Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)
14 marca 2013
Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu. W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.
Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie solidnego, nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy w eksperymencie na dużą skalę. Najpierw wyekstrahuj metabolity w formie płytki. Ustal solidną próbkę i metodę kontroli jakości, aby zapewnić stabilność analityczną w czasie.
Następnie uzyskaj dane spektralne mas na QC i randomizowanych próbkach surowicy w powtórzeniu, przejdź do danych, wstępnego przetwarzania, analizy statystycznej i identyfikacji metabolitów. Wyniki niecelowanego profilowania metabolitów za pomocą U-P-L-C-M-S mogą być wykorzystane do identyfikacji biomarkerów małocząsteczkowych w surowicy. Poniżej przedstawiono protokół analizy surowicy.
Można go jednak łatwo rozszerzyć na analizę innych płynów biologicznych, takich jak ekstrakty z moczu, tkanek i kultur komórkowych. Aby utworzyć mapę tablic do przygotowania próbki, otwórz arkusz kalkulacyjny W pierwszej kolumnie wprowadź listę próbek w kolejności ładowania. W drugiej kolumnie wprowadź 96 lokalizacji płytek dołkowych, używając poprawnej nomenklatury oprogramowania do pobierania próbek automatycznych.
Zapisz jedną studzienkę w każdej płytce dla próbki kontroli jakości. Jeśli Twój próbnik lc autos może obsłużyć dwie płytki jednocześnie, podziel listę próbek na partie po 190 i zapisz te informacje w drugim arkuszu. W każdej z tych partii należy losowo określić kolejność wstrzykiwań.
Teraz skopiuj i wklej swoje zlecenie wstrzyknięcia do systemu oprogramowania kolejki próbek LCMS. Zarezerwuj pierwsze trzy wiersze kolejki próbek do iniekcji kondycjonujących kolumnę. Przygotować 10-mililitrowy zapas próbki QC zawierającej co najmniej cztery związki o znanej masie i czasie retencji, które obejmują chromatograficzną elucję eksperymentu.
Rozmrozić próbki surowicy na lodzie i delikatnie wirować przez około pięć sekund. Wstępnie zwilż końcówki 12-kanałowego pipetera metanolem, aby zapobiec kapaniu końcówki podczas dozowania próbki. Następnie dodaj 370 mikrolitrów zimnego metanolu do każdej studzienki z 96-dołkową płytką, 100 mikrolitrów każdej próbki do odpowiedniego miejsca na płytce z map płytek.
Przykryj płytki i inkubuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby wytrącić białka, odwiruj płytki w temperaturze 3 200 g i czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut. Następnie przenieść 250 mikrolitrów supernatantu na nową 96-dołkową płytkę i powtórzyć etap wirowania.
Teraz przenieś 60 mikrolitrowych porcji SNAT do 3 96-dołkowych płytek odpowiednich do próbnika UPLC lub lc autos. Dodać 100 mikrolitrów mieszanki próbek QC do zarezerwowanego dołka na płytce. Uszczelnij każdą płytkę folią samoprzylepną.
Ustaw próbnik automatyczny na cztery stopnie Celsjusza. Umieść pierwsze dwie płytki w próbniku automatycznym. Skonfiguruj metodę akwizycji, używając jednego z dwóch alternatywnych gradientów odwróconej fazy.
Gradient A jest nastawiony na cząsteczki niepolarne. Podczas gdy gradient B zapewni lepsze pokrycie umiarkowanie polarnych cząsteczek. Ustaw spektrometr mas tak, aby zbierał dane w trybie dodatnim, skanując stosunek ładunku masowego od 50 do 1200.
Dodatkowe specyficzne warunki przyrządów będą się różnić w zależności od systemu używanego na początku każdego z dwóch. Łatka na płytkę z próbkami Ręcznie wstrzyknąć próbki kontroli jakości pięć razy. Użyj iniekcji QC od trzeciego do piątego, aby monitorować obszar piku mniejszy niż 25%, czas retencji RSD plus minus 0,05 minuty i dokładność masy plus minus trzy części na milion.
