Name: Selektywne śledzenie włókien słuchowych w ptasim embrionalnym nerwie przedsionkowo-ślimakowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Poznaj technikę mikroiniekcji barwnika do ganglionu słuchowego embrionów kurzych w celu selektywnego śledzenia włókien nerwowych. Ta metoda umożliwia precyzyjną wizualizację projekcji nerwu przedsionkowo-ślimakowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr Candace Hsieh za sugestie i pomoc w technikach obrazowania oraz dr Doris Wu za ekspertyzę na temat anatomii ucha wewnętrznego piskląt podczas wczesnej embriogenezy. Prace te były wspierane przez NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 i DOE GAANN P200A120165.

1. Przygotuj następujące narzędzia i odczynniki do preparowania
<ul>
	<li>Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF; 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 20 mM NaHCO3, 3 mM HEPES, 10 mM Glukoza, 2 mM CaCl2, 1,3 mMMgSO4) w sposób ciągły podawany z 95% O2 / 5% CO2 w temperaturze pokojowej. Do infuzji napełnij do 2/3 500 ml słoik Nalgene z szerokim otworem wywierconym w pokrywce. Zbiornik zostanie przymocowany za pomocą rurki do bełkotki ze szklaną łodygą, która przenika do CSF przez otwór w pokrywie słoika. Dostosuj ciśnienie, aby uzyskać stały strumień bąbelków, które docierają do około 1/3 cieczy, ale nie są wystarczająco silne, aby spowodować rozpryskiwanie się na obręczy. Zanurzyć szklane fiolki o pojemności 5 ml (do 6) w słoiku Nalgene w celu oddzielenia poszczególnych próbek od siebie i od turbulencji przepływu gazu. ACSF powinien być natleniany przez co najmniej 20 minut przed jakąkolwiek inkubacją tkanek.</li>
	<li>Mała silikonowa naczynie preparacyjne (35 mm x 10 mm Petriego pokryte za pomocą zestawu elastomerów Sylgard) z dwoma kołkami preparacyjnymi umieszczonymi w małej sześciokątnej łódce do ważenia polistyrenu (47 mm na dole).</li>
	<li>Dwa kleszczyki z cienką końcówką, jeden kleszcz z zakrzywioną końcówką, zlewka o pojemności 50 ml i pojemnik na odpady tkankowe.</li>
	<li>Wyciągnięta szklana mikropipeta (1,2 OD / 0,9 ID) rozbita do około 20-50 μm otwór na końcówce i wypełniona rodamino-dekstranoaminą (RDA, MW = 3,000, Invitrogen) w 6,25% roztworze z 0,4% Triton X-100 w PBS. Przymocuj za pomocą cienkiej rurki do pikospritzera i ustabilizuj do mikromanipulatora.</li>
</ul>
2. Mikropreparacja w celu odsłonięcia brodawki podstawnej w E8 4,5
<ol>
	<li>Za pomocą zakrzywionych kleszczy odetnij zarodek E8 tuż pod pniem mózgu, umieszczając głowę bezpośrednio na pokrytym silikonem naczyniu preparacyjnym w łodzi do ważenia.</li>
	<li>Za pomocą szpilek do preparowania ustaw głowę tak, aby ucho po stronie zainteresowania było lekko widoczne, głowa lekko pochylona grzbietowo i skierowana 10-30 stopni od środka (ryc. 2A). Natychmiast zabezpiecz głowę szpilkami. Jeśli pożądane jest śledzenie obustronne, wyśrodkuj głowę pod kątem 0 stopni lub pełny widok brzuszny, aby można było uzyskać dostęp po obu stronach. Podobnie, w przypadku wstrzyknięcia lewostronnego, należy zabezpieczyć głowę pod kątem od -10 do -30 stopni od środka, tak aby lewa strona była dostępna.</li>
	<li>Za pomocą zlewki o pojemności 50 ml przenieść 30 ml natlenionego płynu CSF do naczynia, całkowicie zanurzając tkankę.</li>
	<li>Delikatnie chwyć i oderwij dolną szczękę za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, a następnie zdejmij dolną powiekę po stronie zainteresowania.</li>
	<li>Usuń leżącą nad nim tkankę naczyniową, w tym pozostałe podniebienie i przełyk. Te tkanki miękkie powinny się złuszczać, odsłaniając gładką powierzchnię rozwijającego się chondroczaszki z charakterystycznymi tętnicami kręgowymi na jej powierzchni. W tym momencie powinna być widoczna charakterystyczna biała masa otoconialna.</li>
