Name: Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Poznaj metodę eksplantacji całej półkuli mózgowej myszy z elektroporacją ex utero do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej. Technika umożliwia precyzyjną manipulację genową i analizy farmakologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana grantami od NINDS (NS066071) i NIAAA. (P50AA017823) do ECO. Autorzy dziękują dr. Robertowi Quinnowi i personelowi Zakładu Laboratoryjnych Zasobów Zwierzęcych za opiekę nad zwierzętami. Dziękujemy Judsonowi Belmontowi za wsparcie techniczne, Nicole Belletier za pomoc jako Summer Undergraduate Research Fellow (SURF). Dziękujemy również dr Davidowi Cameronowi za komentarze i poprawki do wcześniejszej wersji manuskryptu.

1. Elektroporacje ex utero z plazmidem o ekspresji białek zielonej fluorescencji
<ol>
	<li>Roztwory do wstrzykiwań plazmidowego DNA przygotowuje się z CAG-eGFP DNA 27 rozcieńczonego do końcowego stężenia roboczego 0,33 mg/ml w ddH2O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps stosuje się do oczyszczania plazmidu z transformowanych bakterii. Szybki zielony barwnik o stężeniu ~0,02% (w/v końcowy) jest dodawany do roztworu DNA jako znacznik iniekcyjny.</li>
	<li>Aby przygotować obszar operacyjny, spryskaj stół laboratoryjny i stolik mikroskopu preparacyjnego 70% roztworem etanolu i wytrzyj do sucha. Przed sekcją spryskaj nożyczki chirurgiczne i kleszcze 70% etanolem i wytrzyj do sucha.</li>
	<li>Ciężarne matki szwajcarskie/Webstera są uśmiercane na E13 poprzez przeniesienie do komory wypełnionej CO2 z butli pod ciśnieniem, a zapora jest monitorowana do momentu zatrzymania całego ruchu na co najmniej 1 minutę. Po uśmierceniu przez inhalację CO2 zarodki są usuwane z macicy i umieszczane na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty roztwór soli fizjologicznej Hanksa (HBSS).</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj każdy zarodek z otaczających błon pozazarodkowych i trzymaj w lodowatym HBSS.</li>
	<li>Przenieść każdy zarodek pojedynczo na drugą 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą zimny HBSS. Za pomocą strzykawki Hamiltona wstrzyknąć 2-3 μl szybko zielonej mieszaniny DNA do komory lewej półkuli mózgowej, uważając, aby wstrzyknąć w obszar korowy przestrzennie oddzielony od obszaru korowego do przyszłej analizy.</li>
	<li>Aby wykonać elektropostację, delikatnie przytrzymaj zarodek kleszczami i delikatnie umieść dodatnią łopatkę elektrody pęsety na grzbietowej linii środkowej głowy i lekko umieść ujemną łopatkę pod brodą zarodka. Elektroporacje są osiągane za pomocą elektroporatora BTX830 zaprogramowanego do dostarczania pięciu impulsów 30 V o czasie trwania 50 ms, oddzielonych odstępami 950 ms. Te ustawienia dotyczą modelu BTX830. Inne systemy mogą być używane zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
2. Przygotowanie eksplantatu na całej półkuli
<ol>
	<li>Po elektroporacji zarodki umieszcza się z powrotem w lodowatym HBSS. Mózg jest usuwany za pomocą dwóch kleszczy jubilerskich #5 w celu usunięcia skóry i chrzęstnej czaszki z głowy zarodka. Następnie wsuwa się kleszcz pod mózg w celu usunięcia nienaruszonego mózgu z czaszki. Elektropograficzna półkula (po lewej) jest następnie wycinana z dala od mózgu, a przyczepiona tkanka śródmózgowiowa jest usuwana. Podczas procedury preparacji należy uważać, aby nie uszkodzić opon mózgowych pokrywających lewą półkulę korową.</li>
	<li>Po wypreparowaniu każdy zarodek jest przenoszony do HBSS za pomocą pipetora z naciętą końcówką pipety o pojemności 1 ml. Półkula jest delikatnie wydalana na wkładkę hodowlaną pokrytą kolagenem. Na każdej wkładce 24 mm umieszczono do sześciu eksplantatów półkulowych przyśrodkowa stroną do dołu. Po ułożeniu nadmiar HBSS jest usuwany z wkładu, a następnie wkładka jest umieszczana w jednym 35 mm dołku w 6-dołkowym naczyniu. Studzienka zawiera dokładnie 2,7 ml pożywki: pożywki DMEM-F12 zawierającej Glutamax i uzupełnionej 2% B-27, 1% G5 i 1% Penicyliny-Strep. Kilka kropel pożywki ze studzienki można odpipetować na wierzch każdego eksplantatu, ale nie należy dodawać pożywki w ilości większej niż pierwotne 2,7 ml na studzienkę.</li>
	<li>Po umieszczeniu eksplantatów na filtrach kolagenowych, 6-dołkowe naczynie zawierające eksplantaty umieszcza się w komorze Billups Rothenberg (BR) (która zawiera również naczynie nawilżające z wodą). Mieszanina 95%/5% tlenu/CO2 jest podawana w komorze przez co najmniej 1 minutę przed zamknięciem komory i odłączeniem rurki doprowadzającej gaz 95%/5% tlen/CO2. Komorę BR umieszcza się następnie w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na pozostałą część okresu hodowli, 1-2 DIV.</li>
</ol>
3. Utrwalenie tkanki eksplantacyjnej, do histologii
<ol>
	<li>W dygestorium przygotuj roztwór utrwalający Pagano, najpierw rozpuszczając 8 g paraformaldehydu w 100 ml podgrzanego (~80 °C) ddH2O. Dodaj 1-3 krople stężonego NaOH, aby ułatwić rozpuszczanie i delikatnie wymieszaj. Po rozpuszczeniu zmieszać 8% roztwór paraformaldehydu 1:1 z roztworem o stężeniu 500 mM sacharozy, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl2, 5 mM KCl, aby uzyskać końcowe stężenie 4% paraformaldehydu w 250 mM sacharozy 50 mM Hepes, 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4.</li>
