Name: Jednoczesny pre- i postsynaptyczny zapis elektrofizjologiczny z kokultur nerwowo-mięśniowych Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego pre- i postsynaptycznego zapisu elektrofizjologicznego z kokultur nerwowo-mięśniowych Xenopus. Technika ta umożliwia badanie fiziologii synaptycznej i uwalniania neuroprzekaźników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowane przez NSF (0854551).

1. Przygotowanie przedeksperymentalne
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory (patrz tabela 1 dla kompozycji): a) 1 litr NFR (Normal Frog Ringer), (b) 100 ml 10% soli fizjologicznej, (c) 100 ml CMF (roztwór wolny od Ca2+ / Mg2+), (d) 1 ml ITS (insulina-transferyna-selen, Sigma I1884), (e) 100 ml pożywki L-15, (f) 10 ml HCG (ludzka gonadotropina kosmówkowa Sigma CG-10), (g) 100 ml K+-roztwór wewnętrzny, h) 100 ml K+-roztwór wewnętrzny dla amfoterycyny B. Za pomocą osmometru prężności pary (np. Wescor model #5100C) należy sprawdzić siłę osmotyczną roztworu 1, aby upewnić się, że wynosi ona około 260 mOsM).</li>
	<li>Filtrować roztwory sterylizacyjne (b) i (c). Roztwory a), b) i c) mogą być przechowywane do trzech miesięcy w temperaturze 4 °C. Przygotować roztwór (d) przez dodanie 1 ml dejonizowanegoH2Odo fiolki zawierającej liofilizowany proszek za pomocą igły strzykawkowej o rozmiarze 25 G i filtra strzykawkowego. Ten końcowy roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 30 dni.</li>
	<li>Przygotować roztwór (e) w okapie z przepływem laminarnym, łącząc wszystkie składniki w zlewce lub kolbie. Przefiltrować, wysterylizować roztwór końcowy i przenieść 10 ml podwielokrotności do sterylnych probówek wirówkowych. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować HCG (roztwór (f)) dodając 10 ml dejonizowanegoH20 do fiolki zawierającej liofilizowany proszek za pomocą igły strzykawki o rozmiarze 25 G i filtra strzykawkowego. Ten końcowy roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 30 dni.</li>
	<li>Wykonaj co najmniej dwa narzędzia do mikrodysekcji, przyklejając szpilkę Minutien (26002-10, Fine Science Tools) do końca szklanej pipety Pasteura za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Pozwól, aby ostry koniec szpilki wystawał poza koniec pipety na około 0,5 cm.</li>
	<li>Dwa dni przed przygotowaniem kultur wywołaj hodowlę zgodnie z następującą procedurą. Zidentyfikuj gotową do rozrodu parę Xenopus, obserwując wyraźną, czerwonawą kloakę na samicy i ciemną pigmentację na płaskiej powierzchni przednich łap samca. Pojedynczo utrzymaj każdą żabę w sieci i trzymaj ją brzuszną stroną do dołu na zlewie z siatką, aby nie mogła uciec. Wstrzyknąć 1 ml roztworu (f) przez siatkę i podskórnie do jednego z grzbietowych woreczków chłonnych.</li>
	<li>Umieść parę hodowlaną razem w zakrytym zbiorniku z wodą o pojemności dziesięciu galonów. Aby upewnić się, że zwierzęta nie będą deptać nowo złożonych i zapłodnionych jaj, zainstaluj siatkowaną podłogę o rozmiarze oczek około 1/2 cala, zamontowaną około 1-2 cali nad dnem zbiornika (rysunek 1A).</li>
	<li>Pozostaw żaby w spokoju przez 12-48 godzin, aż zwierzęta znajdą się w ampleksusie, a zapłodnione jaja zostaną zaobserwowane na podłodze pod ekranem (ryc. 1B).</li>
	<li>Wyjmij zwierzęta ze zbiornika, ale pozostaw jaja w spokoju przez co najmniej 24 godziny dłużej. Ta para żab może być ponownie rozmnażana po sześciu tygodniach.</li>
	<li>Poluzować zarodki z dna zbiornika i przenieść je do czterech lub pięciu szalek hodowlanych o wymiarach 60x15 mm zawierających 10% soli fizjologicznej (roztwór b). Posortuj zarodki według etapu zgodnie ze schematem Niewkoopa i Fabera (ref. 20). Pożyteczne zarodki to te w stadium 22-24. Rycina 2A przedstawia zarodek w przybliżeniu w stadium 22, podczas gdy rysunek 2B pokazuje zarodek, który jest zbyt zaawansowany w rozwoju, aby mógł być użyteczny (w przybliżeniu stadium 28). Ważne jest, aby wybierać zarodki, które są zdrowe: idealne są te, które mają gładki wygląd z jasnobrązowymi i białymi cętkami. Zarodki, które mają duże czarne lub białe plamy, są na ogół niezdrowe i bezużyteczne.</li>
</ol>
2. Mikrodysekcja zarodków Xenopus
<ol>
	<li>Wewnątrz okapu z przepływem laminarnym oznaczyć i napełnić mniej więcej do połowy trzy sterylne naczynia hodowlane o wymiarach 60 x 15 mm 10 % solą fizjologiczną, a jedną CMF.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej, szklanej pipety Pasteura przenieś od pięciu do dziesięciu zarodków w stadium 22-24 do jednej z naczyń zawierających 10% soli fizjologicznej. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego z zoomem stereo wewnątrz kaptura (0,6-5x z okularami 10x), usuń galaretowaty płaszcz i błonę witelinową z każdego zarodka za pomocą dwóch par sterylnych kleszczyków #5 (11251-30, Fine Science Tools). (Patrz rysunki 3A i 3B.)</li>
