Name: Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Poznaj metodę SHAPE do przewidywania struktury drugorzędowej RNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Technika łączy modyfikację chemiczną, odwrotną transkrypcję i elektroforezę kapilarną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, K.J. Purzycka, J.W. Rausch i S.F.J. Le Grice są wspierani przez Intramural Research Program National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA.

<ol><li>Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+regulatory+RNA+elements%3A+ribozymes+that+regulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).</li>
<li>Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+PB+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22">Cold Spring Harb. Perspect. Biol</a>. 3, a003780(2011).</li>
<li>Wilkinson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SHAPE+analysis+reveals+structures+in+HIV-1+genomic+RNA+strongly+conserved+across+distinct+biological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states.</a> Plos Biol. 6, 883-899 (2008).</li>
<li>Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution+by+selective+2+%27-hydroxyl+acylation+and+primer+extension+%28SHAPE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 '-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE).</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).</li>
<li>Watts, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+secondary+structure+of+an+entire+HIV-1+RNA+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome.</a> Nature. 460, 711-716 (2009).</li>
<li>Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+combination+of+computer-assisted+structure+prediction+and+SHAPE+probing+to+elucidate+the+secondary+structures+of+five+viroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids.</a> Mol. Plant Pathol. , (2012).</li>
<li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+architecture+of+the+human+long+non-coding+RNA%2C+steroid+receptor+RNA+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).</li>
<li>Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+structural+analysis+of+yeast+ribosomes+using+hSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE.</a> RNA Biol. 8, 478-487 (2011).</li>
<li>Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+approach+for+the+selection+of+2-aminopurine+substitution+sites+to+investigate+RNA+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).</li>
<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2+%27-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+%28SHAPE%29%3A+quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Selective 2 '-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).</li>
<li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Shape+and+Hydroxyl+Radical+Analysis+of+Rna+Structure+and+Ribonucleoprotein+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly.</a> Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).</li>
<li>Low, J. T., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE-directed+RNA+secondary+structure+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SHAPE-directed RNA secondary structure prediction.</a> Methods. 52, 150-158 (2010).</li>
<li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Rna-a+Publication+of+the+Rna+Society%22%5BJournal%5D)">Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467, 103-107 (2010).</li>
<li>Underwood, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FragSeq%3A+transcriptome-wide+RNA+structure+probing+using+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing.</a> Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).</li>
<li>Mauger, D. M., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+global+RNA+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward global RNA structure analysis.</a> Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).</li>
<li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2%27-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).</li>
<li>Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShapeFinder%3A+a+software+system+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+nucleic+acid+reactivity+information+resolved+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis.</a> RNA. 14, 1979-1990 (2008).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).</li>
<li>Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+RNA+secondary+structure+mapping+by+automation+of+SHAPE+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 39, e151(2011).</li>
<li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).</li>
<li>Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VARNA%3A+Interactive+drawing+and+editing+of+the+RNA+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure.</a> Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).</li>
<li>Byun, Y., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PseudoViewer%3A+web+application+and+web+service+for+visualizing+RNA+pseudoknots+and+secondary+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures.</a> Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).</li>
<li>Brown, T., Brown, D. J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+T+%22Oligonucleotides+and+Analogues+-+A+Practical+Approach%22">Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach</a>. Eckstein, F. , IRL Press. 20(1990).</li>
<li>Legiewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+Transport+Element+of+the+Murine+musD+Retrotransposon+Requires+Long-range+Intramolecular+Interactions+for+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function.</a> J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).</li>
<li>Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheis+of+1-methyl-8-nitroisatoic+anhydride+%281M7%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7).</a> Protocol Exchange. , (2011).</li>
<li>Mortimer, S. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast-acting+reagent+for+accurate+analysis+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure+by+SHAPE+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).</li>
<li>Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-nucleotide+structural+mapping+by+capillary+automated+footprinting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis.</a> Nucleic Acids Res. 36, e63(2008).</li>
<li>Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+software+system+for+data+analysis+in+automated+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A software system for data analysis in automated DNA sequencing.</a> Genome Res. 8, 644-665 (1998).</li>
<li>Aviran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+and+automation+of+sequencing-based+characterization+of+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół dla wysokoprzepustowego SHAPE, techniki, która umożliwia określenie struktury drugorzędowej z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu dla RNA o dowolnej wielkości. Co więcej, sprzężenie eksperymentalnych danych SHAPE z algorytmami przewidywania struktury drugorzędowej ułatwia generowanie modeli 2D RNA z większą dokładnością niż jest to możliwe w przypadku każdej z tych metod osobno. Połączenie znakowanych fluorescencyjnie starterów i zautomatyzowanego CE zapewnia znaczące korzyści...

