Name: Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj metodę nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy przy użyciu UPLC-MS. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, kontrolę jakości oraz identyfikację biomarkerów małocząsteczkowych w badaniach metabolomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prezentowany samouczek został wykonany i opracowany w Ośrodku Proteomiki i Metabolomiki na Uniwersytecie Stanowym Kolorado, który jest częściowo finansowany przez CSU Research Administration Resources for Scholarly Projects.

1. Przykładowa organizacja
<ol>
	<li>Aby utworzyć mapę płyt do przygotowania próbki w arkuszu kalkulacyjnym, w pierwszej kolumnie wprowadź listę próbek w kolejności ładowania. W drugiej kolumnie wprowadź 96 lokalizacji płytek dołkowych, używając prawidłowej nomenklatury oprogramowania automatycznego podajnika próbek.</li>
	<li>Zapisz jedną studzienkę w każdej płytce na próbki kontroli jakości.</li>
	<li>Jeśli Twój automatyczny podajnik próbek LC może obsługiwać dwie płytki jednocześnie, podziel listę próbek na partie po 190 sztuk i zapisz te informacje w drugim arkuszu.</li>
	<li>W każdej z tych partii użyj funkcji randomize [uwaga: "=rand()"w programie Excel], aby losowo określić kolejność wstrzykiwania. Teraz skopiuj i wklej zlecenie wstrzyknięcia do systemu oprogramowania kolejki próbek LC-MS. Randomizacja powinna odbywać się między partiami, w obrębie partii i być unikatowa dla wszystkich powtórzeń iniekcji.</li>
</ol>
2. Procedury przygotowania próbek surowicy i kontroli jakości (QC)
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml zapasu próbki QC zawierającej co najmniej cztery związki o znanej masie i czasie retencji, które obejmują chromatograficzną elucję doświadczenia. (Uwaga: kofeina, rezerpina, sulfadimetoksyna i terfenadyna w stężeniu 2 μg/ml każdy).</li>
	<li>Rozmrozić próbki surowicy na lodzie i delikatnie wirować przez ~5 sekund.</li>
	<li>Końcówki 12-kanałowego pipetatora należy wstępnie zwilżyć metanolem, aby zapobiec kapaniu końcówki podczas dozowania próbki. Następnie dodać 370 μl zimnego metanolu do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Przenieść 100 μl każdej próbki do odpowiedniego miejsca na płytce z map płytek. Przykryć płytki i inkubować w temperaturze -80 °C przez 30 minut w celu wytrącenia białek.</li>
	<li>Obracać płytki w wirówce o temperaturze 4 °C przy 3 200 x g przez 30 minut. Przenieść 250 μl supernatantu do nowego dołka 96 i powtórzyć wirowanie.</li>
	<li>Teraz przenieś 60 μl porcji supernatantu na trzy 96-dołkowe płytki odpowiednie do automatycznego podajnika próbek UPLC lub LC.</li>
	<li>Dodać 100 μl mieszanki próbek QC do zarezerwowanego dołka na płytce.</li>
	<li>Uszczelnij każdą płytkę folią samoprzylepną. Rozpuszczalnik może szybko odparować po przebiciu studzienki, dlatego wstrzyknięcia należy wykonywać tylko raz z każdej płytki. Płytki w kolejce do pobierania próbek mogą być przechowywane przez krótki czas w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Akwizycja danych UPLC-MS
<ol>
	<li>Ustaw automatyczny podajnik próbek na 4 °C i umieść pierwsze dwie płytki w automatycznym podajniku próbek.</li>
	<li>Skonfiguruj metodę akwizycji, używając jednego z dwóch alternatywnych gradientów odwróconej fazy. Gradient A jest nastawiony na cząsteczki niepolarne, podczas gdy gradient B zapewni lepsze pokrycie cząsteczek umiarkowanie polarnych.
	<ol>
		<li>Gradient A: 
		<obramowanie tabeli="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Czas (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>krzywa</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,1</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1,0</td>
					<td>60</td> Rozdział
					<td>Rozdział 40</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Wersja 3.0</td>
					<td>Rozdział 30</td>
					<td>70</td> Rozdział
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11,0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17,0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Rozdział 17.1</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>23,0</td> pkt.
					<td>100</td> szt.
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>Gradient B 
		<obramowanie tabeli="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Czas (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>krzywa</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>13</td>
					<td>5</td>
					<td>95 Rozdział 95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16</td>
					<td>5</td>