	<li>Aby utrwalić eksplantaty, ogrzej roztwór Pagano fix do temperatury 37 °C. Szybko usuń większość pożywki DMEM/F12 z każdej studzienki hodowlanej i dodaj 5 ml Pagano Fix do każdej studzienki eksplantatów. Upewnij się, że każdy eksplant jest całkowicie zakryty. Poprawka na 1 godzinę w RT. Nie wyjmuj eksplantatów z filtra przed upływem 1 godziny utrwalania.</li>
	<li>Po utrwaleniu usunąć roztwór Pagano fix i zastąpić roztworem Pagano bez fix (250 mM sacharozy, 50 mM Hepes, 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Dodać kilka kropli 10% azydku sodu i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu zatopienia.</li>
</ol>
4. Osadzanie i dzielenie na sekcje dla histologii
<ol>
	<li>Przygotować 10% roztwór żelatyny dla skóry cielęcej, rozpuszczając 10 g żelatyny ze skóry cielęcej w 100 ml ciepłej wody (55-60 °C). Umieść roztwór żelatyny na płycie grzejnej ustawionej na 60 °C i okresowo mieszaj, aż do rozpuszczenia.</li>
	<li>Wlać około 10 ml 10% roztworu żelatyny na dno 10 cm szalki Petriego i odczekać 30 minut do zestalenia. Utworzy to "podkładkę" do osadzenia eksplantatów. Podkładki te można przygotować z kilkudniowym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Za pomocą linijki narysuj siatkę na dnie szalki Petriego i przenieś poszczególne eksplanty do każdego pudełka siatki. Usuń resztki roztworu Pagano i za pomocą pipetora przykryj każdy eksplant ciepłym 10% roztworem żelatyny i pozostaw do zestalenia. Wznów powolne dodawanie roztworu żelatyny, aż każdy eksplant zostanie całkowicie otoczony żelatyną, uważając, aby nie stopić podkładki przez dodanie zbyt dużej ilości ciepłej żelatyny na raz. Pozostaw żelatynę do stwardnienia na ~1 godzinę. Po stwardnieniu poszczególne eksplantaty można wyciąć w małe bloki żelatyny. Bloki są następnie mocowane w Pagano fix przez 24-48 godzin przed cięciem za pomocą wibratomu.</li>
	<li>Eksplantaty w blokach żelatyny umieszcza się opuszką węchową do góry i dzieli w płaszczyźnie koronalnej na grubość 100 μm. Skrawki są zbierane i przechowywane w PBS + 0,1% azydku sodu w temperaturze 4 °C do czasu obróbki immunohistochemicznej.</li>
	<li>Detekcja immunohistochemiczna polega na przeniesieniu skrawków do płytki 24-dołkowej (2-3 sekcje na dołek). Najpierw blokuj wiązanie przeciwciał nieswoistych przez dodanie 0,5 ml PBST+B (PBS + 0,5% Triton X 100 i 2% BSA) do każdej studzienki, inkubuj przez 1 godzinę z delikatnym wstrząsaniem. Odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńcza się następnie w PBST+B i dodaje 0,4 ml na studzienkę do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej. Pierwotny jest wypłukiwany za pomocą 3 płukań PBS przez co najmniej 10 minut każde. Przeciwciało drugorzędowe i 2 μg/ml barwnika jądrowego Hoechst 33342 rozcieńcza się następnie w PBST+B, a próbki inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem. Wykonywane są trzy płukania PBS (każde po 10 min), a następnie sekcje są montowane na szkiełkach za pomocą 90% glicerolu 50 mM Tris, pH7,4, media montażowe.</li>
</ol>

<ol><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+neural+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. , (2004).</li>
<li>Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+neuronal+positioning+and+dendritogenesis+in+the+neocortex+after+cell-autonomous+Dab1+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression.</a> J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).</li>
<li>Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+neuron+origin+and+neocortical+laminar+fate%3A+relation+to+cell+cycle+of+origin+in+the+developing+murine+cerebral+wall%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall.</a> J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+prenatal+ontogenesis+of+the+cerebral+cortex+%28neocortex%29+of+the+cat+%28Felis+domestica%29.+A+Golgi+study.+I.+The+primordial+neocortical+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Anat.+Entwicklungsgesch%22%5BJournal%5D)">Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization.</a> Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).</li>
<li>Nichols, A. J., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+promotes+neuronal+orientation+and+dendritogenesis+during+preplate+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting.</a> Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).</li>
<li>Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+reorganization+of+preplate+neurons+and+their+associated+extracellular+matrix%3A+an+early+manifestation+of+altered+neocortical+development+in+the+reeler+mutant+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse.</a> J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).</li>