	<li>Umyj gołe zarodki, przepuszczając je, pojedynczo, przez pozostałe dwie szalki z 10% solą fizjologiczną, a na koniec do naczynia zawierającego CMF. Używaj nowej, sterylnej pipety do każdego transferu i zminimalizuj objętość roztworu przenoszonego z naczynia na naczynie.</li>
	<li>Z kolei chwyć każdy zarodek delikatnie, ale stanowczo za pomocą kleszczy i za pomocą narzędzia do mikrodysekcji opisanego w kroku 1.5 usuń cewę nerwową i związane z nią miotomy, które znajdują się w najbardziej grzbietowej części zwierzęcia. Zrób to, robiąc trzy plasterki, jeden na każdym końcu miejsca cewy nerwowej, a trzeci tuż brzusznie do niej (ryc. 4A). Przenieś każdą wypreparowaną rurkę nerwową/miotom do czystej części naczynia, z dala od granulek żółtka i innych zanieczyszczeń (ryc. 4B). Oś grzbietowo-brzuszna oraz lokalizacje cewy nerwowej i miotomów przedstawiono na rycinie 4.</li>
	<li>Po około piętnastu minutach w tym roztworze (CMF) użyj kleszczy, aby podnieść pigmentowaną skórę z wypreparowanej tkanki i wyrzucić. Po dodatkowych 30-60 minutach komórki utworzą "stos piasku", gdy zostaną oddzielone od siebie (ryc. 4C).</li>
</ol>
3. Przygotowanie kokultur nerwowo-mięśniowych
<ol>
	<li>Rozmrozić 10 ml probówki z pożywką hodowlaną i aseptycznie dodać 70 μl ITS i 35 ng/ml BDNF (Sigma B3795).</li>
	<li>Oznaczyć i napełnić sterylne szalki hodowlane o średnicy 35 mm (FD35-100 World Precision Instruments) mniej więcej do połowy pożywką hodowlaną L-15 (roztwór (e)), po jednej dla każdego wypreparowanego zarodka.</li>
	<li>Wykonaj pipetę do powlekania, chwytając każdy koniec szklanej pipety Pasteura, trzymając zwężającą się część nad płomieniem. Rozsuń końce na około 10 cm, a następnie oderwij koniec, aby uzyskać końcówkę o średnicy około 0,2 mm.</li>
	<li>Użyj pipety do posiewu, aby zassać "stos piasku" z jednego zarodka, minimalizując ilość pobranego roztworu. Wyrzuć komórki na dno naczynia hodowlanego. Ułóż komórki w kilka linii. Obserwuj posiane niezróżnicowane komórki (ryc. 5A i 5B).</li>
	<li>Pozostaw naczynia z posiaczonymi komórkami w spokoju przez co najmniej piętnaście minut, aby dać komórkom czas na przyczepienie się do naczynia.</li>
</ol>
4. Łata zaciskająca synapsy nerwowo-mięśniowe
<ol>
	<li>Po 12-24 godzinach w hodowli posiane komórki nabierają wyraźnych cech morfologicznych: komórki mięśniowe stają się wrzecionowate, a neurony rdzeniowe wydłużają długie procesy (ryc. 6). Funkcjonalny kontakt synaptyczny między żylakami neurytów a komórkami mięśniowymi można potwierdzić za pomocą jednoczesnych sparowanych zapisów elektrofizjologicznych. "M", "S" i "V" odnoszą się odpowiednio do komórki mięśniowej, somy neuronalnej i żylaków presynaptycznych.</li>
	<li>Przygotuj dwie elektrody plastrowe do rejestracji: jedną dla żylaków presynaptycznych i jedną dla komórki mięśniowej.</li>
	<li>Dla elektrody presynaptycznej przygotować roztwór zawierający amfoterycynę w następujący sposób: Dodać 100 μl DMSO do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej 5 mg amfoterycyny B (Sigma A4888). Wiruj ten roztwór przez 10 sekund. Następnie dodać 10 μl tego roztworu do drugiej probówki do mikrowirówki, która zawiera 625 μl K+-wewnętrznego roztworu amfoterycyny B (roztwór (h)). Wir jak wyżej.</li>
	<li>Wypełnić elektrodę presynaptyczną roztworem wewnętrznym K+ zawierającym amfoterycynę, przygotowanym w kroku 4.3, a elektrodę postsynaptyczną roztworem wewnętrznym K+ (roztwór (g)).</li>
	<li>Zastąp pożywkę w naczyniu hodowlanym NFR i przenieś ją do odwróconego mikroskopu wyposażonego w optykę z kontrastem fazowym.</li>
	<li>Umieść obie elektrody tuż nad odpowiednimi celami. Uzyskaj konfigurację całej komórki z elektrodą komórki mięśniowej przed konfiguracją perforowanej łaty z elektrodą żylaków.</li>
	<li>Aby potwierdzić funkcjonalność synapsy, należy zdepolaryzować żylaki za pomocą wzmacniacza patch clamp (np. Axopatch 200B, Molecular Devices) pod kontrolą oprogramowania (np. przez pCLAMP 9, Molecular Devices) i obserwować jednoczesne prądy presynaptyczne i postsynaptyczne. Rysunek 7 przedstawia prądy obserwowane w odpowiedzi na depolaryzujące kroki napięcia podawanego do żylaków presynaptycznych w krokach co 10 mV od -30 mV do +40 mV. Prądy wewnętrzne obserwowane w komórce presynaptycznej są przenoszone przez Na+ i Ca2+, a prądy zewnętrzne przez K+. Prądy rejestrowane w komórce postsynaptycznej są odpowiedziami na neuroprzekaźnik uwalniany z żylaków i są przenoszone głównie przez Na+ przez kanały nikotynowego receptora acetylocholiny.</li>
</ol>

