed usunięciem go z boku tuszy (ryc. 1E). Skrzydło można następnie przeciąć lub rozerwać na zawiasie, aby usunąć je z korpusu i ułożyć w stos z dala od tusz i innego materiału.</li>
 <li>Aby uzyskać poczwarkę oczu lub mózgu, umyj poczwarkę, aż kompleks oko-mózg zostanie usunięty i wolny od poczwarki (ryc. 1F, 1H). Za pomocą kleszczy delikatnie odciągnij oko poczwarki od mózgu i zachowaj pożądaną tkankę.</li>
 <li>Nie należy poświęcać więcej niż 45 minut na analizę każdej próbki, ponieważ wyniki stają się mniej dokładne, im dłużej komórki pozostają w PBS po otwarciu zwierząt.</li>
</ol>
3. Dysocjacja tkanek i barwienie DNA
<ol>
 <li>Za pomocą nasmarowanej pipety Pasteura ostrożnie przenieś wypreparowane tkanki do 0,5 ml roztworu barwienia żywego DNA w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml (ryc. 1G). Przenieś jak najmniej PBS (mniej niż 300 μl) do roztworu barwienia DNA, ponieważ rozcieńczenie trypsyny zahamuje dysocjację tkanek.</li>
 <li>Inkubować probówki z wytrząsaniem w temperaturze 23 °C przy 500 obr./min (używamy termomiksera Eppendorf).</li>
 <li>Inkubować przez 70 minut, a następnie delikatnie wirować przez 5 sekund ze średnią prędkością (ustawienie 5). Nadmierne wirowanie spowoduje rozerwanie komórek i powstanie gruzu, podczas gdy niedostateczne wirowanie doprowadzi do grudek komórek. Przywrócić próbki do wytrząsania w temperaturze 23 °C przy 500 obr./min przez dodatkowe 15–20 minut, a następnie ponownie wirować je przez 5 sekund z prędkością 5.</li>
 <li>W przypadku mózgów i oczu poczwarek starszych niż 36hAPF wymagany jest zmodyfikowany protokół. Dysocjuj tkanki w roztworze barwienia DNA w temperaturze 23 °C przy 500 obr./min przez 45-60 minut w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Następnie, jeden po drugim, ręcznie dysocjuj duże kawałki tkanki, przenosząc je do naczynia preparacyjnego wraz z około 50 μl roztworu barwienia DNA i szybko pipetując w górę iw dół za pomocą ręcznie rysowanej pipety Pasteura 16 (o otworze około 100-150 μm). Przenieść każdą zdysocjowaną próbkę z resztą 0,5 ml roztworu barwienia DNA do probówki o pojemności 5 ml. Inkubować przez dodatkowe 45–30 minut (do 90 minut całkowitego czasu inkubacji) w temperaturze 23 °C z wytrząsaniem z prędkością 500 obr./min, aż grudki przestaną być widoczne.</li>
 <li>W pełni zdysocjowane próbki powinny mieć bardzo mało widocznych dużych kawałków tkanki, chociaż należy pamiętać, że bezkomórkowy przezroczysty naskórek skrzydła poczwarki nie ulegnie dysocjacji.</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
<ol>
 <li>Włącz cytometr Attune i otwórz oprogramowanie Attune. Lasery cytometryczne powinny być włączane za pomocą menu startowego, a przed każdym dniem pozyskiwania danych należy wykonywać codzienny test wydajności za pomocą koralików śledzących wydajność z odpowiednimi wynikami. Poziom płynów powinien być wypełniony co najmniej do połowy, a odpady opróżnione przed testem wydajności. Szczegóły dotyczące uruchamiania, prawidłowej kalibracji i obsługi Attune można znaleźć w Podręczniku użytkownika Attune (<a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf" target="_blank"> http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf</a>)</li>
 <li>Zaprojektuj nowy szablon, tworząc 4 wykresy punktowe i 2 histogramy w pustym obszarze roboczym z parametrami wskazanymi w punkcie 4.3 lub wybierz wcześniej zaprojektowany szablon odpowiedni dla eksperymentu i wskaż liczbę próbek do pobrania. Dostarczyliśmy szablony Attune (pliki w formacie .get) do analizy cyklu komórkowego Drosophila na żywo z ekspresją Vybrant DyeCycle Violet i GFP lub RFP w Załączniku I.</li>
 <li>Dostarczone szablony zawierają cztery wykresy punktowe i dwa histogramy z parametrami wskazanymi na rysunku 2. Kanały detekcji obejmują: FSC i SSC - rozproszenie do przodu i rozproszenie boczne wskazujące rozmiar komórki i złożoność błony, wysokość (H), szerokość (W) i obszar (A) VL1 - wskazujące na wzbudzenie laserem fioletowym DyeCycle Violet barwiące DNA oraz BL1-A - Obszar kanału 1 niebieskiego lasera, wskazujący fluorescencję GFP. Dostarczony szablon do analizy zapytania ofertowego jest identyczny z szablonem do analizy GFP, z tą różnicą, że korzysta z kanału niebieskiego lasera 3 (BL3-A), który jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania zapytań ofertowych.</li>
 <li>Wykresy punktowe w szablonach mają bramki, które ograniczają analizę do pożądanych populacji oraz ograniczają szczątki i grudki komórek z analizy (rysunek 2). Bramka 1 nie obejmuje gruzu i grudek w oparciu o SSC vs. FSC (rysunek 2A). Bramka 2 wyklucza niebarwione komórki, komórki apoptotyczne sub G1 i grudki komórek na podstawie identyfikacji singli (VL1Area vs. VL1Width) (Figura 2B). Bramka 3 jest bramką pochodną, obejmującą komórki w bramkach 1 i 2 i identyfikuje komórki ujemne GFP (lub RFP) w stosunku do zawartości DNA na podstawie VL1Height (figura 2C). Bramka 4 jest bramką pochodną, obejmującą komórki w obrębie bramek 1 i 2 i identyfikuje komórki dodatnie GFP (lub RFP) w stosunku do zawartości DNA (ryc. 2C). Wykresy punktowe wielkości komórki mierzonej za pomocą GFP (lub RFP) w porównaniu z rozproszeniem do przodu (FSC) są używane do generowania bramek 5 i 6 (rysunek 2D). Dwa histogramy przedstawiają zawartość DNA na osi X i liczbę komórek na osi Y dla populacji zdefiniowanych przez bramkę 3 i bramkę 4. (Rysunek 2E i 2F) W razie potrzeby można również dołączyć histogramy dotyczące rozmiaru komórki (nie pokazano). W przypadku histogramów wielkości komórek populacje powinny być ustawione na bramki 5 i 6, wykreślając FSC na osi X i zliczania na osi y.</li>
 <li>Ustaw nagrywanie tak, aby zatrzymało się na 10 000 pozytywnych zdarzeń GFP lub RFP (będzie to bramka 4, pochodna bramka bramki 1, bramka 2 i dodatnia bramka GFP lub RFP). Zakresy od 6 000 do 10 000 pozytywnych zdarzeń GFP były tradycyjnie celem dla profili jakości publikacji9,11. Sugerujemy użycie co najmniej 15 skrzydeł lub oczu, które są w około 50% dodatnie pod względem GFP, aby uzyskać wystarczającą liczbę zdarzeń Gate4 10 dla profili wysokiej jakości. Jednak udało nam się uzyskać jasne dane do wstępnej analizy cyklu komórkowego z zaledwie 6 skrzydeł (Figura 3A). Ustaw objętość akwizycji na 300 μl, pozwoli to na użycie około 460 μl z całkowitej próbki 0,5 ml. Tabela 2 przedstawia odpowiednie ustawienia progu i napięcia podane w szablonie dla przykładu na rysunku 2.</li>
 <li>Badaj próbki z czułością standardową lub wysoką czułością 100 μl/min i nagrywaj. W naszej analizie znajdujemy niewielką lub żadną różnicę w różnych poziomach czułości. Ze względu na akustyczne ogniskowanie komórek, cytometr ten może dokładnie mierzyć próbki przy bardzo dużych natężeniach przepływu. W przeciwieństwie do tradycyjnych cytometrów, nie znajdujemy żadnych zagrożeń dla danych, pozyskując z prędkością do 1500 zdarzeń na sekundę. Nagrane pliki danych generowane przez oprogramowanie Attune są w formacie .fcs, który jest kompatybilny z większością programów do modelowania cyklu komórkowego.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
 <li>Można porównać histogramy wielkości komórki i zawartości DNA dla populacji GFP (lub RFP) dodatnich i ujemnych. Można je ręcznie nakładać warstwami, kopiując i wklejając za pomocą oprogramowania Adobe Photoshop. Jeśli oś y jest ustawiona na automatyczną, oś y będzie skalowana z najwyższą liczbą dla każdej próbki. Nałożenie dwóch wykresów z osią Y ustawioną na automatyczne skalowanie powoduje utworzenie nakładki histogramów z osiami ustawionymi na globalne maksimum dla każdej populacji. Pozwala to na łatwe wizualne porównanie względnych zmian w fazach cyklu komórkowego, nawet jeśli całkowita liczba komórek w populacjach GFP dodatnich i GFP ujemnych nie jest równoważna (przykład na rysunku 3B). Alternatywnie można ustawić niestandardową oś y (opcja ręczna osi y) na stałą wartość histogramów. W takim przypadku można porównać względną liczbę komórek dla dwóch populacji. Ponieważ Attune wykorzystuje zdefiniowaną objętość próbki na przebieg, bezwzględną kwantyfikację komórek dla każdego przebiegu, w każdej bramce z procentami całkowitej populacji, można uzyskać z tabeli statystycznej generowanej automatycznie podczas przebiegu w obszarze roboczym (przykład na rysunku 3F). Wykresy punktowe i histogramy można również łatwo nakładać na siebie w oprogramowaniu Attune, po prostu przeciągając i upuszczając różne próbki z menu pliku próbki po prawej stronie na żądany wykres otwartej próbki w celu porównania. Jednak w celu nałożenia na siebie subpopulacji z jednej próbki (tj. dodatniej i ujemnej GFP w tej samej próbie) używamy programu Photoshop.</li>
 <li>Do znalezienia względnych wartości procentowych w różnych fazach cyklu komórkowego dla populacji można zastosować dwie metody. Metoda aproksymacji opiera się na regionach zdefiniowanych przez użytkownika w celu wyznaczenia granic pików G1, S, G2 i >G2. Metoda ta umożliwia szybkie i łatwe oszacowanie wartości procentowych w regionach zdefiniowanych przez użytkownika (rysunek 3E). Ustaliliśmy nasze regiony na podstawie bezpośredniego testu z komórkami Drosophila Kc, oznaczonymi do fazy S przy użyciu inkorporacji etynylo-deoksyurydyny (EdU). Druga metoda wykorzystuje oprogramowanie do modelowania innych firm do szacowania rozkładu cyklu komórkowego. Użyliśmy oprogramowania ModFitLT (Verity Software House) na przykład na rysunku 3F.</li>
</ol>

