Name: Paradygmat urazów do badania naprawy ośrodkowego układu nerwowego u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj paradygmat urazów kłujących w sznurze nerwowym brzusznym larw Drosophila do badania regeneracji ośrodkowego układu nerwowego. Ta metoda umożliwia analizę dynamiki komórkowej po urazie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Mei Ann Lim za krytyczne przeczytanie manuskryptu oraz innym członkom naszego laboratorium za ich dyskusje podczas tej pracy. Praca ta została sfinansowana przez Yamada Science Foundation i Royal Society Short Visit Fellowships oraz EU Marie Curie International Incoming Fellowship GRR to K.K. oraz BBSRC Project Grant (BB/H002278/1) i Wellcome Trust Equipment Grant (073228/Z/03/Z) dla A.H.

1. Kolekcja zainscenizowanych larw
<ol>
	<li>Umieścić 15 samic i 15 samców dorosłych much w cylindrycznej klatce z pleksiglasu, aby złożyły jaja na szalce Petriego z agarem i sokiem winogronowym uzupełnionym małą miarką pasty drożdżowej przez 3 godziny w temperaturze 25 °C. Zmieniaj szalkę 3-4 razy dziennie i wyrzuć pierwszą płytkę (tj. z jaj nieśnych O/N). Wyrzuć również talerze z pierwszego dnia. Od drugiego dnia talerze z jajkami należy przechowywać w temperaturze 25 °C. Po 7 dniach zbierania jaj zacznij od nowego zestawu much rodzicielskich.</li>
	<li>Po około 24 godzinach z jaj wylęgają się larwy. Zaczepiając larwy rozcieńczonym pędzlem lub parą kleszczy, przenieś 35 larw z agaru winogronowego do fiolki zawierającej standardowy pokarm dla much (10 ml) (ryc. 1A).</li>
	<li>Fiolki zawierające larwy należy przechowywać w temperaturze 25 °C przez 3 dni (96 godzin po złożeniu jaj).</li>
</ol>
2. Sekcja brzusznych sznurów nerwowych larw w celu hodowli
<ol>
	<li>Czysta ławka i ręce z 70% etanolem. Namocz 4 bloczki barwiące, 2 pary kleszczyków i igłę z 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Przygotuj 4 bloki barwiące z następującymi pożywkami: jeden z wodą destylowaną (DW) do oczyszczenia i zebrania oczyszczonych larw; drugi z 2 ml pożywki dla owadów Shield and Sang M3 z 1% penicyliną i streptomycyną, bez ekdyzonu (pożywka M3 PS) do wypreparowania larw; trzeci z 2 ml pożywki M3 PS do zebrania wypreparowanych brzusznych rdzeni nerwowych (VNC); i czwarty z 2 ml pożywki M3 PS do dźgnięcia VNC. Wszystkie odczynniki muszą być wstępnie podgrzane do temperatury suchej.</li>
	<li>Dodać wodę do fiolki zawierającej larwy 96 godzin AEL. Następnie za pomocą szpatułki delikatnie rozprowadź pokarm z larwami z fiolki na mokrym ręczniku papierowym. Przenieś 10 larw do bloku barwiącego zawierającego DW, aby zmyć pokarm. Wymień DW 6 razy. Następnie wymień na M3 PS medium.</li>
	<li>Przenieść jedną z larw do bloku barwiącego zawierającego 2 ml pożywki M3 PS.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym należy dokładnie wypreparować mózg larwy przy użyciu standardowych metod 12, ale aby zminimalizować uszkodzenie tkanek, należy zachować szczególną ostrożność, postępując w następujący sposób. Umieść larwę grzbietową stroną do góry i przytrzymaj stronę grzbietową w jednej trzeciej od przedniego końca za pomocą 2 par kleszczy (po jednym w każdej ręce). Trzymając przedni odciągnij tylny koniec kleszczami i rozerwij naskórek. Mózg i VNC powinny być widoczne z tylnej krawędzi przedniej połowy. Ostrożnie wyizoluj mózg i kompleks VNC, usuwając ciało tłuszczowe, jelita i naskórek. Gdy VNC są zbyt mocno uszkodzone, VNC ulegną całkowitej lub częściowej degeneracji, nawet bez obrażeń kłutych. Weź pod uwagę następujące punkty:</li>
</ol>
<ul>
	<li>Nie ciągnij ani nie rozrywaj dysków wyobrażonych i nerwów obwodowych z klatki piersiowej VNC, ponieważ spowoduje to uszkodzenie VNC. Aby przeciąć nerwy obwodowe, przytrzymaj nerwy obwodowe dwiema parami kleszczy umieszczonymi blisko siebie, a następnie pociągnij nerwy kleszczami. Wyimaginowane dyski i części gębowe można pozostawić przymocowane do VNC.</li>
	<li>Pozostaw gruczoł pierścieniowy i gruczoł limfatyczny przyczepione do mózgu.</li>
	<li>Przetnij jelito w punkcie najbliższym mózgu, gdzie nie ma dużo jedzenia.</li>
</ul>
<ol start="6">
	<li>Używając pipetara P20 z odciętą i nieco poszerzoną końcówką, przenieś VNC do bloku barwiącego zawierającego świeże podłoże M3 PS. Przed przeniesieniem VNC należy najpierw pipetować w górę i w dół tylko medium używane do sekcji, aby zapobiec przywieraniu VNC do końcówki.</li>
</ol>
3. Rana kłuta larwy Drosophila VNC
Ta sekcja opisuje, jak wykonać obrażenia kłute VNC i przygotować dźgnięte VNC do analizy poklatkowej i barwienia immunologicznego. Warunki i czas trwania posiewu po dźgnięciu opisano w sekcji 5 (dla analizy poklatkowej) i w sekcji 6 (dla barwienia immunologicznego).
