Name: Oddzielenie embrionalnej ektodermy twarzy myszy i mezenchymy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Naucz się oddzielać ektodermę twarzy i mezenchym u embrionów myszy CD-1 E10.5 przy użyciu Dispase II. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju twarzy i molekularnej komunikacji między tkankami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Irene Choi za zilustrowanie głów embrionów na Ryc. 1 oraz innym członkom laboratorium za pomoc i dyskusję. Ta praca jest wspierana przez grant NIH DE012728 (T.W.)

1. Przygotuj Dispase II
<ol>
	<li>Przygotuj świeżą sól fizjologiczną buforowaną przez Hepes (HBS) (50 mM Hepes/KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Dodać 2 ml 0,5 M Hepes/KOH pH 7,4 i 1,2 ml 2,5 M NaCl do 16,8 ml UltrapureH2O.</li>
	<li>Zrobić 10 mg/ml Dypaza II. Odważyć 0,2 g Dispase II (Roche, Cat# 4942078001) i rozpuścić w 20 ml HBS. Przygotować 1,0 ml porcji w oddzielnych probówkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Rozcieńczyć 10 mg/ml Dispase II w stosunku 1:10 w PBS przed użyciem. Rozcieńczoną Pipezę II umieścić na lodzie.</li>
</ol>
2. Sekcja zarodków CD-1 E10.5 od ciężarnej kobiety
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Kolorado w Denver (UCD). Myszy CD-1 (ICR) uzyskano z Harlan Laboratories (Indianapolis, IN).
<ol>
	<li>Oczyść obszar sekcji i narzędzia 70% etanolem.</li>
	<li>Eutanazja ciężarnej samicy CD-1 przy użyciu zatwierdzonych protokołów.</li>
	<li>Spryskaj brzuch 70% etanolem, a następnie otwórz brzuch. Użyj jednego zestawu kleszczy, aby wyciągnąć macicę, a drugiego, aby oderwać mezometrium od macicy. Usuń macicę z ciała. Powtórz dla rogu macicy po drugiej stronie brzucha.</li>
	<li>Krótko przepłucz macicę lodowatym PBS na 10-centymetrowej szalce Petriego, aby wypłukać krew.</li>
	<li>Przenieś macicę na nową szalkę Petriego z lodowatym PBS. Rozdzielać na jednozarodkowe fragmenty poprzez cięcie między miejscami implantacji.</li>
	<li>Przenieś jeden zarodek do lodowatego PBS pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj cienkich kleszczy, aby oderwać mięśniową ścianę macicy, zaczynając od jednego z miejsc cięcia, aby odsłonić zarodek z woreczkiem żółtkowym. Oderwij woreczek żółtkowy i owodnię. Przenieść wypreparowany zarodek na 6-centymetrową szalkę Petriego z PBS na lodzie. Kontynuuj, aż wszystkie zarodki zostaną zebrane w ten sposób.</li>
</ol>
3. Leczenie Dispase II
<ol>
	<li>Umyj wszystkie zarodki za pomocą PBS na 6-centymetrowej szalce Petriego. Zastąp PBS 10 ml rozcieńczonej dypazy II w PBS. Przykryć szalkę Petriego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 25 minut - powinien wystarczyć inkubator bakteryjny lub ciepłe pomieszczenie - do tego etapu nie użyliśmy inkubatora do hodowli tkankowychCO2</li>.
	<li>Wyjmij szalkę Petriego i obserwuj zarodek pod mikroskopem stereoskopowym. Ektoderma powinna była się poluzować, co charakteryzuje się wyraźną szczeliną między tą warstwą tkanki a leżącą pod nią mezenchymią. W przeciwnym razie inkubować przez dodatkowe 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie połóż szalkę Petriego na lodzie.</li>
</ol>
4. Rozwiń nienaruszone wypukłości twarzy
<ol>
	<li>Za pomocą jednorazowej szklanej pipety (VWR, kat. # 14672-380) przenieść jeden zarodek poddany działaniu Dispase II do lodowatego PBS na 6-centymetrowej szalce Petriego pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Użyj jednej pary kleszczy do przytrzymania zarodka. Użyj ostrożnie innej pary cienkich kleszczy, aby przeciąć granice wypukłości twarzy przymocowanych do głowy (ryc. 1 pokazuje granice wypukłości twarzy). Zacznij od jednej strony MnP, następnie MxP, a na końcu FNP. Zrób to samo z drugą stroną, aby wyciąć wypukłości twarzy w stanie nienaruszonym (ryc. 2A).</li>
</ol>
5. Oddziel ektodermę twarzy od mezenchymy
<ol>
	<li>Obserwuj protuberancje twarzy pod mikroskopem stereoskopowym z 3-krotną odległością roboczą. Użyj długiej szklanej pipety Pasteura, aby delikatnie odpipetować wypukłości twarzy w górę iw dół 5 razy. Następnie ektodermę można łatwo odkleić.</li>
