Krótko- i długoterminowa aktywność ruchowa myszy analizowana przez oprogramowanie do śledzenia wideo
June 20th, 2013
Aktywność lokomotoryczna (LMA) to prosty i łatwy do wykonania pomiar zachowania u myszy. Sprzężenie oprogramowania do śledzenia wideo (VTS) i LMA pozwala na poprawę swoistości i czułości, zwłaszcza w porównaniu z ręczną metodą analizy LMA polegającą na przekraczaniu linii. Dodatkowo VTS umożliwia długoterminowe śledzenie LMA myszy.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie różnic w krótko- lub długoterminowej aktywności lokomotorycznej między różnymi grupami myszy leczonych eksperymentalnie. Osiąga się to poprzez nagrywanie wideo aktywności domowej klatki myszy w czasie rzeczywistym. W drugim kroku aktywność lokomotoryczna zwierzęcia jest analizowana w czasie rzeczywistym lub na podstawie nagrania za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.
Następnie ocenione parametry lokomotoryczne są importowane do oprogramowania wtórnego w celu analizy statystycznej. Procedura może zatem wyjaśnić wpływ leczenia lub schorzeń na krótko- i długoterminową aktywność lokomotoryczną w oparciu o oceniane parametry, takie jak przebyty dystans, prędkość ruchu i czas trwania ruchu. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak przekraczanie linii i implantacja emitera, jest to, że zapewnia dokładniejsze badanie aktywności lokomotorycznej myszy bez konieczności inwazyjnego i potencjalnie mylącego zabiegu chirurgicznego.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ ustawianie klatek i sprzętu w sposób, który zapewnia optymalną jakość obrazu dla późniejszego śledzenia wideo, może być żmudne i wymagać czasu na naukę. Krótkotrwała aktywność lokomotoryczna jest testowana w klatkach domowych izolowanych myszy z pościelą, która ma wysoki kontrast z kolorem kodu zwierzęcia. Przed eksperymentem zwierzęta muszą być zaaklimatyzowane do ściółki przez co najmniej 24 godziny.
Aby przygotować pomieszczenie testowe, zacznij od zamontowania kamery wideo z noktowizorem z co najmniej 120 gigabajtami pamięci nad obszarem nagrywania. W pomieszczeniu nie powinny słychać żadnych dźwięków otoczenia o natężeniu powyżej 70 decybeli. Jeśli nie da się uniknąć przerywanego szumu tła, użyj generatora białego szumu, aby zagłuszyć te dźwięki.
Ważne jest również, aby warunki środowiskowe w pomieszczeniu do przeprowadzania badań były podobne do normalnych warunków przetrzymywania zwierzęcia. Przed ustawieniem nowych obiektów wyczyść obszar nagrywania, a następnie przykryj powierzchnię papierem rzeźniczym lub laboratoryjnym o kolorze podobnym do ściółki klatki Następna pozycja, nieprzezroczyste przegrody klatki wykonane z półcalowego tworzywa sztucznego. Na powierzchni testowej przegrody muszą mieć podobny kolor do pościeli i być czyste.
Teraz przynieś myszy do obszaru testowego i umieść ich klatki między przegrodami. Aby ułatwić analizę, koszyki należy zawsze ustawiać w ten sam sposób. Do testu przykryj klatki przezroczystą pleksi o grubości ćwierć cala.
Pleksiglas potrzebuje co najmniej 11 ćwierć cala otworów, aby zapewnić odpowiednią wentylację. Następnie ustaw lampy zaciskowe wylęgu z czerwonymi żarówkami, aby oświetlić klatki. Teraz wyśrodkuj widok kamery na klatkach testowych, aby nie przekraczać możliwości systemu śledzenia wideo.
Ten system ogranicza się do śledzenia ośmiu myszy w czasie rzeczywistym. Teraz, patrząc na wyświetlacz kamery wideo, dostosuj kąt i położenie świateł, aby usunąć odblaski lub odbicia od blatów klatki z pleksiglasu. Uzyskanie czystego widoku myszy wolnego od jakichkolwiek artefaktów wizualnych jest najważniejszym krokiem do uzyskania dobrych wyników.