<ol>
	<li>Po zebraniu wystarczającej liczby VNC (4-5 w przypadku barwienia poklatkowego i ponad 24 w przypadku barwienia immunologicznego), przenieś jeden VNC do czystego bloku barwiącego zawierającego M3 PS.</li>
	<li>Ustaw VNC tak, aby neuropile grzbietowe było widoczne pod mikroskopem preparacyjnym (ryc. 1B). Jest to najbardziej naturalna orientacja, w której VNC mogą się leżeć, gdy są przymocowane do płatów wzrokowych.</li>
	<li>Dźgnij ręcznie za pomocą igły wolframowej pod mikroskopem preparacyjnym, od strony grzbietowej praktycznie pod kątem prostym i kierując się do brzusznej połowy VNC (ryc. 1B).</li>
</ol>
Zwróć szczególną uwagę na następujące kwestie:
<ul>
	<li>Dźgnij tylko raz.</li>
	<li>Dźgaj, aż igła uderzy w dno szklanki. Należy jednak uważać, aby nie uszkodzić końcówki igły.</li>
	<li>Trzpień uchwytu igły nie może dotykać podłoża podczas dźgania.</li>
	<li>Rana nie jest widoczna pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
</ul>
Uwaga: Zwyrodnienie niezwiązane z ranami kłutymi
Procedura może spowodować zwyrodnienie komórkowe w obrębie VNC odmienne od zmiany kłującej. Zwyrodnienie powoduje w neuropile, a czasami obserwowano w korze niedźgniętych próbek. Próbki ze zwyrodnieniem wpływającym na neurostos lub rozległym zwyrodnieniem obejmującym również powierzchnię VNC należy wyrzucić. Zwyrodnienie można zidentyfikować w następujący sposób:
<ul>
	<li>Szorstka powierzchnia, szczególnie w bocznej/brzusznej części klatki piersiowej, po 22 godzinach od dźgnięcia. W skrajnych przypadkach VNC wygląda na wystający.</li>
	<li>lub wakuole w neuropile klatki piersiowej, które mogą być widoczne jako w sygnale tła z fluorescencyjnym barwieniem immunologicznym.</li>
</ul>
4. Konserwacja igieł i kleszczy
<ul>
	<li>Rutynowo sprawdzać, czy końcówka igły jest wystarczająco ostra. Końcówka igły może być wygięta lub po użyciu jej do kilku eksperymentów. W takim przypadku naostrz końcówkę za pomocą kamienia z Arkansas lub jego odpowiednika.</li>
	<li>Końcówki kleszczy muszą się idealnie spotykać. Końcówki mogą ulec uszkodzeniu podczas użytkowania. W takim przypadku wyreguluj końcówkę za pomocą kamieni Arkansas lub ich odpowiednika.</li>
</ul>
5. Kultura i nagranie poklatkowe dźgniętych VNC
Aby zobrazować neuropile aksonalne w żywym VNC, można użyć linii pułapki białkowej GFP, która oznacza wszystkie aksony - G9 13 - oraz do wizualizacji wszystkich komórek glejowych (z wyjątkiem gleju w linii środkowej) można użyć sterownika glejowego repoGAL4 do wyrażenia reportera UASdsRed S197Y 14. Poprzez przekroczenie G9 leci do UASdsRedS197Y; Muchy repoGAL4, VNC z larw potomstwa uzyskuje się z zielonymi aksonami i czerwonym glejem, które można zarejestrować w żywej tkance.