<ol><li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Issues+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li>
<li>Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li>
<li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila%3A+the+laboratory+setup%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34(2007).</li>
<li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
<li>McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+gene+expression+targeting+with+the+TARGET+and+gene-switch+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila.</a> Sci STKE. 2004, pl6(2004).</li>
<li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).</li>
<li>Bjorklund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pathways+regulating+cell+size+and+cell-cycle+progression+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi.</a> Nature. 439, 1009-1013 (2006).</li>
<li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93, 1183-1193 (1998).</li>
<li>de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of Drosophila cells.</a> Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).</li>
<li>Reis, T., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+dE2F1+by+cyclin-dependent+kinases+controls+cell+cycle+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing.</a> Cell. 117, 253-264 (2004).</li>
<li>Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycling+and+patterned+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+during+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).</li>
<li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3B+A+laboratory+handbook%22">Drosophila; A laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Press. (1989).</li>
<li>Theodosiou, N. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+FLP%2FFRT+system+to+study+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li>
<li>On-line Protocols of Protistology Workshop 2005 at The Marine Biological Laboratory [Internet]. , Woods Hole, M.A. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm">http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm</a> (2005).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li>
<li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation%2C+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół pozwala na analizę cyklu komórkowego, względnej wielkości komórki i względnej liczby komórek w żywych tkankach Drosophila na różnych etapach rozwoju. Gdy ta analiza jest połączona z ekspresją białek fluorescencyjnych specyficznych dla typu komórki lub śledzeniem linii, można uzyskać szczegółowe informacje na temat odpowiedzi komórkowych na dyskretne zaburzenia cyklu komórkowego lub wzrostu. Jako dowód zasady, zakłóciliśmy spoczynek w mózgu muchy poczwarkowej poprzez ekspresję regulatorów c...