	<li>Ostrożnie przeanalizuj skórę wokół przewodu zewnętrznego, chrząstki stawu szczękowego i ucha środkowego, pozostawiając ucho wewnętrzne nienaruszone. Użyj kleszczy, aby delikatnie odciąć te chrzęstne struktury.</li>
	<li>Usuń tętnice kręgowe i gromadzącą się krew delikatnym ruchem zamiatającym cienkimi końcówkami kleszczy. Krew może zasłaniać widok, a krzepnięcie może zatkać otwór pipety iniekcyjnej.</li>
	<li>Przewód ślimakowy z przylegającym nabłonkiem czuciowym (brodawką podstawną) i zwojem akustycznym leży bezpośrednio pod chondroczaszką 6 i może być wizualizowany jako wydłużona projekcja przypominająca palec rozciągająca się od ucha wewnętrznego brzusznie, z dystalnym końcem (wierzchołkiem) w pobliżu przedniej linii środkowej 5. Może wystąpić niewielka kałuża krwi (czerwona) z sekcji i/lub zwapnienia otolityczne (białe) na wierzchołku przewodu ślimakowego (ryc. 2B), które mogą pomóc w wizualizacji. Na wierzchołku znajduje się plamka krzgowata, plama czuciowa, o której uważa się, że pełni funkcję przedsionkową 7,8.</li>
</ol>
3. Selektywne znakowanie włókien słuchowych CN VIII
<ol>
	<li>Umieścić pipetę do wstrzykiwań w pobliżu powierzchni zarodka w przewodzie ślimakowym i okolicy brodawki podstawnej.</li>
	<li>Powoli opuść mikropipetę, aby najpierw nakłuć czaszkę. Ten obszar czaszki jest cieńszy niż otaczające go obszary i wymaga mniejszej siły do penetracji. Mikropipeta powinna teraz znajdować się w przewodzie ślimakowym. Opcjonalnie: w tym miejscu można wykonać mały zastrzyk barwnika śledzącego, aby pomóc w wizualizacji brodawki podstawnej.</li>
	<li>Bez zmiany położenia mikropipety kontynuuj opuszczanie, aż dotrze ona do głębokiej granicy przewodu ślimakowego (Rysunek 1). Wykonaj wstrzyknięcie w tym miejscu i powtórz w wielu regionach wzdłuż brodawki podstawnej (ryc. 2C, 2D), z wyjątkiem najbardziej proksymalnego końca, w którym znajduje się lagena przedsionkowa. Przy ciśnieniu pikospritzera ustawionym na 10-30 psi wykonuje się kilka wstrzyknięć. Objętość wstrzykiwanego płynu barwiącego jest różna i zależy od pożądanego zakresu etykietowania. Każde wstrzyknięcie powinno skutkować powstaniem plamki znakowanej barwnikiem fluorescencyjnym o średnicy około 200 - 400 μm (ryc. 2D).</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzyknięcia użyj kleszczy, aby przeciąć próbkę powyżej pnia mózgu i użyj pipety do przenoszenia, aby umieścić część ogonową w małym słoiku w pojemniku z CSF, który jest stale perfuzjowany 95% O2 / 5% CO2 .</li>
	<li>Dla każdego zarodka należy odczekać 20-30 minut na transfer barwnika, w zależności od pożądanej odległości środkowego śledzenia.</li>
	<li>Usuń tkankę i przygotuj się do cięcia histologicznego. W przedstawionym przykładzie tkanka jest zanurzana w 4% paraformaldehydzie (w 1X PBS) na noc, 30% sacharozy (w 1X PBS) na noc. </li>
</ol>
4. Przeciwbarwienie i analiza
<ol>
	<li>Barwienie przeciwstawne jest przydatne, aby pomóc obserwatorowi zorientować się w położeniu anatomicznym, a także zidentyfikować określone obszary zainteresowania. Skutecznym przeciwbarwnikiem w tym preparacie jest immunoznakowanie neurofilamentów (ryc. 1, 3B, 3E), które silnie znakuje aksony i pozwala na rozgraniczenie dróg aksonalnych w OUN.</li>
	<li>Analizę należy przeprowadzić w całym oznaczonym obszarze, ponieważ wypustki mogą rozciągać się na kilkaset mikronów lub więcej wzdłuż osi ostroogonowej. Oto kilka przykładów analiz podstawowych: docelowe poziomy błędów, czas lub zmiany rozbieżności w wzorcach projekcji. Aksony znakowane RDA są wizualizowane w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym z wysoką rozdzielczością (ryc. 3A, 3D).</li>
</ol>