Aby zrozumieć funkcje katalitycznych i niekodujących RNA zaangażowanych w regulację splicingu, translacji, replikacji wirusów oraz nowotworów, wymagana jest szczegółowa wiedza na temat struktury RNA1,2. Niestety, dokładne przewidywanie fałdowania RNA stanowi ogromne wyzwanie. Klasyczne środki sondujące obarczone są wieloma wadami, takimi jak toksyczność, niepełne pokrycie nukleotydów i/lub wydajność ograniczona do 100-150 nukleotydów na eksperyment. Algorytmy przewidywania struktury drugorzędowej bez wsparcia doświadczalnego są podobnie nieefektywne ze względu na niedokładności wynikające z niezdolności do skutecznego rozróżniania struktur o podobnej energii. Duże cząsteczki RNA są szczególnie oporne na metody wyznaczania struktury 3D, takie jak krystalografia rentgenowska i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), ze względu na ich elastyczność konformacyjną oraz konieczność zastosowania dużych ilości próbek o wysokiej czystości w tych technikach.
Wysokoprzepustowa metoda SHAPE rozwiązuje wiele z tych problemów, zapewniając efektywne i proste podejście do badania struktur dużych cząsteczek RNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Co więcej, odczynniki stosowane w SHAPE są bezpieczne, łatwe w obsłudze i, w przeciwieństwie do większości innych odczynników do sondowania chemicznego, reagują ze wszystkimi czterema rybonukleotydami. Odczynniki te mogą również przenikać przez błony komórkowe, co umożliwia badanie RNA w kontekście in vivo3. Metoda SHAPE, opracowana pierwotnie w laboratorium Weeksa4, była wykorzystywana do analizy szerokiej gamy RNA, czego najbardziej znaczącym przykładem jest wyznaczenie pełnej struktury drugorzędowej genomu RNA HIV-1 o długości ok. 9 kb5. Inne istotne osiągnięcia z zastosowaniem SHAPE obejmują wyjaśnienie struktur zakaźnych wiroidów6, ludzkich długich niekodujących RNA7, rybosomów drożdżowych8 oraz ryboszaczy9, a także identyfikację miejsc wiązania białek w RNA HIV-1 związanym z wirionami3. Choć oryginalna i wysokoprzepustowa odmiany protokołu SHAPE zostały opublikowane w innych opracowaniach10-12, niniejsza praca dostarcza szczegółowego opisu wyznaczania struktury drugorzędowej RNA za pomocą wysokoprzepustowego SHAPE z wykorzystaniem fluorescencyjnych oligonukleotydów, analizatora genetycznego Beckman Coulter CEQ 8000 oraz oprogramowania SHAPEfinder i RNAStructure (v5.3). Uwzględniono również niepublikowane wcześniej szczegóły techniczne oraz wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów.
Warianty metody SHAPE
Istotą metody SHAPE i jej odmian jest poddanie RNA w roztworze wodnym działaniu bezwodników elektrofilowych, które selektywnie acylują grupy 2'-hydroksylowe (2'-OH) rybozy, tworząc rozbudowane addukty w miejscach modyfikacji. Reakcja chemiczna ta służy do badania lokalnej dynamiki strukturalnej RNA, ponieważ nukleotydy jednoniciowe są bardziej podatne na przyjmowanie konformacji sprzyjających atakowi elektrofilowemu tych odczynników, podczas gdy nukleotydy sparowane lub ograniczone architektonicznie są mniej reaktywne lub całkowicie nieaktywne10. Miejsca tworzenia adduktów wykrywa się poprzez odwrotną transkrypcję inicjowaną z fluorescencyjnie lub radiologicznie znakowanych starterów, zhybrydyzowanych ze specyficznym miejscem na zmodyfikowanym RNA (reakcja wydłużania startera „(+)”). Gdy odwrotna transkryptaza (RT) nie jest w stanie przejść przez acylowane rybonukleotydy, powstaje pula produktów cDNA, których długości odpowiadają miejscom modyfikacji. Przeprowadza się również kontrolną reakcję wydłużania startera „(–)” z wykorzystaniem RNA, które nie było poddane działaniu odczynnika, aby można było odróżnić przedwczesne przerwanie syntezy DNA (t.j. „zatrzymania”) wynikające ze struktury RNA, niespecyficznych pęknięć nici RNA itp., od zatrzymań spowodowanych modyfikacją chemiczną. Na koniec dwie reakcje sekwencjonowania dideoksy, inicjowane z tych samych starterów, służą jako markery do skorelowania reaktywnych nukleotydów z sekwencją pierwotną RNA po elektroforezie.
W pierwotnej aplikacji metody SHAPE ten sam starter z końcowym znakowaniem 32P jest wykorzystywany w reakcjach (+), (-) oraz w dwóch reakcjach sekwencjonowania. Produkty tych reakcji są nakładane do sąsiednich studzienek żelu płytkowego z poliakryloamidem 5-8% i frakcjonowane za pomocą denaturującej elektroforezy żelowej w poliakryloamidzie (PAGE; Rysunek 1). Analiza ilościowa obrazów żelu uzyskanych za pomocą konwencjonalnej metody SHAPE może być przeprowadzona przy użyciu SAFA, półautomatycznego oprogramowania do analizy footprintingu13.
W przeciwieństwie do tego, wysokoprzepustowy SHAPE wykorzystuje startery znakowane fluorescencyjnie oraz zautomatyzowaną elektroforezę kapilarną. Konkretnie, dla każdego badanego regionu RNA należy zsyntetyzować lub zakupić zestaw czterech starterów DNA o wspólnej sekwencji, ale różnych fluorescencyjnych znakowaniach na końcu 5'. Te różnie znakowane oligonukleotydy służą do inicjacji dwóch reakcji SHAPE i dwóch reakcji sekwencjonowania, których produkty są łączone i następnie frakcjonowane/wykrywane za pomocą zautomatyzowanej elektroforezy kapilarnej (CE). Podczas gdy profil reaktywności 100-150 nt RNA można uzyskać z zestawu czterech reakcji przy użyciu pierwotnego podejścia, wysokoprzepustowy SHAPE umożliwia rozdzielenie 300-600 nt z jednej połączonej próbki3. Jednocześnie można frakcjonować do 8 zestawów reakcji, natomiast w ciągu 12 następujących po sobie przebiegów CE można przygotować do frakcjonowania nawet 96 próbek (Rysunek 2). Co więcej, oprogramowanie SHAPEfinder, opracowane do przetwarzania i analizy danych pochodzących z analizatorów CEQ i innych analizatorów genetycznych, jest bardziej zautomatyzowane i wymaga znacznie mniejszej interwencji użytkownika niż SAFA13 lub inne pakiety do analizy żelowej.