<ol><li>Augustine, G. J., Eckert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divalent+cations+differentially+support+transmitter+release+at+the+squid+giant+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse.</a> J. Physiol. 346, 257-271 (1984).</li>
<li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641(1976).</li>
<li>Weldon, P. R., Cohen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+synaptic+ultrastructure+at+neuromuscular+contacts+in+an+amphibian+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Development of synaptic ultrastructure at neuromuscular contacts in an amphibian cell culture system.</a> J. Neurocytol. 8, 239-259 (1979).</li>
<li>Tabti, N., Poo, M. -M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTabti%2C+N+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. 137-153 (1991).</li>
<li>Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+presynaptic+calcium+and+calcium-activated+potassium+currents+regulating+neurotransmitter+release+at+cultured+Xenopus+nerve-muscle+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses.</a> J. Neurosci. 17, 2990(1997).</li>
<li>DiGregorio, D. A., Peskoff, A., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+action+potential-induced+presynaptic+calcium+domains+at+a+cultured+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Measurement of action potential-induced presynaptic calcium domains at a cultured neuromuscular junction.</a> J. Neurosci. 19, 7846(1999).</li>
<li>Yazejian, B., Sun, X. P., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+presynaptic+Ca2%2B+dynamics+during+neurotransmitter+release+with+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels.</a> Nat. Neurosci. 3, 566(2000).</li>
<li>Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization-induced+Ca2%2B+entry+preferentially+evokes+release+of+large+quanta+in+the+developing+Xenopus+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction.</a> J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).</li>
<li>Xie, S. P., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+events+in+the+formation+of+neuromuscular+synapse%3A+rapid+induction+of+acetylcholine+release+from+embryonic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Initial events in the formation of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7069(1986).</li>
<li>Li, P. P., Chen, C., Lee, C. W., Madhavan, R., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+filopodial+asymmetry+induced+by+synaptic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Axonal filopodial asymmetry induced by synaptic target.</a> Mol. Biol Cell. 22 (14), 2480-2490 (2011).</li>
<li>Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+promote+synaptogenesis+at+the+neuromuscular+junction+via+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Schwann cells promote synaptogenesis at the neuromuscular junction via transforming growth factor-beta1.</a> J. Neurosci. 28 (39), 9599-9609 (2008).</li>
<li>Song, H. J., Ming, G. L., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP-induced+switching+in+turning+direction+of+nerve+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cAMP-induced switching in turning direction of nerve growth cones.</a> Nature. 17 (6639), 275-279 (1997).</li>
<li>Morimoto, T., Wang, X. H., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+synaptotagmin+modulates+short-term+synaptic+plasticity+at+developing+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions.</a> Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).</li>
<li>Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+synapsin+I+correlates+with+maturation+of+the+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse.</a> Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).</li>
<li>Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+IIa+accelerates+functional+development+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synapsin IIa accelerates functional development of neuromuscular synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (9), 3882-3886 (1994).</li>
<li>Liou, J. C., Tsai, F. Z., Ho, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiation+of+quantal+secretion+by+insulin-like+growth+factor-1+at+developing+motoneurons+in+Xenopus+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture.</a> J. Physiol. 553 (Pt. 3), 719-7128 (2003).</li>
<li>Peng, H. B., Yang, J. F., Dai, Z., Lee, C. W., Hung, H. W., Feng, Z. H., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+neurotrophins+and+schwann+cell-derived+signals+on+neuronal+survival%2Fgrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects of neurotrophins and schwann cell-derived signals on neuronal survival/growth and synaptogenesis.</a> J. Neurosci. 23 (12), 5050-5060 (2003).</li>
<li>Dan, Y., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hebbian+depression+of+isolated+neuromuscular+synapses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hebbian depression of isolated neuromuscular synapses in vitro.</a> Science. 12 (5063), 1570-1573 (1992).</li>
<li>Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-dependent+regulation+of+neurotransmitter+specification+and+embryonic+neuronal+calcium+spike+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity.</a> J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).</li>
<li>Niewkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiewkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , North-Holland, Amsterdam. (1967).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Kluczowymi etapami udanej wspólnej hodowli neuronów ruchowych i komórek mięśniowych jest wykorzystanie odpowiednio zaawansowanych zarodków powstałych w wyniku indukowanej hodowli żab Xenopus oraz staranne, aseptyczne rozwarstwienie niezróżnicowanych neuronów rdzeniowych i mioblastów. Zapłodnione jaja należy pozostawić w spokoju, dopóki nie osiągną około 10 stadium, ponieważ wcześniejsze ich przeniesienie często zatrzymuje ich rozwój. Zdrowe zarodki można rozpoznać po gładkim wyglądzie i brązowo-białym nakrapianym zabarwieniu. Zarodki w stadium 22-24 są najbardziej przydatne, ponieważ jest to moment podczas rozwoju, tuż po zamknięciu cewy nerwowej i przed znacznym zróżnicowaniem miocytów. Ponadto komórki ze starszych zarodków nie dysocjują dobrze w CMF. Należy zachować ostrożność podczas usuwania błony witeliny, ponieważ silnie przylega ona do zarodka. Błonę należy rozerwać ostrymi kleszczami, aby zarodek wyszedł nienaruszony. Innym ważnym środkiem ostrożności jest ostrożne umieszczenie komórek na dnie naczynia hodowlanego (zamiast pozwalania im tam osiąść). Ta metoda jest preferowana, ponieważ zwiększa prawdopodobieństwo, że komórki będą przylegać do naczynia hodowlanego.
Funkcjonalne neuroprzekaźnictwo między nerwem a mięśniem można określić za pomocą samego zapisu postsynaptycznego i często można je ustalić, obserwując spontaniczny skurcz mięśni po unerwieniu. Nieunerwione komórki mięśniowe nie drgają w hodowli. Sam zapis postsynaptyczny jest przydatny do rejestrowania miniaturowych prądów lub potencjałów płytki końcowej, ale pomiary uwolnienia wywołanego wymagają stymulacji presynaptycznej, a korelacja prądów pre- i postsynaptycznych wymaga podwójnego patch-clamp.
Oprócz opisanej tutaj metody zapisu sparowanych plastrów, preparat ten daje możliwość wprowadzenia trzeciej pipety do somy neuronalnej5 Pozwala to na wygenerowanie potencjału czynnościowego, który może rozprzestrzeniać się do żylaków presynaptycznych i prowadzić do uwolnienia neuroprzekaźnika. Ponadto przypuszczalne czynniki, które uważa się za pośredniczące lub modulujące przekaźnictwo synaptyczne, mogą być wprowadzane po obu stronach synapsy: za pomocą pipety komórek mięśniowych lub poprzez dyfuzję z trzeciej pipety umieszczonej w somie.