					<td>95 Rozdział 95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Godzina 16.05</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw spektrometr mas do zbierania danych w trybie dodatnim skanowania w zakresie 50-1,200 m/z. Dodatkowe specyficzne warunki przyrządu będą się różnić w zależności od używanego systemu. Poniżej przedstawiono warunki używane na naszym spektrometrze mas Waters Xevo G2 Q-TOF: Energia zderzenia = 6V; Czas skanowania = 0,2 sekundy na skan; Napięcie kapilarne = 2 200 V; Temperatura źródła = 150 °C Temperatura desolwatacji = 350 °C Przepływ gazu do desolwatacji (N2) = 800 l / h).</li>
	<li>Próbki z kontrolą jakości należy wstrzykiwać pięć razy na początku każdej dwupłytkowej partii próbek. Po kondycjonowaniu systemu UPLC-MS z pierwszymi dwoma wstrzyknięciami, należy monitorować powierzchnię piku (<25% RSD), czas retencji (+/- 0,05 min) i dokładność masy (+/- 3 ppm) od trzeciego do piątego wstrzyknięcia. Parametry te mogą wymagać dostosowania w celu dopasowania do specyfikacji instrumentu używanego do pozyskiwania danych.</li>
	<li>Jeśli próbki QC przejdą pomyślnie, należy uzyskać dane dotyczące próbek surowicy dla tych dwóch płytek. Jeśli próbki kontroli jakości zakończą się niepowodzeniem, dane próbki nie są zbierane, dopóki problem nie zostanie rozwiązany, a próbki kontroli jakości nie zakończą się pomyślnie. W naszym laboratorium stwierdziliśmy, że parametry te są niezmiennie stabilne przez trzy dni iniekcji (tj. wstrzyknięcia 2 płytek 96-dołkowych). Jeśli okaże się, że system jest niestabilny w tym okresie, częstsze wstrzyknięcia kontroli jakości mogą być odpowiednie. Próbka kontroli jakości nie jest używana w celu skorygowania danych o niskiej jakości, ale w celu zapobieżenia gromadzeniu danych o niskiej jakości.</li>
</ol>
4. Wykrywanie, integracja, wyrównanie i normalizacja szczytów
Istnieje wiele opcji do wykonania tych kroków, w tym darmowe oprogramowanie i narzędzia specyficzne dla dostawców. Ten krok został pominięty w samouczku wideo, ale nasze podejście jest opisane poniżej jako przykład.
Dla każdej próbki, dane analityczne wygenerowane z tego typu eksperymentu to profil jonów opisany przez czas retencji, wartość m/z i intensywność spektralną. Eksperyment z profilowaniem metabolitów bez celu będzie składał się z wielu próbek, a zatem należy przeprowadzić wykrywanie pików, wyrównanie czasu retencji i normalizację, aby umożliwić późniejszą analizę statystyczną zestawu danych.
<ol>
	<li>Eksportuj surowe dane do formatu .cdf za pomocą oprogramowania Waters DataBridge. Wykonaj wyrównanie czasu wykrywania i przechowywania szczytów za pomocą pakietu oprogramowania XCMS 10 (freeware dostępnego pod adresem <a href="http://metlin.scripps.edu/xcms/" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/xcms/</a>) i jest wykonywane w środowisku statystycznym R11). Witryna internetowa zawiera dokumentację dotyczącą pobierania i uruchamiania oprogramowania.</li>
	<li>Użyj metody "dopasowanego filtra" w XCMS z następującymi parametrami: pełna szerokość w połowie max = 8 sekund, stosunek sygnału do szumu = 3, maksymalnie 100 pików dla każdego ekstrahowanego chromatogramu jonowego. Wykonaj kroki grupowania obiektów, korekcji czasu przechowywania, ponownego grupowania i fillPeaks. Wynikiem oprogramowania XCMS jest macierz danych ze wszystkimi wykrywalnymi cechami wymienionymi jako wiersze, każda próbka eksperymentalna jako kolumna, a komórki są wypełniane obszarem piku każdej cechy w każdej próbce. Transpozycja tego zbioru danych może być konieczna w celu włączenia go do dalszych przepływów pracy statystycznych.</li>
	<li>Znormalizuj macierz danych w R, dzieląc obszar piku każdej cechy w danej próbce przez sumę wyekstrahowanego obszaru piku jonów (określanego jako całkowity prąd jonowy lub TIC dla tej próbki (pomnożony przez 100 000, aby liczby były bardziej podatne na wizualną interpretację danych).</li>
	<li>Usuń wartości odstające. Wartości odstające w danych mogą wynikać albo ze złego wstrzyknięcia dobrej próby, albo z dobrego wstrzyknięcia złej próbki.
	<ol>
		<li>Wykonaj wykrywanie wartości odstających w języku R przy użyciu pakietu wartości odstających z następującymi parametrami: (1) wartościami TIC i (2) wynikami PC z 99,9% pewnością.</li>
		<li>Jeśli występują wartości odstające, odpowiednie pliki danych są usuwane i ponownie wykonywane są procedury wykrywania, wyrównywania i normalizacji pików.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uśrednić znormalizowane obszary pików według identyfikatora próbki (w celu uśrednienia wielokrotnych wstrzyknięć). Należy to zrobić przed przeprowadzeniem analizy statystycznej (uwaga: kontrpróby iniekcji uwzględniają zmienność analityczną, ale nie mogą być używane jako prawdziwe kontrpróby biologiczne).</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