Parametry te mogą wymagać dostosowania w celu dopasowania do specyfikacji instrumentu używanego do pozyskiwania danych. Jeśli próbki kontroli jakości przejdą pomyślnie, należy uzyskać dane dotyczące próbek surowicy dla tych dwóch płytek po zakończeniu zbierania całego zestawu danych. Wykrywanie, wyrównywanie i normalizacja danych spektrometrii mas dla całego zestawu danych.
Następnie przeprowadź analizę statystyczną w celu określenia cech molekularnych o znaczeniu biologicznym. Kroki te są opisane w protokole tekstowym. Poniższy przepływ pracy zawiera koncepcyjny przegląd procesu identyfikacji metabolitów.
Alternatywna strategia jest przewidziana w protokole tekstowym. Użyj oprogramowania do przewidywania wzoru cząsteczkowego na podstawie dokładnej masy i rozkładu izotopowego istotnych cech molekularnych. Następnie przeszukaj dokładne pomiary masy w stosunku do metabolitu własnego lub publicznego.
Bazy danych filtrują potencjalny metabolit, identyfikacje według błędu masy, przewidywanego wzoru cząsteczkowego, czasu retencji, fragmentacji insource i znaczenia biologicznego w trendach obserwowanych w odniesieniu do projektu eksperymentalnego. Spowoduje to przypuszczalną identyfikację metabolitu. Bezwzględna identyfikacja wymaga dopasowania dokładnego zachowania masy, czasu i fragmentacji dla eksperymentalnego związku z autentycznym wzorcem domniemanego metabolitu.
Na koniec należy przypisać pewność identyfikacji wszystkim zgłoszonym identyfikacjom metabolitów w oparciu o zalecenia inicjatywy dotyczącej standardów metabolomicznych. Ten przepływ pracy wskazuje podstawowe etapy analityczne przeprowadzania eksperymentu profilowania metabolitów niedocelowych za pomocą U-P-L-C-M-S. Surowe dane można wizualizować jako chromatogram piku bazowego.
W tym przykładzie przedstawiono próbkę surowicy, która została przeanalizowana za pomocą gradientu po analizie statystycznej. Podjęto próbę identyfikacji metabolitów dla wszystkich biologicznie ważnych i statystycznie istotnych cech molekularnych. Tu. Kofeinę zidentyfikowano w ludzkiej surowicy poprzez dopasowanie chromatograficznego czasu retencji, dokładnego wzorca masy i fragmentacji między eksperymentalną cechą molekularną a autentycznym wzorcem przypuszczalnego metabolitu.
Jest to przykład identyfikacji metabolitu pierwszego poziomu Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zapewnić stabilność analityczną podczas wielkoskalowego, nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy przy użyciu UPLC ms. Jednak stabilność analityczna jest tylko jednym z ważnych aspektów udanego profilowania metabolitów, eksperymentu. Kluczowe znaczenie ma również projekt eksperymentu oraz dalsza analiza i interpretacja danych.
Ale poza zakresem tego samouczka wideo, te tematy są wprowadzone i omówione w protokole tekstowym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół nietargetowanego profilowania metabolomów surowicy z wykorzystaniem ultrawydajnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (UPLC-MS). Szczegółowo opisano w nim cały proces, od przygotowania próbek po analizę danych i identyfikację metabolitów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Metabolomika
- Spektrometria mas
- Biochemia
Wstęp
- Nietargetowane profilowanie metabolitów jest kluczowe dla zrozumienia procesów metabolicznych.
- UPLC-MS jest powszechnie stosowaną techniką analizy złożonych próbek biologicznych.
- Kontrola jakości jest niezbędna do zapewnienia wiarygodności wyników analitycznych.
- Identyfikacja biomarkerów będących małymi cząsteczkami może wspomóc różnorodne zastosowania w badaniach biomedycznych.
Cel badania
- Opracowanie solidnej metody ekstrakcji i analizy metabolitów.
- Zapewnienie stabilności analitycznej poprzez zastosowanie środków kontroli jakości.
- Ułatwienie identyfikacji biomarkerów w próbkach surowicy.
Zastosowane metody
- Ekstrakcja metabolitów w formacie płytkowym.