<table><tbody><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmówkowa </td><td>Sigma</td><td>CG-10</td><td></td></tr><tr><td>Osmometr ciśnienia pary</td><td>Wescor</td><td>5100C</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki</td><td>Minutien Narzędzia naukowe</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma</td><td>A4888</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Nazwa rozwiązania</td> <td>Przepis</td> </tr> <tr> <td>(a) NFR (Normalny dzwonek żaby (w mM)</td> <td>116 NaCl, 2 KCl, 1,8 CaCl2, 5 Na+-HEPES, pH 7,35,</td> </tr> <tr> <td>(b) 10% soli fizjologicznej</td> <td>10 ml NFR+90 ml dejonizowany H2O</td> </tr> <tr> <td>(c) CMF (Ca2+ /Mg2+-free solution)</td> <td>125 NaCl, 2 KCl, 1,2 EDTA, 5 Na+-HEPES, pH 7,35,</td> </tr> <tr> <td>(e) L-15 Pożywka hodowlana</td> <td>50 ml Pożywka L-15 (Sigma L1518) + 50 ml NFR.</td> </tr> <tr> <td>g) K+-roztwór wewnętrzny (w mM)</td> <td>116 KCl, 1 NaCl, 1 MgCl2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3</td> </tr> <tr> <td>(h) K+-wewnętrzny roztwór dla amfoterycyny B (w mM) </td> <td>52 K2SO4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1.</td></tr></tbody></table>

jednoczesny pre- i postsynaptyczny zapis elektrofizjologiczny z kokultur nerwowo-mięśniowych xenopus

