Name: Analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T19:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj metodę izolacji włókien mięśniowych szkieletu z zarodków i larw Danio rerio. Technika umożliwia szczegółową analizę morfologii pojedynczych włókien mięśniowych oraz lokalizacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować członkom laboratorium Dowlinga (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta i William Telfer), którzy przyczynili się do rozwoju techniki i produkcji manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez Instytut Taubmana, Wydział Pediatrii Uniwersytetu Michigan oraz częściowo z grantów Stowarzyszenia Dystrofii Mięśniowej (JJD MDA186999) i Narodowych Instytutów Zdrowia (JJD 1K08AR054835).

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną (Czas: 1 godz.)
Powłoka szkiełek nakrywkowych pozwala na szybkie osadzanie się i przyleganie włókien mięśniowych. Można to wykonać podczas etapu dysocjacji izolacji włókien mięśniowych (krok 2 poniżej).
<ol>
	<li>Wytnij i umieść Parafilm na dnie szalki Petriego o średnicy 60 mm (dowolnej marki).</li>
	<li>Umieścić szkiełka nakrywkowe mikroskopu (o średnicy 12 mm) na Parafilm w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm lub umieścić je pojedynczo w pojedynczych dołkach z płytkami 24-dołkowymi.</li>
</ol>
Uwaga 1: Te małe okrągłe szkiełka nakrywkowe pomagają skoncentrować liczbę włókien mięśniowych i zmniejszyć nadmierne użycie przeciwciał.
Uwaga 2: Szkiełka nakrywkowe o innych rozmiarach będą działać; jednak objętości używanych odczynników i zarodków będą musiały być odpowiednio dostosowane.
<ol start="3">
	<li>Odmierzyć pipetą 50-200 μl roztworu poli-L-lizyny (0,01%) na każde szkło nakrywkowe na szalce Petriego.</li>
	<li>Pozostawić szkiełka nakrywkowe na co najmniej godzinę w temperaturze 37 °C. Dłuższe inkubacje nie wpłyną negatywnie na wyniki.</li>
	<li>Usunąć roztwór poli-L-lizyny ze szkła nakrywkowego i przemyć dwukrotnie co najmniej 100 μl 1x PBS.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe są teraz gotowe na włókna mięśniowe.</li>
</ol>
Uwaga 3: Aby zapewnić sterylność, powłokę można wykonać w kapturze i na autoklawowanych szkiełkach nakrywkowych.
Uwaga 4: Trzymaj 60-milimetrową szalkę Petriego z Parafilmem na dnie. Ta konfiguracja będzie używana podczas powlekania włókien mięśniowych i znakowania immunologicznego (późniejsze kroki).
Alternatywa 1: Zamiast powlekania szkiełek nakrywkowych bezpośrednio przed użyciem, można użyć powlekanego materiału na szkiełko nakrywkowe. Szalka Petriego o średnicy 60 mm zawierająca co najmniej 2 ml poli-L-lizyny może być przechowywana w temperaturze 4 °C i zawiera liczne szkiełka nakrywkowe. W przypadku tej alternatywy zacznij od kroku 1.5, aby przetworzyć szkiełka nakrywkowe na włókna mięśniowe.
Alternatywa 2: Również pokrywamy szkiełka nakrywkowe poli-L-ornityną. Jest to bardziej pracochłonne, ale jest przydatne w przypadku hodowli długoterminowej, ponieważ szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-ornityną mogą być poddawane obróbce UV. Dzięki leczeniu promieniowaniem UV i starannej sterylnej technice, żywe włókna mięśniowe można zazwyczaj utrzymać w hodowli przez 4-7 dni.