W ostatnim czasie pojawiły się bardziej zaawansowane metodologie wysokoprzepustowe, takie jak PARS (równoległa analiza struktury RNA)14 oraz Frag-Seq (sekwencjonowanie fragmentów)15, które zamiast odczynników alkilujących wykorzystują enzymy specyficzne dla struktury w połączeniu z technikami sekwencjonowania następnej generacji w celu uzyskania informacji o strukturze RNA. Pomimo atrakcyjności tych technik, wciąż istnieją liczne ograniczenia właściwe dla sondowania nukleazami16. Problemy te można obejść w protokole sekwencjonowania SHAPE (SHAPE-Seq)17, w którym sekwencjonowaniu następnej generacji poprzedza modyfikacja chemiczna i odwrotna transkrypcja RNA w sposób podobny do tego, który stosuje się w konwencjonalnym SHAPE. Chociaż metody te mogą stanowić przyszłość wyznaczania struktury RNA, należy pamiętać, że sekwencjonowanie następnej generacji jest bardzo kosztowne i pozostaje niedostępne dla wielu laboratoriów.
Analiza danych SHAPE
Dane uzyskane w analizatorze genetycznym są przedstawione w formie elektroferogramu, w którym intensywność fluorescencji próbki lub próbek przepływających przez detektor kapilarny jest wykreślona w funkcji czasu migracji. Wykres ten przyjmuje postać nakładających się śladów odpowiadających czterem kanałom fluorescencji wykorzystywanym do wykrywania różnych fluoroforów, gdzie każdy ślad składa się z pików odpowiadających poszczególnym produktom cDNA lub produktom sekwencjonowania. Dane z elektroferogramu są eksportowane z analizatora genetycznego jako plik tekstowy z separatorami tabulatorami, a następnie importowane do oprogramowania do transformacji i analizy ShapeFinder18.
Oprogramowanie ShapeFinder jest początkowo wykorzystywane do przeprowadzenia serii transformacji matematycznych na danych, aby zapewnić, że czasy migracji i objętości pików dokładnie odzwierciedlają odpowiednio tożsamość oraz ilość produktów reakcji. Następnie piki są dopasowywane i całkowane, a wyniki zestawione w tabeli wraz z pierwotną sekwencją RNA. „Profil reaktywności” dla odpowiedniego segmentu RNA uzyskuje się poprzez odjęcie wartości kontrolnych od wartości (+), powiązanych z każdym nukleotydem RNA, oraz normalizację danych zgodnie z opisem poniżej. Profil ten jest importowany do oprogramowania RNAstructure (v5.3)19,20, które przekształca znormalizowane wartości reaktywności w pseudo-ograniczenia energetyczne, włączane do algorytmu zwijania drugorzędowej struktury RNA. Połączenie sondowania chemicznego z algorytmami zwijania w ten sposób znacząco poprawia dokładność przewidywania struktury w porównaniu do stosowania każdej z tych metod z osobna12,21. Wynik działania programu RNAstructure (v5.3) obejmuje obrazy drugorzędowych struktur RNA o najniższej energii, zakodowane kolorystycznie zgodnie z profilem(ami) reaktywności SHAPE, a także te same struktury zapisane w tekstowej notacji kropka-nawias (dot-bracket notation). Te ostatnie mogą być następnie eksportowane do oprogramowania przeznaczonego do graficznej prezentacji drugorzędowej struktury RNA, takiego jak Varna22 i PseudoViewer23.
<img alt="Schemat analizy struktury RNA; transkrypcja in vitro, analiza żelowa, wysokoprzepustowa metoda SHAPE." fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat blokowy wyznaczania struktury RNA za pomocą metody SHAPE4,10. (A) RNA może zostać pozyskane z próbek biologicznych lub poprzez transkrypcję in vitro. (B) W zależności od źródła, RNA jest fałdowane lub w inny sposób przetwarzane, a następnie modyfikowane odczynnikiem SHAPE. (C) Odwrotna transkrypcja z wykorzystaniem starterów znakowanych fluorescencyjnie lub radioaktywnie. (D) Produkty cDNA są frakcjonowane za pomocą elektroforezy kapilarnej lub żelowej na płytkach. (E) Analiza fragmentów. (F) Przewidywanie struktury RNA. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.</a>
<img alt="Schematyczny rysunek struktury RNA; obejmuje strukturę drugorzędową i układ mikromacierzy do analizy." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wysokoprzepustowy charakter metody SHAPE opartej na CE pozwala na szybką analizę wielu cząsteczek RNA i/lub wielu segmentów tej samej cząsteczki RNA. (A) Przedstawia sposób podziału RNA na sekcje o długości 300-600 nt (oznaczone kolorami zielonym, niebieskim i czerwonym) (B) Sekcje RNA są badane niezależnie przy użyciu różnych zestawów starterów fluorescencyjnych (czarne strzałki) (C) Zestawy reakcji są łączone i naniesione odpowiednio do studni A1, B1, C1 itd, zapewniając pełne pokrycie dla RNA1 o długości ~3 kb. Produkty reakcji z RNA 2, 3, 4 itd. mogą być przygotowane w podobny sposób do frakcjonowania w kolejnych przebiegach elektroforetycznych. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.</a>