Cytometria przepływowa może być używana do pomiarów żywotności komórek, względnej wielkości komórek, zawartości DNA i ekspresji białek fluorescencyjnych w żywych populacjach komórek. Ze względu na replikację jądrowego DNA podczas fazy S, informacje o zawartości DNA w populacji komórek można wykorzystać do wywnioskowania względnych wartości procentowych w różnych fazach cyklu komórkowego 1-3. Metoda ta stała się kamieniem węgielnym analizy cyklu komórkowego w systemach modelowych od drożdży po ssaki.
Muszka owocowa Drosophila melanogaster stała się doskonałym modelem do genetycznych analiz in vivo regulacji cyklu komórkowego. Obszerne narzędzia genetyczne dostępne u muszek pozwalają na eleganckie, specyficzne tkankowo i czasowo regulowane manipulacje regulatorami cyklu komórkowego wraz ze śledzeniem linii krwi in vivo na podstawie fluorescencyjnych białek 4-6. Cytometria przepływowa została wykorzystana do zbadania zawartości DNA w wielu typach komórek Drosophila, w tym w komórkach endoreplikujących i hodowanych komórkach mitotycznych 7,8. De la Cruz i Edgar dokonali ważnego postępu w badaniach cyklu komórkowego in vivo, opracowując protokół analizy cytometrii przepływowej żywych diploidalnych dysków wyobrażonych Drosophila 9,10, który to protokół był używany i adaptowany przez wiele laboratoriów. Technika ta, w połączeniu z genetycznym śledzeniem linii produkcyjnej in vivo za pomocą indukowalnej ekspresji białek fluorescencyjnych i znakowania specyficznego dla tkanki, pozwala uzyskać informacje o wpływie manipulacji genami na ogólny czas podwajania komórek, wielkość komórki oraz określić dokładny czas faz cyklu komórkowego in vivo 9,11. Jednak do tej pory metoda ta opierała się na użyciu przepuszczalnego dla komórek barwnika interkalacyjnego DNA Hoechst 33342 do barwienia i ilościowego oznaczania DNA w żywych komórkach, co ograniczyło użytkowników do cytometrów przepływowych z laserem UV zdolnym do wzbudzenia barwnika Hoechsta. Są one zazwyczaj spotykane tylko w sorterach (np. BD FACS Vantage, BD FACSAria) lub drogich wielokolorowych systemach stołowych (np. BD LSR), zwykle wymagających wsparcia ze strony instytucjonalnych urządzeń do zarządzania przepływem.
Zmodyfikowaliśmy protokół oparty na Hoechst, aby używał nowego barwnika DNA żywych komórek od Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet. Barwnik ten jest kompatybilny z fioletowym laserem o długości fali 405 nm, bardziej powszechnym w mniejszych analizatorach stacjonarnych i dostępnym w małym, samodzielnym analizatorze laboratoryjnym, Attune Acoustic Focusing Cytometer. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół analizy cyklu komórkowego, który można połączyć z typem komórki, rozmiarem komórki, liczbą komórek i analizą linii w różnych tkankach Drosophila na różnych etapach rozwoju przy użyciu DyeCycle Violet i Attune. Protokół ten rozszerza liczbę cytometrów odpowiednich do takiej analizy z tkankami Drosophila i zawiera przykłady, w jaki sposób ten rodzaj analizy cyklu żywej komórki może być modyfikowany dla dodatkowych typów tkanek i etapów rozwoju.

