Jednoczesny pre- i postsynaptyczny zapis elektrofizjologiczny z kokultur nerwowo-mięśniowych Xenopus

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie pierwotnych kultur synaptycznie sprzężonych neuronów rdzeniowych i komórek mięśniowych z zarodków xenopus. Osiąga się to poprzez najpierw indukcję rozmnażania u ksenopusów poprzez wstrzyknięcie ludzkiej kosmówki w atropinę zarówno samcom, jak i samicom żab oraz zebranie zapłodnionych jaj. Drugim krokiem jest usunięcie galaretki oraz fatelu i błon z zarodków w stadium 22.

Następnie neurony rdzeniowe i mięśnie są izolowane od zarodków, a skóra jest usuwana i odrzucana. Ostatnim krokiem jest umieszczenie izolowanych komórek w szalkach hodowlanych i umożliwienie utworzenia funkcjonalnych połączeń nerwowo-mięśniowych. Ostatecznie funkcjonalne połączenia synaptyczne można zademonstrować za pomocą jednoczesnych zapisów sparowanych klapsów z neuronów i komórek mięśniowych w hodowli.

Piękno tej techniki polega na tym, że daje ona łatwo dostępny preparat synaptyczny kręgowców. Może być stosowany do monitorowania uwalniania neuroprzekaźników za pomocą postsynaptycznych zapisów elektrofizjologicznych przy jednoczesnym pomiarze występowania jonów presynaptycznych. Co więcej, metody są jasne i proste, nie wymagają specjalnego sprzętu poza mikroskopem preparacyjnym, a kultury można następnie przechowywać w temperaturze pokojowej w prostym podłożu hodowlanym.

Preparat ten może być przydatny w udzielaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fizjologii synaptycznej, w tym w jaki sposób zdarzenia presynaptyczne, biochemiczne i biofizyczne są sprzężone z uwalnianiem neuroprzekaźników. Ponadto jest również przydatny do badania synaptogenezy neuromodulacji i plastyczności synaptycznej Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj wymagane roztwory zgodnie z dołączonym rękopisem. Następnie wyprodukuj co najmniej dwa narzędzia do mikropreparacji, przyklejając szpilkę minuchin do końca szklanej pipety do pastiera.

Za pomocą kleju akrylowego Sano pozwól, aby ostry koniec szpilki wystawał poza koniec pipety na około 0,5 centymetra. Dwa dni przed przygotowaniem kultur zidentyfikuj gotową do rozrodu parę XUS, obserwując wyraźną czerwonawą pazur aika na samicy i ciemną pigmentację na płaskiej powierzchni przednich łap samca. Następnie nawiąż siatkę na każdą żabę i trzymaj ją brzuszną stroną do dołu w zlewie z siatką, aby mogła uciec.

Wstrzyknąć jeden mililitr HCG przez siatkę i podskórnie do jednego z grzbietowych worków limfatycznych, aby upewnić się, że zwierzęta nie będą deptać nowo złożonych i zapłodnionych jaj. Zainstaluj ekranowaną podłogę o rozmiarze oczek pół cala, zamontowaną od jednego do dwóch cali na dnie zbiornika. Następnie umieść parę hodowlaną razem w zakrytym zbiorniku z wodą o pojemności 10 galonów.

Pozostaw żaby w spokoju przez 12 do 48 godzin, aż zapłodnione jaja zostaną zaobserwowane na podłodze pod ekranem. Następnie wyjmij zwierzęta ze zbiornika, ale pozostaw jaja w spokoju przez co najmniej 24 godziny dłużej. Ta para żab może zostać ponownie odłowiona po sześciu tygodniach.

Następnie poluzuj zarodki z dna zbiornika i przenieś je do czterech lub pięciu naczyń hodowlanych o wymiarach 60 na 15 milimetrów zawierających 10% soli fizjologicznej. Sortuj zarodki według etapów zgodnie ze schematem nowych zarodków coupe i Faber, które mają gładki wygląd z jasnym, brązowym i białym modelem, takim jak te po lewej stronie, są idealne. Z drugiej strony, zarodki, które mają duże czarne lub białe plamy, takie jak te po prawej, są na ogół niezdrowe i nie nadają się do użytku.

Wewnątrz okapu z przepływem laminarnym oznaczyć etykietę i napełnić około połowy sterylnych naczyń hodowlanych 360 na 15 milimetrów 10% solą fizjologiczną i jedną CMF. Za pomocą sterylnej szklanej pipety pastierowej przenieś od pięciu do 10 zarodków w stadium od 22 do 24 do jednej z naczyń zawierających 10% soli fizjologicznej za pomocą ośmiu mikroskopów preparacyjnych stereoskopowych z zoomem wewnątrz kaptura, usuń galaretowaty płaszcz i błonę viel z każdego zarodka za pomocą dwóch par sterylnych kleszczy. Umyj nagie zarodki, przepuszczając je pojedynczo przez pozostałe dwie naczynia z 10% solą fizjologiczną, a na koniec do naczynia zawierającego CMF.