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Wiele informacji na temat sprzężenia presynaptycznych prądów jonowych z uwalnianiem neuroprzekaźnika uzyskano z preparatów bezkręgowców, w szczególności z synapsy gigantycznejkałamarnicy 1. Jednak poza opisywanym tu preparatem, istnieje niewiele preparatów kręgowców, w których możliwe jest jednoczesne wykonywanie pomiarów uwalniania neuroprzekaźników i presynaptycznych prądów jonowych. Embrionalne neurony ruchowe Xenopus i komórki mięśniowe mogą być hodowane razem w prostej pożywce hodowlanej w temperaturze pokojowej; Utworzą funkcjonalne synapsy w ciągu dwunastu do dwudziestu czterech godzin i mogą być używane do badania rozwoju komórek nerwowych i mięśniowych oraz interakcji synaptycznych przez kilka dni (aż do wystąpienia przerostu). Niektóre zalety tych kokultur w porównaniu z innymi preparatami kręgowców obejmują prostotę przygotowania, zdolność do utrzymania kultur i pracy w temperaturze pokojowej oraz łatwą dostępność synaps utworzonych2-4. Preparat znalazł szerokie zastosowanie do badania właściwości biofizycznych presynaptycznych kanałów jonowych oraz regulacji uwalniania przekaźnika5-8. Ponadto preparat znalazł zastosowanie w innych badaniach, w tym w badaniu przerostu neurytów i synaptogenezy9-12, molekularnych mechanizmów uwalniania neuroprzekaźników13-15, roli dyfuzyjnych przekaźników w neuromodulacji16,17 oraz plastyczności synaptycznej in vitro 18-19.

Rysunek 4B przedstawia widok grzbietowy wyizolowanego rdzenia kręgowego i miotomu bezpośrednio po jego usunięciu z zarodka Xenopus w stadium 22. Rysunek 4C pokazuje, że po usunięciu skóry i inkubacji w roztworze wolnym od Ca2+-Mg2+ (CMF, roztwór (c)), komórki dysocjują, tworząc „stertę piasku” i są gotowe do wysiania. Bezpośrednio po wysianiu na pożywkę komórki wykazują niewielką zmienność morfologiczną (Rysunek 5B), lecz po dwudziestu czterech godzinach hodowli przyjmują wyraźne kształty. Komórki mięśniowe stają się wrzecionowate, podczas gdy neurony pozostają sferyczne, wysyłając neuryty, które tworzą ż nào lce (varikosomy) w synapsach z komórkami mięśniowymi (Rysunek 6). Jednoczesna rejestracja metodą patch-clamp z warukosomu presynaptycznego i postsynaptycznej komórki mięśniowej (Rysunek 7) ujawnia presynaptyczne prądy wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe związane z uwalnianiem neuroprzekaźnika oraz wynikające z tego pobudzające prądy postsynaptyczne.
<img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig1.jpg" alt="Zachowanie amplexusu u żab; dwa etapy w badaniu obserwacyjnym, badania nad reprodukcją płazów." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. A: Para rozrodcza żab w wiadrze do kojarzenia na siatce. B: Żaby w amplexusie z zapłodnionymi jajami. 
<img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig2.jpg" alt="Proces kiełkowania nasion, obraz mikroskopowy, analiza porównawcza stadiów nasion A i B, badanie wzrostu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. A: zarodek w stadium 22 określony jako „odpowiedni”. B: zarodek w stadium 28 określony jako „nieodpowiedni”. Pasek skali reprezentuje 1 mm. 
<img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig3.jpg" alt="Zarodek przed i po usunięciu otoczki galaretowatej, mikroskopia, wizualizacja błony, biologia rozwoju." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. A: Zarodek w stadium 22 przed usunięciem błony witelinowej i otoczki galaretowatej. Strzałka wskazuje zewnętrzną krawędź otoczki galaretowatej. Błona witelinowa przylega ściśle do zarodka i jest praktycznie niewidoczna. B: Ogołocony zarodek. Pasek skali odpowiada 1 mm.
<img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig4.jpg" alt="Etapy kiełkowania nasion; obrazy mikroskopowe; proces rozwoju nasion; oznakowane części embrionu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. A: Embrion w stadium 22 z przerywaną linią wskazującą część przeznaczoną do wycięcia. B: Świeżo wyizolowana część grzbietowa embrionu; „d” i „v” odnoszą się odpowiednio do strony grzbietowej (dorsal) i brzusznej (ventral) embrionów, natomiast „m” i „n” wskazują przybliżoną lokalizację mytomów i rurki nerwowej. C: „Kopczyk” komórek po 60 min w CMF. Pasek skali odpowiada 1 mm dla A oraz 0.5 mm dla B i C.
<img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig5.jpg" alt="Wzrost kolonii mikrobiologicznych, obrazy mikroskopowe, porównanie kultur A i B, analiza mikrobiologiczna." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
 Rycina 5. A: Widok komórek w kulturze przy powiększeniu 5x bezpośrednio po wysianiu. B: Ta sama kultura przy powiększeniu 40x. Pasek skali reprezentuje 40 μm dla A oraz 5 μm dla B.
<img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig6.jpg" alt="Mikroskopowy obraz struktury komórkowej, wyróżniający pęcherzyki i komponenty błony, równowaga statyczna." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
 Rycina 6. Złącze neuromięśniowe w hodowli z identyfikacją somy neuronu (S), przedsynaptycznego zgrubienia (V) oraz postsynaptycznej komórki mięśniowej (M). Pasek skali: 5 μm.
<img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7.jpg" alt="Wykres elektrofizjologiczny; analiza odpowiedzi synaptycznej; pomiary clampa napięciowego przy zmiennych mV." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
 Rycina 7. Prądy presynaptyczne (góra) i postsynaptyczne (dół) zarejestrowane w odpowiedzi na przyłożenie przyrostowych skoków napięcia o wartości 10 mV do wypustki presynaptycznej w zakresie od -30 mV do +40 mV. Skoki napięcia są wskazane obok niektórych zapisów presynaptycznych. Potencjał holdingowy dla obu komórek wynosił -70 mV.