Dla eksperymentów metabolomicznych, zarówno wielowymiarowe, jak i jednowymiarowe techniki statystyczne są niezbędne do interpretacji danych. Dwie techniki, które są powszechnie stosowane, to analiza głównych składowych i analiza wariancji (ANOVA). Istnieje wiele sposobów podejścia do analizy statystycznej danych i dostępne są zarówno narzędzia oprogramowania open source, jak i komercyjne. Ten krok został pominięty w samouczku wideo, ale nasze podejście jest opisane poniżej jako przykład.
<ol>
	<li>Wykonaj ANOVA, stosując funkcję aov do zestawu danych w języku R.</li>
	<li>Uwzględnij wyniki fałszywie dodatnie za pomocą korekty Benjaminiego-Hochberga (funkcja p.adjust w R).</li>
	<li>Przeprowadź PCA ze skalą Pareto (można również zastosować wariancję jednostek) i zestawem danych skoncentrowanym na średniej. Zarówno wyniki komputera, jak i obciążenia są obliczane przy użyciu pakietu pcaMethods w języku R.</li>
	<li>Użyj wartości p ANOVA, wyników obciążenia i parametrów zmiany fałdowania, aby określić cechy molekularne, które najlepiej opisują zmienność związaną z eksperymentalnym leczeniem.</li>
	<li>Ręcznie zbadaj każdą interesującą cechę molekularną, aby określić, czy odpowiada ona jonowi molekularnemu, adduktowi (np. sodu, potasu lub dimeru) lub utracie neutralnej.</li>
</ol>
6. Identyfikacja metabolitów
Przedstawiony tutaj przepływ pracy jest bardzo ogólny i może być zastosowany do wyników z dowolnej platformy instrumentu. Alternatywna strategia jest przedstawiona w sekcji Dyskusja.
<ol>
	<li>W przypadku wszystkich statystycznie istotnych cech (określonych na podstawie analizy w kroku 6) przejrzyj surowe dane i potwierdź, że jony macierzyste, addukty, izotopy i fragmenty sodu podążają za podobnymi trendami w całym zestawie danych. Na przykład wartość p pochodząca z ANOVA dla jonu macierzystego powinna być podobna do jego izotopu. Wskazuje to, że obie cechy molekularne odpowiadają temu samemu metabolitowi.</li>
	<li>Przeszukaj dokładne pomiary masy i/lub neutralne ubytki statystycznie istotnych cech molekularnych (wybierz izotop C12, jeśli wiele izotopów jest istotnych) w wewnętrznych (jeśli są dostępne) lub publicznie dostępnych bazach danych metabolitów, takich jak:
	<ol class="lroman">
		<li>Baza danych ludzkiego metabolomu (<a href="http://www.hmdb.ca/" target="_blank">http://www.hmdb.ca/</a>)</li>
		<li>Metlin (<a href="http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php</a>)</li>
		<li>Bank masowy (<a href="http://www.massbank.jp/?lang=en" target="_blank">http://www.massbank.jp/?lang=en</a>)</li>
		<li>Mapy lipidowe (<a href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html" target="_blank">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a>)</li>
		<li>Narodowy Instytut Standaryzacji i Technologii MS Search (<a href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/" target="_blank">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a>)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj oprogramowania, aby przewidzieć wzór cząsteczkowy na podstawie dokładnego rozkładu masy i izotopów istotnych cech molekularnych. W oprogramowaniu Waters odbywa się to za pomocą narzędzia Elemental Comp w pakiecie MassLynx.</li>
	<li>Filtruj potencjalne identyfikacje metabolitów według: błędu masy (odpowiednio do platformy urządzenia), przewidywanego wzoru cząsteczkowego, znaczenia biologicznego w trendach obserwowanych w odniesieniu do projektu eksperymentalnego oraz czasu retencji (np. lipidy i inne związki niepolarne będą miały dłuższe czasy retencji przy zastosowaniu chromatografii z odwróconymi fazami).</li>
	<li>Wykonaj kolejne eksperymenty, aby uzyskać fragmentację MS/MS dla statystycznie istotnych cech molekularnych. W każdym przypadku, gdy jest to możliwe, identyfikacja metabolitów powinna opierać się na dopasowaniu eksperymentalnych pików fragmentacji i czasu retencji do autentycznego wzorca uzyskanego za pomocą tego samego urządzenia. Alternatywnie, eksperymentalna fragmentacja może być dopasowana do spektralnej bazy danych.</li>
	<li>Pewność identyfikacji należy przypisać wszystkim zgłoszonym identyfikacjom metabolitów w oparciu o zalecenia inicjatywy dotyczącej standardów metabolomicznych12. 
	Poziom 1: pewna identyfikacja molekularna w oparciu o ortogonalne parametry analityczne (dokładna masa, czas retencji i fragmentacja MS/MS) w stosunku do autentycznego związku. 
	Poziom 2 odnosi się do przypuszczalnej podstawy identyfikacyjnej właściwości fizykochemicznych i/lub podobieństwa spektralnego z literaturą lub bibliotekami spektralnymi. 
	Poziom 3 odnosi się do przypuszczalnej identyfikacji klasy związków na podstawie właściwości fizykochemicznych lub podobieństwa spektralnego. 
	Poziom 4 odnosi się do nieznanego związku.</li>
</ol>