<ol><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+sound+in+space%3A+the+regulation+of+inner+ear+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139, 245-257 (2012).</li>
<li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum%2C+Monodelphis+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li>
<li>Molea, D., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+topography+of+nucleus+magnocellularis+innervation+by+the+cochlear+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion.</a> The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).</li>
<li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
<li>Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+pattern+formation+in+the+inner+ear%3A+do+compartment+boundaries+play+a+role%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).</li>
<li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBellairs%2C+R+%22The+atlas+of+chick+development%22">The atlas of chick development</a>. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).</li>
<li>Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+patterns+and+spontaneous+activity+of+afferent+fibres+to+the+lagenar+macula+and+apical+basilar+papilla+of+the+chick%27s+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea.</a> Hearing Research. 56, 211-226 (1991).</li>
<li>Code, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+neurons+to+the+macular+lagena+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick.</a> Hearing Research. 82, 26-30 (1995).</li>
<li>Maklad, A., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vestibular+afferent+projections+into+the+hindbrain+and+their+central+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets.</a> Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).</li>
<li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+system+development%3A+primary+auditory+neurons+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+inner+ear+cells+using+genomic+tags+for+clonal+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification.</a> Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).</li>
<li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).</li>
<li>Appler, J. M., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+ear+to+the+brain%3A+Molecular+mechanisms+of+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly.</a> Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).</li>
<li>Bulankina, A. V., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit+development+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Neural circuit development in the mammalian cochlea.</a> Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).</li>
<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).</li>
<li>Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+functional+synaptic+connections+in+the+auditory+system+visualized+with+optical+recording%3A+afferent-evoked+activity+is+present+from+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).</li>
<li>Marrs, G. S., Spirou, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+assembly+of+auditory+circuits%3A+spiral+ganglion+and+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem.</a> The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).</li>
<li>Milo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+the+function+of+the+transcription+factor+gata3+during+development+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear.</a> PloS One. 4, e7144(2009).</li>
<li>Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bHLH+genes+in+ear+development+and+evolution%3A+revisiting+a+10-year-old+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+regulates+survival+and+formation+of+connections+in+mouse+ear+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain.</a> Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).</li>
<li>Huang, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+is+a+transcriptional+regulator+of+soma+size%2C+target+field+innervation+and+axon+pathfinding+of+inner+ear+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons.</a> Development. 128, 2421-2432 (2001).</li>
<li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).</li>
<li>Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+profiling+of+spiral+ganglion+neurons+reveals+insights+into+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Badania nad wczesnym rozwojem VIII nerwu były ograniczone częściowo z powodu trudności w identyfikacji aksonów embrionalnych powstających z wielu odrębnych zwojów. W kilku badaniach analizowano sygnały molekularne kierujące losami słuchowych i przedsionkowych komórek czuciowych i komórek zwojowych we wczesnym okresie rozwoju, 5,11,12 , ale procesy regulujące unerwienie centralne nie zostały jeszcze określone. Doniesienia o akustycznych projekcjach komórek zwojowych zazwyczaj opisują procesy obwodowe do nabłonk...

