Ocena funkcji sensomotorycznych w mysich modelach choroby Parkinsona

Ogólnym celem tych procedur jest ilościowa ocena funkcji motorycznej czujnika. U myszy. Osiągamy to za pomocą baterii czułych testów behawioralnych.

Należą do nich trudna spontaniczna aktywność przesuwu wiązki w cylindrze oraz test usuwania kleju, który jest również znany jako test DOT. Po przeprowadzeniu testów można uzyskać nagrania wideo przedstawiające przechodzenie wiązki i spontaniczną aktywność. Ostatecznie testy te mogą być wykorzystane do scharakteryzowania funkcji sensora lub motoryki w nowatorskich genetycznych modelach myszy, a także w przedklinicznych badaniach nad lekami badającymi potencjalne terapie choroby.

Tak więc główną przewagą tych testów nad innymi testami, zwłaszcza automatycznymi, jest to, że uważamy, że są one bardzo czułe na dysfunkcję motoryczną, bardziej czułe niż testy takie jak pręt wirnika. Ponadto testy te są w rzeczywistości bardzo opłacalne, zwłaszcza w porównaniu z automatycznymi, które mogą kosztować nawet tysiące dolarów. Testy te mogą odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń ruchowych w ogóle i są bardzo przydatnymi miernikami wyników.

Podczas testowania potencjalnych środków terapeutycznych wiązka jest ustawiana poprzez odwrócenie trzech czystych klatek dla myszy na blacie stołu lub w klatce dla myszy. Zmieniając wyciąg, wyrównaj klatki równomiernie, tak aby mogły wytrzymać długość belki o długości jednego metra. Następnie zmontuj cztery sekcje belki od najszerszej do najwęższej sekcji i umieść na odwróconych klatkach myszy.

Umieść klatkę domową myszy, które planujesz przetestować, na boku na końcu belki, tak aby najwęższy koniec wiązki prowadził prosto do klatki domowej. Aby rozpocząć próbę wspomaganą, podnieś pierwszą mysz za podstawę ogona i podeprzyj jej tylne kończyny dłonią. Umieść mysz na szerokim końcu belki i puść jej ogon i zdejmij rękę.

Pozwól myszy wąchać i poruszać się, aby lepiej zorientować się w urządzeniu. Jeśli mysz delikatnie się obróci, przekieruj ją w żądanym kierunku. Aby zachęcić mysz do zejścia ze ścieżki, podnieś klatkę domową, trzymając ją w tej samej pozycji na boku, i zbliż ją do myszy testowej.

Gdy mysz zacznie próbować wejść do klatki domowej, przesuń ją do tyłu, aby mysz nie wchodziła, ale robiła krok do przodu. Na koniec pozwól myszy wejść do klatki domowej. Wykonaj tę samą procedurę dla każdej myszy w klatce.

Dokładnie wyczyść belkę między klatkami roztworem do czyszczenia pomieszczeń dla zwierząt w klatce. Ważne jest, aby usunąć mocz lub kał z belki przed uruchomieniem następnej myszy, ponieważ odwróci to uwagę następnej myszy. Gdy wszystkie myszy w klatce przejdą jedną próbę wspomaganą, ponownie podnieś pierwszą mysz i umieść ją na szerokim końcu belki, jeśli to konieczne.

Delikatnie ustaw mysz w żądanym kierunku i delikatnie dotknij jej grzbietu, aby zachęcić ją do poruszania się wzdłuż belki w kierunku klatki domowej, popraw mysz, jeśli przestanie wąchać lub odejdzie od belki. Trzymaj rękę w pobliżu, aby poprowadzić mysz do końca belki. Zminimalizuj zatrzymywanie się i eksplorację podczas jazdy na belce.

Im częściej odbywa się to podczas treningu, tym mniej mysz ma do tego tendencję. Podczas testowania próba kończy się, gdy mysz umieści jedną ze swoich czterech kończyn w klatce domowej, następna mysz może następnie otrzymać drugą próbę. Myszy otrzymują w sumie pięć prób w pierwszym dniu treningu, naprzemiennie na myszach, tak aby każda mysz miała przerwę między próbami wynoszącą 30 sekund lub więcej.

Drugiego dnia wykonaj pięć kolejnych prób dla każdej myszy, używając tej samej konfiguracji wiązki, co w pierwszym dniu, myszy nie powinny potrzebować żadnej pomocy, ale mogą wymagać korekty lub dotknięcia tyłu, aby zapobiec zatrzymaniu się lub eksploracji. 24 godziny później rozpocznij dzień testowy. Ustaw belkę w podobny sposób, jak w poprzednich dwóch dniach treningowych.

Należy jednak umieścić siatkę odpowiadającą każdej szerokości belki na górze każdego przekroju belki. Użyj kamery wideo, aby nagrać wszystkie próby przejścia wiązki przed rozpoczęciem każdej próby. Oznacz kartę podstawowymi informacjami o eksperymencie, takimi jak data, numer myszy i numer próby, a następnie umieść ją przed kamerą.

Nagrywaj przez dwie do trzech sekund przed każdą próbą, aby było jasne, która mysz jest testowana i w jakiej próbie się znajduje. W każdym teście umieść mysz na powierzchni siatki w najszerszym obszarze i nagrywaj, gdy porusza się wzdłuż rekordu wiązki, tak aby widoczna była cała długość ciała myszy. Kamera powinna być ustawiona tak, aby siatka znajdowała się pośrodku przeglądarki.