Ten film demonstruje procedury używane do hodowli pierwotnych kultur embrionalnych komórek nerwowych i mięśniowych Xenopus oraz przydatność tego preparatu do jednoczesnego wykonywania nagrań pre- i post-synaptycznych klamerów.

Jednoczesny pre- i postsynaptyczny zapis elektrofizjologiczny z kokultur nerwowo-mięśniowych Xenopus

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie pierwotnych kultur synaptycznie połączonych neuronów rdzeniowych i komórek mięśniowych z embrionów xenopus. Osiąga się to poprzez uprzednie wywołanie rozrodu u xenopus za pomocą iniekcji ludzkiej gonadotropiny trofoblastycznej u żab samców i samic oraz zebranie zapłodnionych jaj. Drugim krokiem jest usunięcie otoczki galaretowatej, żółtka i błon z embrionów w stadium 22.Następnie z embrionów izoluje się neurony rdzeniowe i mięśnie, a skórę usuwa i odrzuca. Ostatnim krokiem jest wysianie wyizolowanych komórek na płytki hodowlane i umożliwienie utworzenia funkcjonalnych złączy nerwowo-mięśniowych. Ostatecznie funkcjonalne połączenia synaptyczne można zademonstrować za pomocą jednoczesnych, sparowanych rejestracji metodą patch clamp z neuronów i komórek mięśniowych w hodowli.Zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na uzyskanie łatwo dostępnego preparatu synaptycznego kręgowca. Może on być wykorzystywany do monitorowania uwalniania neurotransmiterów za pomocą postsynaptycznych rejestracji elektrofizjologicznych przy jednoczesnym pomiarze obecności jonów presynaptycznych. Ponadto metody te są przejrzyste i proste, nie wymagają specjalistycznego sprzętu poza mikroskopem sekcyjnym, a tak przygotowane hodowle można następnie przechowywać w temperaturze pokojowej w prostym medium hodowlanym.Niniejszy preparat może być przydatny w udzielaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fizjologii synaptycznej, w tym dotyczące tego, w jaki sposób zdarzenia presynaptyczne, biochemiczne i biofizyczne są sprzężone z uwalnianiem neuroprzekaźników. Ponadto jest on użyteczny w badaniach nad neuromodulacją, synaptogenezą i plastycznością synaptyczną. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować wymagane roztwory zgodnie z towarzyszącym rękopisem. Następnie należy wykonać co najmniej dwa narzędzia do mikrosekcji, przyklejając szpilkę minuchin do końcówki szklanej pipety Pasteura.Używając akrylowego kleju Sano, należy pozwolić, aby ostry koniec szpilki wystawał poza koniec pipety o około 0,5 centymetra. Na dwa dni przed przygotowaniem kultur należy zidentyfikować parę XUS gotową do rozrodu, obserwując wyraźną czerwonawą skórkę (aika) u samicy oraz ciemną pigmentację na płaskiej powierzchni przednich łap samca. Następnie każdą żabę należy złapać w siatkę i przytrzymać ją w zlewie brzuchem do dołu, używając siatki w taki sposób, aby zwierzę nie mogło uciec.Wstrzyknij 1 mL HCG przez siatkę, podskórnie do jednego z grzbietowych worków limfatycznych, aby zapobiec podeptaniu nowo złożonych i zapłodnionych jaj przez zwierzęta. Zamontuj dno z siatki o oczkach o wielkości 0,5 cala, dopasowując ją na wysokość od 1 do 2 cali u dołu zbiornika. Następnie umieść parę hodowlaną razem w przykrytym zbiorniku z wodą o pojemności 10 galonów.Pozostaw żaby w spokoju od 12 do 48 godzin, aż na dnie pod siatką pojawią się zapłodnione jaja. Następnie usuń zwierzęta z akwarium, pozostawiając jaja w spokoju przez co najmniej kolejne 24 godziny. Tę parę żab można ponownie rozmnożyć po sześciu tygodniach.Następnie poluzuj zarodki z dna zbiornika i przenieś je do czterech lub pięciu szalek hodowlanych o wymiarach 60 na 15 mm zawierających 10% soli fizjologicznej. Posegreguj zarodki według stadium zgodnie ze schematem New Coupe i Fabera; idealne są zarodki o gładkim wyglądzie z jasnobrązowym i białym cieniowaniem, podobne do tych po lewej stronie. Z kolei zarodki posiadające duże czarne lub białe plamy, jak te po prawej stronie, są zazwyczaj niezdrowe i nieprzydatne.Wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza należy opisać i wypełnić mniej więcej do połowy sterylne szalki Petriego o wymiarach 360 by 15 millimeter roztworem 10%saline, a jedną z nich medium CMF. Używając sterylnej szklanej pipety Pasteura, należy przenieść od pięciu do 10 zarodków