Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie całych eksplantów półkuli mózgu do badania wczesnego rozwoju kory mózgowej. Osiąga się to najpierw poprzez pobranie embrionów myszy w 13. dniu embrionalnym. Następnie do komory bocznej mózgu wstrzykuje się mieszaninę plazmidowego DNA i przeprowadza elektroporację ex utero.

Następnie należy przygotować eksplant całej półkuli z elektroporowanego zarodka. Ostatnim krokiem jest utrwalenie i wykonanie przekrojów eksplantu całej półkuli do analiz histologicznych. W końcowym etapie wpływ mutacji lub ekspozycji na toksynę na rozwój neuronów korowych można ocenić za pomocą analiz immunohistochemicznych neuronów wykazujących ekspresję GFP.

Nazywam się Eric Olson. Pracuję w Katedrze Neuronauki i Fizjologii na SUNY Upstate Medical University w Syracuse. Dzisiaj zaprezentujemy metodę opracowaną przez nasz zespół, zwaną eksplantacją całej półkuli (whole Hemisphere X explan). Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak eksplantacja skrawków, jest prostota przygotowania eksplantów całej półkuli oraz zapewnienie dwudniowego wzrostu organotypowego.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurorozwoju, takie jak wpływ konkretnej mutacji lub toksyny na zaburzenia wczesnego rozwoju kory mózgowej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ przygotowanie całego półkulistego eksplantu bez uszkodzenia opon mózgowych może wymagać wprawy. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy sekcji i transferu eksplantu są trudne do opanowania ze względu na wrażliwość tkanki na uszkodzenia mechaniczne.

Procedury zaprezentuje dr Theresa Ozzi, pracownik postdoctoralny w moim laboratorium. W tym protokole należy użyć komercyjnie dostępnego zestawu do oczyszczania plazmidów. Przygotować DNA plazmidowe w stężeniu 0,33 mg/ml w wodzie i dodać barwnik fast green jako znacznik wstrzyknięcia w stężeniu około 0,02% w/v. Zawsze należy dezynfekować narzędzia chirurgiczne, przestrzeń roboczą oraz mikroskop.

Po przemyciu 70% etanolem, uśmierca się wymaganą liczbę samic szczurów linii Swiss Webster w dniu E 13 poprzez inhalację dwutlenkiem węgla. Po usunięciu embrionów umieszcza się je w 10-centymetrowej płytce z lodowatym HBSS; płytka powinna być utrzymywana w niskiej temperaturze. Należy ostrożnie wypreparować każdy embrion z otaczających go pozazarodkowych błon płucnych.

Następnie przenieś każdy embrion pojedynczo do czystej szalki z lodowatym HBSS. Za pomocą strzykawki Hamiltona wstrzyknij od dwóch do trzech mikrolitrów przygotowanego DNA do komory lewej półkuli mózgowia. Nie wstrzykuj preparatu do obszaru kory lub w jego pobliżu, który jest przeznaczony do późniejszej analizy.

Aby przeprowadzić elektroporację DNA, delikatnie przytrzymaj embrion pęsetą i lekko przyłóż dodatnią elektrodę elektrod pęsetowych do linii środkowej grzbietu głowy. Lekko przyłóż elektrodę ujemną pod brodę embrionu. Uruchom program składający się z pięciu impulsów o napięciu 30 V, każdy o czasie trwania 50 ms, w odstępach jednej sekundy, korzystając z modelu BTX 830 lub innych systemów, które można skonfigurować zgodnie z instrukcjami producenta.

Przenieś każdy embrion z powrotem do schłodzonego HBSS i przystąp do przygotowania preparatu całej półkuli pod mikroskopem stereoskopowym, używając dwóch pęset jubilerskich nr 5. Usuń skórę oraz chrzęstną czaszkę z głowy embrionu. Następnie wsuń pęsetę pod mózg.

Aby usunąć nienaruszony mózg z czaszki, wypreparuj elektroporowaną półkulę, wliczając w to przylegającą tkankę śródmózgowia. Należy uważać, aby nie uszkodzić opon mózgowych pokrywających wypreparowaną półkulę korową. Stwierdziliśmy, że najtrudniejszym etapem do opanowania jest dyssekcja i usunięcie elektroporowanej półkuli bez uszkodzenia opon mózgowych.