<ol><li>Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Holistic+Analytical+Approaches+for+Metabolite+Profiling+in+Systems+Biology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies.</a> Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).</li>
<li>Zelena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+and+repeatable+UPLC-MS+method+for+the+long-term+metabolomic+study+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a robust and repeatable UPLC-MS method for the long-term metabolomic study of human serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 1357-1364 (2009).</li>
<li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC-MS-based+analysis+of+human+plasma+for+metabonomics+using+solvent+precipitation+or+solid+phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">UPLC-MS-based analysis of human plasma for metabonomics using solvent precipitation or solid phase extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li>
<li>Kamburov, A., Cavill, R., Ebbels, T. M., Herwig, R., Keun, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+pathway-level+analysis+of+transcriptomics+and+metabolomics+data+with+IMPaLA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrated pathway-level analysis of transcriptomics and metabolomics data with IMPaLA.</a> Bioinformatics. 27, 2917-2918 (2011).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetPA%3A+a+web-based+metabolomics+tool+for+pathway+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetPA: a web-based metabolomics tool for pathway analysis and visualization.</a> Bioinformatics. 26, 2342-2344 (2010).</li>
<li>Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities of metabolomics.</a> J. Cell. Physiol. 227, 2975-2981 (2012).</li>
<li>Issaq, H. J., Waybright, T. J., Veenstra, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+discovery%3A+Opportunities+and+pitfalls+in+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker discovery: Opportunities and pitfalls in analytical methods.</a> Electrophoresis. 32, 967-975 (2011).</li>
<li>Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">LC-MS-based metabolomics.</a> Mol. Biosyst. 8, 470-481 (2012).</li>
<li>Weckwerth, W., Morgenthal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+from+pattern+recognition+to+biological+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation.</a> Drug Discov. Today. 10, 1551-1558 (2005).</li>
<li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN+-+A+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN - A metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).</li>
<li>Culpepper, S. A., Aguinis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+is+for+Revolution%3A+A+Cutting-Edge%2C+Free%2C+Open+Source+Statistical+Package%5BTitle%5D)+AND+%22Organ+Res.+Methods%22%5BJournal%5D)">R is for Revolution: A Cutting-Edge, Free, Open Source Statistical Package.</a> Organ Res. Methods. 14, 735-740 (2011).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis.</a> Metabolomics. 3, 211-221 (2007).</li>
<li>Vuckovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+and+challenges+in+sample+preparation+for+global+metabolomics+using+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 403, 1523-1548 (2012).</li>
<li>Garcia-Canaveras, J. C., Donato, M. T., Castell, J. V., Lahoz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+untargeted+metabonomic+analysis+of+human+steatotic+liver+tissue+by+RP+and+HILIC+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+reveals+important+metabolic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comprehensive untargeted metabonomic analysis of human steatotic liver tissue by RP and HILIC chromatography coupled to mass spectrometry reveals important metabolic alterations.</a> Journal of Proteome Research. 10, 4825-4834 (2011).</li>
<li>Nordstrom, A., Want, E., Northen, T., Lehtio, J., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ionization+mass+spectrometry+strategy+used+to+reveal+the+complexity+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple ionization mass spectrometry strategy used to reveal the complexity of metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 421-429 (2008).</li>
<li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassBank%3A+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> J. Mass Spectrom. 45, 703-714 (2010).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Advances in metabolite identification.</a> Bioanalysis. 3, 1769-1782 (2011).</li>
<li>Broeckling, C., Heuberger, A., Prince, J., Ingelsson, E., Prenni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assigning+precursor-product+ion+relationships+in+indiscriminant+MS%2FMS+data+from+non-targeted+metabolite+profiling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Assigning precursor-product ion relationships in indiscriminant MS/MS data from non-targeted metabolite profiling studies.</a> Metabolomics. , 1-11 (2012).</li>
<li>Kangas, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+identification+software+%28ISIS%29%3A+a+machine+learning+approach+to+tandem+mass+spectral+identification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">In silico identification software (ISIS): a machine learning approach to tandem mass spectral identification of lipids.</a> Bioinformatics. 28, 1705-1713 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ten samouczek ma służyć jako punkt wyjścia do przeprowadzenia na dużą skalę nieukierunkowanego profilowania metabolitów przez UPLC-MS. Przepływ pracy koncentruje się na metabolitach, które można ekstrahować za pomocą wodnego rozpuszczalnika metanolowego, przechowywać na kolumnie UPLC C8 lub C18 i wykrywać jako jony dodatnie. W sytuacji, gdy nie ma z góry określonego odchylenia w kierunku określonej klasy metabolitów i pożądana jest hipoteza generująca profil globalny, protokół ten jest cenny, ponieważ doprowadzi do wykry...