<table><tbody><tr><td>Polistyrenowe naczynie wagowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-101</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego, 35 X 10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>50820644</td><td>Służy do produkcji silikonowej naczynia preparacyjnego</td></tr><tr><td>Sylgard Silicone Elastomer Kit</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Płaszcz Petriego do wykonania naczynia preparacyjnego</td></tr><tr><td>Szpilki do preparacji Różne</td><td></td><td></td><td>Utrzymuje zarodek na miejscu podczas sekcji</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Różne</td><td></td><td>części receptury aCSF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Różne</td><td></td><td>części receptury aCSF</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Różne</td><td></td><td>części receptury aCSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Różne</td><td></td><td>części receptury aCSF</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Różne</td><td></td><td>części receptury</td></tr> <tr><td>aCSFCaCl2Różne</td><td></td><td></td> <td>części receptury aCSF</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Różne</td><td></td><td>części receptury aCSF</td></tr><tr><td>Pojemnik na aCSF. Zaproponuj półprzezroczysty słoik Nalgene z szerokim otworem, 500 ml (16 uncji) z pokrywką.</td><td>CPLabSafety</td><td>QP-PLC-03717</td><td>Wywierć otwór w górnej części pokrywy na szklaną trzpień bulgoczącą do penetracji cieczy</td></tr><tr><td>Pusta szklana fiolka o pojemności 5 ml lub porównywalna przezroczysta fiolka</td><td>American Pharmaceutical Partners, Inc</td><td>6332300105</td><td>Stosować podczas inkubacji CSF, aby oddzielić próbki od siebie i od bulgoczącego strumienia</td></tr><tr><td>Zbiornik karbogenu (95% O2 / 5% CO2) połączony rurką z bełkotką</td><td>Różne</td><td></td><td>Przymocuj za pomocą rurki do szklanej łodygi bełkotki do infuzji do aCSF</td></tr><tr><td>Szklany trzpień bełkotka</td><td>Różne</td><td></td><td>Do wlewania karbogenu do aCSF</td></tr><tr><td>Kleszcze z zakrzywioną końcówką</td><td>World Precision Instruments</td><td>501008</td><td>Aby usunąć głowę zarodka z jaja</td></tr><tr><td>Dwa kleszcze z cienką końcówką</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td>Do mikropreparacji</td></tr><tr><td>50 ml Zlewka</td><td>różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rodamina Dekstran Amina (RDA)</td><td>Invitrogen</td><td>różne</td><td>Fluorescencyjny znacznik aksonów</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ICN Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, (1X PBS)</td><td>Różne</td><td></td><td>Standardowy odczynnik laboratoryjny</td></tr><tr><td>Cienkościenne szklane kapilary, 1,2 OD, .9 ID 4" (100 mm) długości</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW120F-4</td><td>Załaduj za pomocą RDA. Każda kapilara tworzy dwie szklane mikropipety</td></tr><tr><td>Igła / Ściągacz do pipet</td><td>David Kopf Instrumenty</td><td>Model 720</td><td>Używane ustawienia: Ciepło 16.4, Elektromagnes 2.2</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Oprzyrządowanie</td><td>różne</td><td>Podłącz za pomocą cienkiej rurki do szklanej mikropipety</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny z fluorescencją</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Różne</td><td></td><td>Standardowy odczynnik laboratoryjny</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Neurofilament, opcjonalnie</td><td>Millipore</td><td>AB1991</td><td>Postępuj zgodnie z protokołem histologicznym zalecanym przez producenta</td></tr><tr><td>Kriostat i powiązane materiały do cięcia</td><td>Leica</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny do obrazowania</td><td>Zeiss, różne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selektywne śledzenie włókien słuchowych w ptasim embrionalnym nerwie przedsionkowo-ślimakowym

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Pisklę embrionalne jest powszechnie używanym modelem do badania projekcji obwodowych i centralnych komórek zwojowych. W układzie słuchowym selektywne znakowanie aksonów słuchowych w obrębie VIII nerwu czaszkowego wzmocniłoby badania nad rozwojem centralnego obwodu słuchowego. Takie podejście jest trudne, ponieważ wiele narządów zmysłów ucha wewnętrznego przyczynia się do rozwoju VIII nerwu 1. Co więcej, markery, które wiarygodnie odróżniają słuchowe i przedsionkowe grupy aksonów w obrębie ptasiego VIII nerwu, nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Ścieżki słuchowe i przedsionkowe nie mogą być funkcjonalnie rozróżnione we wczesnych zarodkach, ponieważ reakcje wywołane czuciowo nie są obecne przed utworzeniem obwodów. W niektórych badaniach śledzono centralnie wystające osiii aksony nerwowe, ale znakowaniu aksonów słuchowych towarzyszyło znakowanie z innych VIII komponentów nerwowych 2,3. W tym miejscu opisujemy metodę śledzenia następczego od zwoju akustycznego w celu selektywnego oznaczania aksonów słuchowych w rozwijającym się VIII nerwie. Po pierwsze, po częściowym rozbiorze przedniego obszaru głowowego 8-dniowego zarodka pisklęcia zanurzonego w natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym, przewód ślimakowy jest identyfikowany za pomocą anatomicznych punktów orientacyjnych. Następnie umieszcza się cienką szklaną mikropipetę, aby wstrzyknąć niewielką ilość rodaminy i dekstranu aminy do przewodu i przyległego głębokiego obszaru, w którym znajdują się akustyczne komórki zwojowe. W ciągu trzydziestu minut po wstrzyknięciu aksony słuchowe są śledzone centralnie w tyłomózgowiu i mogą być później uwidocznione po przygotowaniu histologicznym. Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do badań rozwojowych nad powstawaniem obwodów słuchowych od obwodowych do ośrodkowych.