<li>Manzini, M. C., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+disorders+of+cortical+development+tell+us+about+the+cortex%3A+one+plus+one+does+not+always+make+two%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).</li>
<li>Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+alteration+of+dendritic+development+in+the+cerebral+cortex+following+prenatal+cocaine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure.</a> Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).</li>
<li>Olney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Addict.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome at the cellular level.</a> Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).</li>
<li>Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+impact+of+early+cellular+environment+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.+Med%22%5BJournal%5D)">The critical impact of early cellular environment on neuronal development.</a> Prev. Med. 27, 180-183 (1998).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+migratory+pathways+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex.</a> Science. 258, 299-302 (1992).</li>
<li>Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+adhesion+is+necessary+for+radial+migration+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex.</a> Nature. 448, 901-907 (2007).</li>
<li>Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+regulates+cadherin+function+via+Dab1%2FRap1+to+control+neuronal+migration+and+lamination+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex.</a> Neuron. 69, 482-497 (2011).</li>
<li>Gotz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+preservation+of+cortical+layers+in+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation and preservation of cortical layers in slice cultures.</a> J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).</li>
<li>Cameron, R. S., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+membrane+proteins+that+comprise+the+plasmalemmal+junction+between+migrating+neurons+and+radial+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells.</a> J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).</li>
<li>Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Study+of+Neuronal+Morphogenesis%3A+Ex+vivo+RNAi+Electroporation+in+Embryonic+Murine+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex.</a> J. Vis. Exp. (63), e3621(2012).</li>
<li>Jossin, Y., Goffinet, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+signals+through+phosphatidylinositol+3-kinase+and+Akt+to+control+cortical+development+and+through+mTor+to+regulate+dendritic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth.</a> Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).</li>
<li>Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SRC+family+kinases+and+non-classical+protein+kinases+C+induce+a+reeler-like+malformation+of+cortical+plate+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development.</a> J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).</li>
<li>Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-proliferative+effects+of+lysophosphatidic+acid+enhance+cortical+growth+and+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding.</a> Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).</li>
<li>Rehen, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+embryonic+culture+for+assessing+global+changes+in+brain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).</li>
<li>Jossin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+fragment+of+Reelin%2C+generated+by+proteolytic+processing+in+vivo%2C+is+critical+to+its+function+during+cortical+plate+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development.</a> J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).</li>
<li>O'Dell, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortical+neurons+require+Reelin-Dab1+signaling+for+cellular+orientation%2C+Golgi+deployment%2C+and+directed+neurite+growth+into+the+marginal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone.</a> Neural. Dev. 7, 25(2012).</li>
<li>Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+disruption+of+Golgi+apparatus+morphology%2C+primary+neurite+number+and+cellular+orientation+in+developing+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons.</a> Alcohol. , (2012).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+neocortical+neurogenesis+and+neuronal+specification%3A+a+positional+information+system+encoded+by+neurogenetic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+of+The+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients.</a> The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).</li>
<li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia%2C+intermediate+progenitor+cells%2C+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li>
<li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eomes%3A%3AGFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast%2C+primitive+streak%2C+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45, 208-217 (2007).</li>