Termin "metabolomika" może obejmować wiele rzeczy. Na przykład eksperyment metabolomiczny można przeprowadzić przy użyciu różnych platform analitycznych, takich jak NMR oraz chromatografia gazowa i/lub cieczowa w połączeniu ze spektrometrią mas. Co więcej, eksperymenty metabolomiczne mogą być przeprowadzane w sposób ukierunkowany lub nieukierunkowany, lub w połączeniu obu. Ukierunkowany eksperyment metabolomiczny będzie obejmował ukierunkowaną analizę panelu cząsteczek ważnych dla danego zagadnienia biologicznego (np. małe cząsteczki zaangażowane w cykl TCA pozwolą na dokładne określenie ilościowe tego szlaku). W tej sytuacji hipoteza biologiczna dyktuje wybór metabolitów, które mają być przedmiotem analizy, a etapy analityczne są zoptymalizowane pod kątem wykrywania tych cząsteczek. Alternatywnie, nieukierunkowany eksperyment metabolomiczny generuje hipotezy. W tym przypadku eksperyment jest przeprowadzany w sposób szeroki i bezstronny, aby umożliwić wykrycie jak największej liczby metabolitów. Wyniki eksperymentu bez celowania będą stanowić podstawę do kolejnego etapu badań (który w wielu przypadkach może obejmować ukierunkowany przepływ pracy metabolomicznej). Możliwe jest również połączenie tych dwóch podejść, w którym to przypadku eksperyment jest przeprowadzany w sposób nieukierunkowany, podczas gdy jednocześnie monitorowany jest panel znanych cząsteczek w ramach danych. 
Prezentowany tutaj poradnik skupia się konkretnie na profilowaniu metabolitów surowicy za pomocą nieukierunkowanego profilowania. Jak opisano powyżej, podejście nieukierunkowane zapewnia bezstronny obraz wykrywalnych metabolitów, może generować duże ilości informacji i ostatecznie umożliwić nowe odkrycia. Zastosowanie tego podejścia, w szczególności wykorzystującego ultrasprawną chromatografię cieczową sprzężoną ze spektrometrią mas (UPLC-MS), staje się powszechne 1, 2, 3 i obejmuje następujące etapy: (1) projekt eksperymentalny (2) pobieranie próbki (3) przygotowanie próbki (4) akwizycja danych przez UPLC-MS (5) wstępne przetwarzanie danych (wykrywanie, całkowanie, wyrównanie i normalizacja pików) (6) analiza danych statystycznych (zarówno jedno-, jak i wieloczynnikowych) (7) identyfikacja metabolitów i (8) biologiczne interpretacja. 
Obecnie nie ma ustalonych standardowych metod profilowania metabolitów opartych na UPLC-MS i kolejnych etapach wstępnego przetwarzania danych. Ten brak standaryzacji wynika częściowo z jednego z głównych wyzwań analitycznych związanych z profilowaniem metabolitów; różnorodność chemiczna metabolomu. Ze względu na tę różnorodność niemożliwe jest, aby pojedyncza metoda ekstrakcji lub metoda akwizycji spektrometrii mas zapewniła kompleksowe pokrycie wszystkich metabolitów w jednej analizie. Koncepcyjnie pokrycie metabolitów można zmaksymalizować poprzez zastosowanie wielu ekstrakcji (np. wodnego, metanolu, chloroformu:metanolu itp.) w połączeniu z różnymi warunkami chromatograficznymi (np. faza odwrócona, HILIC itp.) i różnymi trybami jonizacji (np. jon dodatni, jon ujemny, jonizacja chemiczna itp.). Często jednak badacze nie mają z góry określonego uprzedzenia do określonej klasy chemicznej, a zatem koszt przeprowadzenia wielu ekstrakcji i nabycia instrumentów nie jest uzasadniony, zwłaszcza w przypadku eksperymentów na dużą skalę. W związku z tym prezentowany tutaj film instruktażowy został zaprojektowany w celu zapewnienia ogólnej procedury profilowania na dużą skalę, nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy przez UPLC-MS. Umożliwi to nowym i istniejącym laboratoriom przeprowadzanie tego typu eksperymentów oraz elementy składowe, na podstawie których będą mogły rozszerzyć podejście do różnych typów próbek, określonych klas chemicznych lub analizy celowanej. W szczególności protokół ten będzie zawierał następujące etapy: przygotowania próbki surowicy, organizacji próbki do badań na dużą skalę, pozyskiwania danych UPLC-MS, procedur kontroli jakości (QC) i identyfikacji metabolitów. Przedstawiono również strategie wstępnego przetwarzania danych i analizy statystycznej.
Protokół nie będzie skupiał się na etapach projektowania eksperymentalnego, pobierania próbek czy interpretacji danych biologicznych, ponieważ wykracza to poza zakres tego samouczka. Jednak w literaturze istnieje wiele źródeł na te tematy, a autorzy zachęcają badaczy nowych w metabolomice do ich dokładnego zbadania 4, 5, 6, 7, 8, 9. W szczególności niezwykle ważny jest projekt eksperymentalny, który ma kluczowe znaczenie dla powodzenia nieukierunkowanego eksperymentu metabolomicznego. Należy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak właściwa replikacja biologiczna i spójność procedury pobierania próbek (np. czas na stanowisku badawczym, temperatura przechowywania, czas przechowywania, zamrażanie i rozmrażanie itp.) w celu zapewnienia wykonalności badania i ułatwienia właściwej interpretacji biologicznej danych.

