Name: Pomiar pH wakuolarnego i cytozolowego in vivo w zawiesinach komórek drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Poznaj metodę pomiaru pH wakuolarnego i cytozolowego in vivo w komórkach drożdży z wykorzystaniem fluorescencyjnych sond BCECF-AM i pHluorin. Technika ta umożliwia badanie dynamiki pH w odpowiedzi na zmiany środowiskowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH R01 GM50322 do P.M. Kane'a. Autorzy dziękują dr Rajini Rao z Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa za dostarczenie plazmidów drożdżowych pHluorin i za porady dotyczące ratiometrycznych pomiarów pH, a także dr Glorii A. Martinez Munoz za opracowanie tych protokołów dla naszego laboratorium.

1. Pomiar pH wakuolarnego in vivo za pomocą BCECF-AM
<ol>
	<li>Wyhoduj 50 ml płynnej kultury szczepu drożdży, która ma być mierzona w żądanym podłożu przez noc. Celem jest uzyskanie komórek w środkowej fazie logarytmicznej (OD600 (gęstość optyczna przy 600 nm) pomiar około 0,8 dla zawiesiny).</li>
	<li>Osadzać komórki drożdży przez odwirowanie. Zawiesić osad w 0,6 ml pożywki wzrostowej i przenieść do uprzednio zważonej probówki mikrowirówkowej. Ponownie zagnieździć komórki w mikrowirówce o sile 2 000 x g przez 60 sekund. Usunąć supernatant tak całkowicie, jak to możliwe, a następnie zważyć osad komórkowy. Zawiesić osad do końcowej gęstości 0,5 g/ml (w/v); Hodowla o tej objętości da osad komórkowy o wielkości około 200 mg, a następnie zostanie dodane 200 μl buforu, aby uzyskać końcową objętość 400 μl.</li>
	<li>Dodać BCECF-AM do zawiesiny komórek w końcowym stężeniu 50 mM z 12 mM podstawowego materiału przygotowanego w DMSO. Dobrze wymieszać, a następnie inkubować komórki w temperaturze 30 °C przez 30 minut na platformie kołyszącej lub bębnie rolkowym.</li>
	<li>Podczas inkubacji komórek przygotuj kalibracyjne. Bufor kalibracyjny zawiera 50 mM MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy), 50 mM HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy), 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 0,2 M octanu amonu, 10 mM azydku sodu i 10 mM 2-deoksyglukozy i jest dostosowany do wartości pH odpowiednich dla zakresu kalibracji z NaOH lub HCl. (Uwaga: Azydek sodu jest wysoce toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.) Do pomiaru pH w komórkach typu dzikiego przygotowalibyśmy kilka mieszanin kalibracyjnych o pH od 5,5 do 6,5, ale dla mutantów, od których oczekuje się, że będą miały bardziej zasadowe pH wakuolarne (mutanty vma), przygotujemy dodatkowe, wyższe pH.</li>
	<li>Podwielokrotność 2 ml buforu kalibracyjnego dla każdego pH rozlać do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i dodać monenzynę (15 mM podstawy) i nigerycynę (2 mM podstawówki), aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 110 μM monenzyny i 15 μM nigerycyny. Dobrze wymieszaj na mikserze wirowym. (Uwaga: Zarówno monenzyna, jak i nigerycyna są toksyczne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie.)</li>
	<li>Po zakończeniu czasu inkubacji BCECF-AM, zawiesinę komórek osadzać przez wirowanie przez 30 sekund przy 2,000 x g w mikrowirówce. Ponownie zawiesić komórki 1 ml pożywki wzrostowej pozbawionej glukozy i odwirować jak powyżej. Powtórz ten etap mycia raz, a następnie ponownie zawieś granulkę w 200 μl pożywki wzrostowej bez glukozy. Ułóż na lodzie.</li>
	<li>Dodać 20 μl zawiesiny komórek do każdej probówki kalibracyjnej pH przygotowanej powyżej. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30-60 minut na bębnie rolkowym.</li>
	<li>Ustaw fluorymetr tak, aby dokonywał naprzemiennego pomiaru przy długościach fal wzbudzenia 450 nm i 490 nM, przy długości fali emisji 535 nm. Ustawić temperaturę w komorze próbki na 30 °C. Wszystkie pomiary należy wykonywać, ciągle mieszając mieszaninę w kuwecie.</li>