W każdej grupie należy zawsze uwzględniać zarówno osoby eksperymentalne, jak i kontrolne, aby zminimalizować potencjalne skutki różnic czasowych w LMA. Tuż przed badaniem usuń z klatek wszelkie materiały zagnieżdżające i wzbogacające, ponieważ mogą one zasłaniać widok myszy. W filmie rozpocznij nagrywanie od tablicy, która identyfikuje odpowiednie informacje eksperymentalne.
Aby zapewnić prawidłową identyfikację wideo, użyj timera na wyświetlaczu kamery, aby śledzić czas trwania testu i pozostawać poza zasięgiem wzroku zwierzęcia. W czasie nagrywania. Po zakończeniu testu włóż wszystkie materiały z powrotem do każdej klatki.
Jeżeli zwierzęta mają być ponownie badane, należy przywrócić im dostęp do pożywienia i wody między badaniami. Przechowuj nagrania wideo z sesji testowej na nośniku archiwalnym kompatybilnym z systemem śledzenia wideo, takim jak dysk twardy W systemie śledzenia wideo analizuj filmy w czasie rzeczywistym. Początkowo wybierz całą podłogę klatki jako obszar zainteresowania lub zwrot z inwestycji do śledzenia.
W przypadku zaawansowanych analiz, takich jak ocena podatków Figma, utwórz wiele zwrotów z inwestycji wewnątrz klatki dla badań o wysokiej przepustowości. Analizuj wszystkie klatki w filmie jednocześnie z indywidualnymi zwrotami z inwestycji we wszystkie podłogi klatki. Ustaw VTS tak, aby obliczał całkowitą odległość, poruszał się prędkość ruchów i czas trwania ruchów po wykonaniu obliczeń, wyeksportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego w celu przechowywania i dodatkowej analizy.
Testowanie długoterminowe jest wykonywane tak samo jak testowanie krótkoterminowe. Wymaga to jednak zmodyfikowanej klatki z nowym punktem dostępu do jedzenia i wody. Najpierw wytnij otwór o średnicy 5,5 centymetra w krótkiej ściance końcowej standardowej klatki.
Następnie wytnij półcalowe otwory w ćwierćcalowej ocynkowanej siatce stalowej i poleruj siatkę, aby usunąć ostre krawędzie za pomocą tej samej siatki, zbuduj zewnętrzny zbiornik na granulki żywności, które mogą połączyć się z siatką nad otworem. Następnie dodaj otwory na nity. Następnie zakryj otwór w klatce siatką i dołączonym lejem za pomocą aluminiowych nitów i podkładek ze stali nierdzewnej.
Aby zapewnić nawodnienie, zbuduj butelkę na wodę ze standardowego stożkowego o pojemności 50 mililitrów i gumowego korka z jednym otworem, który jest nadmiernie nawiercony. Aby umożliwić włożenie rurki bez kapania. Przymocuj tę butelkę z wodą do klatki.
Za pomocą taśmy rzepowej rurkę sipper należy włożyć przez otwór pokryty siatką. Teraz, gdy klatka jest przykryta pokrywą z pleksiglasu, myszy zachowują dostęp do jedzenia i wody, postępując zgodnie z tymi samymi procedurami, które opisano dla krótkoterminowego testu lokomotorycznego. Długoterminowy test trwa zwykle 12 godzin lub trwa przez czas trwania bieżącej fazy cyklu jasno-ciemnego.
Długoterminowe testy aktywności ruchowej są zazwyczaj analizowane w czasie rzeczywistym bez konieczności nagrywania wideo. Nagranie można jednak wykonać za pomocą dodatkowej kamery lub za pomocą nagrywarki DVD połączonej z główną kamerą. Myszy mogą być testowane, o ile możliwości systemu śledzenia wideo są w stanie sobie z tym poradzić, i podobnie jak w przypadku testów krótkoterminowych, z klatki usuwany jest tylko materiał wzbogacający oświetlenie gniazda, a nie kolba kukurydzy lub ściółka z trocin.