Następnie chwyć każdy zarodek delikatnie, ale stanowczo za pomocą kleszczy i użyj narzędzia do mikropreparacji, aby usunąć cewę nerwową i związane z nią miotomy, które znajdują się w najbardziej grzbietowej części zwierzęcia. Zrób to, robiąc trzy plasterki, jeden na każdym końcu cewy nerwowej, a trzeci tuż brzusznie do niej. Następnie przenieś każdy wypreparowany miotom cewy nerwowej do czystej części naczynia, z dala od granulek żółtka i innych zanieczyszczeń.

Po około 15 minutach w CMF użyj kleszczy, aby podnieść pigmentowaną skórę z wypreparowanej tkanki i wyrzucić skórę. Po dodatkowych 30 do 60 minutach komórki utworzą stos piasku, gdy zostaną od siebie oddzielone. W tej procedurze rozmrozić 10-mililitrową probówkę pożywki hodowlanej, a następnie w 70 mikrolitrach ITS w 35 nanogramach na mililitr, oznaczyć BDNF i napełnić 35-milimetrowe sterylne szalki hodowlane mniej więcej do połowy pożywką hodowlaną L 15.

Użyj jednego naczynia hodowlanego dla każdego wypreparowanego zarodka. Aby wyprodukować pipetę do powlekania, przytrzymaj oba końce szklanej pipety o konsystencji pasty i umieść stożkową część nad płomieniem. Następnie rozsuń końce na około 10 centymetrów.

Następnie odłam koniec, aby ustąpić końcówce około 0,2 milimetra. Następnie za pomocą pipety do posiewu należy zassać stos piasku z jednego zarodka. Należy uważać, aby zminimalizować ilość pobieranego roztworu.

Następnie wyrzuć komórki na dno naczynia hodowlanego i ułóż je w kilku liniach. Następnie pozostaw szalki z posiaczonymi komórkami w spokoju przez co najmniej 15 minut, aby komórki miały czas na przymocowanie się do naczynia. Po 12 do 24 godzinach w hodowli posiane komórki rozwiną wyraźne cechy morfologiczne.

Na przykład komórki mięśniowe przybierają kształt wrzeciona, a neurony rdzeniowe rozwijają długie procesy. Funkcjonalny kontakt synaptyczny między moczanem, żylakami i komórkami mięśniowymi można potwierdzić za pomocą jednoczesnych sparowanych zapisów elektrofizjologicznych. W tym celu należy przygotować dwie elektrody plastrowe do rejestracji, jedną dla żylaków presynaptycznych i jedną dla komórki mięśniowej.

Następnie napełnij elektrodę presynaptyczną roztworem zawierającym infoterynę, a elektrodę postsynaptyczną wewnętrznym roztworem potasu. Następnie zastąp pożywkę w naczyniu hodowlanym NFR. Następnie przenieś go do odwróconego mikroskopu wyposażonego w optykę kontrastową twarzy, załataj żylaki presynaptyczne elektrodą zawierającą amfoterycynę, a postsynaptyczną komórkę mięśniową drugą elektrodą, aby potwierdzić funkcjonalność synapsy, zdepolaryzuj żylaki za pomocą wzmacniacza patch clamp i obserwuj jednoczesne prądy presynaptyczne i postsynaptyczne.

Rysunek ten przedstawia pięciokrotny widok mocy komórek i hodowli bezpośrednio po posianiu, a jest to ta sama kultura przy 40 x. Oto połączenie nerwowo-mięśniowe w hodowli, które pokazuje somę neuronalną, presynaptyczną, żylaki i postsynaptyczną komórkę mięśniową. Pokazano tutaj prądy presynaptyczne i postsynaptyczne.

W odpowiedzi na zastosowanie 10 miliwoltów przyrostowych kroków napięcia przedstawionych do żylaków presynaptycznych od minus 30 miliwoltów do plus 40 miliwoltów, potencjał utrzymania dla obu komórek wynosił minus 70 miliwoltów Po opanowaniu technikę tę można ukończyć w około dwie godziny. Żywe hodowle komórkowe można następnie uzyskać już po 24 godzinach i można je utrzymywać przez kilka dni. Preparat ten jest stosowany już od wielu lat, pomagając wyjaśnić niektóre z podstawowych właściwości przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego.

Mamy nadzieję, że ten film pozwoli na kontynuację odkryć, pomagając badaczom lepiej zapoznać się z tą potężną i prostą techniką.