<ol>
	<li>Po zebraniu 4-5 VNC przenieś 1 VNC do czystego bloku barwiącego zawierającego 2 ml M3 PS i dźgnij brzuszną połowę VNC, jak wskazano w sekcji 3.</li>
	<li>Przenieś dźgnięty VNC na pokrytą poli-L-lizyną 3,5-milizynową szklaną szalkę Petriego, zawierającą 1 ml M3 PS. Umieść VNC grzbietową stroną do dołu. Delikatnie popchnij VNC płaską stroną kleszczy, aby VNC przykleił się do naczynia.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 1 ml M3 PS 15% FBS, co sprawi, że końcowe stężenie FBS wyniesie 7,5%.</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Zeskanuj VNC, zbierając serię przekrojów Z na całej jej grubości. Użyliśmy odwróconego mikroskopu konfokalnego Leica SP2 z komorą środowiskową o kontrolowanej temperaturze. Każdy równoważny mikroskop konfokalny powinien działać, jednak może wymagać optymalizacji ustawień skanowania. Ustawienia dla naszej poklatkowej mikroskopii konfokalnej były następujące: Temperatura komory środowiskowej: 25 °C; Obiektyw 20X z 4-krotnym zoomem; Tryb skanowania XYZT, z rozdzielczością pikseli 512x512, krokami z=1 μm i odstępami 1-godzinnymi lub 2-godzinnymi.</li>
</ol>
<ul>
	<li>Mikroskop konfokalny Leica SP2 ma ograniczony rozmiar pliku do skanowania. Dzięki tym ustawieniom można przeskanować 8-9 punktów czasowych. W przypadku innych mikroskopów konfokalnych powinno być możliwe uzyskanie stosów obrazów dla dłuższych punktów czasowych, tj. w okresie do 24 godzin.</li>
</ul>
6. Posiew i barwienie immunologiczne utrwalonych i utrwalonych VNC
<ol>
	<li>Przygotować 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą 500 μl M3 PS 7,5% FBS na studzienkę.</li>
	<li>Powtórz sekcję więcej niż 24 VNC dla 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Używając pipetara P20 z odciętą końcówką, przenieś 12 niedźgniętych VNC z puli do naczynia hodowlanego, używając 1 VNC na studzienkę.</li>
	<li>Dźgnij resztę VNC w puli zgodnie z opisem w sekcji 3. Przenieś każdego dźgniętego VNC do studni.</li>
	<li>Umieścić 24-dołkową szalkę w inkubatorze o temperaturze 25 °C na żądany czas, w zależności od doświadczenia. Integralność komórek pozostaje niezmieniona przez co najmniej 24 godziny.</li>
	<li>Po hodowli przenieś 12 VNC w 250 μl 4% formaldehydu PEM w probówce o pojemności 1,5 ml za pomocą pipetara P20 z odciętą końcówką. Następnie utrwalacz jest ostrożnie odpipeowywany, uważając, aby nie uszkodzić VNC. W każdej probówce powinna pozostać niewielka ilość utrwalacza wystarczająca do pokrycia próbek. Następnie dodać świeży utrwalacz i delikatnie mieszać przez 50 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Spłukać 2 razy 0,3% Triton X PBS, a następnie prać 2 razy przez 10 minut 0,3% Triton X PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zablokuj VNC, inkubując z 10% normalną surowicą kozią w 0,3% Triton X PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez co najmniej jeden miesiąc.</li>
	<li>Inkubować VNC z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez ponad 20 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Spłukać 2 razy 0,3% Triton X PBS, a następnie myć 3 razy przez 10 minut 0,3% Triton X PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować VNC z przeciwciałami drugorzędowymi przez ponad 16 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Spłukać 2 razy 0,3% Triton X PBS, a następnie myć 3 razy przez 10 minut 0,3% Triton X PBS w pomieszczeniu RT (w ciemności, jeśli stosuje się fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe).</li>
	<li>Zastąp PBS 50% glicerolem: 50% PBS przez co najmniej godzinę.</li>
	<li>Następnie zastąp 80% glicerolem: 20% PBS przez co najmniej godzinę.</li>
	<li>Zamontuj VNC w oknie wykonanym na 2 warstwach taśmy wiolonczelowej (około 0,06 mm) na szkiełku mikroskopowym. Dostosuj orientację i umieść szkiełko nakrywkowe (18x18 mm) nad oknem. W ten sposób można zamontować dwa VNC na zjeżdżalni.</li>
</ol>
Korzystając z różnych podstawowych przeciwciał, można analizować różne reakcje komórkowe na uszkodzenia (np. zmiany w liczbie komórek i kształcie komórek).
7. Analizuj dane za pomocą ImageJ i szeregu wtyczek
Jeśli VNC nie ma niezwiązanego z kłuciem zwyrodnienia, próbka musi zostać uwzględniona do analizy niezależnie od wielkości zmiany. Ponieważ dźganie odbywa się ręcznie, rozmiar zmiany jest za każdym razem inny. Dlatego ważne jest, aby w miarę możliwości analizować statystycznie efekt dźgnięcia nożem.