<li>Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+in+early+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix in early cortical development.</a> Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).</li>
<li>Milev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+expression+of+hyaluronan-binding+proteoglycans+in+developing+brain%3A+aggrecan%2C+versican%2C+neurocan%2C+and+brevican%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+postmitotically+regulates+migration%2C+postmigratory+differentiation%2C+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).</li>
<li>McKenna, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbr1+and+Fezf2+regulate+alternate+corticofugal+neuronal+identities+during+neocortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development.</a> The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).</li>
<li>Powrozek, T. A., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+on+the+development+of+the+vibrissal+somatosensory+cortical+barrel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).</li>
<li>O'Dell, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Dell%2C+R+%22Society+for+Neuroscience%22">Society for Neuroscience</a>. , Washington D.C. (2011).</li>
<li>Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+Golgi+picture+of+the+layer+VI+cortic-geniculate+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research.+Experimentelle+Hirnforschung.+Experimentation+Cerebrale%22%5BJournal%5D)">Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons.</a> Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).</li>
<li>Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+physiological+characterization+of+layer+VI+corticofugal+neurons+of+mouse+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).</li>
<li>Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrony+in+the+interconnected+circuitry+of+the+thalamus+and+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).</li>
<li>Kowalczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+Neuronal+Progenitors+%28Basal+Progenitors%29+Produce+Pyramidal-Projection+Neurons+for+All+Layers+of+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex.</a> Cereb. Cortex. , (2009).</li>
<li>Konig, N., Roch, G., Marty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+synaptogenesis+in+rat+temporal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex.</a> Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ulepszyliśmy i oceniliśmy model eksperymentalny - eksplantaty całej półkuli - do badania wczesnego rozwoju kory mózgowej (E13-E15). Model okazał się przydatny do analizy migracji i różnicowania linii neuronów pobudzających, która stanowi warstwę 6 kory mózgowej 25,37 . Głównymi zaletami systemu są: 1) wzrost organotypowy dla 2 DIV, 2) prostota przygotowania oraz 3) eksperymentalny dostęp do neuronów w celu elektroporacji, manipulacji farmakologicznej i obrazowania w tym wczesnym, krytycznym okresie rozwoju móz...

Kora mózgowa ssaków powstaje poprzez skoordynowaną proliferację, migrację i różnicowanie kolejno generowanych neuronów. Każdy neuron rodzi się w strefie komorowej (VZ) i migruje z VZ do strefy pośredniej (IZ), tworząc płytkę korową (CP) 1. Przechodząc przez różne domeny korowe, migrujące neurony wykazują wiele trybów migracji 2,3, które zależą od środowiska zewnątrzkomórkowego i innych elementów komórkowych (np. promieniowego gleju) w rozwijającej się tkance. Neurony korowe następnie zatrzymują migrację na szczycie tworzącej się płytki korowej w zbieżnych procesach zatrzymania migracji neuronów i dendrytogenezy 4.
Rozwój kory mózgowej jest inicjowany między 11-13 dniem embrionalnym (E11-13) 5 poprzez ustanowienie pierwotnej warstwy splotowatej 6 lub preplate (PP), warstwy pionierskich neuronów, która pokrywa VZ. Prospektywne neurony korowe warstwy 6 (tj. pierwsze neurony korowe urodzone w VZ) następnie orientują swoje somaty w stereotypowy wzór i łączą się w odrębną warstwę w PP 7. Zdarzenia te podzieliły płytkę przedpłytkową na powierzchowną brzeżną (przyszła warstwa korowa 1) i głęboką strefę, tę ostatnią złożoną z komórek podpłytkowych (przejściowa warstwa korowa 7). Proces ten, określany jako rozszczepienie przedpłytkowe, jest fundamentalnym wydarzeniem w przyszłym wzroście kory mózgowej 8.
Zidentyfikowano wiele mutacji genetycznych, które zakłócają różne aspekty rozwoju kory mózgowej 9. Na rozwój kory mózgowej może również negatywnie wpływać narażenie na spożyte toksyny, takie jak kokaina 10 i alkohol 11. Ponieważ wady rozwojowe kory mózgowej, które powstają podczas rozwoju, prawdopodobnie przyczyniają się do zaburzeń neurologicznych (np. autyzmu, schizofrenii), empiryczne badania zaburzeń rozwoju kory mózgowej są z natury ważne. W związku z tym niezwykle ważne jest opracowanie podejść do badania rozwoju kory mózgowej, które umożliwią szybkie testy efektów genetycznych lub toksycznych, ale także zachowają możliwe interakcje między różnicującymi się neuronami, innymi typami komórek i macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) w tym wczesnym okresie rozwoju mózgu 12.