<table><tbody><tr><td>12x75 mm Polistyrenowa probówka okrągłodenna 5 ml BD </td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>probówki 5 ml</td></tr><tr><td>Attune Akustyczny cytometr skupiający</td><td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td><td>4445315</td><td>konfiguracji niebieskiej / fioletowej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie cytometru Attune (wersja 1.2.5)</td><td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td><td>Free</td><td>PC</td></tr><tr><td>Koraliki do śledzenia wydajności Attune (5 x 106 koralików/ml) </td><td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td><td>4449754</td><td>Do codziennego testu wydajności</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5 Inox </td><td>Narzędzia do nauki o naczyniach</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Szalki z zarodkami 30 mm x 12mm </td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>70543-30</td><td>Szklane naczynia preparacyjne </td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>022670051</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA (10x)</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&#252; Nożyczki sprężynowe bingen </td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>Prosta krawędź tnąca 5 mm </td></tr><tr><td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td><td>Life Technologies/ Invitrogen</td><td>V35003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Wymagane odczynniki i instrumenty.</td></tr><tr><td colspan="4">Roztwór barwienia żywego DNA (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ wolny PBS (pH 7,2) 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 5 &mu; l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (należy pamiętać, że jest to 0,25 raza większe stężenie niż zalecane dla komórek ssaków. Okazuje się, że wyższe stężenia są toksyczne dla komórek Drosophila). 10X Ca2+ Mg2+ wolny PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dwuzasadowy), 20mM KH2PO4 (monobasic) dostosowane do pH 7.2 </td></tr><tr><td colspan="4"><table border="1"> <tbody> <tr> <td> </td> <td>FSC</td> <td>SSC</td> <td>BL1</td> <td>VL1</td> </tr> <tr> <td>Próg (x1000)</td> <td>100</td> <td>10</td> <td>10</td> <td>10</td> </tr> <tr> <td>Napięcie (mV)</td> <td>2950</td> <td>4250</td> <td>1800</ td> <td>1150</td> </tr> </tbody> </table> Tabela 2. Ustawienie progu i napięcia dla analizy na rysunku 2.</td></tr></tbody></table>