<ol>
	<li>Pomiar wielkości rany. Wielkość rany jest wskaźnikiem naprawy 15. Zmiana kłuta jest widoczna jako pozbawiona ekspresji GFP. Obszar zmiany chorobowej można zmierzyć za pomocą bezpłatnego oprogramowania ImageJ, w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Za pomocą ImageJ otwórz stos obrazów konfokalnych z menu "Plik", wybierz "Importuj", a następnie wybierz "Sekwencja obrazów". Spowoduje to przekształcenie kolekcji pojedynczych obrazów w stos.</li>
		<li>Następnie zmień "stos" na "Hyperstack", przechodząc do menu "Obraz", wybierz "Hyperstack", a następnie wybierz "Stack do Hyperstack".</li>
		<li>Ustaw rozmiar woksela za pomocą "Właściwości" z menu "Obraz". W danych uzyskanych za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica SP2 rozmiar woksela można uzyskać z oprogramowania skanującego oraz z pliku tekstowego metadanych zapisanego razem z obrazami. Przy naszym ustawieniu opisanym w sekcji 3 wymiary pikseli wynoszą xy=0,366211 μm i z=0,99709 μm.</li>
		<li>Badając wszystkie plasterki w jednym punkcie czasowym, narysuj maksymalny kontur obszaru zmiany za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów na pasku narzędzi. To jest Region Zainteresowania (ROI).</li>
		<li>Dodaj ROI do menedżera ROI, przechodząc do menu "Analizuj", przewiń w dół i wybierz "Narzędzia", następnie "Menedżer ROI", a następnie "dodaj".</li>
		<li>Powtórz to dla wszystkich punktów czasu.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Zmierz" w menedżerze ROI, aby uzyskać rozmiar obszaru każdego ROI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korekcja ruchu VNC podczas nagrań poklatkowych. Wtyczki "Stackreg" i "Turboreg" 16 (ze strony internetowej ImageJ <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/):</a> te wtyczki pozwalają korygować małe ruchy próbki podczas filmu poklatkowego. Zbuduj stos z równoważną reprezentatywną sekcją optyczną przez wszystkie punkty czasowe i zastosuj wtyczki. Pomaga zobrazować, jak zmiana zmienia się w czasie. Szczegółowe informacje na temat tych metod oraz instrukcja obsługi są dostępne w grupie badawczej, która opracowała te wtyczki. (<a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/" target="_blank">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</a>).</li>
	<li>Automatyczne zliczanie komórek glejowych. Wtyczka "DeadEasy glia" (<a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html</a>): została opracowana w celu zliczenia liczby komórek glejowych REPO-dodatnich w larwalach Drosophila VNC i zbadania zmiany liczby glejowej spowodowanej urazem kłutym17. Wtyczka działa poprawnie, z błędem 0,1% wyników fałszywie dodatnich i 4,3% wyników fałszywie ujemnych 17. Aby użyć tej wtyczki, najpierw oznacz wszystkie komórki glejowe (z wyjątkiem linii środkowej) w próbce za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami anty-REPO. Następnie zainstaluj wtyczkę w ImageJ, otwórz stos obrazów konfokalnych i uruchom wtyczkę. Automatycznie zlicza komórki glejowe w około 30 sekund.</li>
	<li>Automatyczne zliczanie komórek apoptotycznych. Wtyczka "DeadEasy Caspase larvae" (<a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html</a>) 18: Została opracowana w celu zliczenia liczby komórek znakowanych anty-rozszczepionym kaspazą3, a nowa wersja została dostosowana do larwalnych VNC. Uraz kłuty powoduje wzrost zaprogramowanej śmierci komórki 11. Aby użyć tej wtyczki, najpierw oznacz komórki apoptotyczne w próbce za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami anty-rozszczepionymi kaspazą-3. Następnie zainstaluj wtyczkę w ImageJ, otwórz stos obrazów konfokalnych i uruchom wtyczkę. Zlicza komórki apoptotyczne automatycznie w około 30 sekund.</li>
</ol>
8. Odczynniki
<ol>
	<li>Pożywka hodowlana: pożywka dla owadów Shield and Sang M3, 7,5% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny i 1% streptomycyny.</li>
	<li>0,01% poli-L-lizyny w sterylnym DW.</li>
	<li>Utrwalacz: 4% formaldehyd, ultra czysty w roztworze PEM (0,1 M RURY, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4).</li>
	<li>Roztwór blokujący do barwienia immunologicznego: 10% normalna surowica kozia w 0,3% Triton X PBS.</li>
	<li>Przeciwciała syntetazy antyglutaminy 2: 1:250 w roztworze blokującym.</li>
	<li>Przeciwciała anty-GFP: 1:1,000 w roztworze blokującym.</li>
	<li>Przeciwciała anty-REPO: 1:250 w roztworze blokującym.</li>
	<li>Przeciwciała anty-ELAV: 1:250 w roztworze blokującym.</li>
	<li>Przeciwciała przeciw rozszczepieniu kaspazy 3: 1:1,000 w roztworze blokującym.</li>
	<li>Przeciwciała drugorzędowe: 1:250 w roztworze blokującym.</li>
</ol>

<ol><li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).</li>
<li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+of+the+Wallenda%2FDLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li>
<li>Leyssen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+promotes+post-developmental+neurite+arborization+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain.</a> EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).</li>
<li>Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+programmed+cell+death+induces+glial+cell+division+in+the+adult+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain.</a> Development. 136, 51-59 (2009).</li>
<li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).</li>
<li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+genetic+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva%3A+more+sense+than+luck%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).</li>
<li>Schleyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavior-based+circuit+model+of+how+outcome+expectations+organize+learned+behavior+in+larval+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila.</a> Learn Mem. 18, 639-653 (2011).</li>
<li>Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-285 (2006).</li>
<li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+pros-notch+and+pros-NFkappaB+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133(2011).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+protocols%22">Drosophila protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Verkhusha, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+mutant+of+red+fluorescent+protein+DsRed+for+double+labeling+and+developmental+timer+of+neural+fiber+bundle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation.</a> J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).</li>
<li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+Pros-Notch+and+Pros-NFkB+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133(2011).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%3A+A+Publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).</li>
<li>Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+cell+counting+in+vivo+in+the+larval+nervous+system+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila.</a> J. Microsc. 46, 202-212 (2012).</li>
<li>Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeadEasy+caspase%3A+automatic+counting+of+apoptotic+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila.</a> PLoS One. 4, e5441(2009).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li>
<li>Nicolai, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+dendritic+marker+sheds+light+on+neuronal+connectivity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opracowaliśmy protokół urazu kłutego ośrodkowego układu nerwowego larw Drosophila , aby zbadać reakcje komórkowe na uraz, naprawę i regenerację. Larwy VNC są preparowane i dźgane, po czym są filmowane za pomocą mikroskopii poklatkowej lub utrwalane w celu barwienia fluorescencyjnego w celu wizualizacji gleju i neuronów, apoptozy lub podziału komórek. Można zmierzyć postęp zmiany w czasie. Metodzie tej towarzyszy specjalnie opracowane oprogramowanie do ilościowej i statystycznej analizy zmian liczby komórek po urazie i podczas naprawy.