w stadium 22 to 24 do jednej z szalek zawierających 10%saline. Korzystając z mikroskopu stereoskopowego znajdującego się wewnątrz komory, należy usunąć otoczkę galaretowatą i błonę witelinową z każdego zarodka za pomocą dwóch par sterylnych pęset. Nagie zarodki należy przemyć, przenosząc je pojedynczo przez pozostałe dwie szalki z 10%saline, a na koniec do szalki zawierającej CMF.Następnie należy delikatnie, lecz pewnie chwycić każdy embrion pęsetą i za pomocą narzędzia do mikrodysekcji usunąć rurkę neuralną oraz powiązane z nią miotomy, które znajdują się w najbardziej grzbietowej części zwierzęcia. Należy to zrobić, wykonując trzy cięcia: jedno na każdym z końców rurki neuralnej oraz trzecie tuż poniżej niej, w stronie brzusznej. Następnie każdą wypreparowaną rurkę neuralną wraz z miotomami należy przenieść w czystą część szalki, z dala od granulek żółtka i innych zanieczyszczeń.Po około 15 minutach w CMF należy za pomocą pęsety oddzielić pigmentowaną skórę od rozdzielonej tkanki i usunąć skórę. Po kolejnych 30 do 60 minutach komórki utworzą osad w postaci kopca w miarę jak będą się od siebie oddzielać. W tej procedurze należy rozmrozić probówkę o pojemności 10 ml pożywki hodowlanej, następnie odmierzyć 70 µl ITS w stężeniu 35 ng/ml, etykietę BDNF i wypełnić sterylne szalki hodowlane o średnicy 35 mm mniej więcej do połowy pożywką L 15.Użyj jednej szalki hodowlanej dla każdego wypreparowanego zarodka. Aby wykonać pipetę do wysiewu, chwyć oba końce szklanej pipety Pasteura i umieść zwężoną część nad płomieniem. Następnie rozciągnij końce do odległości około 10 centymetrów.Następnie odłam koniec, aby uzyskać końcówkę o długości około 0.2 milimetrów. Po tym czasie, użyj pipety do wysiewu, aby zassać stos piasku z jednego embrionu. Należy uważać, aby zminimalizować ilość pobranego roztworu.Następnie przenieś komórki na dno naczynia hodowlanego i rozłóż je w kilku liniach. Pozostaw naczynia z wysianymi komórkami bez ingerencji przez co najmniej 15 minut, aby umożliwić im przytwierdzenie się do dna naczynia. Po 12 do 24 godzinach hodowli wysiane komórki wykształcą wyraźne cechy morfologiczne.Na przykład komórki mięśniowe przyjmują kształt wrzecionowaty, a neurony rdzeniowe rozwijają długie wypustki. Funkcjonalny kontakt synaptyczny między varicosities a komórkami mięśniowymi można potwierdzić za pomocą jednoczesnych sparowanych pomiarów elektrofizjologicznych. W tym celu należy przygotować dwie elektrody patch-clamp do rejestracji: jedną dla presynaptycznej varicosity i jedną dla komórki mięśniowej.Następnie należy napełnić elektrodę presynaptyczną roztworem zawierającym info terin, a elektrodę postsynaptyczną wewnętrznym roztworem potasu. Po tym czasie należy wymienić medium w naczyniu hodowlanym na NFR. Następnie próbkę przenosi się pod mikroskop odwrócony wyposażony w optykę kontrastu fazowego, wykonuje patch presynaptycznego zgrubienia przy użyciu elektrody zawierającej amfoterycynę oraz patch komórki mięśniowej postsynaptycznej przy użyciu drugiej elektrody w celu potwierdzenia funkcjonalności synapsy, depolaryzuje zgrubienie za pomocą wzmacniacza patch clamp i obserwuje jednoczesne prądy presynaptyczne i postsynaptyczne.Rysunek ten przedstawia powiększenie pięciokrotne komórek i hodowli bezpośrednio po wysiewaniu, a tutaj ta sama hodowla przy powiększeniu 40-krotnym. Przedstawiono tutaj złącze nerwowo-mięśniowe w hodowli, na którym widoczne jest ciało neuronu, zakończenie presynaptyczne (zgrubienie) oraz postsynaptyczna komórka mięśniowa. Pokazano tutaj prądy presynaptyczne i postsynaptyczne.W odpowiedzi na przyłożone do wypukłości presynaptycznej inkrementalne skoki napięcia o wartości 10 mV, w zakresie od -30 mV do +40 mV, potencjał spoczynkowy obu komórek wynosił -70 mV. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w około dwóch godzinach. Żywe kultury komórkowe można uzyskać już po 24 godzinach i utrzymywać przez kilka dni. Przygotowanie to jest stosowane od wielu lat, pomagając wyjaśnić niektóre z podstawowych właściwości przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego.Mamy nadzieję, że ten film umożliwi dalsze odkrycia, pomagając badaczom lepiej zapoznać się z tą potężną i prostą techniką.

