Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)
14 marca 2013
Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu. W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie rzetelnego, nietargetowanego profilowania metabolomów surowicy w eksperymencie na dużą skalę. W pierwszej kolejności należy przeprowadzić ekstrakcję metabolitów w formacie płytkowym. Następnie należy opracować rzetelną próbkę QC oraz metodę zapewniającą stabilność analityczną w czasie.
Następnie należy zebrać dane ze spektrometrii mas dla próbek QC oraz zrandomizowanych próbek surowicy w powtórzeniach, a następnie przejść do przetwarzania wstępnego danych, analizy statystycznej i identyfikacji metabolitów. Wyniki nietargetowanego profilowania metabolitów metodą U-P-L-C-M-S mogą zostać wykorzystane do identyfikacji małocząsteczkowych biomarkerów w surowicy. Niniejszy protokół przedstawia analizę surowicy.
Można go jednak łatwo rozszerzyć na analizę innych płynów biologicznych, takich jak mocz, tkanki i ekstrakty z hodowli komórkowych. Aby stworzyć mapę płytki do przygotowania próbek, otwórz arkusz kalkulacyjny. W pierwszej kolumnie wpisz listę próbek w kolejności ich ładowania. W drugiej kolumnie wprowadź lokalizacje w płytce 96-dołkowej, stosując nomenklaturę zgodną z oprogramowaniem Twojego autosamplera.
Zarezerwuj jedną dołkę na każdej płytce dla próbki kontroli jakości (QC). Jeśli autosampler LC może obsługiwać dwie płytki jednocześnie, podziel listę próbek na partie po 190 i zapisz te informacje w drugim arkuszu. W obrębie każdej z tych partii zrandomizuj kolejność wstrzykiwań.
Teraz skopiuj i wklej kolejność wstrzykiwań do oprogramowania systemu kolejki próbek LCMS. Zarezerwuj pierwsze trzy wiersze kolejki próbek na wstrzyknięcia kondycjonujące kolumnę. Przygotuj 10 ml zapasu próbki QC zawierającej co najmniej cztery związki o znanej masie i czasie retencji, które obejmują cały zakres elucji chromatograficznej w eksperymencie.
Próbki surowicy rozmrozić na lodzie i delikatnie wymieszać w wortexie przez około pięć sekund. Końcówki pipety 12-kanałowej zwilżyć uprzednio metanolem, aby zapobiec ściekaniu cieczy podczas dozowania próbek. Następnie dodać 370 µL zimnego metanolu do każdej studzienki płytki transferowej 96-dołkowej, a następnie przenieść 100 µL każdej próbki do odpowiadającego jej miejsca na płytce zgodnie z mapami rozmieszczenia próbek.
Przykryć płytki i inkubować w temperaturze -80 °C przez 30 minut. Aby wytrącić białka, wirować płytki z prędkością 3 200 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Następnie przenieść 250 µL supernatantu do nowej płytki 96-dołkowej i powtórzyć etap wirowania.
Teraz przenieś 60 µL aliquoty snat do 3 płytek 96-dołkowych odpowiednich dla autosamplera UPLC lub lc. Do zarezerwowanej pozycji dołka na płytce dodaj 100 µL mieszaniny próbek QC. Każdą płytkę szczelnie zamknij folią adhezyjną.
Ustaw temperaturę autosamplera na 4°C. Umieść dwie pierwsze płytki w autosamplerze. Skonfiguruj metodę akwizycji, korzystając z jednego z dwóch alternatywnych gradientów fazy odwróconej.
Gradient A jest dostosowany do cząsteczek niepolarnych, natomiast gradient B zapewni lepsze pokrycie cząsteczek umiarkowanie polarnych. Skonfiguruj spektrometr mas do zbierania danych w trybie pozytywnym, skanując zakres stosunku masy do ładunku od 50 do 1200.
Dodatkowe specyficzne warunki instrumentu będą się różnić w zależności od systemu użytego na początku każdego z dwóch etapów. Ręcznie wstrzyknij próbki QC pięć razy. Wykorzystaj trzeci do piątego wstrzyku QC, aby monitorować powierzchnię piku (RSD poniżej 25%), czas retencji (plus lub minus 0,05 minuty) oraz dokładność masy (plus lub minus trzy części na milion).