<table><tr><tbody><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>N-bezwodnik metylosiatoowy (NMIA)</td><td>Technologie życia</td><td>M25</td><td>Rozpuszczają się w bezwodnym bezwodniku</td></tr><tr><td>DMSO 1-metylo-t-nitroizatoowym (1M7)</td><td>patrz ref. 22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny III Technologie odwrotnej transkryptazy</td><td>życiowej</td><td>18080044</td><td>10 000 jednostek</td></tr><tr><td>Zestaw do sekwencjonowania cyklu termosekwencjonazy</td><td>Affymetrix</td><td>78500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiały dostarczone przez użytkownika</td></tr><tr><td>RNA interesujące</td><td></td><td></td><td>6 pmol na reakcję (granica wykrywalności zostanie określona przez urządzenie)</td></tr><tr><td>Zestawy czterech starterów znakowanych 5' (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 i WellRed D1/Licor IR800)</td><td></td><td></td><td>Startery są komplementarne do RNA i są stosowane w reakcjach odwrotnej transkrypcji i sekwencjonowania. Wymienione fluorofory są optymalne dla Beckman Coulter 8000 CEQ. Podkłady można kupić lub zsyntetyzować we własnym zakresie.</td></tr><tr><td>Matryca</td><td></td><td></td> DNA <td>DNA jest używana do reakcji sekwencjonowania i musi zawierać sekwencję badanego RNA - w tym wszelkie 3'końcowe przedłużenie, jeśli jest obecne. W stosownych przypadkach często wygodnie jest użyć szablonu transkrypcji RNA.</td></tr><tr><td colspan="4"><silne></td></tr><tr><td>10x Bufor</td><td></td><td></td> renaturacyjny RNA <td>100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5X Bufor</td><td></td><td></td> składany RNA <td>200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Ten bufor może być zmieniany w zależności od przypadku (np. pH, Inhibitor EDTA, Mg, RNazy)</td></tr> <tr><td>2,5X RT mieszanina</td><td></td><td></td><td>4 &mu; l Bufor 5X, 1 i mu; l 100 mM naziemna telewizja cyfrowa, 1,5 i mu; l woda,1 &mu; l 10 mM dNTP, 0,5 i mu; l Indeks górny III. Należy pamiętać, że bufor 5X i 100 mM DTT są dostarczane z zakupem SuperScript III (Invitrogen).</td></tr><tr><td>Roztwór do ładowania próbek GenomeLab (Beckman Coulter)</td><td></td><td></td><td><silny>Uwaga:</silny> Unikaj wielu cykli zamrażania i rozmrażania</td></tr><td colspan="4"><silny>SPRZĘT</silny>Elektroforeza kapilarna Beckman CEQ8000 Thermocycler różni się <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przewidywanie struktury drugorzędowej rna przy użyciu wysokoprzepustowego shape