	<li>Dodać 1,96 ml 1 mM MES (dostosowanego do pH 5 lub 7 w zależności od pH pożywki wzrostowej komórek i projektu doświadczalnego). Dodać 20 μl zawiesiny komórek do kuwety. Zainicjuj pomiary fluorescencji. W różnych eksperymentach zbieramy zarówno ciągłe dane kinetyczne, jak i dane dotyczące punktów czasowych. W celu uzyskania ciągłych danych kinetycznych wykonujemy pomiary co 6 sekund przez 5 minut, następnie dodajemy glukozę do końcowego stężenia glukozy 50 mM i kontynuujemy pomiar przez 5-10 minut. W przypadku pomiarów z pojedynczym punktem czasowym zazwyczaj wykonujemy pomiary po 1 i 5 minutach od dodania komórek do kuwety, dodajemy glukozę jak w pomiarach kinetycznych, a następnie wykonujemy kolejny pomiar 5 minut po dodaniu glukozy. Dodatki te mogą być różne, a także mogą być dodawane dodatkowe składniki (inhibitory itp.).</li>
	<li>Po zakończeniu pomiarów doświadczalnych wyjąć probówki kalibracyjne z inkubacji w temperaturze 30 °C i przenieść całą objętość 2 ml każdej z nich do kuwety fluorymetru. Mierzyć fluorescencję przy tych samych ustawieniach (patrz ppkt 1.8) co 5 sekund przez łącznie 30 sekund dla każdej próbki.</li>
	<li>Eksport danych fluorescencji do programu Microsoft Excel. (W przypadku naszego fluorymetru wymaga to eksportu danych jako tekstu w formie rozdzielanej tabulatorami i zaimportowania do programu Excel). Uzyskać krzywą wzorcową, obliczając stosunek fluorescencji przy długości fali 490 nm do długości fali 450 nm dla każdej mieszaniny kalibracyjnej. Stosunek fluorescencji jest następnie wykreślany w funkcji pH, aby uzyskać krzywą kalibracyjną.</li>
	<li>Przelicz dane eksperymentalne na współczynnik fluorescencji i oblicz pH za pomocą krzywej wzorcowej. Wartości pH wakuolarne można następnie wykreślić w czasie (kinetyka zmian pH) lub porównać w różnych warunkach (ryc. 1) lub w różnych zmutowanych szczepach.</li>
</ol>
2. Pomiar pH cytozolowego in vivo przy użyciu drożdży pHluorin
<ol>
	<li>Przekształć pożądany szczep drożdży za pomocą plazmidu drożdżowego pHluorin według standardowych protokołów i wybierz transformanty na uzupełnionym minimalnym pożywce pozbawionej uracylu (SC-uracyl).</li>
	<li>Wyhodować 50 ml płynnej kultury przekształconych komórek w SC-uracylu do połowy fazy logarytmicznej (OD600 = 0,8 lub mniej).</li>
	<li>Przygotować wzorce kalibracyjne zgodnie z opisem dla pH wakuolarnego, ale buforować do zakresu pH odpowiedniego dla pomiarów pH cytozolowego, zwykle pH 6-8. Podaniec 2 ml buforu kalibracyjnego dostosowanego do pożądanego pH do kilku stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Dodać monenzynę i nigerycynę, jak opisano powyżej (1.4) i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie, jak opisano powyżej, i ponownie zawiesić osad w 600 μl pożywki wzrostowej. Przenieść do zważonej probówki mikrowirówkowej i komórek osadu przez odwirowanie z prędkością 5 000 obr./min przez 30 sekund. Zawiesić osad w 1 ml pożywki wzrostowej bez glukozy (SC-uracyl, -glukoza), ponownie przesiać komórki osadu i powtórzyć. Po ostatnim odwirowaniu usunąć supernatant tak dokładnie, jak to możliwe i zważyć osad komórkowy. Zawiesić komórki do końcowej gęstości 0,5 g/ml w SC-uracylu bez glukozy.</li>
	<li>Dodać 20 μl zawiesiny komórek do każdej probówki buforu kalibracyjnego i dobrze wymieszać w mieszalniku wirowym. Inkubować w temperaturze 30 °C na wirującym wirniku bębna przez 60 minut.</li>
	<li>Ustaw fluorymetr do wzbudzenia na długościach fal 405 i 485 nm oraz długości fali emisji 508 nm. Kontynuuj pomiary pojedynczego punktu czasowego lub kinetyczne i dodawanie glukozy, jak opisano powyżej dla pomiaru BCECF.</li>
	<li>Zmierzyć fluorescencję próbek kalibracyjnych i skonstruować krzywą kalibracyjną jak dla BCECF (patrz 1.10-1.11). Wykres stosunku fluorescencji w funkcji pH jest liniowy w zakresie większości cytozolowych pomiarów pH (pH 6,0-8,0) 9, więc eksperymentalne pomiary współczynnika fluorescencji można łatwo przekształcić w pH.</li>
</ol>

