Krótko- i długoterminowa aktywność ruchowa myszy analizowana przez oprogramowanie do śledzenia wideo

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykrycie różnic w krótkoterminowej i/lub długoterminowej aktywności lokomocyjnej pomiędzy różnymi grupami myszy poddanych działaniu czynników eksperymentalnych. Osiąga się to poprzez rejestrację wideo aktywności myszy w klatce domowej w czasie rzeczywistym. W drugim kroku aktywność lokomocyjna zwierzęcia jest analizowana w czasie rzeczywistym lub na podstawie nagrania przy użyciu oprogramowania do śledzenia wideo.

Następnie punktowane parametry lokomocyjne są importowane do drugiego oprogramowania w celu przeprowadzenia analizy statystycznej. Procedura ta pozwala zatem wyjaśnić wpływ zabiegów lub warunków na krótkoterminową i długoterminową aktywność lokomocyjną w oparciu o oceniane parametry, takie jak przebyta odległość, prędkość ruchu oraz czas trwania ruchu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak liczenie przekroczeń linii czy implantacja emitera, jest zapewnienie dokładniejszego badania aktywności lokomocyjnej myszy bez konieczności przeprowadzania inwazyjnego i potencjalnie zakłócającego zabiegu chirurgicznego.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ przygotowanie klatek i sprzętu w sposób zapewniający optymalną jakość obrazu do późniejszego śledzenia wideo może być żmudne i wymaga czasu na naukę. Krótkotrwałą aktywność lokomotoryczną testuje się w klatkach domowych izolowanych myszy, stosując ściółkę o wysokim kontraście w stosunku do koloru kodu zwierzęcia. Przed eksperymentem zwierzęta muszą być aklimatyzowane do ściółki przez co najmniej 24 godziny.

Aby przygotować pomieszczenie badawcze, należy rozpocząć od zamontowania powyżej obszaru rejestracji kamery wideo z funkcją widzenia nocnego i pamięcią o pojemności co najmniej 120 gigabajtów. W pomieszczeniu nie powinno występować dźwięków otoczenia przekraczających 70 decybeli. Jeśli okresowy hałas w tle jest nieunikniony, należy zastosować generator białego szumu w celu jego zagłuszenia.

Ważne jest również, aby warunki środowiskowe w pomieszczeniu testowym były zbliżone do normalnych warunków utrzymania zwierząt. Przed umieszczeniem nowych obiektów należy oczyścić obszar rejestracji, a następnie pokryć powierzchnię papierem rzeźniczym lub papierem do blatów laboratoryjnych w kolorze zbliżonym do ściółki w klatce. Następnie należy ustawić nieprzezroczyste ścianki działowe do klatek wykonane z półcalowego plastiku. Ścianki działowe na powierzchni testowej muszą mieć kolor zbliżony do ściółki i być czyste.

Następnie przenieś myszy do obszaru testowego i ustaw ich klatki pomiędzy przegrodami. Aby ułatwić analizę, zawsze ustawiaj klatki w ten sam sposób. Na czas testu przykryj klatki przezroczystym pleksiglasem o grubości 1/4 cala.

Pleksiglas musi posiadać co najmniej 11 otworów o średnicy 1/4 cala, aby zapewnić odpowiednią wentylację. Następnie należy ustawić lampy grzewcze z czerwonymi żarówkami w celu oświetlenia klatek. Teraz należy wycentrować widok kamery na klatkach testowych, dbając o to, aby nie przekroczyć możliwości systemu śledzenia wideo.

System ten jest ograniczony do śledzenia ośmiu myszy w czasie rzeczywistym. Teraz, obserwując obraz z kamery wideo, należy dostosować kąt i położenie lamp, aby usunąć odblaski lub refleksy z pleksiglasowych pokryw klatek. Uzyskanie przejrzystego obrazu myszy, wolnego od jakichkolwiek artefaktów wizualnych, jest najważniejszym krokiem w celu uzyskania dobrych wyników.

W każdej grupie należy zawsze uwzględnić zarówno osobniki eksperymentalne, jak i kontrolne, aby zminimalizować potencjalny wpływ różnic czasowych w LMA. Bezpośrednio przed testem należy usunąć z klatek wszelkie materiały do gniazdowania i wzbogacenia środowiskowe, ponieważ mogą one zasłaniać widok myszy. W materiale wideo nagranie należy rozpocząć od tabliczki identyfikacyjnej zawierającej odpowiednie informacje eksperymentalne.

Aby zapewnić prawidłową identyfikację nagrania, należy używać licznika czasu na wyświetlaczu kamery do śledzenia czasu trwania testu i pozostawać poza polem widzenia zwierzęcia podczas rejestracji. Po zakończeniu testu należy zwrócić wszystkie materiały do każdej klatki.

Jeśli zwierzęta mają zostać poddane ponownym testom, przywróć im dostęp do pożywienia i wody pomiędzy próbami. Przechowuj nagrania wideo z sesji testowej na nośniku archiwalnym kompatybilnym z systemem śledzenia wideo, np. na dysku twardym. W systemie śledzenia wideo analizuj materiały w czasie rzeczywistym. Na początku wybierz całą powierzchnię dna klatki jako obszar zainteresowania (ROI) do śledzenia.