analiza cyklu komórkowego żywych tkanek drosophila przy użyciu cytometru akustycznego attune i barwienia vybrant dyecycle violet dna

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Cytometria przepływowa jest powszechnie stosowana do uzyskiwania informacji o zawartości DNA w populacji komórek, do wnioskowania o względnych procentach w różnych fazach cyklu komórkowego. Technika ta została z powodzeniem rozszerzona na tkanki mitotyczne organizmu modelowego Drosophila melanogaster w badaniach genetycznych regulacji cyklu komórkowego in vivo. W połączeniu z ekspresją białek fluorescencyjnych specyficznych dla danego typu komórki i manipulacjami genetycznymi, można uzyskać szczegółowe informacje na temat wpływu na liczbę komórek, wielkość komórki i fazowanie cyklu komórkowego in vivo. Jednak ta metoda żywych komórek opierała się na użyciu przepuszczalnego dla komórek barwnika interkalacyjnego DNA Hoechst 33342, ograniczając użytkowników do cytometrów przepływowych wyposażonych w laser UV. Zmodyfikowaliśmy ten protokół, aby użyć nowszego barwnika DNA z żywych komórek, Vybrant DyeCycle Violet, kompatybilnego z bardziej powszechnym fioletowym laserem 405 nm. Przedstawiony tutaj protokół pozwala na efektywną analizę cyklu komórkowego w połączeniu z typem komórki, względną wielkością komórki i liczbą komórek w różnych tkankach Drosophila. Protokół ten rozszerza użyteczną technikę analizy cyklu komórkowego dla żywych tkanek Drosophila na mały analizator laboratoryjny, Attune Acoustic Focusing Cytometer, który może być uruchamiany i utrzymywany w skali jednolaboratoryjnej.

