Projektowanie bioresponsywnego robota z DNA Origami

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprojektowanie robotycznego urządzenia z origami DNA przy użyciu oprogramowania CAD nano. Jest to realizowane poprzez najpierw zainstalowanie CAD nano i wykorzystanie go do nakreślenia ogólnego kształtu robota. Drugim krokiem jest zaprojektowanie ścieżki nici rusztowania.

Następnie wprowadza się i edytuje staplery. Ostatnim krokiem jest zdefiniowanie elementów kontrolnych, w tym ładunku (payload), miejsc przyłączenia oraz bramek. Ostatecznie generowana jest lista części DNA do zamówienia przed rozpoczęciem montażu.

Główną zaletą tej techniki jest uproszczenie i standaryzacja projektowania obiektów DNA origami dla różnorodnych zastosowań. Procedurę zaprezentuje Alad Bei, postdoc badający dynamikę robotów DNA origami w moim laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać i zainstalować programy CAD nano two oraz Autodesk Maya 2012.

Zgodnie z instrukcjami na stronie http://cadnano.org, interfejs projektowy CADnano w programie Maya składa się z trzech paneli. Górny panel to widok sieci (lattice view), w którym początkowo określa się kształt.

Ten panel umożliwia wykonywanie operacji na poziomie podwójnej helisy i zapewnia widok przekroju kształtu. Dolny panel jest panelem edycji, który pozwala na przeprowadzanie operacji na poziomie pojedynczych zasad. Prawy panel zawiera wygenerowany w programie Maya trójwymiarowy model kształtu w czasie rzeczywistym.

Kliknij ikonę plastra miodu, aby przybliżyć lub oddalić widok sieci. W górnym panelu można to zrobić za pomocą myszy, przewijając odpowiednio w górę i w dół.

Na początek narysuj fragment pożądanego kształtu na lewym panelu. Każde koło reprezentuje podwójną helisę DN; aby wybrać helisy budujące kształt, po prostu kliknij lewym przyciskiem myszy w ich centrum. Kontynuuj dodawanie helisa po helisie, aż cały kształt zostanie obrysowany.

Alternatywnie kształt można narysować, naciskając lewy przycisk myszy i rysując w sposób ciągły obrys kształtu. Należy obserwować dolny panel. Każda helisa jest reprezentowana przez dwa rzędy kwadratów.

Rzędy stanowią dwie nici podwójnej helisy. Każdy kwadrat reprezentuje zasadę, a pomarańczowy pionowy pasek określa miejsce, w którym odbywają się działania edycyjne wzdłuż helisy. Pozycja zasady w siatce jest wyświetlana jako liczba nad pomarańczowym paskiem.

Domyślna długość szkieletu helisy wynosi 42 zasady. Długość tę można zwiększyć, klikając jedną z szarych ikon strzałek w prawym górnym rogu panelu edycji i wybierając długość rozszerzenia. Aby wykreślić rzeczywistą ścieżkę nici rusztowania w obrębie kształtu, należy nacisnąć przycisk myszy.

Zacznij od pierwszej helisy i przejdź kolejno przez wszystkie helisy, zachowując tę samą kolejność, w jakiej zostały pierwotnie wybrane. Obrysuj prostokątem wszystkie krawędzie po lewej stronie ścieżki rusztowania. Przedłuż ścieżkę rusztowania, przeciągając zaznaczone krawędzie jako grupę na lewą stronę siatki.

Po powtórzeniu tego procesu aż do właściwego wydłużenia ścieżki i zidentyfikowaniu ikon mostków zgodnie z opisem w tekście, przygotuj się do tworzenia skrzyżowań. Kliknij lewym przyciskiem myszy wybraną ikonę mostka. Zostanie wygenerowane skrzyżowanie rusztowania (scaffold crossover), co oznacza, że w tym punkcie rusztowanie przechodzi z jednej helisy do drugiej.

Powtarzaj ten proces, aż rusztowanie przejdzie przez wszystkie helisy i utworzy zamkniętą pętlę obejmującą cały kształt, nie pozostawiając żadnych obszarów odizolowanych od reszty tej struktury. Opisany robot otwiera się w odpowiedzi na określony sygnał biologiczny, aby odsłonić swój ładunek. Otwieranie odbywa się w sposób przypominający rozwieranie skorupy, przy czym dwie połowy obracają się wokół dwóch osi.