Komponenty nerwu VIII oraz anatomia samego nerwu są złożone i poskręcane (Ryciny 1, 3). Poprzez selektywne śledzenie włókien wychodzących z komórek zwoju słuchowego można precyzyjnie wyznaczyć segmenty nerwu VIII, jak i pierwotne aferentne drogi słuchowe w pniu mózgu, odróżniając je od ich odpowiedników przedsionkowych (Ryciny 2, 3). Podobnie, technikę tę można wykorzystać do badania projekcji obwodowych komórek zwoju słuchowego (Rycina 3G) lub zmodyfikować ją w celu bad...

Tutaj opisujemy technikę mikrodysekcji, po której następuje wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego do zwoju akustycznego wczesnych zarodków piskląt w celu selektywnego śledzenia włókien aksonu słuchowego w nerwie i tyłomózgowiu.

Selektywne śledzenie włókien słuchowych w ptasim embrionalnym nerwie przedsionkowo-ślimakowym

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Celem niniejszej procedury jest selektywne śledzenie włókien słuchowych z obwodowego układu nerwowego do ośrodkowego układu nerwowego w embrionie. Osiąga się to poprzez wykonanie w pierwszym kroku cięcia mikrodozowego w celu odsłonięcia brzusznej części chondrokranium i zidentyfikowania ptasiego przewodu ślimakowego. Drugim krokiem jest wykonanie mikroiniekcji do leżących poniżej komórek zwoju akustycznego oraz ich aksonów.Następnie próbkę inkubuje się w natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym przez 20 minut, aby umożliwić transfer DIA. Na koniec przygotowanie histologiczne i sekcjonowanie tkanki pozwalają na mikroskopową wizualizację projekcji centralnych zwoju akustycznego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia ona selektywne śledzenie nerwu ósmego.Włókna słuchowe o wysokiej rozdzielczości umożliwiają szybki transfer barwnika w żywej tkance i pozwalają na prowadzenie eksperymentów na wczesnym etapie rozwoju. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad słuchem. Na przykład: jakie cząsteczki kierują aksonami do ich centralnych celów?A jak obwody reagują na uraz lub ekspozycję ototoksyczną? Najpierw należy dodać sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy do 500 ml szerokoustnego słoika Nalgene, aż słoik zostanie wypełniony w dwóch trzecich. Następnie należy zakręcić słoik pokrywką, w której wywiercono otwór.Wprowadź dyfuzor prądlika podłączony do butli z 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla przez otwór w pokrywie do A CSF. Włącz dopływ gazu i dostosuj ciśnienie tak, aby uzyskać stały strumień pęcherzyków sięgających około jednej trzeciej wysokości cieczy, lecz nie na tyle silny, by powodować rozpryskiwanie poza krawędź naczynia. Zanurz w słoiku do sześciu szklanych fiolek o pojemności 5 ml, aby odseparować poszczególne próbki od siebie.Oraz z turbulencji przepływu gazu. Pozostawić A CSF w celu utlenienia przez co najmniej 20 minut; w czasie utleniania A CSF, odessać szklane mikropipety i napełnić je roztworem 6,25% rodine Dexter i am immune w PBS zawierającym 0,4% Triton XX. Przymocować mikropipetę do mikromanipulatora i złamać końcówkę za pomocą precyzyjnej pęsety, aby utworzyć otwór o średnicy od 20 do 50 mikronów. Użyć cienkiego przewodu, aby połączyć ustabilizowany mikromanipulator z piko-rozpylaczem.Ustaw pico spritzer w zakresie od 10 do 30 PSI, aby rozpocząć i ukończyć pozostałą część konfiguracji. Upewnij się, że przygotowano małą silikonową płytkę sekcyjną z dwiema szpilkami sekcyjnymi umieszczonymi w niewielki, sześciokątny sposób. Przygotuj dwie pęsety z cienkimi końcówkami.Pinceta z jednym zakrzywionym zakończeniem, zlew o pojemności 50 mililitrów oraz