simultaneous-pre-post-synaptic-electrophysiological-recording-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jednoczesne pre- i postsynaptyczne rejestrowanie elektrofizjologiczne z Xenopus współhodowanych kultur nerwowo-mięśniowych

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Mięsień otwierający odnóża raków został zaprezentowany ze względu na jego historyczne znaczenie oraz wszechstronność eksperymentalną w badaniach nad fenotypem mięśni, fizjologią synaptyczną i plastycznością.

Historyczne ujęcie i demonstracja fizjologii złącza neuromięśniowego mięśnia otwieracza raków

Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzać rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi synaptycznych w mięśniu prostowniku nogi chodu raka oraz w jaki sposób wizualizować zakończenia nerwowe, aby wykazać ogólne różnice morfologiczne między zakończeniami nerwowymi o wysokiej i niskiej wydajności.

Rejestracje fizjologiczne złącza nerwowo-mięśniowego o wysokiej i niskiej wydajności w mięśniu prostowniku nogi raka

Ta nowa metoda umożliwia jednoczesną rejestrację wewnątrzkomórkową pojedynczego motoneuronu dorosłej myszy oraz pomiar siły generowanej przez jego włókna mięśniowe. Połączone badanie właściwości elektrycznych i mechanicznych jednostek motorycznych u zwierząt zdrowych i modyfikowanych genetycznie stanowi przełom w badaniach nad układem nerwowo-mięśniowym.

Symultaniczne rejestrowanie wewnątrzkomórkowe lędźwiowego motoneuronu oraz siły generowanej przez jego jednostkę motoryczną u dorosłej myszy in vivo

Ten film prezentuje nagrania elektrofizjologiczne z organotypowych kokultur wycinków rdzenia kręgowego, uchwycone za pomocą matrycy wieloelektrodowej lub urządzenia MEA. Nagrania te oceniają regenerację neuronów między warstwami. Zaobserwowana zsynchronizowana aktywność elektryczna potwierdza udaną regenerację neuronów.

Zapisy elektrofizjologiczne do oceny regeneracji neuronów w współhodowanych wycinkach rdzenia kręgowego

Ten film demonstruje procedurę użycia matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D. Metoda ta pozwala zrozumieć dynamikę sieci neuronowych i aktywność impulsów sieci synaptycznych w sferach 3D.

Wykorzystanie matryc wieloelektrodowych do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.

Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica

Prądy synaptyczne mogą być rejestrowane ogniskowo z wizualizowanych bulionów synaptycznych w trzecim stadium rozwojowym połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego.

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

W tym artykule omawiamy trzy preparaty mózgowe używane do rejestracji klamer z całych komórek w celu zbadania obwodu siatkówkowego kijanek Xenopus laevis. Każdy preparat, z własnymi specyficznymi zaletami, przyczynia się do eksperymentalnej wykonalności kijanki Xenopus jako modelu do badania funkcji obwodów neuronalnych.

Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

Poznaj metodę jednoczesnego pre- i postsynaptycznego zapisu elektrofizjologicznego z kokultur nerwowo-mięśniowych Xenopus. Technika ta umożliwia badanie fiziologii synaptycznej i uwalniania neuroprzekaźników.

Jednoczesny pre- i postsynaptyczny zapis elektrofizjologiczny z kokultur nerwowo-mięśniowych Xenopus

Przeglądaj więcej filmów