<table><tbody><tr><td>Płytki 96-dołkowe - 500 &mu; l studzienki</td><td>VWR</td><td>40002-020</td><td>Służą do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>96-dołkowe maty płytkowe</td><td>VWR</td><td>89026-514</td><td>Służą do przygotowania próbek</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki - 350 &mu; l studnie</td><td>Waters Corporation</td><td>WAT058943</td><td>Są one używane do wstrzykiwania próbki</td></tr><tr><td>96-dołkowe maty płytkowe</td><td>Waters Corporation</td><td>186000857</td><td>Są one używane do wstrzykiwania próbki</td></tr><tr><td>96-dołkowe uszczelki termiczne</td><td>Waters Corporation</td><td>186002789</td><td>Mogą być używane do wstrzykiwania próbek lub długoterminowego przechowywania</td></tr><tr><td>96-dołkowa zgrzewarka płytkowa </td><td>Waters Corporation</td><td>186002786</td><td></td></tr><tr><td>Metanol klasy LC-MS</td><td>Fluka</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy LC-MS</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS aater</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy klasy LC-MS</td><td>Fluka</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowy pipet elektroniczny</td><td>VWR</td><td>89000-674</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Eclipse (zakupione za pośrednictwem Light Labs)</td><td>B-5061/B-4061</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem - Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A - kontakt Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Ultra wydajny system chromatografii cieczowej (UPLC)</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - skontaktuj się z Waters Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna UPLC C8 (opcja gradientu a)</td><td>Kolumna Waters Corporation</td><td>186002876</td><td></td></tr><tr><td>UplC T3 (opcja gradientu b) </td><td>Wody Corporation</td><td>186003536</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF Spektrometr masowy</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - skontaktuj się z Waters Corporation</td><td></td></tr></tbody></table>

wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (uplc-ms)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu. Podejście to oferuje bezstronną i dogłębną analizę, która może umożliwić opracowanie testów diagnostycznych, nowatorskich terapii i pogłębienie naszego zrozumienia procesów chorobowych. Nieodłączna różnorodność chemiczna metabolomu stwarza poważne wyzwania analityczne i nie ma jednego podejścia eksperymentalnego, które mogłoby wykryć wszystkie metabolity. Dodatkowo, biologiczna zmienność indywidualnego metabolizmu i zależność metabolizmu od czynników środowiskowych wymaga dużej liczby próbek, aby osiągnąć odpowiednią moc statystyczną wymaganą do miarodajnej interpretacji biologicznej. Aby sprostać tym wyzwaniom, w tym samouczku przedstawiono analityczny przepływ pracy do profilowania metabolitów w surowicy za pomocą UPLC-MS na dużą skalę, nieukierunkowanego. Procedura obejmuje wytyczne dotyczące organizacji i przygotowania próbek, pozyskiwania danych, kontroli jakości i identyfikacji metabolitów i umożliwi wiarygodne pozyskiwanie danych do dużych eksperymentów oraz zapewni punkt wyjścia dla laboratoriów, które dopiero zaczynają profilować metabolity niecelowane za pomocą UPLC-MS.