pojemnik na odpady tkankowe w obszarze sekcji. Po wyjęciu zarodka kurczaka z jaja, umieść głowę na pokrytej silikonem szalce sekcyjnej. W naczyniu do sekcji ułóż głowę widokiem brzusznym tak, aby ucho po stronie interesującej nas – w tym przypadku po stronie prawej – było widoczne.Po ustawieniu w odpowiedniej pozycji ustabilizuj tkankę za pomocą szpilek sekcyjnych, unikając obszaru tylnego mózgu. Użyj zlewki o pojemności 50 milliliter, aby przenieść 30 milliliters natlenionego A CSF do szalki, całkowicie zanurzając tkankę. Następnie za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami delikatnie chwyć i odchyl w dół żuchwę.Następnie usuń dolną powiekę po interesującej nas stronie. Dalej usuń nadkładające naczynia krwionośne i tkanki miękkie, w tym wszelkie pozostałości podniebienia i gardła. Po usunięciu tych tkanek powinna odsłonić się gładka powierzchnia brzusznej części czaszki oraz wyraźnie widoczne tętnice kręgowe.Ostrożnie wypreparuj skórę wokół zewnętrznych małżowin, chrząstkę stawu żuchwowego oraz ucho środkowe, pozostawiając ucho wewnętrzne nienaruszone. Za pomocą pęsety delikatnie odetnij struktury chrzęstne żuchwy i ucha środkowego. Następnie, wykonując delikatne ruchy zamiatające końcówkami cienkiej pęsety, usuń tętnice kręgowe i skrzepy krwi.Jest to istotne, ponieważ krew może ograniczać widoczność, a krzepnięcie może zablokować otwór pipety do iniekcji. Na tym etapie powinna być widoczna charakterystyczna biała masa ślimaka. Strzałka na tej rycinie wskazuje kanalik ślimaka wraz z przyległym nabłonkiem sensorycznym i zwojem akustycznym.Znajduje się ono bezpośrednio pod chrząstką czaszki i, jak widać tutaj, można je zidentyfikować jako wydłużony, palcowaty wyrostek rozciągający się brzusznie z ucha wewnętrznego, którego wierzchołek znajduje się w pobliżu przedniej linii środkowej, służący do znakowania włókien słuchowych. Najpierw umieść pipetę do iniekcji w pobliżu powierzchni zarodka w obrębie przewodu ślimakowego i regionu baula papular, a następnie powoli opuść mikropipetę, aby najpierw przebić czaszkę. Ten obszar czaszki jest cieńszy niż okolice sąsiednie i wymaga mniejszej siły do penetracji.Mikropipeta powinna znajdować się teraz wewnątrz przewodu ślimakowego. W razie potrzeby można tutaj wykonać niewielki wtrysk barwnika śledzącego, aby ułatwić wizualizację błony podstawnej i komórek filarowych. Bez zmiany położenia mikropipety należy kontynuować jej obniżanie, aż do momentu przebicia głębokiej krawędzi przewodu ślimakowego.Na tym obrazie przedstawiono idealne położenie pipety w odpowiednim obszarze zwoju akustycznego. Wykonaj wtryskiwanie w tym punkcie, a następnie powtórz czynność w wielu obszarach wzdłuż długości papilla basalis. Stopień powtórzeń zależy od pożądanego zakresu znakowania; pomiń najbardziej proksymalny koniec, w którym znajduje się legina vestibularis.Przy ustawieniu mikrorozpylacza (pico spritzer) w zakresie od 10 do 30 PSI, każda iniekcja powinna skutkować powstaniem fluorescencyjnej plamki znakowanej DIA o średnicy około 200 do 400 mikronów, jak pokazano tutaj. Po zakończeniu iniekcji należy użyć pęsety, aby przeciąć próbkę powyżej pnia mózgu, zgodnie z ilustracją, a następnie za pomocą pipety transferowej umieścić część rdzeniową w jednym z małych słoików w pojemniku z perfuzatem CSF.W przypadku każdego zarodka należy przeznaczyć od 20 do 30 minut na transfer barwnika, w zależności od pożądanej odległości śledzenia centralnego. Po upływie czasu inkubacji należy wyjąć tkankę i przygotować ją do sekcjonowania histologicznego. W tym celu tkankę zanurza się na