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki dla próbki skrzydła larwy, wykazującej ekspresję GFP w tylnej połowie tkanki, z wykorzystaniem dostarczonego szablonu GFP. Podobne wyniki uzyskano dla tego samego rodzaju tkanki i wzorca ekspresji w przypadku RFP, stosując dostarczony szablon RFP (Rysunek 3A). Dostarczone szablony i napięcia (Tabela 2) są odpowiednie do analizy oczu larwalnych (Rysunek 3B), mózgów i skrzydeł, a także oczu poczwarki, mózgów (Rysunek 3D<...

Opisano protokół analizy cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila za pomocą cytometru Attune Acoustic Focusing. Protokół ten jednocześnie dostarcza informacji o względnej wielkości komórki, liczbie komórek, zawartości DNA i typie komórki poprzez śledzenie linii lub specyficzną dla tkanek ekspresję białek fluorescencyjnych in vivo.

Analiza cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila przy użyciu cytometru akustycznego Attune i barwienia Vybrant DyeCycle Violet DNA

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar względnej fazy cyklu komórkowego i wielkości komórek tkanek z populacjami komórek genetycznie zmodyfikowanymi i znakowanymi GFP lub RFP u Drosophila. Najpierw należy skonfigurować krzyżówki genetyczne w celu wygenerowania potomstwa zawierającego komórki znakowane pożądanymi białkami fluorescencyjnymi i z pożądanymi manipulacjami genetycznymi w określonej tkance lub populacji komórek. W trakcie badania należy czysto wyizolować pożądaną tkankę od potomstwa w odpowiednim stadium rozwoju, a następnie zdysocjować tkankę do zawiesiny pojedynczej komórki i wybarwić żywym barwnikiem DNA w celu zmierzenia zawartości DNA.Analizować barwione, zdysocjowane próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie wyniki in vivo mierzą zmiany w wielkości komórek i fazie cyklu komórkowego spowodowane badanymi manipulacjami genetycznymi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą cytometrii przepływowej na żywych tkankach Drosophila przy użyciu barwników ultrafioletowych jest to, że fioletowy barwnik o cyklu barwnikowym jest kompatybilny z tańszymi cytometrami laboratoryjnymi zawierającymi fioletowy laser 4:0,5, który można kupić przy niewielki

live-cell-cycle-analysis-drosophila-tissues-using-attune-acoustic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza cyklu życia komórek w tkankach Drosophila przy użyciu cytometru Attune Acoustic Focusing oraz barwnika Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Krwinki Drosophila, czyli hemocyty, krążą między miejscami rezydentnymi a krążeniem.  U larwy hemocyty rezydentne (siedzące) lokalizują się w mikrośrodowiskach indukcyjnych, kieszeniach krwiotwórczych, podczas gdy krążące hemocyty poruszają się swobodnie w hemolimfie. Celem tego protokołu jest standaryzowana izolacja i kwantyfikacja tych dwóch, behawioralnie odrębnych, ale wymiennych populacji hemocytów.

Oznaczanie populacji krwinek larwy Drosophila melanogaster

Podziały komórek mogą być wizualizowane w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnie znakowanych białek i mikroskopii poklatkowej. Korzystając z przedstawionego tutaj protokołu, użytkownicy mogą analizować dynamikę czasu podziału komórki, składanie wrzeciona mitotycznego oraz kongresację i segregację chromosomów. Defekty tych zdarzeń po knockdownie genu za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi) można ocenić i określić ilościowo.

Zastosowanie komórek Drosophila S2 do obrazowania podziału komórek na żywo

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

Poznaj metodę analizy cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila przy użyciu cytometru akustycznego Attune i barwienia DNA. Technika ta umożliwia jednoczesną ocenę wielkości komórek, zawartości DNA i typów komórkowych.

Analiza cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila przy użyciu cytometru akustycznego Attune i barwienia Vybrant DyeCycle Violet DNA (Wideo) | JoVE Journal

Analiza cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila przy użyciu cytometru akustycznego Attune i barwienia Vybrant DyeCycle Violet DNA

Przeglądaj więcej filmów