2. Dysocjacja zarodków danio pręgowanego i posiewanie włókien mięśniowych (Czas: 1 do 3 godzin)
Uwaga: standardowy protokół najlepiej stosuje się do zarodków o wartości 3 dpf (dni po zapłodnieniu).
<ol>
	<li>Przenieś zarodki danio pręgowanego do standardowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i usuń jak najwięcej nadmiaru wody dla ryb. Zazwyczaj 10-20 zarodków w probówce, choć można użyć mniej. Użycie więcej niż 20-25 zarodków często powoduje przygotowanie nadmiernej gęstości.
	<ol>
		<li>Usuń kosmówkę przed dysocjacją, ręcznie za pomocą kleszczy #5. Alternatywnie, chemiczne usuwanie kosmówki uzyskuje się za pomocą 10-15 minutowego zabiegu Pronase. Zazwyczaj wcześniejsze usunięcie kosmówki jest konieczne tylko wtedy, gdy wymagane jest wcześniejsze potwierdzenie zmutowanego fenotypu lub morfologii lub gdy stosuje się etapy, w których zarodki są naturalnie wykluwane z ich kosmówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 900 μl pożywki niezależnej od CO2 do probówki zawierającej zarodki.</li>
	<li>Dodać 100 μl kolagenazy typu II, końcowe stężenie 3,125 mg/ml (podstawowy roztwór kolagenazy o stężeniu 31,25 mg/ml rozcieńczony w 1x PBS), aby rozpocząć dysocjację. Kolagenaza IV może być również stosowana do dysocjacji.</li>
	<li>Obracaj zarodki na wytrząsarce orbitalnej i dziel się trituracją co 30 minut w RT za pomocą Pipetmana P1000 do trituracji.</li>
</ol>
Uwaga 2: Uważnie monitoruj dysocjację zarodków; nadmierna lub niedostateczna dysocjacja (szczególnie nad) to najczęstsze przyczyny niepowodzenia protokołu. Czas trawienia będzie się różnić w zależności od intensywności rozdrobnienia, liczby zarodków w probówce i wieku zarodków. Jest też często mniejsza (w porównaniu z typami dzikimi) w przypadku zarodków z mutantów mięśni szkieletowych.
Uwaga 3: Średni czas trawienia na wiek zarodka: 1 dpf = 1 godzina, 2 dpf = 1,5 godziny, 3 dpf = 2 godziny i 4 dpf = 2-2,5 godziny.
<ol start="5">
	<li>Przerwij trawienie, gdy nie widać całych zarodków, ale nadal widoczne są stałe kawałki - jest to niezbędne, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu.</li>
	<li>Probówki wirówkowe ze zdysocjowanymi zarodkami w ilości 0,8-2,3 x g przez 3-5 minut do osadzania komórek.</li>
	<li>Usunąć supernatant z granulowanych komórek i przemyć 2x pożywką niezależną od CO2</li>.
	<li>Dodaj świeże podłoże niezależne od CO2 w celu ponownego zawieszenia komórek. 1 ml jest zwykle używany do przygotowania 10-20 zarodków. Objętość można skalować na podstawie liczby zarodków.</li>
	<li>Za pomocą pipety P1000 przepuścić zawiesinę zarodków przez filtr 70 μm. Pomaga to usunąć niechciane zanieczyszczenia z preparatu.</li>
</ol>
Uwaga 4: Zawiesina zarodków może być przefiltrowana po raz drugi przez filtr 40 μm, aby dalej usunąć niechciane zanieczyszczenia. Po podwójnej filtracji odzysk wynosi około 800 μl z początkowej objętości 1 ml.
<ol start="10">
	<li>Dodać około 50-100 μl zawiesiny włókien mionowych do każdego szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną.</li>
</ol>
Uwaga 5: Wykonaj krok 2.9 na szalkach Petriego z Parafilmem na dnie, wcześniej przygotowanym. Parafilm zapobiega spływaniu zawiesiny włókien mięśniowych z powlekanych szkiełek nakrywkowych. Szalki Petriego należy przykryć, aby zapobiec parowaniu.