<ol><li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li>
<li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li>
<li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li>
<li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li>
<li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+%28V-ATPases%29+for+overall+cellular+pH+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li>
<li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H%28%2B%29-ATPase-deficient+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li>
<li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+sodium%2Fproton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+endosomal+Na%2BK%2B%2FH%2B+exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li>
<li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5%27%28and+6%27%29-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro%5B7H-benzo%5Bc%5Dxanthene-7%2C+1%27%283%27H%29-isobenzofuran%5D-3%27-one+and+2%27%2C7%27-biscarboxyethyl-5%28and+6%29-carboxyfluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li>
<li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li>
<li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast%3A+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H%2B-ATPase+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li>
<li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li>
<li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li>
<li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. er, Brul, A., S,, Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939(2010).</li>
<li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619(2011).</li>
<li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+the+yeast+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li>
<li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+%28Vph1p%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li>
<li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Wykorzystaliśmy te protokoły, aby zająć się wieloma aspektami homeostazy pH. Na przykład porównaliśmy odpowiedzi cytozolowe i pH zmutowanych komórek typu dzikiego i z niedoborem V-ATPazy 4,5. Zbadaliśmy również wpływ zmienionych warunków wzrostu, w szczególności zewnątrzkomórkowego pH, na wakuolarną odpowiedź pH na glukozę 3. Co ważne, obserwowane przez nas reakcje są zgodne zarówno z innymi metodami ilościowego pomiaru pH, jak i z danymi biochemicznymi opisującymi zmienioną aktywność pomp protonowy...