Dźgnęliśmy 96-godzinne larwy AEL (i zostały one albo utrwalone, albo pozwolono im dalej się rozwijać), etap rozwojowy przed przejściem do poczwarki, a następnie dorosłej muchy. Po 96 godzinach VNC są wystarczająco duże, aby można je dźgać; Znajdują się w połowie trzeciego stadium rozwojowego, a zatem nie przechodzą jeszcze przepoczwarzenia; A układ nerwowy jest już w pełni funkcjonalny, podobnie jak u osoby dorosłej. Możliwe jest dźgnięcie larw nieco później, a dokładny czas musi być dobrany tak, aby pasował do pytania badawczego. Jednakże, w zależności od poruszonych pytań, na ogół konieczne będzie hodowanie VNC przez pewien czas, aby obserwować reakcje komórkowe na uraz. Jakiś czas po 120 godzinach rozpoczyna się przepoczwarzenie AEL, okres, w którym OUN jest przebudowywany i dlatego najlepiej go unikać. Tak więc okno czasowe na dźgnięcie i hodowlę larwy jest raczej ograniczone. Wykorzystanie larw nadal ma dużą przewagę techniczną nad wykorzystaniem dorosłych: podczas gdy, podobnie jak u dorosłego, układ nerwowy jest już w pełni funkcjonalny, analiza reakcji na uraz jest znacznie łatwiejsza i szybsza u larw.
Porównując wielkość i morfologię mózgów i VNC wypreparowanych i hodowanych w naczyniu z VNC, które są preparowane w równoważnym późniejszym czasie bez hodowli w naczyniu, wydaje się, że rozwój jest wolniejszy w kulturze niż in vivo. Pod innymi względami rozwój w hodowli przebiega normalnie, integralność tkanek jest zachowana, a komórki są żywe, wykazując wielorakie reakcje. Rozszerzanie się rany, naprawa neuropala i proliferacja gleju mają miejsce w ciągu 22 godzin po dźgnięciu. Pokazuje to, że reakcje komórkowe na uszkodzenia zachodzą w kulturze i najprawdopodobniej nie ma potrzeby utrzymywania eksplantatów dłużej niż jeden dzień. Jeśli pożądana byłaby hodowla długoterminowa, protokół może wymagać dalszej optymalizacji, takiej jak użycie wkładki5 płytki hodowlanej.
Ważne jest, aby odróżnić próbki dobrej jakości od tych degenerujących. Optymalizacja tego protokołu wymaga pewnych umiejętności i nieuchronnie dojdzie do zwyrodnienia u niektórych okazów. VNC może uzyskać wygląd "kalafiora", który odzwierciedla załamanie integralności tkanek (ryc. 5B). Zwyrodnienie rozpoznaje się również po wakuolizacji VNC niezależnie od dźgnięcia, które może być obecne w nienaruszonych, niedźgniętych próbkach (ryc. 5C). Próbki te należy wyrzucić. Zwyrodnienie jest najprawdopodobniej spowodowane zgrubnym rozwarstwieniem, które może rozerwać nerwy i warstwę ochronną gleju powierzchniowego. Dlatego należy zachować dużą ostrożność, aby delikatnie rozciąć. Inne czynniki wpływające to pożywka hodowlana, która musi być utrzymywana w czystości i przy użyciu antybiotyków, ściśle przestrzegając płukania i czasu wskazanego w protokole. Wreszcie, bardzo ważna jest długość igły i uchwytu igły, rozmiar i ostrość igły. Uchwyt igły może zanieczyścić podłoże hodowlane, a igła może spowodować duże obrażenia, które nie mogą się same naprawić i prowadzą do zwyrodnienia. Ważne jest, aby rutynowo utrzymywać igłę w ostrości.
W tym protokole wykorzystaliśmy linię muszek pułapki białkowej do wizualizacji neurostosu równolegle z wizualizacją procesów glejowych przy użyciu tradycyjnego systemu GAL4-UAS. Narzędzia te można również łączyć z innymi binarnymi systemami ekspresji, takimi jak LexA 19 i Q-system 20, które są niezależne od GAL4. Umożliwiłoby to analizę interakcji, na przykład między aksonami a procesami glejowymi w odpowiedzi na uraz. Poprzez dalsze połączenie jej z innymi narzędziami genetycznymi, takimi jak reportery dendrytów 21 lub napływ wapnia 22, metoda ta stanowi doskonałą okazję do analizy biologii komórki stojącej za reakcją na uszkodzenia komórek glejowych, aksonów neuronalnych i dendrytów w OUN. Wreszcie, metoda ta może być połączona ze standardową genetyką, mutacjami i nadekspresją genów, aby przetestować funkcję genów w odpowiedzi na uraz i regenerację.
