Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

Ogólnym celem tej procedury jest przewidywanie struktury drugorzędowej RNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Osiąga się to poprzez wstępną chemiczną modyfikację złożonego RNA za pomocą odczynnika elektrofilowego, który S izoluje jednoniciowe lub elastyczne regiony RNA. Drugim krokiem jest zastosowanie odwrotnej transkrypcji do wykrycia miejsc RNA, które zostały zmodyfikowane chemicznie.

Następnie produkty CD NA odwrotnej transkrypcji są frakcjonowane przez elektroforezę kapilarną. Ostatnim krokiem jest przetworzenie i normalizacja danych. Ostatecznie, oprogramowanie do tworzenia struktury RNA służy do przewidywania struktury drugorzędowej RNA przy użyciu pseudo swobodnych ograniczeń energii pochodzących z analizy kształtu.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej, takie jak to, w jaki sposób struktura RNA rządzi funkcjami katalitycznych i nieobecnych RNA oraz w jaki sposób genomy wirusowego RNA regulują wielofunkcyjność ich genomów. Implikacje tej techniki rozciągają się na naszą terapię i diagnostykę chorób wirusowych lub nowotworów, ponieważ uzyskanie wglądu w strukturę drugorzędową RNA może pomóc w projektowaniu leków opartych na strukturze. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w strukturę RNA wytwarzanych przez transkrypcję in vitro, może być również stosowana in vivo, ponieważ odczynniki kształtu są przepuszczalne dla komórek.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować RNA metodą transkrypcji in vitro. Korzystanie z komercyjnego zestawu do transkrypcji. RNA powinny być przechowywane w buforze TE w temperaturze od minus 20 do minus 80 stopni Celsjusza w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 0,5 mikrolitra.

Rozcieńczyć 12 piko moli RNA do 18 mikrolitrów wodą i dodać dwa mikrolitry 10 x mieszanki buforowej do naturyzacji, stukając w rurkę, a następnie krótko wirując, podgrzać mieszaninę w probówce do 85 stopni Celsjusza przez jedną minutę, a następnie schłodzić do czterech stopni Celsjusza w tempie 0,1 stopnia Celsjusza na sekundę. Dodaj 100 mikrolitrów wody i 30 mikrolitrów pięciokrotnego buforu składanego do mikroprobówki wirówkowej. Następnie inkubuj zawartość probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut, w zależności od składanego RNA.

Ogólnie rzecz biorąc, zależne od magnezu fałdowanie dłuższych i bardziej strukturalnych RNA wymaga dłuższego czasu inkubacji Przenieś podwielokrotność 72 mikrolitrów do każdej z dwóch 0,5 mililitrowych mikroprobówek wirówek, które powinny być odpowiednio oznaczone jako zmodyfikowane i kontrolne. Następnym krokiem jest dodanie ośmiu mikrolitrów bezwodnego dimetylosulfotlenku do mieszaniny kontrolnej i odstawienie na bok. Następnie dodaj osiem mikrolitrów 10 x i MIA do zmodyfikowanej mieszanki.

Inkubować zmodyfikowaną i kontrolną mieszankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 50 minut. Dodaj osiem mikrolitrów trzech octanu sodu, pH, 5,28 mikrolitrów 100 milimolowych EDTA, 240 mikrolitrów zimnego etanolu i jeden mikrolitr 10 miligramów na mililitr. Glikogen do zmodyfikowanej mieszanej probówki w celu wytrącenia zmodyfikowanego RNA Schłodzić zawartość probówki przez dwie godziny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, a następnie odwirować w temperaturze 14 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie umyj granulat dwukrotnie zimnym odwirowaniem 70% etanolu przez pięć minut. Po każdym praniu usunąć supernatant za pomocą mikropipety i wysuszyć granulkę na powietrzu przez pięć minut. W temperaturze pokojowej przygotuj zmodyfikowane i kontrolne próbki do odwrotnej transkrypcji w 0,5 mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych.

Do zmodyfikowanej reakcji zmieszać pięć mikrolitrów zmodyfikowanego RNA, sześć mikrolitrów wody i jeden mikrolitr 10 mikromolowego roztworu startera znakowanego sci pięć. Do reakcji kontrolnej zmieszaj pięć mikrolitrów kontrolnego RNA, sześć mikrolitrów wody i jeden mikrolitr 10 mikromolowego roztworu startera znakowanego sci 5,5. Umieść probówki w termocyklerze i przyklęknij starter do RNA.

Podczas klęczenia przygotuj mieszankę 2,5 x RT. Dla każdej reakcji RT dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut przed dodaniem do reakcji klęczącej. Gdy temperatura reakcji klęczącej osiągnie 50 stopni Celsjusza, dodaj osiem mikrolitrów 2,5 XRT.

Mieszać i inkubować przez 50 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Następnie hydrolizowano RNA, dodając jeden mikrolitr czteromolowego wodorotlenku sodu i podgrzewając do 90 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Schłodzić reakcje na lodzie, a następnie zneutralizować je, dodając dwa mikrolitry dwóch molowych kwasów solnych.