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Zrozumienie funkcji RNA biorącego udział w procesach biologicznych wymaga gruntownej znajomości struktury RNA. W tym celu metodologia nazwana "wysokoprzepustową selektywną acylacją hydroksylową 2' analizowaną przez wydłużenie startera" (SHAPE) umożliwia przewidywanie struktury drugorzędowej RNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Podejście to wykorzystuje chemiczne środki sondujące, które preferencyjnie acylują jednoniciowe lub elastyczne regiony RNA w roztworze wodnym. Miejsca modyfikacji chemicznej są wykrywane przez odwrotną transkrypcję zmodyfikowanego RNA, a produkty tej reakcji są frakcjonowane przez automatyczną elektroforezę kapilarną (CE). Ponieważ odwrotna transkryptaza zatrzymuje się na tych nukleotydach RNA zmodyfikowanych przez odczynniki SHAPE, powstała biblioteka cDNA pośrednio mapuje te rybonukleotydy, które są jednoniciowe w kontekście złożonego RNA. Za pomocą oprogramowania ShapeFinder elektroferogramy wytworzone przez zautomatyzowane CE są przetwarzane i przekształcane w tabele reaktywności nukleotydów, które z kolei są przekształcane w pseudoograniczenia energetyczne używane w algorytmie przewidywania RNAStructure (v5.3). Dwuwymiarowe struktury RNA uzyskane przez połączenie sondowania SHAPE z przewidywaniem struktury drugorzędowej RNA in silico okazały się znacznie dokładniejsze niż struktury uzyskane przy użyciu którejkolwiek z tych metod osobno.