	<li>Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać wypukłości twarzy. Użyj drugiej pary kleszczy, aby bardzo powoli odkleić ektodermę. Rycina 2B przedstawia oddzielone arkusze ektodermy twarzy.</li>
	<li>Użyj nowej długiej szklanej pipety Pasteura, aby przenieść ektodermę twarzy do 1,5 ml probówki Eppendorfa z PBS na lodzie. Przenieść mezenchymę do innej 1,5 ml probówki Eppendorfa z PBS na lodzie.</li>
	<li>Użyj nowego lodowatego PBS do każdej sekcji. Zbierz próbki.</li>
	<li>Przemyć próbki PBS. Wirować w temperaturze 4 °C, 500 x g przez 3 min.</li>
	<li>Zassać PBS za pomocą długich szklanych pipet Pasteura. Jeśli próbki mają być użyte do testu ChIP, przejdź do kroku 6.1. W przypadku ekstrakcji RNA przejdź do kroku 6.2. W przypadku ekstrakcji białka przejdź do kroku 6.3.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie próbek do dalszych eksperymentów
<ol>
	<li>Próbki do testu ChIP
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml PBS z 1% formaldehydem do sieciowania. Homogenizować próbki.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut z rotacją.</li>
		<li>Dodaj 110 μl 1,25 M glicyny do każdej probówki, aby ugasić nieprzereagowany formaldehyd.</li>
		<li>Wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 500 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Dodaj 1 ml zimnego PBS, aby umyć chusteczki.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 500 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min.</li>
		<li>Usuń PBS i powtórz mycie PBS raz.</li>
		<li>Usuń supernatant, Snap zamroź tkanki w ciekłym azocie. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C w celu późniejszego łączenia i przetwarzania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki do ekstrakcji RNA
	<ol>
		<li>Umieść ektodermę twarzy i mezenchymę w probówkach zawierających RNAlater (Ambion).</li>
		<li>Próbki należy inkubować w późniejszym roztworze RNAlater przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić dokładną penetrację tkanki.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszego łączenia i przetwarzania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki do ekstrakcji białek</li>
</ol>
Dodaj bufor do lizy do próbki w celu późniejszego przetwarzania. Lub zatrzaskowo zamroź tkanki w ciekłym azocie. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C w celu późniejszego łączenia i przetwarzania.
Uwagi
<ol>
	<li>Ograniczenia czasowe. Zaplanuj 4-6 godzin od rozpoczęcia sekcji do początku sekcji 6.</li>
	<li>Gdy jesteś biegły, wykonanie sekcji 4 i 5 zajmuje ~10-15 minut na zarodek (rozwarstwienie protuberancji i separacja ektodermy).</li>
	<li>Jeśli próbki mają być przeznaczone do izolacji RNA, każdy roztwór należy najpierw potraktować dietylopirowęglanem. Wyczyść również kleszcze i obszar roboczy za pomocą RNase Away.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem poddania je działaniu produktu Dispase II i sekcji zwłok. Zmień na nowy lodowaty PBS dla każdej sekcji, aby upewnić się, że PBS używany do sekcji jest zimny.</li>
	<li>Ostre kleszcze mają kluczowe znaczenie dla uzyskania precyzyjnego cięcia. Całkowicie wyczyść kleszcze, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
	<li>W celu pobrania próbek z różnych protuberancji, należy rozciąć każdą protuberancję oddzielnie po poddaniu działaniu Dispase II. Następnie oddziel ektodermę i mezenchymę.</li>
	<li>Po kuracji preparatem Dispase II ektoderma twarzy jest łatwa do odklejenia. Należy zwrócić szczególną uwagę na zanieczyszczenia innymi ektodermami. Wyrzuć wszystkie potencjalnie zanieczyszczone tkanki.</li>
	<li>Po rozpoczęciu nie przestawaj, dopóki próbki nie osiągną odpowiedniego punktu w sekcji 6. Zakończ oddzielanie ektodermy twarzy i mezenchymy dla wszystkich zarodków tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Aktywność enzymatyczna leku Dispase II może się różnić w zależności od partii i marki. Konieczne jest dostosowanie czasu leczenia dla różnych marek i partii leku Dispase II.</li>
</ol>