Podstawowe etapy analityczne eksperymentu z profilowaniem metabolomów metodą nietargetową przy użyciu UPLC-MS przedstawiono na Rysunku 1. Surowe dane dla każdej próbki można zwizualizować w postaci chromatogramu najwyższych pików. Rysunek 2 przedstawia przykładowy chromatogram najwyższych pików próbki surowicy analizowanej zgodnie z opcją gradientową (a) opisaną w tutorialu. Po przeprowadzeniu analizy statystycznej, zgodnie z powyższym opisem, podejmuje się próbę identyfikacji metabolitó...

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu. W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie rzetelnego, nietargetowanego profilowania metabolomów surowicy w eksperymencie na dużą skalę. W pierwszej kolejności należy przeprowadzić ekstrakcję metabolitów w formacie płytkowym. Następnie należy opracować rzetelną próbkę QC oraz metodę zapewniającą stabilność analityczną w czasie.Następnie należy zebrać dane ze spektrometrii mas dla próbek QC oraz zrandomizowanych próbek surowicy w powtórzeniach, a następnie przejść do przetwarzania wstępnego danych, analizy statystycznej i identyfikacji metabolitów. Wyniki nietargetowanego profilowania metabolitów metodą U-P-L-C-M-S mogą zostać wykorzystane do identyfikacji małocząsteczkowych biomarkerów w surowicy. Niniejszy protokół przedstawia analizę surowicy.Można go jednak łatwo rozszerzyć na analizę innych płynów biologicznych, takich jak mocz, tkanki i ekstrakty z hodowli komórkowych. Aby stworzyć mapę płytki do przygotowania próbek, otwórz arkusz kalkulacyjny. W pierwszej kolumnie wpisz listę próbek w kolejności ich ładowania. W drugiej kolumnie wprowadź lokalizacje w płytce 96-dołkowej, stosując nomenklaturę zgodną z oprogramowaniem Twojego autosamplera.Zarezerwuj jedną dołkę n

large-scale-non-targeted-metabolomic-profiling-serum-ultra

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Dużo skalowe nieukierunkowane profilowanie metabolomiki surowicy za pomocą chromatografii cieczowej ultra-wydajnościowej ze spektometrią masową (UPLC-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Wiarygodność wyników eksperymentów metabolomicznych zależy od skuteczności i powtarzalności przygotowania próbki. Opisana jest rygorystyczna i dogłębna metoda, która umożliwia ekstrakcję metabolitów z płynów biologicznych z możliwością późniejszej analizy do tysięcy związków lub tylko klas związków będących przedmiotem zainteresowania.

Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Szczegółowy protokół jest opisany do separacji, identyfikacji i charakterystyki proteoform w próbkach białek za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej-elektrorozpylania jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (CZE-ESI-MS/MS). Protokół może być wykorzystany do charakterystyki proteoform w prostych próbkach białkowych w wysokiej rozdzielczości oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomów.

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę kompleksowego nadzoru nad narkotykami, która pozwala na lepszą rozdzielczość i wykrywanie dużych paneli nadużywanych narkotyków i ich metabolitów, z kontrolą jakości opartą na wielosegmentowej elektroforezie kapilarnej i spektrometrii mas.

Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Przedstawiono metodę nieukierunkowanej analizy metabolitów i lipidów w ziarnie pszenicy. Protokół obejmuje metodę ekstrakcji metabolitu acetonitrylu oraz metodologię chromatografii cieczowej z odwróconą fazą i spektrometrią mas, z akwizycją w dodatnich i ujemnych trybach jonizacji elektrorozpylanej.

Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Celem tego protokołu jest wykrywanie metabolitów fenolowych w osoczu za pomocą metody częściowo ukierunkowanej chromatografii i spektrometrii mas.

Częściowo ukierunkowana ultrawysokosprawna chromatografia sprzężona ze spektrometrią mas Analiza metabolitów fenolowych w osoczu osób w podeszłym wieku

Poznaj metodę nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy przy użyciu UPLC-MS. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, kontrolę jakości oraz identyfikację biomarkerów małocząsteczkowych w badaniach metabolomicznych.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS) (Wideo) | JoVE Journal

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Przeglądaj więcej filmów