Protokół ten z powodzeniem doprowadził do odkrycia sieci genów leżącej u podstaw regeneracyjnej odpowiedzi glejowej na uszkodzenie OUN 11. Biorąc pod uwagę ewolucyjne zachowanie funkcji genów, rozwikłanie tych zdarzeń komórkowych i funkcji genów u muszek owocowych prawdopodobnie dostarczy istotnych informacji na temat reakcji ośrodkowego układu nerwowego ssaków na uraz i regenerację.

Regeneracja u zwierząt ujawnia, że komórki wyczuwają, kiedy wzrost organizmu jest uporządkowany i zakończony, oraz jak osiągnięto i utrzymano integralność strukturalną organizmu. Zrozumienie tych tajemniczych zdolności komórek jest bardzo interesujące w biologii. Promowanie regeneracji jest jednym z kluczowych celów neuronauki medycznej. U ludzi uszkodzony ośrodkowy układ nerwowy (OUN) nie ulega regeneracji. Modele urazu rdzenia kręgowego u gryzoni służą do zrozumienia, w jaki sposób komórki reagują na uraz. Jednak obawy etyczne, wysokie koszty i powolny cykl życia zwierząt ograniczają postęp.
Muszka owocowa Drosophila jest szeroko stosowanym organizmem modelowym w biologii rozwojowej i neurobiologii. Dzięki potężnym narzędziom genetycznym i krótkiemu cyklowi życiowemu Drosophila wielokrotnie prowadziła do odkrywania funkcji genów i sieci genów, które mają znaczenie dla zrozumienia ludzi i chorób. Istnieje wiele dowodów na ewolucyjne zachowanie funkcji genów od much do ludzi.
W ostatnich latach u Drosophila ustalono kilka paradygmatów uszkodzenia układu nerwowego. Niektóre polegają na uszkodzeniu nerwów obwodowych biegnących wzdłuż skrzydła lub aksotomii nerwów obwodowych, w tym aksonów czuciowych 1 i ruchowych 2 . Jednak obwodowy i ośrodkowy układ nerwowy różnią się pod wieloma względami i dobrze wiadomo, że u wielu zwierząt obwodowy układ nerwowy może się regenerować, podczas gdy OUN nie. Dlatego, aby zrozumieć regenerację OUN, bardziej odpowiednie jest bezpośrednie uszkodzenie OUN. Ukłucie igłą zostało z powodzeniem zastosowane w mózgu dorosłego Drosophila w celu zbadania reakcji na uraz 3,4. Stosując inne podejście, Ayaz i in. przecięli aksony OUN w hodowanych dorosłych mózgach za pomocą mikrodysektora mocy piezoelektrycznej i analizowali ich regenerację przez 4 dni 5. Zaletą tych późniejszych eksperymentalnych konfiguracji jest to, że koncentrują się one na mózgu, który niewątpliwie cieszy się dużym zainteresowaniem. Wadą jest to, że mózg jest o wiele bardziej złożony niż VNC, który zajmuje się tylko kontrolą motoryczną i sensoryczną. Praca nad dorosłym mózgiem jest również bardziej czasochłonna. Larwa jest gotowa do eksperymentów w ciągu 4 dni, podczas gdy dorosłe osobniki potrzebują około 10 dni, a następnie dodatkowe 5 dni na ich dojrzewanie. Mózg dorosłego człowieka jest również trudniejszy w obsłudze, ponieważ jest otoczony grubym naskórkiem, który jest trudny do usunięcia. VNC ma dodatkową atrakcyjność polegającą na tym, że jest funkcjonalnie równoważny rdzeniowi kręgowemu kręgowców.
Larwa Drosophila jest powszechnie używana jako organizm modelowy dla neuronauki 6-9. Chociaż ściśle rzecz biorąc, larwa jest w fazie rozwoju, można ją również uznać za w pełni funkcjonalne zwierzę. Larwa ma lokomocję, wiele zmysłów, w tym węch, smak i nocycepcję oraz uczenie się i pamięć. W związku z tym larwalna VNC została wybrana jako idealny model do uszkodzenia OUN.
Larwalne i poczwarkowe VNC mogą być preparowane i hodowane w naczyniu, zachowując integralność komórkową przez okres do 24 godzin 10. Sugerowało to, że uraz może zostać zastosowany do VNC, który może być następnie rejestrowany w czasie poklatkowym przez ten okres czasu lub hodowany i naprawiany w dowolnym punkcie czasowym w tym okresie.