Eksplantaty Slice 13 dostarczyły takiego systemu i były szeroko stosowane do badania rozwoju neuronów korowych 14-16. Jednak testy warstwowe mogą mieć tę wadę, że migracja neuronów i laminowanie mogą być nieprawidłowe17, prawdopodobnie z powodu uszkodzenia komórek opon mózgowych, które otaczają rozwijający się mózg i zakotwiczają promieniowe rusztowanie glejowe. Ponieważ promieniste włókna glejowe są ważnym substratem migracji neuronów korowych 18, przerwanie blaszki podstawnej przez cięcie może lokalnie zakłócić architekturę gleju promieniowego i prowadzić do zmienionej migracji kory. Ponadto pokrojone powierzchnie eksplantatów tworzą obszar martwych komórek, które mogą zmieniać normalny skład ECM w tych obszarach.
Nowsze podejścia skupiły swoją analizę na komórkach znajdujących się głęboko w wycinku, które są otoczone odpowiednimi zdrowymi typami komórek i ECM. Jednak w niektórych przypadkach te nowsze podejścia mogą wymagać, aby oryginalny gruby plasterek z kulturą został poddany kriosekcji lub sekcji parafinowej po utrwaleniu, tak aby stosunkowo normalne wnętrze wycinka było dostępne do analizy 19-21. Zarówno pierwotne cięcie wibratomiczne w celu przygotowania żywych plastrów do hodowli, jak i późniejsza kriosekcja utrwalonych plastrów do analizy wymagają staranności i wysiłku, aby te testy zadziałały.
Aby zapewnić proste, uzupełniające podejście do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej, zmodyfikowaliśmy istniejące metody warstwowe 13, aby ułatwić badania nad wczesnym rozwojem kory mózgowej. Opracowaliśmy model eksplantatu całej półkuli, podobny do istniejącego modelu całej półkuli E14, który obejmował wytrząsanie kultur z prędkością 65 obrotów na minutę i pozwolił na wzrost organotypowy przez 16-18 godzin 22,23 . W naszym podejściu eksplantaty na całej półkuli umieszcza się na półprzepuszczalnej membranie 13 w atmosferze kultury o wysokiej zawartości tlenu 21,24, aby przedłużyć wzrost kory organotypowej na 48 godzin. Takie podejście pozwala również na konsekwentną elektroporację rozwijających się neuronów korowych. Zarodki są usuwane z macicy i elektroporowane w celu wprowadzenia plazmidowego DNA, a następnie preparowana jest kresomózgowie. Każda półkula jest izolowana i umieszczana przyśrodkowo do dołu na filtrze pokrytym kolagenem. Eksplant jest następnie hodowany przez okres 48 godzin, okres obejmujący rozszczepianie przed płytką 8. W okresie hodowli neurony L6 rozwijają się od prekursora do zróżnicowanego neuronu 25, prawidłowo umieszczonego w płytce korowej. Przez cały ten okres rozwijający się neuron jest otoczony przez odpowiednie ECM i typy komórek, które konfrontują się z odpowiednią komórką in vivo. System ten okazał się już cenny w rozszyfrowywaniu zdarzeń komórkowych, które leżą u podstaw toksyczności etanolu 26, tworzenia warstwy 6 i wstępnego rozszczepienia płytki 7,25 .

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>10565</td><td></td></tr><tr><td>G5 Suplement 100X</td><td>Invitrogen</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement bez serum 50X</td><td>Invitrogen</td><td>1504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pen / Strep Liquid 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 500 ml</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka hodowlana pokryta kolagenem </td><td>Costar</td><td>3492</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry bydlęcej </td><td>Sigma</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; CHST 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td>BTX 830 Electroporator Harvard Apparatus 450052 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrody pęsetowe 10mm</td><td>Aparat Harvard</td><td>450166</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Billups Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton (5uL)</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>Igła strzykawki Hamilton</td><td></td><td>Hamilton 7803-04</td><td>Określ 1" i styl 4</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki Tough Cut 9 cm</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Rozwój kory obejmuje złożone interakcje między neuronami a elementami nieneuronalnymi, w tym komórkami prekursorowymi, naczyniami krwionośnymi, oponami mózgowymi i powiązaną macierzą zewnątrzkomórkową. Ponieważ zapewniają odpowiednie środowisko organotypowe, eksplantaty z plastrów korowych są często używane do badania tych interakcji, które kontrolują różnicowanie i rozwój neuronów. Chociaż jest to korzystne, model eksplantacji plastrów może mieć wady, w tym nieprawidłową laminację komórkową i migrację. Tutaj przedstawiamy cały system eksplantatów półkuli mózgowej do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej, który jest łatwiejszy do przygotowania niż plastry korowe i wykazuje spójną organotypową migrację i laminację. W tym systemie modelowym wczesne wzorce laminacji i migracji przebiegają normalnie przez okres dwóch dni in vitro, w tym okres wstępnego podziału płytki, podczas którego tworzy się prospektywna warstwa korowa szósta. Następnie opracowaliśmy metodę elektroporacji ex utero (EUEP), która osiąga ~80% sukces w kierowaniu ekspresji GFP na neurony rozwijające się w grzbietowej korze przyśrodkowej.
