Powłoki grafenowe do implantów biomedycznych

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie metody powlekania metalicznego stopu z pamięcią kształtu, nitinolu, grafenem w celu poprawy kompatybilności hemologicznej w materiałach implantów mających kontakt z krwią. Osiąga się to poprzez pierwsze wyhodowanie grafenu na foliach miedzianych za pomocą chemicznego osadzania z fazy gazowej. Drugim krokiem jest wytrawienie folii miedzianych i przeniesienie tak przygotowanego grafenu na podłoża nitinolowe.

Następnie podłoża nitinolowe pokryte grafenem są wykorzystywane do hodowli komórek śródbłonka i komórek mięśni gładkich. Aby określić ilościowo zgodność cyto, innym testem jest sprawdzenie zgodności hemologicznej poprzez kodowanie obu białek, fibrynogenu i albuminy na podłożach nitinolowych pokrytych grafenem. Ostatecznie spektroskopia mikroraminowa, mikroskopia konfokalna testy cytotoksyczności in vitro i analiza białek na stronie SDS są wykorzystywane do wykazania udanej powłoki grafenowej, ulepszonej morfologii komórek, lepszej żywotności komórek i lepszej kompatybilności hemo.

Główną zaletą tej techniki lub istniejących technik, takich jak powlekanie polimerowe, jest to, że powłoki grafenowe są niezwykle trwałe i odporne na korozję. Implikacje tej techniki rozciągają się na poprawę pochodzenia technologii stentów, ponieważ oczekuje się, że naturalne właściwości materiału grafenów zmniejszą wchłanianie białka i zmniejszą aktywację czynników krzepnięcia w wyniku zmiany potwierdzającej białko. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w stenty nitinolowe powlekane grafenem, mogą być również stosowane w innych systemach, takich jak zastawki serca lub cewniki.

Na początek umieść folie miedziane o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr w jednocalowym piecu z rurkami kwarcowymi i podgrzej do 1000 stopni Celsjusza w obecności 50 SCCM wodoru i 450 SCC CM argonu. Następnie wprowadź jeden i cztery SCCM metanu do pieca o temperaturze 1000 stopni Celsjusza przy różnych natężeniach przepływu przez 20 do 30 minut. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej wewnątrz pieca pod przepływającym wodorem, argonem i metanem.

Po wyjęciu próbek z pieca pokrój je na 4,5 milimetra kwadratowego i użyj PMMA rozcieńczonego 4% Anolem do wirowania folii miedzianych z prędkością 4 000 obr./min, a następnie poddaj obróbce cieplnej przez pięć minut w temperaturze 150 stopni Celsjusza. Wytrawiaj folię miedzianą za pomocą wytrawiania CE 100, aż folia miedziana zostanie całkowicie wytrawiona. Płukać w 10% kwasie solnym przez 10 minut, a następnie w wodzie dejonizowanej przez 10 minut.

Aby uzyskać próbkę grafenu PMMA, przenieś próbki grafenu na 4,5 milimetra kwadratowego podłoża nitinolowego. Następnie w temperaturze 450 stopni Celsjusza w 300 SCCM argonu i 700 SCCM wodoru przez dwie godziny. Aby usunąć PMMA, na koniec przemyj podłoża nitinolowe acetonem, aby rozpuścić resztki PMMA w celu uzyskania próbki grafenu i niklu i tytanu.

Aby rozpocząć badania toksyczności, dodać nieskazitelny nitinol jeden SCCM lub cztery podłoża grafenowo-nitinolowe SCCM do 96-dołkowych płytek, gdzie podany SCCM odpowiada przepływowi metanu stosowanemu w chemicznym osadzaniu grafenu z fazy gazowej. Następnie komórki śródbłonka aorty szczura w ilości od 10 do piątej komórki na studzienkę w niektórych studzienkach zawierających dziewiczy nitinol jeden SCCM lub cztery SCCM. Substraty grafenowo-nitinolowe, nasiona komórek mięśni gładkich aorty szczura w podobny sposób w innym zestawie studzienek.