Tutaj prezentujemy eksperymentalny paradygmat uszkodzenia OUN za pomocą larwalnego VNC Drosophila. VNC jest najpierw wycinany z larwy, a rana kłuta jest nakładana ręcznie za pomocą igły wolframowej. VNC jest następnie umieszczany na szkiełku nakrywkowym ze szklanym dnem i filmowany za pomocą poklatkowej laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Alternatywnie, VNC mogą być hodowane przez pożądany okres czasu, a efekty komórkowe uszkodzenia można analizować w utrwalonych próbkach za pomocą barwienia immunologicznego i mikroskopii konfokalnej. Obszar rany można zmierzyć, a analizę ilościową liczby komórek (proliferacji komórek i śmierci komórek) można przeprowadzić za pomocą specjalnie opracowanego oprogramowania. Duże rozmiary próbek mogą być łatwo obsługiwane, co skutkuje statystycznie zwalidowanymi wynikami. Metody te zostały z powodzeniem połączone z potężną genetyką Drosophila w celu odkrycia sieci genów leżącej u podstaw glejowej odpowiedzi regeneracyjnej na uszkodzenie OUN 11.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Staining block</td><td>Brunel Mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze No. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>np. 11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Igła wolframowa: średnica pręta, 0,5 mm; rozmiar końcówki, 1 &mu; m; długość, 2 cale</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>Kamienie Arkansans: Zestaw naprawczy do kleszczyków Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>29000-00</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 35 mm ze szklaną podstawą 27 mm</td><td>Iwaki</td><td>3930-035</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2-AOBS konfokalny mikroskop odwrócony z komorą środowiskową</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">odczynnik</td></tr><tr><td>Shield and Sang M3 pożywka dla owadów (bez ekdyzonu)</td><td>Sigma</td><td>S3652-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina i streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Patrz 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P1399-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, 10%, bez metanolu, Ultra Pure</td><td>Polysciences</td><td>04018-1</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciała syntetazy antyglutaminy</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciała anty-GFP</td><td>Technologie życiowe</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciała anty-REPO</td><td>Badania rozwojowe Bank hybrydoma</td><td>8D12</td><td></td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciała anty-ELAV</td><td>Badania rozwojowe Bank hybrydoma</td><td>7E8A10</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała antyaktywne kaspazy 3 królika</td><td>Abcam</td><td>ab13847</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królik Alexa Fluor 488</td><td>Technologie życia</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz Alexa Fluor 647</td><td>Technologie życia</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Przeciw szczurom Alexa Fluor 647</td><td>Technologie życia</td><td>A21247</td><td></td></tr></tbody></table>

paradygmat urazów do badania naprawy ośrodkowego układu nerwowego u drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Eksperymentalna metoda została opracowana w celu zbadania odpowiedzi komórkowych na uszkodzenie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) przy użyciu muszki owocowej Drosophila. Zrozumienie naprawy i regeneracji u zwierząt jest kluczowym pytaniem w biologii. Uszkodzony ludzki OUN nie regeneruje się, a zrozumienie, jak promować regenerację, jest jednym z głównych celów neurologii medycznej. Potężny zestaw narzędzi genetycznych Drosophila może być wykorzystany do rozwiązania problemu regeneracji OUN.
Uszkodzenie brzusznego rdzenia nerwowego OUN (VNC, odpowiednik rdzenia kręgowego kręgowców) jest nakładane ręcznie za pomocą igły wolframowej. VNC można następnie sfilmować w trybie poklatkowym za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej przez okres do 24 godzin, aby śledzić rozwój zmiany w czasie. Alternatywnie można go hodować, a następnie utrwalać i barwić za pomocą immunofluorescencji w celu wizualizacji neuronów i komórek glejowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Za pomocą odpowiednich markerów można uwidocznić zmiany w morfologii i stanie komórki w wyniku urazu. Dzięki ImageJ i specjalnie opracowanym wtyczkom można przeprowadzać analizy ilościowe i statystyczne w celu pomiaru zmian wielkości rany w czasie oraz wpływu uszkodzenia na proliferację i śmierć komórki. Metody te pozwalają na analizę dużych rozmiarów prób. Można je połączyć z potężną genetyką Drosophila w celu zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regeneracji i naprawy OUN.

W niniejszej pracy pokazujemy, jak przeprowadzić uraz kłuty centralnego układu nerwowego (VNC) larwy Drosophila oraz jak analizować odpowiedzi komórkowe na uraz za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej z wykorzystaniem obrazowania time-lapse oraz immunobarwienia.
W danych z obrazowania time-lapse zmiana jest widoczna jako obszar negatywny dla GFP w neuropilu okazów posiadających marker aksonalny G9 (Rysunek 2). Krótko po nakłuciu zaczynają pojawiać się niewielkie obszary negatywne dla GFP, które wyglądają jak otwory lub wakuole (Rysunek 2A). Takie obszary negatywne dla GFP zazwyczaj powiększają się do około 6 do 8 godz. po nakłuciu (Rysunek 2A). Następnie obszary negatywne dla GFP kurczą się, a nawet mogą całkowicie zaniknąć (Rysunek 2B). Do 22 godz. po nakłuciu obszar zajmowany przez ranę jest zazwyczaj mniejszy niż maksymalna powierzchnia odnotowana w 6 do 8 godz. po nakłuciu (Rysunki 2A, B). Podobnie obszar negatywny dla DsRed w wypustkach glejowych początkowo również się zwiększa, lecz kurczy się do 22 godz. po nakłuciu. Co ciekawe, często DsRed-dodatnie wypustki glejowe wypełniają negatywne dla GFP otwory w neuropilu przed ich całkowitym zanikiem (Rysunek 2C).