W VTS skonfiguruj system śledzenia wideo do analizy w czasie rzeczywistym. Ustaw zwrot z inwestycji w śledzenie tak, aby obejmował całe piętro dla każdej rejestrowanej klatki. Podobnie jak w przypadku testu krótkoterminowego, ustaw system tak, aby obliczał całkowitą odległość, przesuwał prędkość ruchu i czas trwania ruchu.
Następnie, po zakończeniu analizy, wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu przechowywania i analizy przy użyciu powtarzających się krótkoterminowych testów lokomotorycznych. Stwierdzono, że po wstrzyknięciu lipopolisacharydu myszy trzymane w indywidualnie wentylowanych klatkach lub IVC szybciej wracały do zdrowia po utracie krótkoterminowego LMA po wstrzyknięciu niż myszy trzymane w klatkach otoczenia lub EC. Podczas gdy początkowa utrata aktywności lokomotorycznej jest podobna między grupami, którym wstrzyknięto LPS, powrót do podstawowej aktywności lokomotorycznej jest szybszy. W IVC trzymano myszy, podobnie jak prędkość ruchów i czas trwania ruchów.
W tej analizie wykrycie ruchu o wartości dwóch centymetrów na sekundę rozpoczęło śledzenie, a śledzenie z prędkością 1,75 centymetra na sekundę zostało zatrzymane przy użyciu zmiennych wykrywania. Przeprowadzono mały test lokomocji w ciągu dwóch kolejnych 12-godzinnych cykli aktywności. U normalnych myszy nie stwierdzono znaczącej różnicy w przebytej odległości ani w prędkości ruchów lub czasie trwania ruchów.
Jeśli tendencja do braku mierzalnej różnicy, powtórzy się z dużą wielkością próby, dane sugerują, że test może być wykorzystany do zastąpienia wszczepionych nadajników używanych do długoterminowych testów lokomotorycznych. Próbując wykonać tę procedurę, należy zwrócić szczególną uwagę na warunki panujące w pomieszczeniach inwentarskich przed eksperymentem. Wszystkie zwierzęta doświadczalne i kontrolne powinny znajdować się w podobnych warunkach środowiskowych, szczególnie w odniesieniu do cyklu światła, temperatury pokojowej i wilgotności względnej.
Należy również zminimalizować ich narażenie na bodźce hałasowe i zapachowe Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak test czterech pływaków, można wykorzystać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy leczenie w danym eksperymencie powoduje zachowanie podobne do depresji bez wpływu na ogólną aktywność lokomotoryczną.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie koncentruje się na pomiarze aktywności lokomotorycznej (AL) u myszy z wykorzystaniem oprogramowania do śledzenia wideo (OSV). Integracja OSV poprawia specyficzność i czułość pomiarów AL w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Analiza zachowań
- Modele zwierzęce
Tło
- Aktywność lokomotoryczna jest kluczowym wskaźnikiem behawioralnym w badaniach neuronaukowych.
- Tradycyjne metody, takie jak przechodzenie przez linie, mogą być mniej czułe.
- Śledzenie wideo zapewnia nieinwazyjną alternatywę do monitorowania aktywności.
- Możliwość długotrwałego śledzenia umożliwia kompleksową analizę.
Cel badania
- Wykryć różnice w aktywności lokomotorycznej między grupami myszy poddanych leczeniu.
- Analizę zarówno krótko-, jak i długoterminowych wzorców aktywności.
- Ocenę wpływu różnych leczeń na zachowanie lokomotoryczne.
Zastosowane metody
- Rejestracja wideo w czasie rzeczywistym aktywności myszy w klatkce domowej.
- Analiza parametrów lokomotorycznych za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.
- Importowanie ocen parametrów do programu wtórnego do analizy statystycznej.
- Ocena przebytej odległości, prędkości i czasu trwania ruchu.