Model eksplantacji całej półkuli umożliwia wczesny rozwój kory mózgowej dla elektroporacji, interwencji farmakologicznej i metod obrazowania na żywo. Metoda ta pozwala uniknąć operacji przetrwania wymaganej w przypadku metod elektroporacji in utero (IUEP), jednocześnie poprawiając zarówno transfekcję, jak i spójność celowania powierzchniowego. Metoda ta ułatwi eksperymentalne badania proliferacji, migracji i różnicowania neuronów.

Zarodek kory mózgu gryzoni wykazuje poprzeczny gradient neurogenetyczny w całym okresie rozwoju, w taki sposób, że boczna neocortex jest o około 1 dzień bardziej dojrzała niż grzbietowa przyśrodkowa neocortex 28. Większość neuronów warstwy 6 jest zatem generowana (i.e. przechodzi końcową fazę S) w dniu E12 w korze bocznej (nazywanej również Polami 405) i w dniu E13 w grzbietowej korze przyśrodkowej (nazywanej również Polami 15). Podział preplate rozpoczyna się około 1 dzień po ge...

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie całych eksplantów półkuli mózgu do badania wczesnego rozwoju kory mózgowej. Osiąga się to najpierw poprzez pobranie embrionów myszy w 13. dniu embrionalnym. Następnie do komory bocznej mózgu wstrzykuje się mieszaninę plazmidowego DNA i przeprowadza elektroporację ex utero.Następnie należy przygotować eksplant całej półkuli z elektroporowanego zarodka. Ostatnim krokiem jest utrwalenie i wykonanie przekrojów eksplantu całej półkuli do analiz histologicznych. W końcowym etapie wpływ mutacji lub ekspozycji na toksynę na rozwój neuronów korowych można ocenić za pomocą analiz immunohistochemicznych neuronów wykazujących ekspresję GFP.Nazywam się Eric Olson. Pracuję w Katedrze Neuronauki i Fizjologii na SUNY Upstate Medical University w Syracuse. Dzisiaj zaprezentujemy metodę opracowaną przez nasz zespół, zwaną eksplantacją całej półkuli (whole Hemisphere X explan). Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak eksplantacja skrawków, jest prostota przygotowania eksplantów całej półkuli oraz zapewnienie dwudniowego wzrostu organotypowego.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurorozwoju, takie jak wpływ konkretnej mutacji lub toksyny na zaburzenia wczesnego rozwoju kory mózgowej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ przygotowanie całego półkulistego eksplantu bez uszkodzenia opon mózgowych może wymagać wprawy. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy sekcji i transferu eksplantu są trudne do opanowania ze względu na wrażliwość tkanki na uszkodzenia mechaniczne.Procedury zaprezentuje dr Theresa Ozzi, pracownik postdoctoralny w moim laboratorium. W tym protokole należy użyć komercyjnie dostępnego zestawu do oczyszczania plazmidów. Przygotować DNA plazmidowe w stężeniu 0,33 mg/ml w wodzie i dodać barwnik fast green jako znacznik wstrzyknięcia w stężeniu około 0,02% w/v. Zawsze należy dezynfekować narzędzia chirurgiczne, przestrzeń roboczą oraz mikroskop.Po przemyciu 70% etanolem, uśmierca się wymaganą liczbę samic szczurów linii Swiss Webster w dniu E 13 poprzez inhalację dwutlenkiem węgla. Po usunięciu embrionów umieszcza się je w 10-centymetrowej płytce z lodowatym HBSS; płytka powinna być utrzymywana w niskiej temperaturze. Należy ostrożnie wypreparować każdy embrion z otaczających go pozazarodkowych błon płucnych.Następnie przenieś każdy embrion pojedynczo do czystej szalki z lodowatym HBSS. Za pomocą strzykawki Hamiltona wstrzyknij od dwóch do trzech mikrolitrów przygotowanego DNA do komory lewej półkuli mózgowia. Nie wstrzykuj preparatu do obszaru kory lub w jego pobliżu, który jest przeznaczony do późniejszej analizy.Aby przeprowadzić elektroporację DNA, delikatnie przytrzymaj embrion pęsetą i lekko przyłóż dodatnią elektrodę elektrod pęsetowych do linii środkowej grzbietu głowy. Lekko przyłóż elektrodę ujemną pod brodę embrionu. Uruchom program składający się z pięciu impulsów o napięciu 30 V, każdy o czasie trwania 50 ms, w odstępach jednej sekundy, korzystając z modelu BTX 830 lub innych systemów, które można skonfigurować zgodnie z instrukcjami producenta.Przenieś każdy embrion z powrotem do schłodzonego HBSS i przystąp