homeostaza pH jest dynamicznym i wysoce regulowanym procesem we wszystkich organizmach 1,2. Procesy biochemiczne są ściśle regulowane przez pH, a środowiska wewnątrzkomórkowe są dostrojone do wąskich zakresów pH, aby umożliwić optymalną aktywność rezydujących enzymów. Jednak wewnątrzkomórkowa homeostaza pH może być zagrożona przez szybkie zmiany pH środowiska, zmiany metaboliczne i niektóre szlaki sygnałowe. Ponadto wewnątrzkomórkowe pH samo w sobie może służyć jako ważny sygnał. Wreszcie, wiele organelli utrzymuje wartości pH światła, które różnią się od otaczającego cytozolu i są niezbędne dla funkcji specyficznych dla organelli.
Drożdże Saccharomyces cerevisiae dzielą szereg mechanizmów homeostazy pH z wyższymi eukariontami 2. W kwaśnych organellach szlaku endocytarnego/lizosomalnego pH jest przede wszystkim kontrolowane przez wysoce konserwatywną wakuolarną ATPazę translokującą protony (V-ATPazę), działającą w tandemie z wieloma wymiennikami w zależności od gradientu pH. Wszystkie komórki eukariotyczne mają również mechanizmy eksportu protonów. U grzybów i roślin druga, odrębna pompa protonowa na błonie plazmatycznej, Pma1, eksportuje protony metaboliczne i uważa się, że jest głównym wyznacznikiem cytozolowego pH i potencjału błony plazmatycznej. Elastyczność genetyczna S. cerevisiae i jej znaczenie komercyjne sprawiły, że jest to bardzo interesujący i ważny model do badania homeostazy pH 2.
Oprócz tego, że są głównymi czynnikami powodującymi zakwaszenie organelli, V-ATPazy są wysoce regulowanymi enzymami, a nasze laboratorium jest zainteresowane zrozumieniem mechanizmów regulacji V-ATPazy. W tym celu stosujemy pomiary pH in vivo pH wakuolarnego i cytozolowego: 1) do monitorowania odpowiedzi na zmieniające się warunki zewnątrzkomórkowe, takie jak deprywacja glukozy i readdycja, 2) do zbadania skutków mutacji, które upośledzają aktywność V-ATPazy, oraz 3) do zbadania koordynacji pomp protonowych organelli i błony plazmatycznej 3-5. Eksperymenty te stały się możliwe tylko dzięki opracowaniu solidnych wskaźników ratiometrycznych pH, które można stosować w komórkach drożdży. Plant i wsp. po raz pierwszy wykazali, że BCECF (2'7'-Bis-(2-karboksyetylo)-5-(i 6)-karboksyfluoresceina), która jest szeroko stosowana do pomiaru pH cytozolu w komórkach ssaków, gromadzi się w wakuoli drożdży zamiast cytozolu 6. Ta różnica w lokalizacji BCECF została przypisana wielu enzymom hydrolitycznym w wakuoli, które są prawdopodobnie odpowiedzialne za rozszczepienie estru acetoksymetylowego z BCECF-AM (ester acetoksymetylowy BCECF) i retencję wakuolarną 6. Ali i wsp. 7 rozwinęli dalej wakuolarny pomiar pH za pomocą BCECF i dostosowali te pomiary do formatu czytnika płytek fluorescencyjnych. Brett i wsp. wprowadzili drożdżową pHluorynę jako sposób pomiaru cytozolowego pH u drożdży poprzez ekspresję plazmidowego, ratiometrycznego wrażliwego na pH GFP 8 pod kontrolą promotora specyficznego dla drożdży 9.
Widma wzbudzenia zarówno BCECF, jak i drożdży pHluorin są wrażliwe na pH, dlatego są używane jako ratiometryczne wskaźniki pH, w których stosunek fluorescencji przy dwóch długościach fal wzbudzenia, mierzony przy jednej długości fali emisyjnej, daje miarę pH 8,10. Te wakuolarne i cytozolowe czujniki pH drożdży były używane zarówno do pomiarów jednokomórkowych, jak i populacyjnych. Pomiary pojedynczych komórek 6,11 są wykonywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizy obrazu. Fluorescencja wakuolarna lub cytozolowa na dwóch długościach fal jest mierzona dla każdej komórki. Pomiary populacyjne są wykonywane w czytniku mikropłytek o odpowiednich możliwościach fluorescencji lub we fluorymetrze. Zazwyczaj wykonujemy nasze pomiary we fluorymetrze, ponieważ zapewnia on łatwy dostęp do dodawania składników, takich jak glukoza, podczas ciągłych pomiarów kinetycznych. Nasze aktualne protokoły laboratoryjne do pomiaru pH wakuolarnego i cytozolowego są wymienione poniżej; Oba są również łatwo przystosowane do testów mikropłytek.