Osie są tworzone przez skrzyżowania między helisami 29 i 30 oraz 61 i zero, które są jedynymi skrzyżowaniami między tymi połowami i znajdują się wyłącznie w lewej krawędzi siatki lub blisko niej. Prawa krawędź będzie zawierać nici kroczące. Usuń istniejące skrzyżowanie między helisami 29 i 30.

Aby usunąć skrzyżowanie, kliknij punkt przegięcia w dowolnej nici. Pozostawi to nacięcie w obu niciach w miejscu, w którym znajdowało się skrzyżowanie. Aby zszyć nacięcia, naciśnij shift i kliknij każde nacięcie, a następnie utwórz nowe skrzyżowanie między helisami 29 i 30 jak najbliżej lewej krawędzi siatki.

Następnie utwórz nowy crossover pomiędzy helisami 61 a zero tak blisko lewej krawędzi siatki, jak to możliwe, i zdefiniuj cztery miejsca ładowania skierowane w stronę wewnętrznej strony robota. Miejsca ładowania będą odgałęziać się od helis 3 27, 34 i 58. Dla każdego miejsca w górnym panelu kliknij helisę bezpośrednio sąsiadującą z tymi helisami, która jest skierowana w stronę wewnętrzną.

To spowoduje dodanie helis do siatki w dolnym panelie. Nie klikaj jeszcze ponownie w te linie, aby dodać i edytować staple. Najpierw kliknij auto staple.

Oprogramowanie automatycznie doda sekwencje zszywek w różnych kolorach. Należy zauważyć, że do kształtu 3D w prawym panelu zostały dodane zszywki. Kolory zszywek są zgodne dla paneli dolnego i prawego.

Dodatkowo, w lewym dolnym rogu interfejsu znajduje się wskaźnik informujący, że zszywki nie mogą być zbyt długie, zbyt krótkie ani koliste, aby można było je automatycznie edytować. Aby spełnić te kryteria, kliknij auto break; otworzy się okno dialogowe z prośbą o zdefiniowanie parametrów tej operacji. Użyj parametrów domyślnych i kliknij okay. Oprogramowanie podzieli zszywki zgodnie z tymi parametrami, na tyle, na ile będzie to możliwe.

Usuń wszystkie skrzyżowania zszywek (staple crossovers) pomiędzy helisami 29 i 30 oraz 61 i 0, aby umożliwić rozdzielenie tych helis i otwarcie robota. Usunięcie skrzyżowań zszywek będzie wymagało ręcznej edycji w celu poprawienia zszywek, które w wyniku tej akcji staną się zbyt krótkie lub nieprawidłowe. Aby wykonać to poprawnie, postępuj zgodnie z instrukcjami w protokole tekstowym: usuń dwie zszywki na helisie 29, naciskając klawisz shift i klikając w nacięcie między nimi.

Analogicznie, trzy zszywki na nici 30 należy połączyć w jedną; zszywki można ręcznie wydłużać lub skracać, klikając krawędź i przeciągając ją w pożądany sposób. Należy uważać, aby nie doprowadzić do zapętlenia żadnej zszywki. Powtórz ten proces dla HELOC-ów zero i 61 oraz ręcznie edytuj wszystkie zszywki w każdej helisie.

Zlokalizuj zszywki zaznaczone grubą linią, co oznacza, że wymagają one dalszej edycji. Przejrzyj każdą z nich i popraw w razie potrzeby. Na przykład zbyt krótkie zszywki można usunąć lub, jeśli to możliwe, wydłużyć.

Po drugie, kliknij helisy miejsca ładowania w górnym panelu, a następnie wydłuż powstałe fragmenty nici rusztowania w dolnym panelu, klikając krawędź i przeciągając ją według uznania. Dodaj ręcznie zszywki (staples) do tych fragmentów rusztowania, umieszczając pomarańczowy pionowy pasek w pożądanym miejscu wzdłuż rusztowania, przejeżdżając nad helisami prowadzącymi w lewym panelu, trzymając klawisz shift i klikając. Spowoduje to dodanie prekursora zszywki przy każdej helisie.

Wydłuż również prekursory zszywek do pełnej długości. Klikając i przeciągając, zlokalizuj czerwone ikony mostków oznaczające punkty przecięcia (crossover) między nicią prowadzącą a szkieletem. Wybierz najdogodniejszą lokalizację do wprowadzenia przecięcia i kliknij ikonę mostka. Dogodna lokalizacja to taka, która wymaga minimalnej edycji istniejących zszywek w szkieletie.