RNA zawierające element odpowiedzi rev (RRE) HIV-1 oraz kasetę strukturalną końcową 3'4 przygotowano z liniowego plazmidu poprzez transkrypcję in vitro, po czym poddano go fałdowaniu poprzez ogrzewanie, chłodzenie i inkubację w 37 °C w obecności MgCl2. RNA poddano działaniu NMIA, a następnie przeprowadziono odwrotną transkrypcję przy użyciu znakowanego z końca 5' primera DNA zhybrydyzowanego z kasetą strukturalną końcową 3'. Powstałą bibliotekę cDNA SHAPE, wraz z reakcjami kontrolnymi i sek...

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przewidywanie struktury drugorzędowej RNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Osiąga się to poprzez wstępną modyfikację chemiczną sfałdowanego RNA za pomocą odczynnika elektrofilowego, który izoluje jednoniciowe lub elastyczne regiony RNA. Drugim krokiem jest zastosowanie odwrotnej transkrypcji w celu wykrycia miejsc w RNA, które zostały zmodyfikowane chemicznie.Następnie produkty odwrotnej transkrypcji CD NA są frakcjonowane za pomocą elektroforezy kapilarnej. Końcowym etapem jest przetwarzanie i normalizacja danych. Ostatecznie, z wykorzystaniem oprogramowania do analizy struktury RNA, przewiduje się drugorzędową strukturę RNA, stosując ograniczenia pseudowolnej energii wynikające z analizy shape.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej, takie jak wpływ struktury RNA na funkcje RNA katalitycznych i niekodujących oraz sposób, w jaki wirusowe genomy RNA regulują wielofunkcyjność swoich genomów. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię i diagnostykę chorób wirusowych lub nowotworów, ponieważ uzyskanie wglądu w strukturę drugorzędową RNA może wspomóc projektowanie leków opartych na

rna-secondary-structure-prediction-using-high-throughput-shape

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przewidywanie wtórnej struktury RNA przy użyciu SHAPE o wysokiej wydajności

Opisano wytyczne dotyczące komputerowej charakterystyki strukturalnej i funkcjonalnej białka z wykorzystaniem potoku I-TASSER. Wychodząc od sekwencji białka zapytania, generowane są modele 3D przy użyciu wielokrotnych dopasowań wątkowych oraz iteracyjnych symulacji montażu strukturalnego. Następnie wyciągane są wnioski funkcjonalne na podstawie dopasowań do białek o znanej strukturze i funkcjach.