Parametry te mogą wymagać dostosowania do specyfikacji instrumentu używanego do akwizycji danych. Jeśli próbki QC zostaną zaakceptowane, po zakończeniu akwizycji całego zestawu danych należy zebrać dane z próbek surowicy dla tych dwóch płytek. Przeprowadzić detekcję cech, wyrównanie oraz normalizację danych z spektrometrii mas dla całego zestawu danych.
Następnie należy przeprowadzić analizę statystyczną w celu określenia cech molekularnych o znaczeniu biologicznym. Kroki te są opisane w protokole tekstowym. Poniższy schemat przedstawia koncepcyjny przegląd procesu identyfikacji metabolitów.
Alternatywna strategia została przedstawiona w protokole tekstowym. Należy wykorzystać oprogramowanie do przewidzenia wzoru sumarycznego na podstawie dokładnej masy i rozkładu izotopowego istotnych cech molekularnych. Następnie należy przeszukać pomiary dokładnej masy w wewnętrznych lub publicznych bazach metabolitów.
Bazy danych filtrują kandydatów na metabolity, identyfikując je na podstawie błędu masy przewidywanej formuły cząsteczkowej, czasu retencji, fragmentacji w źródle oraz istotności biologicznej w trendach obserwowanych w odniesieniu do projektu eksperymentalnego. Pozwala to na uzyskanie domniemanej identyfikacji metabolitu. Bezwzględna identyfikacja wymaga dopasowania dokładnej masy, czasu retencji i fragmentacji związku eksperymentalnego do autentycznego standardu domniemanego metabolitu.
Na koniec przypisz poziom pewności identyfikacji do wszystkich zgłoszonych identyfikacji metabolitów, zgodnie z rekomendacjami Metabolomic Standards Initiative. Niniejszy schemat postępowania przedstawia podstawowe etapy analityczne przeprowadzania eksperymentu niescelowanego profilowania metabolitów metodą U-P-L-C-M-S. Surowe dane można zwizualizować w formie chromatogramu szczytów bazowych.
Ten przykład przedstawia próbkę surowicy, która została poddana analizie gradientowej po przeprowadzeniu analizy statystycznej. Próba identyfikacji metabolitów została podjęta dla wszystkich biologicznie istotnych i statystycznie znaczących cech molekularnych. Tutaj kofeina została zidentyfikowana w ludzkiej surowicy poprzez dopasowanie chromatograficznego czasu retencji, dokładnej masy oraz wzorca fragmentacji pomiędzy eksperymentalną cechą molekularną a autentycznym standardem domniemanego metabolitu.
Jest to przykład identyfikacji metabolitu na poziomie pierwszym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak zapewnić stabilność analityczną podczas wielkoskalowego, nietargetowanego profilowania metabolomów surowicy z wykorzystaniem UPLC-MS. Należy jednak pamiętać, że stabilność analityczna to tylko jeden z ważnych aspektów udanego eksperymentu profilowania metabolitów. Równie krytyczne są projekt eksperymentalny oraz późniejsza analiza i interpretacja danych.
Jednak poza zakresem niniejszego samouczka wideo, tematy te są wprowadzone i omówione w protokole tekstowym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół nietargetowanego profilowania metabolomów surowicy z wykorzystaniem ultrawydajnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (UPLC-MS). Szczegółowo opisano w nim cały proces, od przygotowania próbek po analizę danych i identyfikację metabolitów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Metabolomika
- Spektrometria mas
- Biochemia
Wstęp
- Nietargetowane profilowanie metabolitów jest kluczowe dla zrozumienia procesów metabolicznych.
- UPLC-MS jest powszechnie stosowaną techniką analizy złożonych próbek biologicznych.
- Kontrola jakości jest niezbędna do zapewnienia wiarygodności wyników analitycznych.
- Identyfikacja biomarkerów będących małymi cząsteczkami może wspomóc różnorodne zastosowania w badaniach biomedycznych.
Cel badania
- Opracowanie solidnej metody ekstrakcji i analizy metabolitów.
- Zapewnienie stabilności analitycznej poprzez zastosowanie środków kontroli jakości.
- Ułatwienie identyfikacji biomarkerów w próbkach surowicy.