W celu przeprowadzenia zaawansowanych analiz, takich jak ocena podatków Figma, należy utworzyć wiele obszarów zainteresowania (ROI) wewnątrz klatek dla badań o wysokiej przepustowości. Należy analizować jednocześnie wszystkie klatki w obrębie filmu, wykorzystując indywidualne ROI dla podłóg wszystkich klatek. Należy ustawić system VTS tak, aby obliczył całkowity dystans, prędkość przemieszczeń oraz czas trwania ruchów; po wykonaniu obliczeń dane należy wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego w celu ich archiwizacji i dalszej analizy.

Badania długoterminowe przeprowadza się w taki sam sposób jak badania krótkoterminowe. Wymagają one jednak zmodyfikowanej klatki z nowym punktem dostępu do pokarmu i wody. Najpierw należy wyciąć otwór o średnicy 5,5 centymetra w krótkiej ścianie końcowej standardowej klatki.

Następnie w ocynkowanej siatce stalowej o oczkach 1/4 cala należy wyciąć otwory o średnicy 1/2 cala i wypolerować siatkę, aby usunąć ostre krawędzie, wykorzystując do tego fragment tej samej siatki; następnie należy zbudować zewnętrzny zasobnik na pelety z paszą, który można przymocować do siatki nad otworem. W kolejnym kroku należy wykonać otwory pod nity. Następnie otwór w klatce należy zakryć siatką oraz przymocowanym zasobnikiem, używając nitów aluminiowych i podkładek ze stali nierdzewnej.

W celu zapewnienia nawodnienia, należy przygotować butelkę z wodą, wykorzystując standardową kolbę stożkową o pojemności 50 ml oraz jednodziurkowy korek gumowy z poszerzonym otworem. Pozwoli to na włożenie rurki do picia zapobiegającej wyciekom. Tak przygotowaną butelkę z wodą należy przymocować do klatki.

Za pomocą taśmy rzepowej rurkę ssącą należy wprowadzić przez otwór osłonięty siatką. Teraz, gdy klatka jest przykryta pleksiglasową pokrywą, myszy zachowują dostęp do pożywienia i wody zgodnie z procedurami opisanymi dla krótkotrwałego testu lokomocyjnego. Test długoterminowy zazwyczaj trwa 12 godzin lub przez czas trwania aktualnej fazy cyklu światło-ciemność.

Długoterminowe testowanie aktywności lokomotorycznej jest zazwyczaj analizowane w czasie rzeczywistym, bez sporządzania nagrania wideo. Można jednak wykonać nagranie, korzystając z dodatkowej kamery lub rejestratora DVD połączonego z kamerą główną. Myszy mogą być testowane tak długo, na ile pozwalają możliwości systemu śledzenia wideo, a podobnie jak w przypadku testów krótkoterminowych, z klatki usuwa się jedynie materiały wzbogacające służące do budowy gniazda, a nie ściółkę z kolb kukurydzy lub trocin.

W systemie VTS skonfiguruj system śledzenia wideo do analizy w czasie rzeczywistym. Ustaw obszar zainteresowania (ROI) śledzenia tak, aby obejmował całą powierzchnię dna każdej rejestrowanej klatki. Podobnie jak w przypadku testu krótkoterminowego, ustaw system tak, aby obliczał całkowity dystans, prędkość poruszania się oraz czas trwania ruchu.

Następnie, po przeprowadzeniu analizy, wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu ich przechowywania i analizy z wykorzystaniem powtarzalnych testów lokomocyjnych w krótkim odstępie czasu. Stwierdzono, że po wstrzyknięciu lipopolisacharydu myszy utrzymywane w klatkach z indywidualną wentylacją (IVC) szybciej regenerowały utratę krótkoetapowej aktywności lokomocyjnej (LMA) wywołaną zastrzykiem niż mysze utrzymywane w klatkach w środowisku otoczenia (EC). Chociaż początkowy spadek aktywności lokomocyjnej był podobny w grupach po wstrzyknięciu LPS, powrót do podstawowej aktywności lokomocyjnej był szybszy u myszy w IVC, podobnie jak prędkość i czas trwania ruchów.

W niniejszej analizie śledzenie rozpoczynało się po wykryciu ruchu o prędkości 2 cm/s i kończyło przy prędkości 1,75 cm/s, przy zastosowaniu zmiennych detekcji. Przeprowadzono krótki test lokomocji w dwóch następujących po sobie 12-godzinnych cyklach aktywności. U myszy zdrowych nie stwierdzono istotnych różnic w przebytej odległości, prędkości ruchów ani ich czasie trwania.

Jeśli trend braku mierzalnych różnic utrzymałby się przy powtórzeniu badania na dużej próbie, dane sugerowałyby, że test ten mógłby zastąpić wszczepione nadajniki stosowane w długoterminowych badaniach lokomocji. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę na warunki utrzymania zwierząt przed eksperymentem. Wszystkie zwierzęta doświadczalne i kontrolne powinny przebywać w podobnych warunkach środowiskowych, zwłaszcza w odniesieniu do cyklu świetlnego, temperatury w pomieszczeniu i wilgotności względnej.

Ponadto, po przeprowadzeniu tej procedury należy zminimalizować ekspozycję zwierząt na bodźce dźwiękowe i zapachowe. Do odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy traktowanie w konkretnym eksperymencie skutkuje zachowaniem podobnym do depresyjnego bez wpływu na ogólną aktywność lokomotoryczną, można wykorzystać inne metody, np. test wymuszonego pływania (four swim test).