Główne wyniki
- Śledzenie wideo umożliwia szczegółową analizę aktywności lokomotorycznej.
- Metody nieinwazyjne dają bardziej wiarygodne dane w porównaniu z tradycyjnymi technikami.
- Analiza statystyczna ujawnia istotne różnice w aktywności w zależności od leczenia.
- Długotrwałą obserwację zapewnia wgląd w zmiany zachowań w czasie.
Wnioski
- Zastosowanie OSV poprawia rozumienie zachowań lokomotorycznych myszy.
- Ta metoda jest preferowana do badania wpływu leczeń na aktywność.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych znaleziskach, aby zgłębić dalsze wglądy w zachowania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Video tracking software (VTS) applied to locomotor activity (LMA) testing in mice provides a non-invasive, high-throughput method for quantifying movement parameters such as distance, velocity, and duration. This approach enhances predictive confidence in target validation by enabling real-time, longitudinal behavioral assessment without surgical implantation or anxiogenic stimuli. The method supports mechanistic de-risking in early discovery by offering quantitative, reproducible outputs that correlate with treatment effects on neural pathways governing motor function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to motor circuit function and neuromodulator activity through quantifiable LMA changes.
- Operational Value: Supports biological de-risking by detecting treatment-induced locomotor differences without confounding variables from invasive procedures.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying compounds that alter basal or stimulated locomotor activity, indicating on-target or off-target effects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated home-cage-based systems for downstream compound screening with standardized environmental controls.
- Quantitative Outputs: Generates scalable, reproducible measurements of path length, movement velocity, and bout duration for hit-to-lead progression.
- Platform Reuse: Enables high-throughput experimentation across multiple cages simultaneously, supporting assay standardization and cross-study comparability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models locomotor endpoints relevant to neurodegenerative, psychiatric, and movement disorders where altered activity is a phenotypic readout.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical phases by providing consistent behavioral metrics across short- and long-term testing paradigms.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by revealing recovery kinetics or sustained effects post-treatment, such as differential LPS recovery in IVC vs. ambient housing.
Pipeline & Workflow Integration
The VTS-LMA workflow fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling iterative assessment of locomotor phenotypes across study phases.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring distance moved, velocity, and duration as functional outputs of neural pathway modulation.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through real-time tracking of up to eight mice per session with defined regions of interest.
- Analytics: Exports quantitative parameters (distance, velocity, duration) to spreadsheets for statistical analysis, enabling inter-group comparisons and effect size determination.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by allowing long-term LMA assessment (up to 12 hours) without telemetry, supporting chronic dosing studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable behavioral platform adaptable to various models and treatments, reducing reliance on single-use techniques.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in locomotor phenotypes through high-resolution, continuous tracking.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability via controlled lighting, bedding contrast, and cage divider protocols that minimize visual artifacts.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by replacing implanted transmitters with non-invasive videography, reducing surgical burden and animal variability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by detecting differential recovery profiles, such as faster LMA normalization in IVC-housed mice post-LPS challenge.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral neuroscience and video tracking software setup for optimal region-of-interest selection and glare reduction.
- Depends on instrumentation including night-vision capable cameras, red-spectrum illumination, and environmental controls (sound <70 dB, stable temperature/humidity).
- Necessitates cross-team standardization of cage preparation, bedding acclimation (24+ hours), and enrichment removal to ensure consistent baseline activity.
- Involves adaptation considerations for long-term studies, such as modifying cage walls for external food/water hoppers without obstructing videography.
- Includes practical limitations: system real-time tracking capped at eight mice; performance affected by reflective surfaces or inadequate ventilation in plexiglass lids.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:27
Short-term Locomotor Activity Assay: Set Up
4:30
Short-term Locomotor Activity Assay: Analysis
3:37
Short-term Locomoter Acitvity Assay: Testing
5:30
Long-term Locomotor Activity Assay: Set Up and Testing
7:31
Long-term Locomotor Activity Assay: Analysis
8:03
The Effect of Housing on LPS-injection Recovery
9:32
Conclusion