Po przeprowadzeniu sekcji przenieś każdą półkulę do 5 ml lodowatego HBSS, używając rozszerzonego końcówki pipety o pojemności 1 ml. W razie potrzeby embriony można przechowywać w oddzielnych studzienkach naczynia hodowlano-tkankowego z 12 studzienkami. Następnie ostrożnie przenieś do sześciu półkul na 24 mm kulturę powleczoną kolagenem.

Włóż insert i ustaw go stroną przyśrodkową do dołu. Następnie napełnij dołek 35 milimetrowej płytki 6-dołkowej 2,7 mililitrami uzupełnionej pożywki. Usuń nadmiar HBSS z insertu, a następnie umieść insert w dołku z pożywką i za pomocą pipety nanieś kilka kropel pożywki z dołka na wierzch każdego eksplantu.

Nie zwiększaj objętości pożywki. Stwierdzono, że kluczowe jest naniesienie kilku kropel pożywki kulturacyjnej na wierzch eksplantów X, tak aby nie były one całkowicie zakryte pożywką. Może to oznaczać dodanie nawet 400 µL do 2,7 ml pożywki na wierzch eksplantów X.

Przenieś naczynie do komory Billupsa-Rothenberga zawierającej naczynie z wodą do nawilżania, która była nasycana 95% tlenem przez co najmniej jedną minutę. Szczelnie zamknij komorę i odłącz rurkę doprowadzającą gaz. Umieść komorę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na dwie doby, po których nastąpi podział pre-plastidialny.

Przygotowanie. Przygotuj podkładki do zatapiania preparatu. Przygotuj 10% roztwór żelatyny ze skóry cielęcej w temperaturze 60 °C.

Po rozpuszczeniu wlej około 10 mililitrów roztworu doy 10 centymetrowej szalki. Pozostałą część roztworu przechowuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza do późniejszego użycia. W razie potrzeby odczekaj pół godziny, aż podkład zastygnie.

Można je przechowywać w temperaturze 4°C przez kilka dni, jednak przed użyciem należy ogrzać je do temperatury pokojowej. W dniu fiksacji, w dygestorium, przygotować odczynnik Pagano, utrwalacz oraz roztwór Pagano bez utrwalacza. Roztwór do fiksacji należy ogrzać do 37°C.

Wyjmij eksplantaty z inkubatora, robiąc to ostrożnie i szybko, aby nie uszkodzić tkanek. Usuń większość pożywki i zastąp ją pięcioma mililitrami podgrzanego utrwalacza. Upewnij się, że każdy eksplantat jest całkowicie zanurzony.

Utrwalaj tkanki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń utrwalacz i zastąp go roztworem Pagano. Bez utrwalacza.

Do każdej studzienki dodaj kilka kropel 10% azotku sodu. Tkanki można teraz przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu ich zatopienia na podkładce do zatapiania. Za pomocą linijki narysuj siatkę na dnie naczynia.

Przygotuj kwadraty o boku od dwóch do trzech centymetrów. Przenieś poszczególne eksplanty na podkładkę do zatapiania. Odessaj resztki roztworu i pokryj każdy eksplant ciepłym 10% roztworem żelatyny.

Pozostawić do zastygnięcia. Po powolnym zastygnięciu dodawać stopniowo roztwór żelatyny, aż każdy eksplant zostanie całkowicie otoczony. Należy unikać rozpuszczenia podłoża, co może nastąpić w przypadku dodania zbyt dużej ilości żelatyny naraz.

Następnie należy pozostawić żelatynę do stężenia przez około godzinę. Po stężeniu poszczególne ekplanaty można pociąć na małe bloki żelatynowe przed przystąpieniem do sekcjonowania. Ważne jest, aby utrwalić bloki w fiksatywie Pagano przez dzień lub dwa.

Podczas krojenia należy ułożyć eksplanty cebulką węchową do góry i wykonywać przekroje w płaszczyźnie czołowej o grubości 100 µm. Przekroje należy zbierać do schłodzonego PBS z 0,1% azydku sodu.