Protokół komputerowego przewidywania struktury i funkcji białek

Baza danych ITS2 to środowisko pracy służące do wnioskowania filogenetycznego z jednoczesnym uwzględnieniem sekwencji i struktury drugorzędowej wewnętrznego transkrybowanego odstępnika 2. Obejmuje ona gromadzenie danych z dokładną adnotacją, przewidywanie struktury, wielokrotne dopasowanie sekwencji i struktur oraz szybkie obliczanie drzew. W skrócie, to narzędzie sprowadza wstępne analizy filogenetyczne do kilku kliknięć.

Baza danych ITS2

Pakiet oprogramowania 3DNA jest popularnym i wszechstronnym narzędziem bioinformatycznym umożliwiającym analizę, konstrukcję i wizualizację trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły dla wybranych nowych i popularnych funkcji dostępnych w 3DNA, które można zastosować zarówno do pojedynczych struktur, jak i zespołów struktur powiązanych.

Analiza i budowanie struktur kwasów nukleinowych przy użyciu programu 3DNA

Opracowaliśmy obliczeniowe metody projektowania białek de novo, które są w stanie zająć się kilkoma ważnymi obszarami projektowania białek. Aby rozpowszechnić te metody, prezentujemy Protein WISDOM, internetowe narzędzie do projektowania białek (http://www.proteinwisdom.org). Zaczynając od szablonu strukturalnego, można zaprojektować białka monomeryczne w celu zwiększenia stabilności i kompleksów w celu zwiększenia powinowactwa wiązania.

Protein WISDOM: Stół warsztatowy do projektowania in silico de novo biomolekuł

Ten artykuł opisuje tworzenie wysoce uporządkowanych struktur opartych na peptydach poprzez spontaniczny proces samoorganizacji. Metoda wykorzystuje dostępne na rynku peptydy i powszechnie stosowany sprzęt laboratoryjny. Technika ta może być stosowana do wielu różnych peptydów i może prowadzić do odkrycia nowych zespołów opartych na peptydach.

Tworzenie uporządkowanych struktur biomolekularnych przez samoorganizację krótkich peptydów

Kafelkowanie DNA jest skutecznym podejściem do tworzenia programowalnych nanostruktur. Opisujemy protokoły konstruowania złożonych dwuwymiarowych kształtów poprzez samoorganizację jednoniciowych płytek DNA.

Samoorganizacja złożonych dwuwymiarowych kształtów z jednoniciowych płytek DNA

Opisujemy strukturę obejmującą prostą analizę biochemiczną i obliczeniową, aby kierować charakterystyką i krystalizacją dużych domen o zwiniętych zwojach. Struktura ta może być dostosowana do białek globularnych lub rozszerzona w celu uwzględnienia różnych technik wysokoprzepustowych.

Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Szczegółowe protokoły zarówno in vitro, jak i selektywnej acylacji 2'-hydroksylowej w komórce, analizowane za pomocą eksperymentów z rozszerzaniem starterów (SHAPE) w celu określenia drugorzędowej struktury sekwencji pre-mRNA interesujących w obecności małej cząsteczki ukierunkowanej na RNA, są przedstawione w tym artykule.

Wykorzystanie in vitro i in-cell SHAPE do badania zmian strukturalnych pre-mRNA wywołanych małymi cząsteczkami

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Projektowanie białek polega na budowie sekwencji aminokwasów i włączaniu określonych motywów w celu stworzenia funkcjonalnych wariantów. Takie podejście ma kluczowe znaczenie dla opracowania peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) do zwalczania patogenów opornych na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę budowy białek z wykorzystaniem różnych narzędzi bioinformatycznych.

Zastosowanie I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, serwera HADDOCK i lorii HEX do projektowania białek De Novo i In Silico

Poznaj metodę SHAPE do przewidywania struktury drugorzędowej RNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Technika łączy modyfikację chemiczną, odwrotną transkrypcję i elektroforezę kapilarną.

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

Przeglądaj więcej filmów