<ol start="11">
	<li>Pozwól włókien mięśniowych osiąść na powlekanych szkiełkach nakrywkowych przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Uwaga 6: Włókna mięśniowe zaczną się osadzać w ciągu 5-10 minut. Jednak dla dobrego przyczepienia włókien mięśniowych zaleca się co najmniej 1 godzinę (1-2 godziny). Pozostawienie włókien mięśniowych na dłuższe osiadanie nie zaszkodzi przygotowaniu. W przypadku dłuższych inkubacji (w tym przez noc) do pożywki można dodawać antybiotyki. Dzięki antybiotykom i sterylnej technice żywe kultury mogą być zwykle utrzymywane przez 1-2 dni.
<ol start="12">
	<li>W tym momencie można zaobserwować żywe włókna mięśniowe. Włókna mięśniowe z zarodków 2 dpf i późniejszych będą widoczne jako komórki prążkowane i wydłużone (ryc. 1). W tym momencie włókna mięśniowe są teraz gotowe do analizy na żywo lub do znakowania immunologicznego.</li>
</ol>
Uwaga 7: Mięśnie szkieletowe z zarodków 1 dpf nie pokrywają się jako wydłużone i wyraźnie prążkowane włókna. Zamiast tego widoczne są duże miokule. Ponadto, podczas fazy granulowania po dysocjacji (krok 2.6), 1 dpf miokulek musi być odwirowywana przez co najmniej 8 minut przy 5,000 x g, aby uzyskać osad. Do analizy zarodków na tym etapie zaleca się stosowanie linii transgenicznej wykazującej ekspresję EGFP specyficznie w mięśniach szkieletowych23. Umożliwi to identyfikację komórek pochodzenia mięśniowego w porównaniu z innymi źródłami.
3. Barwienie immunologiczne fluorescencji zdysocjowanych włókien mięśniowych danio pręgowanego (czas: około 1 dzień)
3.1. Znakowanie immunologiczne
<ol>
	<li>Usuń część podłoża z włókien mięśniowych przyklejonych do powlekanego szkiełka nakrywkowego</li>
	<li>Napraw komórki za pomocą 4% paraformaldehydu lub metanolu. W przypadku PFA usuń 1/2 objętości nośnika i zastąp taką samą ilością PFA. Utrwalaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usuń całkowitą objętość, zastąp 50-100 μl PFA i utrwalaj przez dodatkowe 10 minut. Do utrwalania alkoholu można stosować lodowaty metanol lub aceton w temperaturze 4 °C odpowiednio przez 10 minut lub 5 minut.</li>
	<li>Umyj włókna mięśniowe co najmniej 3-5 razy za pomocą 1x PBS lub 1x PBS plus 0,1% TWEEN. Średnia objętość prania wynosi 50-100 μl na szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Dodać roztwór blokujący do włókien mięśniowych (materiał roboczy) i inkubować 20-60 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór blokujący będzie się różnić w zależności od przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Dwa najczęściej stosowane w laboratorium to (1) 1x PBS, 2 mg/ml BSA, 1% surowica owcza, 0,25% Triton X-100 final i (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg/ml (0,2% BSA) i 5% surowica owcza/kozia.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym lub PBS. Inkubować włókna mięśniowe przez noc w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że folia lub owiń saran szalkę Petriego zawierającą szkiełka nakrywkowe obciążone miofibrą pokryte przeciwciałem. Można dodać małe kawałki zwilżonego ręcznika papierowego, aby stworzyć nawilżoną komorę.</li>
	<li>Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe z szkiełek nakrywkowych i przemyć szkiełka nakrywkowe 3-5 razy przez 5 minut PBS lub roztworem blokującym.</li>