noc w 4%paraldehydzie w one XPBS, a następnie przeprowadza nocną dehydratację w 30%sacharozy w one XPBS.Po równoważeniu tkanki przez noc w 30%sucrose, wykonuje się koronalne kriostatyczne cięcia. Po przecięciu, immunoznakowanie odpowiednimi przeciwciałami pozwala obserwatorowi na orientację w lokalizacji anatomicznej oraz identyfikację konkretnych obszarów zainteresowania. Ten obraz przedstawia widok koronalny pnia mózgu E sześć z nienaruszonymi obustronnie zwojami akustycznymi.Schematyczna czerwona pipeta ilustruje precyzyjne celowanie w komórki zwoju akustycznego z grzbietowo-bocznego punktu wejścia. Przekroje zostały oznakowane immunochemicznie przeciwciałem anty-neurofilament w celu uwidocznienia projekcji aksonalnych. Organy przedsionkowe znajdują się rostralnie względem przedstawionego przekroju.Nerw przedsionkowo-ślimakowy został oznakowany, podobnie jak zwoj ślimakowy i zwoj przedsionkowy. Strona grzbietowa znajduje się u góry, a pasek skali odpowiada 300 mikronów. Poniżej przedstawiono reprezentatywne obrazy przy niskim i wysokim powiększeniu selektywnego śledzenia włókien słuchowych w embrionie E8 z przekroju 25 mikronów.Przekroje wieńcowe pobrane z tego samego zarodka przedstawiają różne płaszczyzny, jak pokazano tutaj. Aksony znakowane RDA można śledzić od miejsca wstrzyknięcia wskazanego przez grot strzałki, przez nerw czaszkowy wskazany strzałką, a następnie w kierunku docelowych jąder słuchowych pierwotnych wskazanych przez podwójny grot strzałki; pasek skali odpowiada 300 mikronów. Immunoznakowanie przeciwciałem przeciwko neurofilamentom uwidacznia wszystkie projekcje aksonalne, a włókna śledzone RDA z poprzedniego obrazu znajdują się w obrębie drogi projekcji słuchowej.AP i VP oznaczają odpowiednio komponenty słuchowy i przedsionkowy obwodowo względem punktu wejścia nerwu. Połączony kolorowy obraz pokazuje, jak znakowane RDA aksony wpisują się w lokalną anatomię. Obraz o dużym powiększeniu tego samego zarodka w pozycji bardziej rdzeniowej wykazuje wysoką rozdzielczość włókien w punkcie wejścia nerwu wskazanym strzałką oraz wzdłuż centralnej ścieżki wskazanej podwójnym grotem strzałki.Barwienie neurofilamentów wszystkich aksonów pozwala na wyznaczenie P-N-S-C-N-S, a także domniemanych projekcji słuchowych i błędnikowych. Ponownie, AP i VP oznaczają odpowiednio komponenty słuchowy i błędnikowy obwodowo względem punktu wejścia nerwu, natomiast AC i VC oznaczają odpowiednio projekcje słuchowe i błędnikowe centralnie względem punktu wejścia nerwu. Ponownie, nałożenie osobnych kanałów przedstawiono jako połączenie kolorystyczne.Badanie histologiczne zwoju akustycznego ujawnia lokalizację znakowanych komórek zwoju akustycznego z poprzedniego śledzenia oraz ich projekcje obwodowe oznaczone gwiazdką, A śledzone wstecznie rozciąga się znacznie do brodawki podstawnej. Tutaj AG oznacza zwój akustyczny, bp – brodawkę podstawną, a lm – Laina macular. Pasek skali odpowiada 100 mikronów.Na koniec, niniejsza ilustracja przedstawia 700 mikronową ścieżkę śledzenia, której oczekuje się przy znakowaniu specyficznych dla słuchu włókien ósmego nerwu w dniu E8. Miejsce iniekcji zaznaczone czerwonym okręgiem znajduje się przyśrodkowo względem punktu wejścia nerwu, a projekcje centralne biegną rostralnie i ku tyłowi. Po dotarciu do tylnego mózgu w tym miejscu, pasek skali odpowiada 300 mikronom.Podczas wykonywania tej procedury dostosuj iniekcje tak, aby najlepiej odpowiadały kryteriom analizy. Należy pamiętać, że między próbkami wystąpi pewna zmienność w dokładnej liczbie i rozmieszczeniu aksonów śledzących.