Przechowywać skrawki w temperaturze 4°C do czasu ich zabarwienia zgodnie z opisaną techniką. Eksplanty całych półkul przygotowano w dniu E 13 przed rozdzieleniem płatów. W grzbietowej części nowokory.

Tkanka zawierała transgen raportujący niedojrzałe neurony z pobudzeniowej linii korowej. Eksplanty korowe z tego samego miotu utrwalano metodą drop-fix sekwencyjnie w ciągu dwóch dni in vitro i poddano dalszej analizie histologicznej. W początkowym punkcie czasowym analizy, DIV 0, podział prepolów w polu nie nastąpił jeszcze w DIV.

Płyta naczyniowa (CP) stała się widoczna i nadal rosła aż do etapu 2D IV. W ten sposób całe eksplanty półkuli hodowane początkowo w dniu E 13 podtrzymywały przez dwa dni dojrzewanie kory mózgowia i uchwyciły wcześniejszy podział w grzbietowej części nowokory, co potwierdziło prawidłowy rozwój histologiczny w grzbietowej części nowokory. Eksplanty 2D IV poddano immunobarwieniu na siarczan chondroityny, proteoglikany i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. Dwa pasma immunoreaktywności w korze grzbietowej wskazały na odpowiedni podział płyty przedpływowej (PPP) na strefę marginalną (MZ) i płytę podkomórkową (SP) w okresie hodowli in vitro.

PP został podzielony przez L na sześć neuronów korowych wykazujących ekspresję CTIP2 i TBR1. Wzór barwienia immunologicznego tych markerów potwierdza prawidłową ekspresję tych czynników transkrypcyjnych w nowo powstałej cp. Wspólnie analizy te potwierdzają ORGANOTYPICZNY wczesny rozwój kory w całej półkuli; stosując opisany protokół, wykonano iniekcje do komory bocznej nienaruszonych embrionów E13.

Ekspresję GFP po elektroporacji i procesowaniu można było zaobserwować w prekursorach neuronalnych w strefie brzusznej (vz). Choć intensywnie wykazujące ekspresję GFP komórki zaobserwowano w strefie pośredniej (IZ) i płycie korowej (cp), istotne jest to, że na szczycie formującej się płyty korowej zaobserwowano liczne neurony GFP-dodatnie (oznaczone grotami strzałek) z wyłaniającymi się dendrytami i aksonami. Wyraźna warstwa na styku płyty korowej (CP) i strefy marginalnej (MZ) wskazuje na prawidłową migrację, zatrzymanie i laminację.

Dendryty rozciągały się do strefy brzeżnej (MZ), podczas gdy aksony korowo-zwojowe biegły poniżej płytki korowej (CP) i w głąb strefy pośredniej (iz). Różnicujące się komórki były komórkami GFP-dodatnimi w różnych stadiach dojrzałości, w tym neuronami o morfologii dwubiegunowej sąsiadującymi z włóknami radialnej glei oraz znajdującymi się poniżej nich neuronami wielobiegunowymi w strefie iz. Dendryty rozciągały się również do strefy MZ, w której odpowiednio zlokalizowano immunochemicznie białko macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) reelin.

Zatem warunki elektroporacji i eksplantacji umożliwiają prawidłowy rozwój neuronów korowych. Zgodnie z oczekiwaniami, postmitotyczne neurony GFP-dodatnie zasiedliły formujący się cp. W związku z tym protokół ten pozwala na niezawodne targetowanie neuronów kory warstwy L six w celu badania ich migracji i dojrzewania.

Szerokie zastosowanie tej procedury pozwoliło na osiągnięcie 79% skuteczności. 195 z 248 prób nadawało się do obrazowania i analizy. Połowa niepowodzeń wynikała z braku ekspresji GFP lub niepowodzenia w celowaniu GFP po opanowaniu metody.

Technikę tę można przeprowadzić w 90 minut, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo. Podczas próby zastosowania tej procedury ważne jest, aby przećwiczyć sekcje w taki sposób, aby po zakończeniu procedury elektroporowane półkule mózgu można było hodować z nienaruszonymi oponami mózgowymi. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące tego, w jaki sposób interesujące nas mutacje zaburzają migrację neuronów lub dendrogenezę, można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia poklatkowa.