	<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe o odpowiednim stężeniu rozcieńczone w 1x PBS lub roztworze blokującym przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń przeciwciało wtórne i przemyj włókna mięśniowe 3-5x w PBS przez 5 minut każde w RT.</li>
</ol>
3.2. Montaż szkiełek nakrywkowych
<ol start="9">
	<li>Nałóż 1-2 krople odczynnika zapobiegającego blaknięciu na szkiełko mikroskopowe.</li>
	<li>Ostrożnie podnieś powlekane i immunologiczne szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umieść (włóknami mięśniowymi w dół) szkiełko nakrywkowe na odczynniku zapobiegającym blaknięciu na szkiełku mikroskopowym.</li>
</ol>
Uwaga 1: Uwaga na orientację powlekanego szkiełka nakrywkowego jest kluczowa.
<ol start="11">
	<li>Połóż 1-2 chusteczki Kimwipes na twardej, twardej powierzchni. Szybko odwróć szkiełko podstawowe z powlekanymi szkiełkami nakrywkowymi spoczywającymi na odczynniku zapobiegającym blaknięciu i umieść je (szkiełko nakrywkowe w dół) na chusteczkach Kimwipes.</li>
	<li>Lekko dociśnij rogi szkiełka mikroskopowego, aby usunąć nadmiar płynu zapobiegającego blaknięciu i utworzyć szczelne uszczelnienie między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym</li>
	<li>Pozostaw płyn zapobiegający blaknięciu do wyschnięcia przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie włókna mięśniowe są gotowe do obrazowania (rysunki 2A i B) lub przechowywania w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Obrazowanie wapnia na żywych komórkach za pomocą GCaMP3
Eksperymenty z żywymi komórkami mogą być przeprowadzane na włóknach mięśniowych przed fiksacją (po kroku 2.10). Poniższy protokół opisuje obrazowanie na żywo we włóknach mięśniowych wykazujących ekspresję GCaMP324, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia, wyrażanego przez specyficzny dla mięśni szkieletowych promotor α-aktyny danio pręgowanego (pSKM)23. Alternatywnie, technikę tę można łatwo dostosować do stosowania barwników wskaźnikowych wapnia, takich jak Fura-2.
<ol>
	<li>Wstrzyknąć zarodkom pSKM: konstrukt GCaMP3 w stadium 1-2 komórek</li>
	<li>Przy 3 dpf zebrać larwy i przygotować włókna mięśniowe zgodnie z opisem w sekcjach 1 i 2. Pozwól włókien mięśniowych przylegać przez co najmniej 1 godzinę. Do tej techniki wymagane jest przygotowanie szkiełek nakrywkowych w naczyniach 24-dołkowych.</li>
	<li>Ostrożnie usuń nadmiar pożywki i dodaj 300 μl świeżych niezależnych pożywek CO2 w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem. Włókna mięśniowe GCaMP3 dodatnie powinny być widoczne pod wpływem zielonej fluorescencji.</li>
	<li>W razie potrzeby skonfiguruj kamerę do nagrywania.</li>
	<li>Przygotować 30 mM roztwór kofeiny w pożywce niezależnej od CO2 . Aby pobudzić komórki, delikatnie odpipetuj 300 μl roztworu kofeiny do powiększonej studzienki. W ciągu 5-10 sekund włókna mięśniowe GCaMP dodatnie powinny reagować na kofeinę szybkim wzrostem fluorescencji (ryc. 3). Włókna mięśniowe mogą również się kurczyć. Warto zauważyć, że kofeina indukuje uwalnianie wapnia z zapasów retikulum sarkoplazmatycznego25. Inne środki, takie jak KCl26 i ryanodine4, mogą być stosowane do badania indukowalnego uwalniania wapnia.</li>
</ol>