Hoduj komórki przez trzy lub siedem dni w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, wymieniając pożywkę co drugi dzień. W końcowym punkcie czasowym usuń pożywkę z dołków zawierających komórki mięśni gładkich i dodaj do każdej z nich świeżą pożywkę zawierającą 0,5 miligrama na mililitr MTT. Dobrze inkubuj komórki przez dodatkowe trzy godziny.

Następnie delikatnie usuń pożywkę i dodaj 100 mikrolitrów sulfotlenku dimetylu do każdej studzienki. Po odczekaniu 10 minut, aż kryształy MTT się rozpuszczą, przenieś roztwór na inną płytkę dołka. W przypadku testu MTS należy usunąć pożywkę z dołków zawierających komórki śródbłonka w końcowym punkcie czasowym.

Zastąp 120 mikrolitrami roztworu MTS i inkubuj przez trzy godziny. Następnie przenieś zawartość studzienki na nową płytkę. Odczytaj absorbent przy 490 nanometrach i określ procentową żywotność, normalizując chłonność do średniej absorbancji próbki nieskazitelnego nitinolu.

Powtórzyć ten krok co najmniej pięć razy dla każdej próbki. W przypadku obrazowania konfokalnego komórek mięśni gładkich aorty szczura należy umieścić podłoża w szkiełku ośmiokomorowym, pozostawiając jedną komorę pustą jako kontrolę. Następnie wysiewaj komórki we wszystkich komorach po 25 000 komórek na komorę i inkubuj przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po wyjęciu pożywki ze szkiełek należy przykleić komórki do podłoża z 4% formaldehydem w buforze PBS przez 20 minut. Umyć PBS, a następnie przecierać 0,1%Triton X przez jedną minutę. Po przemyciu PBS dodać 100 mikrolitrów roztworu LOR 4 88 PHIN do 1,9 mililitra buforu PBS.

Aby uwidocznić akton, wybarwić komórki 250 mikrolitrami LOR 4 88 Phin przez 45 minut, a następnie przemyć dwukrotnie buforem PBS. Następnie wybarwić jądra fluorescencyjnym podłożem montażowym zawierającym dpi. Zbieraj obrazy konfokalne za pomocą konfokalnego ti.

Przed rozpoczęciem eksperymentów z absorpcją albuminy i białka fibrynogenu należy zmierzyć wymiary podłoża za pomocą suwmiarki. Wykonaj trzy pomiary z każdej strony próbek o powierzchni około kwadratowej i uśrednij. Aby uzyskać długość i szerokość, umieść nieskazitelną próbkę nitinolu, jedną próbkę grafenu nitinolu SCCM i cztery próbki grafenu nitinolu SCCM w dwóch 12.

Płytki studzienne dodają bufor PBS zawierający jeden miligram na mililitr albuminy. Dodaj temperaturę pokojową do jednej z płytek i inkubuj osobno przez trzy godziny. Inkubować trzy typy próbek z buforem PBS zawierającym jeden miligram na mililitr.

Fibrynogen w temperaturze pokojowej przez trzy godziny po umyciu próbek PBS, połączyć podobne próbki w mikroprobówce wirówkowej z 200 mikrolitrami redukującego buforu próbki i gotować przez pięć minut. Rozcieńczyć próbki w stosunku objętościowym od jednego do dziewięciu objętości buforu T glicyny SDS do wody dejonizowanej i przepuścić przez żel do elektroforezy z poliakryloamidu od czterech do 15% tris przy napięciu 90 woltów przez 100 minut. Rozcieńczyć roztwór podstawowy czerwieni spro w stosunku jeden do 5 000 w 7,5% kwasie octowym.

Następnie barwić żele przez 60 minut rozcieńczonym roztworem spro red. Zawiń w folię aluminiową, aby chronić spro red przed światłem żeli obrazowych za pomocą Fluor chem SP i określ ilościowo intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania Image J. Następnie znormalizuj intensywność fluorescencji z każdej próbki przez całkowitą powierzchnię substratu i porównaj absorpcję fibrynogenu z absorpcją albuminy.