do przygotowania preparatu całej półkuli pod mikroskopem stereoskopowym, używając dwóch pęset jubilerskich nr 5. Usuń skórę oraz chrzęstną czaszkę z głowy embrionu. Następnie wsuń pęsetę pod mózg.Aby usunąć nienaruszony mózg z czaszki, wypreparuj elektroporowaną półkulę, wliczając w to przylegającą tkankę śródmózgowia. Należy uważać, aby nie uszkodzić opon mózgowych pokrywających wypreparowaną półkulę korową. Stwierdziliśmy, że najtrudniejszym etapem do opanowania jest dyssekcja i usunięcie elektroporowanej półkuli bez uszkodzenia opon mózgowych.Po przeprowadzeniu sekcji przenieś każdą półkulę do 5 ml lodowatego HBSS, używając rozszerzonego końcówki pipety o pojemności 1 ml. W razie potrzeby embriony można przechowywać w oddzielnych studzienkach naczynia hodowlano-tkankowego z 12 studzienkami. Następnie ostrożnie przenieś do sześciu półkul na 24 mm kulturę powleczoną kolagenem.Włóż insert i ustaw go stroną przyśrodkową do dołu. Następnie napełnij dołek 35 milimetrowej płytki 6-dołkowej 2,7 mililitrami uzupełnionej pożywki. Usuń nadmiar HBSS z insertu, a następnie umieść insert w dołku z pożywką i za pomocą pipety nanieś kilka kropel pożywki z dołka na wierzch każdego eksplantu.Nie zwiększaj objętości pożywki. Stwierdzono, że kluczowe jest naniesienie kilku kropel pożywki kulturacyjnej na wierzch eksplantów X, tak aby nie były one całkowicie zakryte pożywką. Może to oznaczać dodanie nawet 400 µL do 2,7 ml pożywki na wierzch eksplantów X.Przenieś naczynie do komory Billupsa-Rothenberga zawierającej naczynie z wodą do nawilżania, która była nasycana 95% tlenem przez co najmniej jedną minutę. Szczelnie zamknij komorę i odłącz rurkę doprowadzającą gaz. Umieść komorę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na dwie doby, po których nastąpi podział pre-plastidialny.Przygotowanie. Przygotuj podkładki do zatapiania preparatu. Przygotuj 10% roztwór żelatyny ze skóry cielęcej w temperaturze 60 °C.Po rozpuszczeniu wlej około 10 mililitrów roztworu doy 10 centymetrowej szalki. Pozostałą część roztworu przechowuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza do późniejszego użycia. W razie potrzeby odczekaj pół godziny, aż podkład zastygnie.Można je przechowywać w temperaturze 4°C przez kilka dni, jednak przed użyciem należy ogrzać je do temperatury pokojowej. W dniu fiksacji, w dygestorium, przygotować odczynnik Pagano, utrwalacz oraz roztwór Pagano bez utrwalacza. Roztwór do fiksacji należy ogrzać do 37°C.Wyjmij eksplantaty z inkubatora, robiąc to ostrożnie i szybko, aby nie uszkodzić tkanek. Usuń większość pożywki i zastąp ją pięcioma mililitrami podgrzanego utrwalacza. Upewnij się, że każdy eksplantat jest całkowicie zanurzony.Utrwalaj tkanki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń utrwalacz i zastąp go roztworem Pagano. Bez utrwalacza.Do każdej studzienki dodaj kilka kropel 10% azotku sodu. Tkanki można teraz przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu ich zatopienia na podkładce do zatapiania. Za pomocą linijki narysuj siatkę na dnie naczynia.Przygotuj kwadraty o boku od dwóch do trzech centymetrów. Przenieś poszczególne eksplanty na podkładkę do zatapiania. Odessaj resztki roztworu i pokryj każdy eksplant ciepłym 10% roztworem żelatyny.Pozostawić do zastygnięcia. Po powolnym zastygnięciu dodawać stopniowo roztwór żelatyny, aż każdy eksplant zostanie całkowicie otoczony. Należy unikać rozpuszczenia podłoża, co może nastąpić w przypadku dodania zbyt dużej ilości żelatyny naraz.Następnie należy pozostawić żelatynę do stężenia przez około godzinę. Po stężeniu poszczególne ekplanaty można pociąć na małe bloki żelatynowe przed przystąpieniem do sekcjonowania. Ważne jest, aby utrwalić bloki w fiksatywie Pagano przez dzień lub dwa.Podczas krojenia należy ułożyć eksplanty cebulką węchową do góry i wykonywać przekroje w płaszczyźnie czołowej o grubości 100 µm. Przekroje należy zbierać do schłodzonego PBS z 0,1% azydku sodu.Przechowywać skrawki w temperaturze 4°C do czasu ich zabarwienia zgodnie z opisaną techniką. Eksplanty całych półkul przygotowano w dniu E 13 przed rozdzieleniem płatów. W grzbietowej