<ol><li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).</li>
<li>Bannister, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+myoplasmic+gap%3A+recent+developments+in+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).</li>
<li>Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+defects+and+disorders+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Nerve%22%5BJournal%5D)">Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction.</a> Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).</li>
<li>Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors%3A+structure%2C+expression%2C+molecular+details%2C+and+function+in+calcium+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li>
<li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+diversity%3A+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li>
<li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+steps+of+myofibril+assembly%3A+integrins+pave+the+way%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).</li>
<li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dystrophin+glycoprotein+complex%3A+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Barresi, R., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystroglycan%3A+from+biosynthesis+to+pathogenesis+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease.</a> J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).</li>
<li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+frequencies+of+inherited+neuromuscular+diseases-a+world+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey.</a> Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).</li>
<li>Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+myopathies%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neurol.+Neurosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Congenital myopathies: an update.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).</li>
<li>Bassett, D. I., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+muscular+dystrophy+and+congenital+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy.</a> Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).</li>
<li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5, (2009).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+Zebrafish+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of the Zebrafish system.</a> Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li>
<li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease%3B+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).</li>
<li>Schredelseker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+1a+subunit+is+essential+for+the+assembly+of+dihydropyridine-receptor+arrays+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li>
<li>Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+MTMR14+is+required+for+excitation-contraction+coupling%2C+developmental+motor+function+and+the+regulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).</li>
<li>Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+restoration+of+excitation-contraction+coupling+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1-null+zebrafish+relaxed+is+an+exclusive+function+of+the+beta1a+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit.</a> J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).</li>
<li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-sense+mutations+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1+gene%2C+CACNB1%2C+paralyze+zebrafish+relaxed+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants.</a> Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).</li>
<li>Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevation+of+intracellular+calcium+in+smooth+muscle+causes+endothelial+cell+generation+of+NO+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((accordion%2C+a+zebrafish+behavioral+mutant%2C+has+a+muscle+relaxation+defect+due+to+a+mutation+in+the+ATPase+Ca2%2B+pump+SERCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1.</a> Development. 131, 5457-5468 (2004).</li>
<li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li>
<li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li>
<li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li>
<li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li>
<li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li>
<li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Ca2%2B-conducting+Ca2%2B+channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Danio pręgowany to potężny system modelowy kręgowców do badania rozwoju i funkcji mięśni in vivo25,27,28 . Okazały się również cennym zasobem w modelowaniu chorób mięśni u ludzi14,15,20,29 . Chociaż poczyniono ogromne postępy w celu przyspieszenia wykorzystania i zastosowania danio pręgowanego do badania funkcji mięśni i chorób mięśni, istnieje ciągła krytyczna potrzeba opracowania narzędzi, które pozwolą na bardziej dogłębną analizę, która uzupełni genetyczne, morfologiczne, behawioralne i...