Metoda chemicznego osadzania z fazy gazowej pozwoliła uzyskać próbki grafenu polikrystalicznego, które naśladują ziarna kryształów miedzi Spektroskopia Ramen została wykorzystana do potwierdzenia obecności grafenu jednowarstwowego w jednej próbce SCCM i czterech SCCM. Jedna próbka SCCM wykazuje intensywne pasmo georadarowe, co wskazuje na monowarstwowy charakter przygotowanego grafenu. Natomiast cztery próbki SCCM wykazują stosunkowo słabsze pasmo GPR, co potwierdza obecność kilku warstw grafenu przedstawionych na zdjęciu jest obrazem grafenu przeniesionym na podłoża nitinolowe z mikroskopii sił atomowych.

Szczegółowe pomiary próbki dały wartość chropowatości powierzchni około pięciu nanometrów. Pokazano. Oto obrazy konfokalnej mikroskopii optycznej dla komórek mięśni gładkich hodowanych na kontrolowanym szkiełku podstawowym na nieskazitelnych podłożach nitinolowych SCCM na jednym podłożu grafenowo-nitinolowym SCCM i na czterech podłożach grafenowo-nitinolowych SCCM. Komórki są gęste i kuliste na obu powierzchniach grafenu nitinolu, co świadczy o lepszej morfologii komórek.

Testy MTT i MTS pokazują, że jeden i cztery substraty grafenu nitinolu SCCM nie wykazują znaczącej różnicy w żywotności komórek mięśni gładkich w porównaniu z nieskazitelnym nitinolem. Testy MTS pokazują, że trzydniowa żywotność komórek śródbłonka nie różniła się znacząco od kontrolnej. Obrazy ze skaningowej mikroskopii elektronowej pokazują, że komórki śródbłonka wyhodowane na nieskazitelnych podłożach nitinolowych są rzadkie i wydłużone, podczas gdy są elipsoidalne i gęste na jednym i czterech podłożach grafenowo-nitinolowych SCCM.

Wyniki te pokazują, że powłoki grafenowe prowadzą do lepszej morfologii komórek sferycznych komórek śródbłonka, jedna próbka SCCM i cztery próbki grafenu nitinolu SCCM wykazują niski stosunek albuminy fibrynogenu w stosunku do próbki dziewiczego nitinolu, co sugeruje lepszą kompatybilność hemologiczną wynikającą z grafenu. Równowaga poziomu Fermiego jest pokazana na wykresie poziomu energetycznego dla fibrynogenu i gęstości stanów elektronowych dla grafenu. Przeniesienie elektronów z fibrynogenu do grafenu nitinolu jest możliwe tylko z zajętych stanów elektronowych cząsteczki fibrynolu do pustych stanów elektronowych grafenu nitinolu na tym samym poziomie energetycznym.

Zarówno grafen mono, jak i kilkuwarstwowy są półmetalami w temperaturze pokojowej o niskiej gęstości elektronów na poziomie furii, co powoduje słaby transfer ładunku z fibrynogenu na grafen. Grafen nie wykazuje żadnych zmian w kształcie linii pasma GB ani częstotliwości, co wskazuje na słaby transfer ładunku z białek plazmy. Zawiłe piki D uzyskane w wyniku dopasowania krzywej są pokazane w kolorze czarnym, aby zademonstrować przydatność i żywotność grafenu jako powłoki implantu.

Miedziany grosz pokryty grafenem był wystawiony na działanie 5% nadtlenku wodoru. Pokryta grafenem część grosza pozostała niezmieniona, podczas gdy odkryta część została odbarwiona przez roztwór nadtlenku wodoru. Ponadto grafen nitinol zanurzony w 70% kwasie azotowym nie wykazał zmiany częstotliwości pasma GB, co potwierdza, że powłoka grafenowa jest niezwykle trwała.

Co więcej, powłoka grafenowa w nitinolu grafenu zmniejszyła się do współczynnika X leżącej pod spodem miedzi, co wskazuje na nieprzepuszczalność membran grafenowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przenosić grafen i implanty biomedyczne, aby poprawić ich biokompatybilność.