selective-tracing-auditory-fibers-avian-embryonic-vestibulocochlear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Selektywne śledzenie włókien słuchowych w zarodkowym nerwie przedmiechowo-słuchowym ptaków

Ten film pokazuje proces przygotowywania wycinków mózgu w kształcie klina w warunkach laboratoryjnych. Za pomocą wibratomu wytwarzany jest plasterek w kształcie klina z mózgu myszy o różnej grubości. Ten wycinek zawiera korzeń nerwu słuchowego umieszczony na grubszym końcu, podczas gdy neurony związane ze słuchem znajdują się na cieńszym końcu.

Przygotowanie klinowych wycinków mózgu do wizualizacji neuronów słuchowych

Analiza funkcji przedsionkowych komórek rzęsatych jest skomplikowana przez ich lokalizację głęboko w najtwardszej części czaszki, kości skroniowej skalistej. W większości badań nad funkcjonalnymi komórkami rzęsatymi wykorzystano dokładnie izolowane komórki rzęsate. W tym artykule opisano częściowo nienaruszony preparat nabłonka przedsionkowego myszy do badań elektrofizjologicznych i mikroskopii dwufotonowej.

Izolowany, częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i mikroskopii dwufotonowej o wysokiej rozdzielczości

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Narząd słuchowy pośredniczy w słyszeniu. W niniejszej pracy przedstawiono zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo zoptymalizowaną do badania proliferacji i różnicowania słuchowych komórek progenitorowych w rozwijającym się narządzie słuchowym kurcząt.

Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania niekoronalnych warstw słuchowych pnia mózgu zarodka kurczaka w celu zbadania właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych w obrębie jednego wycinka pnia mózgu. Przekroje te obejmują przekroje strzałkowe, poziome i poziome/poprzeczne obejmujące większe obszary tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie przekroju niż tradycyjne sekcje koronalne.

Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

Użyliśmy standardowych technik słuchowej reakcji pnia mózgu (ABR) i zastosowaliśmy je do piskląt piskląt, przedwcześnie rozwiniętego ptasiego modelu funkcji słuchowych. Protokół szczegółowo opisuje techniki przygotowania zwierząt i pozyskiwania ABR, wraz z krokami, które mogą przełożyć się na inne modele ptaków lub gryzoni.

Ocena słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u piskląt kurcząt

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Korzystając z elektroporacji in ovo, opracowaliśmy metodę selektywnego transfekowania wewnętrznego ucha słuchowego i jądra ślimakowego w zarodkach kurczaków, aby osiągnąć specyficzne dla danej grupy komórek eliminację delikatnego białka X w upośledzeniu umysłowym podczas dyskretnych okresów składania obwodów.

Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

Prążek naczyniowy jest niezbędny do generowania potencjału wewnątrzślimakowego. Tutaj przedstawiamy sekcję rozstępów naczyniowych dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego.

Rozwarstwienie rozstępu naczyniowego dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego

Poznaj technikę mikroiniekcji barwnika do ganglionu słuchowego embrionów kurzych w celu selektywnego śledzenia włókien nerwowych. Ta metoda umożliwia precyzyjną wizualizację projekcji nerwu przedsionkowo-ślimakowego.

Selektywne śledzenie włókien słuchowych w ptasim embrionalnym nerwie przedsionkowo-ślimakowym

Przeglądaj więcej filmów