Mięsień szkieletowy to wysoce wyspecjalizowana tkanka odpowiedzialna za generowanie sił skurczowych niezbędnych do motoryki. Skurcz jest inicjowany w procesie znanym jako sprzężenie wzbudzenie-skurcz (EC), który przekształca sygnały elektryczne w uwalnianie wapnia z zapasów wewnątrzkomórkowych1,2 . Wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia aktywuje sarkomer do skrócenia i wytworzenia siły. Wiele specyficznych składników maszynerii molekularnej odpowiedzialnych za pośredniczenie w przekazywaniu połączeń nerwowo-mięśniowych3, sprzężeniu EC4,5 i skurczach zależnych od aktyny-miozyny6 nadal jest przedmiotem intensywnych badań. Ponadto zidentyfikowano i zbadano bardzo szczegółowo białka, które stabilizują błonę mięśniową podczas skurczu7,8 i pośredniczą w sygnalizacji między włóknem mięśniowym a macierzą zewnątrzkomórkową7,9.
Mutacje w wielu genach ważnych dla struktury i funkcji mięśni zostały zidentyfikowane jako przyczyny chorób mięśni szkieletowych u ludzi (<a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a>). Choroby te, klasyfikowane ogólnie jako miopatie szkieletowe i dystrofie mięśniowe na podstawie cech klinicznych i histopatologicznych, są związane z osłabieniem mięśni, niepełnosprawnością przez całe życie i wczesną śmiertelnością10,11 . Danio pręgowany okazał się znakomitym systemem do modelowania i badania chorób mięśni szkieletowychu ludzi 8,12,13 . Został on wykorzystany do walidacji nowych mutacji genów8, zdefiniowania nowych aspektów patofizjologii choroby14,15 oraz identyfikacji nowych podejść terapeutycznych15,16 . Moc danio pręgowanego w badaniu chorób mięśni u ludzi wiąże się z dużą liczbą potomstwa, szybkim rozwojem struktury i funkcji mięśni, jasnością optyczną zarodka danio pręgowanego oraz łatwością manipulacji genetycznej i farmakologicznej rozwijającego się danio pręgowanego17.
My i inni12,18,19 opracowaliśmy ostatnio prostą technikę szybkiej i efektywnej izolacji włókien mięśniowych od rozwijającego się danio pręgowanego. Metodologia ta umożliwiła bardziej szczegółowe badanie włókien mięśniowych niż jest to możliwe w przypadku analizy całego zarodka. Technika ta została wykorzystana do scharakteryzowania lokalizacji subkomórkowej białek20, a także do identyfikacji ważnych cech histopatologicznych w ramach badań walidacyjnych w nowo opracowanych modelach choroby21. Co więcej, izolowane włókna mięśniowe mogą być dodatkowo wykorzystywane do obrazowania na żywo i do badań elektrofizjologicznych22, technik, które pozwalają na badanie kluczowych aspektów funkcjonowania mięśni. Szczegółowy protokół izolacji włókien mięśniowych, wraz z dwoma przykładami późniejszych eksperymentów analitycznych, jest szczegółowo opisany w pozostałych częściach tego manuskryptu.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>hodowlana Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Niezależna pożywka</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004186</td><td>Lot 41H12764</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Worthington</td><td>Biochemical L5004188</td><td></td></tr><tr><td>8% Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Surowica owcza</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtr</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtr</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik przeciw blaknięciu Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-&alfa-aktyninowe</td><td>Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-RYR</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Przeciwciało fluorowe</td><td>Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>60 mm szalka Petriego</td><td>Fischerbrand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornityna</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Fischerbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Kofeina</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Danio pręgowany okazał się cennym modelem do badania funkcji mięśni szkieletowych i do badania chorób mięśni ludzkich. Pomimo wielu zalet oferowanych przez analizę in vivo mięśni szkieletowych u danio pręgowanego, wizualizacja złożonego i drobno ustrukturyzowanego środowiska białkowego odpowiedzialnego za funkcjonowanie mięśni, zwłaszcza w całych zarodkach, może być problematyczna. Przeszkoda ta wynika z niewielkich rozmiarów mięśni szkieletowych danio pręgowanego (60 μm) i jeszcze mniejszych rozmiarów sarkomeru. Tutaj opisujemy i demonstrujemy prostą i szybką metodę izolowania włókien mięśniowych szkieletu z zarodków i larw danio pręgowanego. Dołączamy również protokoły, które ilustrują techniki postprepakuracji przydatne do analizy struktury i funkcji mięśni. W szczególności szczegółowo opisujemy późniejszą immunocytochemiczną lokalizację białek mięśni szkieletowych oraz analizę jakościową stymulowanego uwalniania wapnia za pomocą obrazowania wapnia w żywych komórkach. Ogólnie rzecz biorąc, ten artykuł wideo przedstawia prostą i skuteczną metodę izolacji i charakterystyki włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego, technikę, która stanowi kanał dla niezliczonych późniejszych badań nad strukturą i funkcją mięśni.