Zastosowane metody
- Ekstrakcja metabolitów w formacie płytkowym.
- Przygotowanie próbki kontrolnej jakości (QC).
- Nabywanie danych spektrometrii mas dla prób QC oraz zrandomizowanych próbek surowicy.
- Wstępne przetwarzanie danych i analiza statystyczna w celu identyfikacji metabolitów.
Główne wyniki
- Skuteczne profilowanie metabolitów w próbkach surowicy.
- Identyfikacja potencjalnych biomarkerów małocząsteczkowych.
- Wykazanie odporności metody UPLC-MS.
- Wnioski dotyczące wariacji metabolicznych w surowicy.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodny schemat dla nietargetowanego profilowania metabolomów.
- Środki kontroli jakości zwiększają powtarzalność wyników.
- UPLC-MS jest skuteczną metodą identyfikacji biomarkerów w surowicy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Nietargetowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą UPLC-MS umożliwia obiektywną detekcję biomarkerów małocząsteczkowych, wspierając wczesną walidację punktów uchwytu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków. Metoda ta dostarcza ilościowych i powtarzalnych danych, niezbędnych do uzyskania mocy statystycznej w badaniach na dużą skalę, co ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w oparciu o modulację ścieżek metabolicznych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych poprzez powiązanie wyników fenotypowych z sygnaturami metabolicznymi.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezstronne wykrywanie metabolitów w surowicy.
- Wartość operacyjna: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez identyfikację zaburzeń metabolicznych związanych z modulacją celu.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczenie biomarkerów opartych na metabolitach do potwierdzenia mechanizmu działania.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego screeningu poprzez ustalenie bazowych profili metabolitów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki rygorystycznemu monitorowaniu próbek kontroli jakości (QC) oraz randomizowanemu pobieraniu próbek.
- Skalowalność: Umożliwia wiarygodną ocenę związków dzięki detekcji cech, wyrównaniu oraz normalizacji danych MS w dużych zestawach próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki analizy metabolomów z fazy odkryć z walidacją przedkliniczną za pomocą schematów identyfikacji biomarkerów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje dotyczące rozwoju związków poprzez korelację zmian w poziomie metabolitów z efektami fenotypowymi.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Koncentruje się na wartości predykcyjnej, wymagając przypisania poziomu pewności identyfikacji zgodnie z zaleceniami MSI dla raportowanych metabolitów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków – od testowania hipotez, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając danych o metabolitach, które pozwalają na ocenę zaangażowania celu molekularnego oraz analizę szlaków metabolicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez wykrywanie statystycznie istotnych cech molekularnych w surowicy.
- Screening: Zapewnia gotowość analizy i wyniki ilościowe dzięki wielokrotnemu pozyskiwaniu próbek kontroli jakości (QC) oraz zrandomizowanych próbek surowicy.
- Analityka: Umożliwia porównywanie warunków za pomocą analizy statystycznej w celu określenia cech molekularnych o znaczeniu biologicznym.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez identyfikację metabolitów i przypisanie poziomu ufności na podstawie dokładnej masy, czasu retencji i fragmentacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Definiuje przepływ pracy jako powtarzalną funkcjonalność dla wielkoskalowego odkrywania biomarkerów w różnych obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki bezstronnemu profilowaniu metabolitów i identyfikacji biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki przygotowaniu próbek w płytkach oraz monitorowaniu kontroli jakości (QC).
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnej analizie metabolicznej.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące dalszego rozwoju oparte na panelach biomarkerów metabolicznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu metabolomiki, spektrometrii mas oraz analizy danych w celu identyfikacji metabolitów.
- Wymagane jest oprzyrządowanie UPLC-MS z możliwością przeprowadzania dużych serii analiz oraz zautomatyzowanej obsługi próbek.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania próbek, randomizacji oraz protokołów kontroli jakości (QC) pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacji metody w celu jej rozszerzenia na ekstrakty z moczu, tkanek lub kultur komórkowych, zgodnie z opisem w protokole.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność zastosowania dużej liczby próbek w celu uzyskania odpowiedniej mocy statystycznej ze względu na biologiczną i środowiskową zmienność metaboliczną.