- Przygotowanie próbki kontrolnej jakości (QC).
- Nabywanie danych spektrometrii mas dla prób QC oraz zrandomizowanych próbek surowicy.
- Wstępne przetwarzanie danych i analiza statystyczna w celu identyfikacji metabolitów.
Główne wyniki
- Skuteczne profilowanie metabolitów w próbkach surowicy.
- Identyfikacja potencjalnych biomarkerów małocząsteczkowych.
- Wykazanie odporności metody UPLC-MS.
- Wnioski dotyczące wariacji metabolicznych w surowicy.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodny schemat dla nietargetowanego profilowania metabolomów.
- Środki kontroli jakości zwiększają powtarzalność wyników.
- UPLC-MS jest skuteczną metodą identyfikacji biomarkerów w surowicy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Nietargetowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą UPLC-MS umożliwia obiektywną detekcję biomarkerów małocząsteczkowych, wspierając wczesną walidację punktów uchwytu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków. Metoda ta dostarcza ilościowych i powtarzalnych danych, niezbędnych do uzyskania mocy statystycznej w badaniach na dużą skalę, co ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w oparciu o modulację ścieżek metabolicznych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych poprzez powiązanie wyników fenotypowych z sygnaturami metabolicznymi.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezstronne wykrywanie metabolitów w surowicy.
- Wartość operacyjna: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez identyfikację zaburzeń metabolicznych związanych z modulacją celu.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczenie biomarkerów opartych na metabolitach do potwierdzenia mechanizmu działania.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego screeningu poprzez ustalenie bazowych profili metabolitów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki rygorystycznemu monitorowaniu próbek kontroli jakości (QC) oraz randomizowanemu pobieraniu próbek.
- Skalowalność: Umożliwia wiarygodną ocenę związków dzięki detekcji cech, wyrównaniu oraz normalizacji danych MS w dużych zestawach próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki analizy metabolomów z fazy odkryć z walidacją przedkliniczną za pomocą schematów identyfikacji biomarkerów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje dotyczące rozwoju związków poprzez korelację zmian w poziomie metabolitów z efektami fenotypowymi.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Koncentruje się na wartości predykcyjnej, wymagając przypisania poziomu pewności identyfikacji zgodnie z zaleceniami MSI dla raportowanych metabolitów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków – od testowania hipotez, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając danych o metabolitach, które pozwalają na ocenę zaangażowania celu molekularnego oraz analizę szlaków metabolicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez wykrywanie statystycznie istotnych cech molekularnych w surowicy.
- Screening: Zapewnia gotowość analizy i wyniki ilościowe dzięki wielokrotnemu pozyskiwaniu próbek kontroli jakości (QC) oraz zrandomizowanych próbek surowicy.
- Analityka: Umożliwia porównywanie warunków za pomocą analizy statystycznej w celu określenia cech molekularnych o znaczeniu biologicznym.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez identyfikację metabolitów i przypisanie poziomu ufności na podstawie dokładnej masy, czasu retencji i fragmentacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Definiuje przepływ pracy jako powtarzalną funkcjonalność dla wielkoskalowego odkrywania biomarkerów w różnych obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki bezstronnemu profilowaniu metabolitów i identyfikacji biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki przygotowaniu próbek w płytkach oraz monitorowaniu kontroli jakości (QC).
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnej analizie metabolicznej.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące dalszego rozwoju oparte na panelach biomarkerów metabolicznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu metabolomiki, spektrometrii mas oraz analizy danych w celu identyfikacji metabolitów.
- Wymagane jest oprzyrządowanie UPLC-MS z możliwością przeprowadzania dużych serii analiz oraz zautomatyzowanej obsługi próbek.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania próbek, randomizacji oraz protokołów kontroli jakości (QC) pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacji metody w celu jej rozszerzenia na ekstrakty z moczu, tkanek lub kultur komórkowych, zgodnie z opisem w protokole.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność zastosowania dużej liczby próbek w celu uzyskania odpowiedniej mocy statystycznej ze względu na biologiczną i środowiskową zmienność metaboliczną.