Teraz połącz reakcje zmodyfikowane i kontrolne i dodaj 0,1 objętości lub jedną dziesiątą całkowitej objętości reakcyjnej trzech molowych octanów sodu i 100 milimolowych EDTA, 1,5 objętości zimnego etanolu i jeden mikrolitr 10 miligramów na mililitr. Glikogen. Powoduje to wytrącanie się CDNA z roztworu. Wstaw roztwór do lodówki na dwie godziny, a następnie odwiruj w temperaturze 14 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umyj osad dwukrotnie zimnym, 70% etanolem ponownie zawiesić, granulowany CD NA w 40 mikrolitrach dejonizowanej formy amidu przez ogrzewanie do 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie energicznie wirować przez co najmniej 30 minut w celu przygotowania reakcji sekwencjonowania w 0,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej wymieszaj 40 mikrolitrów mieszanki zakończenia DDA. Pięć moli PICA matrycy DNA, 4,6 mikrolitra 10 x bufor do usuwania zakwasów i 10 mikrolitrów dobrze odczytanego D-dwa znakowane startery. Do tej mieszaniny dodaj 4,6 mikrolitra QUIN A i rozcieńczyć wodą, aby uzyskać całkowitą objętość do 82 mikrolitrów.

Przygotuj drugą reakcję sekwencjonowania w ten sam sposób, używając zamiast tego DDT i startera znakowanego lycor IR 800. Następnie przejdź do amplifikacji PCR przy użyciu podanych warunków zalecanych przez USB. Dodaj 16 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu o pH 5,2, 16 mikrolitrów 100 milimolowych EDTA, jeden mikrolitr 10 miligramów na mililitr glikogenu i 480 mikrolitrów 95% etanolu, aby wytrącić DNA, a następnie inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut i odwirować w temperaturze 14 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zawiesić granulowaną płytę CD NA w 100 mikrolitrach dejonizowanej formy amidu, podgrzewając do 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie energicznie wirując przez co najmniej 30 minut. Następnie wymieszaj 40 mikrolitrów próbek o łącznym kształcie z 10 mikrolitrami połączonych drabinek sekwencjonowania i pipetuj całkowitą objętość próbki do 96-dołkowych płytek z próbkami i przygotuj przyrząd do elektroforezy kapilarnej i rozpocznij przebieg zgodnie z instrukcjami producenta. Cztery nakładające się na siebie ślady oznaczone kolorami są wytwarzane przez migrację czterech zestawów produktów reakcji przez kapilarnę w następujący sposób, niebieski ślad pokazuje produkty odwrotnej transkrypcji wygenerowane z odwrotnej transkrypcji zmodyfikowanych RNA NMIA.

Zielony ślad pokazuje produkty odwrotnej transkrypcji ze złożonych, ale poza tym niezmodyfikowanych RNA. ślad pokazuje drabinę sekwencjonowania D-N-A-D-D-G, a czerwony ślad pokazuje drabinę sekwencjonowania DDT. Surowe ślady elektroforezy kapilarnej są oddzielane, przetwarzane, wyrównywane i integrowane za pomocą oprogramowania do wyszukiwania kształtów.

Analiza danych rozpoczyna się od zaimportowania elektroferogramów z systemu elektroforezy kapilarnej do wyszukiwarki kształtów. Centralne okno widoku danych zapewnia graficzną informację zwrotną na każdym etapie przetwarzania danych. Okno inspektora narzędzi znajdujące się w lewym dolnym rogu ekranu pokazuje parametry narzędzi wybranych w inspektorze skryptów.

Inspektor skryptów u góry ekranu wyświetla te narzędzia, które zostały zastosowane do danych, dostosowuje elektroferogramy w celu skorygowania tła fluorescencyjnego, nakładania się widm między kanałami fluorescencyjnymi, przesunięć ruchliwości, nadawanych przez różnie oznaczone startery, zaniku sygnału wynikającego z przedwczesnego zakończenia odwrotnej transkrypcji i różnic w intensywności fluorescencji popularnych produktów oznaczonych różnymi fluoroforami w narzędziu do wyrównywania i integrowania kształtów. Użyj funkcji konfiguracji, aby automatycznie przypisać tożsamości do poszczególnych pików i skorelować te informacje z sekwencją RNA zdefiniowaną przez dane wejściowe użytkownika i dwiema drabinkami sekwencjonowania, aby włączyć profile reaktywności nukleotydów do algorytmu struktury drugorzędowej używanego przez oprogramowanie RNA structure 5.3 i/lub porównać profile blisko spokrewnionych RNA. Normalizuj dane kształtu w ustandaryzowany sposób.

W tym celu należy wykluczyć wartości odstające z kolejnych obliczeń. Określ efektywną maksymalną reaktywność i znormalizuj, dzieląc wszystkie wartości reaktywności przez efektywną wartość maksymalną. Oprogramowanie do tworzenia struktury RNA służy do przewidywania eksperymentalnie wspieranych struktur drugorzędowych RNA przy użyciu pseudo ograniczeń energii swobodnej z analizy kształtu.

Oprogramowanie zapewnia graficzną reprezentację struktur o najniższej energii dla DRNA, a także tekstową reprezentację tych struktur. W notacji nawiasu kropkowego sekwencja i adnotacja w nawiasie kropkowym powinny zostać zaimportowane do przeglądarki struktury RNA pokazanej tutaj jest struktura 2D drugiego regionu pętli rdzenia elementu odpowiedzi HIV rev wygenerowanego w strukturze RNA 5.3 przy użyciu profili reaktywności pochodnych kształtu i wizualizowanych za pomocą lekkiego apletu Java. Nukleotydy zabarwione na niebiesko mają niską reaktywność, podczas gdy nukleotydy zabarwione na czerwono mają wyższą reaktywność Po opanowaniu technikę można wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując próbę tej procedury, należy pamiętać, że otrzymany model RNA musi zostać dokładnie zinterpretowany przed wyciągnięciem ostatecznych wniosków na temat struktury drugorzędowej RNA Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak sondowanie rodników hydroksylowych poprzez metody rozszczepienia przestrzeni, mogą być wykonane w celu wyjaśnienia złożonych oddziaływań trzeciorzędowych i ostatecznie umożliwienia naukowcom określenia struktur tych RNA w trzech wymiarach.