W helisie prowadzącej należy usunąć fragment zszywki (staple), który nie stanowi części miejsca ładowania, a następnie skrócić część uczestniczącą do pożądanej długości. Pożądana długość powinna zapewniać zarówno specyficzność ładowania różnych typów ładunku, jak i siłę wiązania. Zazwyczaj odpowiednia będzie końcówka o długości 18 mer.

Upewnij się, że zszywka pozostaje narysowana cienką linią. W przeciwnym razie edytuj, aż znajdzie się ona w obudowie. W razie potrzeby edytuj zmienione zszywki.

Usuń prowadnik, pozostawiając jedynie przedłużenie staplerowe. Powtórz te kroki dla wszystkich miejsc ładowania, aby zaprojektować nici gait. Najpierw określ odpowiednie pozycje dla nici gait.

Będą one pełniły funkcję zszywek (staples) w helisach 29, 30, 61 oraz zero. Na przykład, należy przyjrzeć się regionowi bramki między helisą 29 a 30. Po prawej stronie siatki znajdują się dogodne nici zszywek, flankujące helisy 29 i 30, które mogą służyć jako nici bramki.

Należy zwrócić uwagę, że są one skierowane w przeciwne strony. Kliknij krawędź jednej z potencjalnych nici bramki, aby wysunąć ją poza obszar kształtu. Jeśli krawędź znajduje się nad skrzyżowaniem rusztowania, wybór można uprościć, upewniając się, że możliwe jest zaznaczanie wyłącznie zszywek.

Klikając opcję scaf na pasku narzędzi w prawym górnym rogu interfejsu, wydłuż oba zszywacze (staples), aby utworzyć nici bramki. Edytuj zszywacze. Jeśli to wydłużenie jest konieczne, powtórz tę czynność dla nici bramek helis zero oraz 61.

Aby wybrać sekwencję rusztowienia, kliknij narzędzie wyszukiwania. Umieść kursor w dowolnym miejscu na nici rusztowienia i kliknij; otworzy się okno dialogowe z prośbą o wybór źródła DNA rusztowienia. W oknie dialogowym wybierz M 13 MP 18. Zauważ, że wybrana sekwencja DNA została dodana do nici rusztowienia i zszywek w dolnym panelu.

Na koniec wyeksportuj sekwencję zszywek do arkusza kalkulacyjnego, klikając przycisk export na górnym pasku narzędzi i wybierając nazwę pliku docelowego dla listy zszywek. Kliknij save. W tym filmie zaprezentowano krok po kroku proces projektowania nanorobota z origami DNA.

W tym miejscu najpierw obrysowano przekrój poprzeczny kształtu. Po obrysowaniu nastąpiła automatyczna edycja fragmentów nici rusztowania oraz uzupełnienie całej ścieżki rusztowania. Przedstawiono tutaj widok ogólny dolnego i prawego panelu, demonstrujący, jak model 3D zmienia się w czasie rzeczywistym wraz z wykonywanymi czynnościami edycyjnymi.

Nici staplowe zostały dodane automatycznie, co widać na schemacie po wykonaniu akcji auto staple. Na tym obrazie kolory nici staplowych w panelu dolnym i prawym są zgodne. Następnie nici staplowe zostały przerwane zgodnie z parametrami zdefiniowanymi przez użytkownika, co przedstawiono tutaj na schemacie po wykonaniu akcji auto brake.

Następnie nici staplowe zostały ręcznie zmodyfikowane, aby dostosować je do zamierzonej funkcji urządzenia. Cała przerwa między helisami 29 i 30 pokazuje, że w tym projekcie nie występują żadne przecięcia łączące obie helisy. Po ręcznej edycji widok nici staplowych miejsca ładowania przedstawiony jest w dolnym panelu.

Po usunięciu niepotrzebnych już przewodnich HELOCs, obraz ten pokazuje rozciągnięcie dwóch zszywek, które posłużą jako nici GA z HELOCs 29 i 30. Należy zauważyć, że dwie nici są skierowane w przeciwne strony, co jest niezbędne do utworzenia dupleksu gait. Jest to obraz TEM końcowego modelu zaprojektowanego w tej procedurze.

Próbkę barwi się octanem uranylu i obrazuje w transmisyjnym mikroskopie elektronowym GL dokładnie tak, jak opisano w poprzednich raportach autorów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zaprojektować robota z origami DNA do dowolnie wybranej przez siebie aplikacji.