Uruchom każdą mysz przez test pięć razy na belce powierzchni siatki, czyszcząc ją między każdą myszką. Aby przygotować eksperyment z aktywnością spontaniczną, ustaw dwie klatki obok siebie w odległości około 18 centymetrów od siebie, tak aby fronty klatek były skierowane w stronę eksperymentatora. W razie potrzeby umieść dodatkową klatkę za pozostałymi dwiema klatkami, aby służyła jako podparcie dla lustra.

Następnie umieść kawałek szkła na dwóch klatkach i ustaw go tak, aby szkło było podparte przez zewnętrzną krawędź pierwszych dwóch klatek. Następnie umieść cylinder na szkle i lustro pod kątem pod szkłem. Opierając się o trzecią klatkę z tyłu.

Kąt może wynosić od 30 do 45 stopni, ale co ważniejsze, widok z kamery musi obejmować pełną średnicę cylindra. Po skonfigurowaniu eksperymentu umieść kamerę wideo przed lustrem i wyreguluj zarówno lustro, jak i kamerę wideo, aż będziesz mógł zobaczyć całą średnicę dna cylindra. Następnie ustaw minutnik na trzy minuty i oznacz kartę ważnymi szczegółami eksperymentu, tak jak w poprzednim filmie z eksperymentu.

Nagrywaj etykietę przez dwie do trzech sekund. Potem przestań. Aby przeprowadzić eksperyment, umieść mysz w cylindrze.

Naciśnij przycisk nagrywania i uruchom minutnik. Nagrywaj mysz przez trzy minuty. Ważne jest, aby obszar testowy był cichy, ponieważ głośne dźwięki i rozmowy mogą rozpraszać mysz i potencjalnie powodować zawieszanie się.

Podczas eksperymentu użyj licznika wskazówek, aby policzyć, ile tylnych ruchów wykonuje mysz w cylindrze. Tył definiuje się jako ruch pionowy, w którym obie kończyny opadają z podłogi, tak że mysz stoi tylko na tylnych kończynach. Po upływie czasu wyjmij mysz i umieść ją z powrotem w jego klatce domowej.

Wyczyść cylinder i szybę roztworem do czyszczenia pomieszczeń dla zwierząt między każdą myszą. Poczekaj, aż roztwór czyszczący wyschnie, zanim przejdziesz do następnej myszy. Rozpocznij test usuwania kleju, umieszczając mysz w klatce domowej.

Po wyjęciu pojemnika na karmnik pozwól myszom przyzwyczaić się do pomieszczenia testowego i klatki bez karmnika. Przez godzinę na testowanie użyj czystej klatki, aby umieścić kolegów z klatki, tak aby mysz testowa była jedyną w klatce domowej. Usuń trzy czwarte ściółki i umieść ją w czystej klatce z kolegami z klatki w klatce domowej.

Zmasakruj mysz testową, aby ją unieruchomić za pomocą pary małych kleszczyków, umieść jedną etykietę samoprzylepną na sslt myszy. Delikatnie dociśnij kleszczykami etykietę na pysku i zwolnij mysz. Umieść pokrywę na klatce i uruchom stoper, gdy mysz spróbuje usunąć etykiety za pomocą czterech porów.

Rejestruj czas, w którym mysz nawiązuje kontakt, ale nie usuwa etykiety. Nagraj czas, ale nie wyłączaj stopera, dopóki to się nie stanie. Usuń go całkowicie.

Jeśli mysz nie dotknie naklejki lub nie usunie jej w ciągu 60 sekund, zakończ próbę i ręcznie usuń naklejkę. Po każdej próbie umieść mysz testową w klatce i rozpocznij testowanie następnej myszy. Wszystkie myszy otrzymują trzy badania naprzemiennie na myszach.

Zamiast przeprowadzać wszystkie trzy próby na myszy w tym samym czasie, próby, w których etykieta odpada lub nie jest zabezpieczona na pyskach, nie są liczone. Trudna spontaniczna aktywność wiązki w cylindrze i testy usuwania kleju są bardzo przydatnymi testami funkcji silnika czujnika u myszy w trudnym teście wiązki, myszy TH jeden alfa-synukleina popełniają znacznie więcej błędów na krok niż myszy typu dzikiego. Liczba błędów wzrosła u myszy alfa-synukleiny, gdy wiązka stawała się węższa.

Nie miało to miejsca w przypadku myszy typu dzikiego. Ta sama linia myszy wykazuje również znaczny spadek kroków kończyn tylnych w teście cylindrycznym. Wyniki te pokazują, że nadekspresja ludzkiego alfa w jądrze u zmutowanych myszy prowadzi do rozwoju wykrywalnych deficytów motorycznych czujników.

Wreszcie, w teście usuwania kleju, trzy myszy akia PITX z głębokim spadkiem neuronów dopaminowych nigrostriatal wykazują znacznie wydłużony czas kontaktu w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego. My i inni rutynowo używamy tych testów do oceny potencjału terapeutycznego leczenia choroby Parkinsona. Testy te mogą być również wykorzystane do scharakteryzowania genetycznych modeli myszy i określenia konsekwencji określonych mutacji dla funkcji czuciowo-motorycznych.