<table><tbody><tr><td>Spektrofluorometr</td><td>Horiba Jobin Yvon</td><td>Model Fluoromax-4</td><td>Pożądana jest kontrola temperatury i możliwość mieszania.</td></tr><tr><td>BCECF-AM</td><td>Sondy invitrogenowe/molekularne</td><td>B1150</td><td>Przygotować zapas 12 mM w suchym DMSO, przechowywać jako podwielokrotności w temperaturze -20 & stopni; C </td></tr><tr><td>monenzyna</td><td>Sigma</td><td>M5273</td><td>Toksyczny. </td></tr><tr><td>nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td>Toksyczny. </td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar ph wakuolarnego i cytozolowego in vivo w zawiesinach komórek drożdży

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Wakuolarne i cytozolowe pH są wysoce regulowane w komórkach drożdży i odgrywają kluczową rolę w ogólnej homeostazie pH. Opisujemy protokoły ratiometrycznego pomiaru pH in vivo przy użyciu wrażliwych na pH fluoroforów zlokalizowanych w wakuoli lub cytozolu. pH wakuolarne mierzy się za pomocą BCECF, który lokalizuje się w wakuoli drożdży po wprowadzeniu do komórek w postaci estru acetoksymetylowego. Odczyn cytozolowy mierzy się za pomocą GFP wrażliwego na pH wyrażonego pod kontrolą promotora drożdży, drożdżowej pHluoryny. Opisano metody pomiaru współczynników fluorescencji w zawiesinach komórek drożdży we fluorymetrze. Dzięki tym protokołom porównano pomiary pH w pojedynczym punkcie czasowym w różnych warunkach lub w różnych mutantach drożdży oraz monitorowano zmiany pH w czasie. Metody te zostały również dostosowane do formatu czytnika płytek fluorescencyjnych do eksperymentów o wysokiej przepustowości. Opisano również zalety ratiometrycznych pomiarów pH w porównaniu z innymi obecnie stosowanymi podejściami, potencjalne problemy i rozwiązania eksperymentalne oraz perspektywy przyszłego zastosowania tych technik.

Rysunek 1 przedstawia dane dotyczące pH wakuoli otrzymane z komórek drożdży typu dzikiego hodowanych w pożywce bogatej (ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstrana; YEPD) buforowanej do pH 5 za pomocą 50 mM MES. Często hodujemy komórki w pożywce buforowanej, ponieważ pH pożywki może ulec znacznym zmianom podczas hodowli nocnej, szczególnie w przypadku pożywek minimalnych, a odkryliśmy, że pH pożywki hodowlanej może wpływać na odpowiedzi pH wakuol 3. Jednak w wielu eksperymentach dopuszczalne jest równ...

Vacuolar i cytozolowe pH może być mierzone w żywych komórkach drożdży (S. cerevisiae) za pomocą ratiometrycznych barwników fluorescencyjnych zlokalizowanych w określonych przedziałach komórkowych. Opisujemy procedury pomiaru pH wakuolarnego za pomocą BCECF-AM, który lokalizuje się w wakuoli u drożdży, oraz pH cytozolowego za pomocą cytozolowego ratiometrycznego GFP wrażliwego na pH (drożdże pHluorin).