<ol><li>Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+craniofacial+development+and+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of craniofacial development and malformation.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).</li>
<li>Gritli-Linde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2+-+The+Etiopathogenesis+of+cleft+lip+and+cleft+palate%3A+usefulness+and+caveats+of+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.</a> Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).</li>
<li>Schutte, B. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+and+factors+of+orofacial+clefts%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">The many faces and factors of orofacial clefts.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).</li>
<li>Chai, Y., Maxson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+craniofacial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Recent advances in craniofacial morphogenesis.</a> Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).</li>
<li>Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+upper+lip%3A+Morphogenetic+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms.</a> Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).</li>
<li>Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectodermal+WNT%2F%CE%B2-catenin+signaling+shapes+the+mouse+face%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face.</a> Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+analysis+of+gene+expression+during+growth+and+fusion+of+the+mouse+facial+prominences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences.</a> PLoS ONE. 4, e8066(2009).</li>
<li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).</li>
<li>Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+the+mouse+Zic1%2C+Zic2%2C+and+Zic3+gene+suggests+an+essential+role+for+Zic+genes+in+body+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation.</a> Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).</li>
<li>Britsch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Sox10+is+a+key+regulator+of+peripheral+glial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development.</a> Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów ani innych konfliktów związanych z treścią tego artykułu.

Protokół ten zapewnia prostą metodę oddzielania embrionalnej ektodermy twarzy myszy i mezenchymy w oparciu o początkowy etap leczenia Dispase II. W poprzednich badaniach przeprowadziliśmy sekcję wypukłości twarzy przed zabiegiem Dispase II, ale konsekwentnie stwierdzaliśmy, że mezenchyma staje się "lepka" i trudniejsza do manipulowania. Nasz nowy protokół pozwala uniknąć tego problemu. Skojarzone leczenie Dispase II z delikatną siłą fizyczną poprzez pipetowanie w górę i w dół ułatwia oddzielenie ektodermy i mezenchymy. C...

<table><tbody><tr><td>Dyspaza II (proteaza obojętna, stopień II)</td> <td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego Dyspazy II w HBS. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & C . </td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td></td></tr></tbody></table>