Fluorescencyjne znakowanie immunologiczne włókien mięśniowych (Rysunek 2) 
Obrazy przedstawiające oczekiwany wzór znakowania fluorescencyjnego włókien mięśniowych poddanych immunostynowaniu po pomyślnej izolacji i wysiewie. Włókna mięśniowe zostały znakowane przeciwciałami przeciwko receptorowi ryanodyny (1:100) (Rycyna 2A) lub przeciwko α-aktyninie (1:100) (Rycina 2B), co ujawnia odpowiednio immunostynowanie triady oraz prążka Z. Jak...

Danio pręgowany to nowy system do modelowania zaburzeń mięśni szkieletowych u ludzi. Opisujemy szybką i skuteczną metodę izolowania włókien mięśniowych mięśni szkieletowych od embrionalnego i larwalnego danio pręgowanego. Metoda ta pozwala uzyskać preparat z włókien mięśniowych o dużej gęstości, odpowiedni do badania morfologii pojedynczych włókien mięśni szkieletowych, lokalizacji subkomórkowej białek i fizjologii mięśni.

Analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Ogólnym celem tej procedury jest wydajne wyizolowanie włókien mięśni odszczepowych z embrionów i larw danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez przygotowanie szkiełek podstawowych pokrytych poli-L-lizyną, a następnie dysocjację embrionów danio pręgowanego od jednego do czterech dni po zapłodnieniu. Następnie wyizolowane z dysocjowanych embrionów włókna mięśniowe są wysiewane na szkiełka podstawowe pokryte polilizyną.Na koniec włókna mięśniowe są utrwalane, barwione i obrazowane w celu analizy białek mięśniowych. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące lokalizację subkomórkową białek mięśniowych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza całego zarodka, jest możliwość bardziej szczegółowego badania morfologii i fizjologii pojedynczych włókien mięśniowych.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad mięśniami, takie jak te dotyczące subkomórkowej lokalizacji białek, i może być łączona z obrazowaniem wapnia w żywych komórkach. Zastosowania tej techniki obejmują walidację modeli chorób mięśni u rybek zebrafish, ponieważ może ona służyć do wizualizacji patognomonicznych nieprawidłowości strukturalnych związanych z ludzkimi schorzeniami. Może ona również pomóc w identyfikacji nowych aspektów chorób mięśni.Patogeneza Poprzez tę metodę można uzyskać wgląd w strukturę i funkcję mięśni. Może ona zostać zastosowana również w innych badaniach, takich jak choroby mięśni szkieletowych u ludzi. Aby przygotować się do dysocjacji embrionów danio pręgowanego, przygotuj szkiełka nakrywkowe, wycinając je i umieszczając na dnie 60 milimetrowej szalki Petriego.Następnie należy położyć szkiełka nakrywki na tacy i nanieść pipetą od 50 do 200 µL roztworu polilizyny na każde szkiełko. Inkubować szkiełka nakrywki w temperaturze 37 °C przez co najmniej jedną godzinę, po czym usunąć roztwór polilizyny i przemyć je dwukrotnie 100 µL PBS. Pozostawić szkiełka nakrywki do wyschnięcia, a następnie przechowywać je w przykrytym naczyniu.Do dysocjacji embrionów. Przenieść embriony danio pręgowanego w 10. do 23. doby po zapłodnieniu do standardowej probówki do wirowania o pojemności 1,5 ml i usunąć jak największą ilość nadmiaru wody z rybami. Do probówki pipetować 900 µl pożywki niezależnej od dwutlenku węgla.Następnie dodaj 100 µL kolagenazy typu two or four w stężeniu 3,125 mg/mL, aby rozpocząć dysocjację. Inkubuj zarodki na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej, a co 30 minut pipetuj próbkę za pomocą pipety P 1000, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu, aż do momentu, gdy nie będą już widoczne całe zarodki, lecz obecne będą stałe fragmenty. Przerwij reakcję, pelletując próbki przy przeciążeniu od 0,8 do 2,3 ×g przez trzy do pięciu minut.Usunąć supernatant i przemyć dwukrotnie medium niezależnym od dwutlenku węgla. Przepuścić zawiesinę przez filtr o gęstości 70 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń, a następnie nanieść około 50 do 100 µL zawiesiny włókien mięśniowych na każde szkiełko podstawowe pokryte poli-L-lizyną. Pozostawić włókna mięśniowe do osadzenia się na godzinę w temperaturze pokojowej, a po utrwaleniu i immunoznakowaniu włókien zgodnie z protokołem tekstowym, przystąpić do montowania preparatu.Przykryj preparat, nakładając najpierw jedną lub dwie krople odczynnika przeciwko blaknięciu na szkiełko przedmiotowe. Za pomocą pęsety ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe, odwróć je i połóż na kroplach odczynnika na szkiełku przedmiotowym. Następnie połóż jedną lub dwie chusteczki na twardej, płaskiej powierzchni i szybko odwróć szkiełko, kładąc je na chusteczkach.Wywrzeć lekki nacisk na rogi szkiełka, aby usunąć nadmiar odczynnika Antifa i zapewnić szczelne przyleganie szkiełka podstawowego do nakrywki. Pozostawić preparaty do wyschnięcia przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem lub przechowywać w temperaturze 4 °C. Przedstawione tutaj włókna mięśniowe, znakowane immunofluorescencyjnie przeciwko receptorowi anodyne i alfa-aktyninie, ujawniają odpowiednio triadę oraz linię Z.W poprzednich badaniach wykorzystaliśmy izolowane włókna mięśniowe (myop) do określenia subkomórkowej lokalizacji białek mięśniowych, badania lokalizacji ekspresowanych transgenów chimerycznych oraz zdefiniowania specyficznych parametrów włókien mięśniowych, w tym ich wielkości. Niniejsza rycina przedstawia prawidłowe uwalnianie wapnia indukowane kofeiną w włóknach myop wykazujących ekspresję konstruktu PSKM GCaMP three.Technika opisana w protokole tekstowym może być wykorzystana do badania aparatu sprzężenia wzbudzenia ze skurczem za pomocą obrazowania na żywo po przeprowadzeniu tej procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak obecność wad w sprzężeniu wzbudzenia ze skurczem po jego rozwoju, można zastosować inne metody, np. obrazowanie wapnia na żywo. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie chorób mięśni do przeprowadzania badań walidacyjnych nowo zidentyfikowanych genów chorób mięśni oraz określania nowych aspektów patogenezy tych schorzeń.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak izolować pojedyncze komórki FBS z embrionów zebrafish.