części nowokory.Tkanka zawierała transgen raportujący niedojrzałe neurony z pobudzeniowej linii korowej. Eksplanty korowe z tego samego miotu utrwalano metodą drop-fix sekwencyjnie w ciągu dwóch dni in vitro i poddano dalszej analizie histologicznej. W początkowym punkcie czasowym analizy, DIV 0, podział prepolów w polu nie nastąpił jeszcze w DIV.Płyta naczyniowa (CP) stała się widoczna i nadal rosła aż do etapu 2D IV. W ten sposób całe eksplanty półkuli hodowane początkowo w dniu E 13 podtrzymywały przez dwa dni dojrzewanie kory mózgowia i uchwyciły wcześniejszy podział w grzbietowej części nowokory, co potwierdziło prawidłowy rozwój histologiczny w grzbietowej części nowokory. Eksplanty 2D IV poddano immunobarwieniu na siarczan chondroityny, proteoglikany i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. Dwa pasma immunoreaktywności w korze grzbietowej wskazały na odpowiedni podział płyty przedpływowej (PPP) na strefę marginalną (MZ) i płytę podkomórkową (SP) w okresie hodowli in vitro.PP został podzielony przez L na sześć neuronów korowych wykazujących ekspresję CTIP2 i TBR1. Wzór barwienia immunologicznego tych markerów potwierdza prawidłową ekspresję tych czynników transkrypcyjnych w nowo powstałej cp. Wspólnie analizy te potwierdzają ORGANOTYPICZNY wczesny rozwój kory w całej półkuli; stosując opisany protokół, wykonano iniekcje do komory bocznej nienaruszonych embrionów E13.Ekspresję GFP po elektroporacji i procesowaniu można było zaobserwować w prekursorach neuronalnych w strefie brzusznej (vz). Choć intensywnie wykazujące ekspresję GFP komórki zaobserwowano w strefie pośredniej (IZ) i płycie korowej (cp), istotne jest to, że na szczycie formującej się płyty korowej zaobserwowano liczne neurony GFP-dodatnie (oznaczone grotami strzałek) z wyłaniającymi się dendrytami i aksonami. Wyraźna warstwa na styku płyty korowej (CP) i strefy marginalnej (MZ) wskazuje na prawidłową migrację, zatrzymanie i laminację.Dendryty rozciągały się do strefy brzeżnej (MZ), podczas gdy aksony korowo-zwojowe biegły poniżej płytki korowej (CP) i w głąb strefy pośredniej (iz). Różnicujące się komórki były komórkami GFP-dodatnimi w różnych stadiach dojrzałości, w tym neuronami o morfologii dwubiegunowej sąsiadującymi z włóknami radialnej glei oraz znajdującymi się poniżej nich neuronami wielobiegunowymi w strefie iz. Dendryty rozciągały się również do strefy MZ, w której odpowiednio zlokalizowano immunochemicznie białko macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) reelin.Zatem warunki elektroporacji i eksplantacji umożliwiają prawidłowy rozwój neuronów korowych. Zgodnie z oczekiwaniami, postmitotyczne neurony GFP-dodatnie zasiedliły formujący się cp. W związku z tym protokół ten pozwala na niezawodne targetowanie neuronów kory warstwy L six w celu badania ich migracji i dojrzewania.Szerokie zastosowanie tej procedury pozwoliło na osiągnięcie 79% skuteczności. 195 z 248 prób nadawało się do obrazowania i analizy. Połowa niepowodzeń wynikała z braku ekspresji GFP lub niepowodzenia w celowaniu GFP po opanowaniu metody.Technikę tę można przeprowadzić w 90 minut, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo. Podczas próby zastosowania tej procedury ważne jest, aby przećwiczyć sekcje w taki sposób, aby po zakończeniu procedury elektroporowane półkule mózgu można było hodować z nienaruszonymi oponami mózgowymi. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące tego, w jaki sposób interesujące nas mutacje zaburzają migrację neuronów lub dendrogenezę, można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia poklatkowa.

ex-utero-electroporation-whole-hemisphere-explants-simple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ex utero Elektroporacja i eksplantacja całej półkuli: Prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Poznaj metodę eksplantacji całej półkuli mózgowej myszy z elektroporacją ex utero do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej. Technika umożliwia precyzyjną manipulację genową i analizy farmakologiczne.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Przeglądaj więcej filmów