oddzielenie embrionalnej ektodermy twarzy myszy i mezenchymy

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Szczeliny ustno-twarzowe są najczęstszymi wadami twarzoczaszki, które dotykają 1,5 na 1000 noworodków na całym świecie1,2. Rozszczep jamy ustnej twarzy jest spowodowany nieprawidłowym rozwojem twarzy3. U ludzi i myszy początkowy wzrost i wzór twarzy opiera się na kilku małych zawiązkach tkanki, wypukłości twarzy4,5. Twarz wywodzi się z sześciu głównych protuberancji: parzystych wyrostków czołowych nosowych (FNP), protuberancji szczękowych (MxP) i protuberancji żuchwy (MdP). Te protuberancje składają się z obrzęków mezenchymy, które są otoczone leżącym nad nimi nabłonkiem. Badania na wielu gatunkach wykazały, że przesłuch sygnalizacyjny między ektodermą twarzy a mezenchymą ma kluczowe znaczenie dla kształtowania twarzy6. Brakuje jednak mechanistycznych szczegółów dotyczących genów zaangażowanych w te przekaźniki sygnalizacyjne. Jednym ze sposobów na uzyskanie kompleksowego zrozumienia ekspresji genów, wiązania czynników transkrypcyjnych i znaczników chromatyny związanych z rozwijającą się ektodermą twarzy i mezenchymą jest wyizolowanie i scharakteryzowanie oddzielonych przedziałów tkankowych.
Tutaj prezentujemy metodę oddzielania ektodermy twarzy od mezenchymy w dniu embrionalnym (E) 10.5, krytycznym etapie rozwoju w tworzeniu się twarzy myszy, który poprzedza fuzję protuberancji. Nasza metoda jest zaadaptowana z podejścia, które wcześniej stosowaliśmy do preparowania wypukłości twarzy7. W tym wcześniejszym badaniu wykorzystaliśmy myszy wsobne C57BL/6, ponieważ szczep ten stał się standardem w genetyce, genomice i morfologii twarzy8. W tym przypadku jednak, ze względu na bardziej ograniczoną ilość dostępnych tkanek, wykorzystaliśmy niekrewny szczep CD-1, który jest tańszy w zakupie, bardziej wytrzymały w hodowli i ma tendencję do produkcji większej liczby zarodków (12-18) na miot niż jakikolwiek wsobny szczep myszy8. Po wyizolowaniu zarodka do leczenia całego zarodka zastosowano neutralną proteazę Dispase II. Następnie wypreparowano wypukłości twarzy i oddzielono ektodermę twarzy od mezenchymy. Ta metoda utrzymuje zarówno ektodermę twarzy, jak i mezenchymę w stanie nienaruszonym. Próbki uzyskane przy użyciu tej metodologii mogą być wykorzystane do technik takich jak wykrywanie białek, test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), badania mikromacierzy i sekwencjonowanie RNA.

Po traktowaniu Dispase II ektoderm zarodka wykazuje tendencję do rozluźniania. Wyrostki twarzy powinny pozostać nienaruszone po sekcji (Rysunek 2A). Izolowana ektoderm twarzy jest przejrzysta i wolna od tkanki mezenchymy (Rysunek 2B). Aby określić skuteczność protokołu i wykryć zanieczyszczenia krzyżowe, przeprowadzono analizę ekspresji Zic39 (wyrażanego w przedmózgowiu), specyficznego dla ektodermy cdh15 oraz specyficznego dla mezenchymy sox1010 przy uży...

Opisano protokół separacji ektodermy twarzy i mezenchymy zarodka. Używamy Dispase II do leczenia najpierw całych zarodków, następnie wycinamy całe wypukłości twarzy, a następnie oddzielamy ektodermę twarzy i mezenchymę.