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza miofibrili szkieletu zarodkowego i larw rybki zebry z dysocjowanych preparatów

Pomiary siły mogą być użyte do pokazania zmian w funkcjonowaniu mięśni spowodowanych rozwojem, kontuzją, chorobą, leczeniem lub toksycznością chemiczną. W tym filmie pokazujemy metodę pomiaru siły podczas maksymalnego skurczu mięśnia tułowia larw danio pręgowanego.

Pomiar siły podczas skurczu w celu oceny funkcji mięśni u larw danio pręgowanego

Danio pręgowany jest teraz sprawdzonym i potężnym narzędziem do modelowania dystrofii mięśniowych, wrodzonych miopatii i pokrewnych chorób nerwowo-mięśniowych. Dwójłomność i zachowanie ucieczki wywołane dotykiem to dwa powszechne nieinwazyjne testy stosowane do określenia stopnia dezorganizacji mięśni i upośledzenia lokomocji zarodków danio pręgowanego we wczesnym okresie rozwoju.

Analiza wad mięśni szkieletowych u larw danio pręgowanego za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki wywołanej dotykiem

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Danio pręgowany to doskonały model do badania funkcji mięśni i chorób. Podczas wczesnej embriogenezy danio pręgowany rozpoczyna regularne skurcze mięśni, powodując rytmiczne zachowanie podczas pływania, które zmienia się, gdy mięsień jest zakłócony. W tym miejscu opisujemy reakcję wywołaną dotykiem i test lokomocji, aby zbadać wydajność pływania jako miarę funkcji mięśni.

Wykorzystanie reakcji wywołanej dotykiem i testów lokomocji do oceny wydajności i funkcji mięśni u danio pręgowanego

Analiza metodą elementów skończonych jest często używanym narzędziem do badania właściwości mechanicznych konstrukcji pod obciążeniem. Tutaj zastosujemy jego zastosowanie do modelowania biomechaniki szczęki danio pręgowanego.

Budowa modeli elementów skończonych w celu zbadania biomechaniki szczęk danio pręgowanego

Immunohistochemiczne barwienie izoform łańcucha ciężkiego miozyny stało się najnowocześniejszym dyskryminatorem włókien mięśni szkieletowych typu (tj. typu I, typu IIA, typu IIX, typu IIB). W tym miejscu przedstawiamy protokół barwienia wraz z nowatorskim półautomatycznym algorytmem, który ułatwia szybką ocenę rodzaju włókien i morfologii włókien.

Półautomatyczna analiza morfologii mięśni szkieletowych myszy i składu włókien

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Obecny protokół opisuje ostrą izolację żywotnych komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłego, młodocianego, larwalnego i embrionalnego danio pręgowanego (Danio rerio), nadającego się do badań elektrofizjologicznych.

Izolacja komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłych, młodocianych, larwalnych i embrionalnych danio pręgowanego do badań elektrofizjologicznych

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Poznaj metodę izolacji włókien mięśniowych szkieletu z zarodków i larw Danio rerio. Technika umożliwia szczegółową analizę morfologii pojedynczych włókien mięśniowych oraz lokalizacji białek.

Analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych

Przeglądaj więcej filmów