Pomiar pH wakuolarnego i cytozolowego in vivo w zawiesinach komórek drożdży

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest pomiar pH wakuolarnego i cytozolowego w żywych komórkach drożdży oraz obserwacja zmian pH pod wpływem modyfikacji warunków zewnętrznych. Cel ten osiąga się poprzez wprowadzenie do wakuoli (VA) i cytozolu komórek drożdży fluorescencyjnych sondy wrażliwych na pH. W celu pomiaru pH wakuolarnego do komórek wprowadza się barwnik B-C-E-C-F-A-M, natomiast w celu pomiaru pH cytozolowego w komórkach z plazmidu ekspresowane jest białko GFP Florin wrażliwe na pH.W drugim kroku komórki znakowane fluorescencyjnie są przemywane i resuspendowane w wysokim zagęszczeniu w pożywce wzrostowej pozbawionej glukozy. Alikwoty zawiesiny przenosi się do buforów kalibracyjnych o różnych wartościach pH w celu stworzenia krzywej kalibracyjnej.Następnie inną porcję zawiesiny rozcieńcza się w słabym buforze, a fluorescencję zawiesiny monitoruje się w sposób ciągły za pomocą fluorymetru przed i po dodaniu glukozy lub innych dodatków. W celu określenia odpowiedzi pH w wakuolach lub cytozolu in vivo uzyskuje się wyniki wykazujące zależne od czasu i warunków poziomy pH w próbce eksperymentalnej, w oparciu o stosunki fluorescencji ratiometrycznej skalibrowane na podstawie p

measurement-vacuolar-cytosolic-ph-vivo-yeast-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Obecny artykuł przedstawia protokół do ustanowienia systemu modelowego hodowli komórkowych in vitro do badania interakcji fakultatywnego wewnątrzkomórkowego patogenu grzyba ludzkiego Candida glabrata z ludzkimi makrofagami, co będzie użytecznym narzędziem do poszerzenia naszej wiedzy o mechanizmach wirulencji grzybów.

Stworzenie systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania Candida glabrata w ludzkich makrofagach THP-1

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Dostępnych jest kilka metod pomiaru pH wewnątrzkomórkowego, ale bardzo niewiele z nich pozwala na jednoczesny pomiar pH cytoplazmatycznego i organellarnego. W tym miejscu szczegółowo opisujemy szybką i dokładną metodologię jednoczesnego pomiaru pH cytoplazmatycznego i pęcherzykowego za pomocą obrazowania ratiometrycznego żywych komórek.

Jednoczesny pomiar pH w przedziałach endocytarnych i cytozolowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Opisujemy kwantyfikację cytozolowej i wakuolarnej Salmonella typhimurium w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą różnicowej przepuszczalności digitoniny.

Kwantyfikacja cytozolowej i wakuolarnej salmonelli w pierwotnych makrofagach przez różnicową przepuszczalność

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Intherentnie nieuporządkowane regiony (IDR) to elastyczne domeny białkowe, które modyfikują swoją konformację w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Zespołowy transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) może oszacować wymiary białka w różnych warunkach. Przedstawiamy podejście FRET do oceny wrażliwości strukturalnej IDR w żywych komórkach Saccharomyces cerevisiae w warunkach stresu hiperosmotycznego.

Oszacowanie wrażliwości strukturalnej regionów wewnętrznie nieuporządkowanych w odpowiedzi na stres hiperosmotyczny w żywych komórkach za pomocą FRET

Przedstawiamy tutaj protokół mającycy mierzenie przeżycia po stresie w próbkach drożdży. Test wykorzystuje dwa barwniki fluorescencyjne, SYTO 9 i jodek propidiu (PI), do ilościowego określenia integralności błony plazmatycznej. Wykorzystuje cytometrię przepływową do dostarczania ilościowych i powtarzalnych szacunków ułamków żywych, martwych i uszkodzonych komórek dla próbek po stresie utlencyjnym.

Zoptymalizowany test ŻYWY/MARTWY połączony z cytometrią przepływową do ilościowego przeżycia po stresie w komórkach drożdży

Poznaj metodę pomiaru pH wakuolarnego i cytozolowego in vivo w komórkach drożdży z wykorzystaniem fluorescencyjnych sond BCECF-AM i pHluorin. Technika ta umożliwia badanie dynamiki pH w odpowiedzi na zmiany środowiskowe.

Pomiar pH wakuolarnego i cytozolowego in vivo w zawiesinach komórek drożdży

Przeglądaj więcej filmów