Oddzielenie embrionalnej ektodermy twarzy myszy i mezenchymy

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie embrionów myszy, ektodermy twarzy i mechów. Osiąga się to poprzez wyizolowanie najpierw zarodków CD 1 E 10,5. Drugim etapem zabiegu jest leczenie całych zarodków za pomocą dys.Faza druga. Po zabiegu enzymatycznym wypukłości twarzy są izolowane, a ostatnim krokiem jest ostrożne oddzielenie skóry właściwej twarzy od mezenchymy. Wyizolowana skóra właściwa twarzy i mezenchyma są następnie gotowe do dalszych eksperymentów.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak leczenie dys space w przypadku wypreparowanej wypukłości twarzy, jest to, że leczenie całego zarodka przestrzenią DYS utrzymuje zarówno incydent twarzy, jak i nienaruszony. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju ssaków, takie jak to, w jaki sposób różnicowa ekspresja genów, modyfikacja epigenetyczna i wiązanie czynników transkrypcyjnych mogą regulować przesłuchy molekularne między skórą właściwą twarzy a mezenchymą. Podczas embriogenezy Zaplanuj od czterech do sześciu godzin od teraz do izolacji tkanek, oczyść obszar sekcji i narzędzia z 70% etanolu.A jeśli próbki są przeznaczone do izolacji RNA, użyj RNA

separation-of-mouse-embryonic-facial-ectoderm-and-mesenchyme

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oddzielenie ektoderma twarzoowego i mezenchymu zarodkowego myszy

Izolacja embrionów w stadium poimplantacyjnym umożliwia badanie wzorców ekspresji genów oraz analizę procesów podejmowania decyzji dotyczących linii komórkowych podczas rozwoju embrionalnego, jednak prawidłowa dysekcja wczesnego embrionu może być trudna. Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji wczesnych embrionów w stadium prążka pierwotnego (~6,5 days post coitum [dpc]).

Disekcja embrionów myszy w 6,5 dniu po zapłodnieniu (dpc)

W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która została opracowana w celu zbadania właściwości sygnalizacyjnych i wzorowania powierzchniowego ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.

Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonków ektodermalnych podczas rozwoju kraniofacjalnego

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Neurony embrionalne rodzą się w strefie komorowej cewy nerwowej, ale migrują, aby dotrzeć do odpowiednich celów. Neurony skrzelomotoryczne twarzy (FBM) są użytecznym modelem do badania migracji neuronów. Protokół ten opisuje całą hodowlę ex vivo zarodków myszy w tyłomózgowiu w celu zbadania mechanizmów regulujących migrację FBM.

Hodowla ex-vivo tyłomózgowia myszy w celu zbadania migracji neuronów skrzelowo-ruchowych twarzy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z różnymi fluorescencyjnymi liniami myszy reporterowych oraz z inhibitorami szlaków w celu uzyskania wglądu mechanistycznego. Protokół ten może być zaadaptowany do obrazowania na żywo w innych systemach rozwojowych.

Obrazowanie na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszki z modeli mysich, głównie do badania migracji komórek. Opisujemy stosowane techniki obrazowania na żywo oraz analizę zmian prędkości i kształtu komórek.

Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego

Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy do obrazowania poklatkowego dwuwymiarowego (2D) wzrostu i gojenia ran. Udostępniamy również metodologię analizy danych z obrazowania poklatkowego w celu określenia powstawania strumienia komórkowego i ruchliwości kierunkowej.

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Opracowaliśmy uogólniony protokół do dysocjacji dużej ilości wysokiej jakości pojedynczych komórek z nabłonka i mezenchymy/tkanki łącznej embrionalnych i dorosłych języków myszy.

Dysocjacja komórek z nabłonka języka i mezenchymy/tkanki łącznej myszy w wieku 12,5 dnia zarodkowego i 8 tygodni

Protokół przedstawia metodę izolowania lizatów białkowych całych komórek z wypreparowanych procesów twarzy zarodków myszy lub hodowanych mysich embrionalnych komórek mezenchymy zarodkowej i przeprowadzania następnie western blot w celu oceny poziomu fosforylowanego białka.

Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein

Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do utrwalania, barwienia immunologicznego i sekcji zarodków w celu wykrycia wyspecjalizowanych filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami w rozwijających się tkankach myszy.

Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Naucz się oddzielać ektodermę twarzy i mezenchym u embrionów myszy CD-1 E10.5 przy użyciu Dispase II. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju twarzy i molekularnej komunikacji między tkankami.

Oddzielenie embrionalnej ektodermy twarzy myszy i mezenchymy

Przeglądaj więcej filmów