Dzięki zastosowaniu immunobarwienia w utrwalonych preparatach, drobne wypustki glejowe oraz ich odpowiedź na uraz mogą być wizualizowane z lepszą rozdzielczością niż w obrazach time-lapse. Można to osiągnąć, na przykład, wykorzystując sterownik glejowy repoGAL4 do indukowania ekspresji reportera zakotwiczonego w błonie (np. UAS-mCD8GFP) u muszek, aby zwizualizować wszystkie komórki glejowe (z wyjątkiem gleju linii środkowej). Można to również połączyć z innymi markerami glejowymi, takimi jak anty-GS2, który znakuje komórki glejowe związane z neuropilem (Ryciny 3A, B). Tutaj pokazujemy, że mimo nakłucia brzusznego sznura nerwowego od strony grzbietowej, uraz ten powoduje wcięcie w części brzusznej (Rycina 3A, groty strzałek). Nakłucie wydaje się silniej wpływać na neuropil i związane z nim komórki glejowe niż na komórki glejowe powierzchniowe i korowe (Rycina 3B). Wypustki glejowe w neuropilu wydają się zdezorganizowane, podczas gdy w korze zachowują one swoją strukturę przypominającą siatkę. Uraz prowadzi do powstania GS2-dodatnich szczątków komórkowych, które różnią się od normalnych komórek, ponieważ fragmenty szczątków są znacznie mniejsze i nie są połączone z ciałem komórkowym. Ujawnia to uszkodzenie komórek glejowych związanych z neuropilem (Rycina 3B). Degenerujące się komórki glejowe związane z neuropilem zaobserwowano również w mikroskopii elektronowej 15. Barwienie na apoptozę przeciwciałem anty-cleaved-Caspase 3+ jest widoczne w komórkach glejowych związanych z neuropilem 15, co wskazuje, że ulegają one apoptozie po urazie nakłuciowym. Wykazano również, że komórki glejowe związane z neuropilem fagocytują szczątki neuronalne 15, a sygnał GS2+ może również ujawniać pochłanianie apoptotycznych neuronów przez wypustki glejowe. Komórki apoptotyczne Cleaved-Caspase+ obserwuje się również w korze, przy czym co najmniej niektóre z nich odpowiadają neuronom Elav+ (Rycina 3C).
Wykorzystanie utrwalonych próbek i immunobarwienia umożliwia również ilościowe analizy odpowiedzi komórkowych na uraz, takie jak efekty w proliferacji i apoptozie. W tym celu opracowaliśmy dwa wtyczki do programu ImageJ: DeadEasy Caspase Larva oraz DeadEasy Glia, służące odpowiednio do automatycznego zliczania liczby komórek glejowych i komórek apoptotycznych. Zostały one zwalidowane pod kątem pracy z VNC larw i są bardzo dokładne. Dzięki nim możliwe jest zaobserwowanie zwiększenia liczby komórek glejowych wykazujących pozytywną reakcję na REPO spowodowanego urazem kłutym w ciągu 22 h (Rycyna 4A)15. Odnotowano również wzrost liczby apoptotycznych komórek wykazujących pozytywną reakcję z przeciwciałem anty-cleaved-Caspase-3 w 6 h po ukłuciu (Rycina 4B)15. Taki wzrost proliferacji gleju i apoptozy w odpowiedzi na uraz w OUN Drosophila przypomina odpowiedź na uraz w OUN kręgowców.
Kluczowym aspektem tego protokołu jest jakość preparatów VNC po wypreparowaniu. W momencie dyssekcji trudno określić, czy łańcuchy brzuszne (VNC) zostały uszkodzone w tym procesie. Należy zachować szczególną ostrożność i przeprowadzać dyssekcję w sposób delikatny. Niemniej jednak nieuchronnie powstaną próbki złej jakości, które muszą zostać zidentyfikowane na późniejszych etapach i odrzucone. W naszych badaniach degeneracja VNC wydaje się nie być powiązana z samym urazem, lecz wynika z gwałtownego przeprowadzania dyssekcji. Nie zaobserwowaliśmy krytycznej wielkości rany urazowej i analizujemy wszystkie uszkodzone próbki, które nie wykazują degradacji. Gdy VNC zachowują swoją integralność, powierzchnia VNC ma tendencję do bycia gładką i błyszczącą, a w neuropile nie obserwuje się żadnych ubytków (Rysunek 5A). Degradację VNC można rozpoznać 24 h po dyssekcji po chropowatej powierzchni brzusznych i bocznych obszarów VNC (Rysunek 5B). Może również wystąpić degradacja neuropila niezwiązana z urazem kłutym, która objawia się jako ubytki w neuropile w sygnale tła w preparatach immunobarwionych. Próbki z takimi oznakami degeneracji muszą zostać odrzucone (Rysunek 5C). W naszych badaniach skuteczność dyssekcji i wywołania urazu u much kontrolnych (yw) nienaruszonych oraz nakłutych wynosi około 70%. Wartość ta będzie różnić się w zależności od umiejętności osoby przeprowadzającej eksperymenty oraz od genotypu.
<img alt="Schemat etapów rozwoju larw i urazu; oś czasu rozwoju i sekcji; igła do badań nad nerwami." src="/files/ftp_upload/50306/50306fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Schematyczny rysunek etapów rozwoju larw i urazu kłutego. (A) W dniu 0 muchy składają jaja w szalce Petri z sokiem z winogron przez 3 hr. W dniu 1 zebrane zostają wyklute larwy pierwszego stadium (L1), które przenosi się do fiolek z standardową pożywką drożdżową, gdzie pozostają przez kolejne 3 dni. W dniu 4 larwy są pobierane z fiolek z pożywką i wykorzystywane do eksperymentów z urazami kłutymi. (B) Widok boczny ośrodkowego układu nerwowego larwy. Region brzuszny brzusznego sznura nerwowego jest przebijany igłą od strony grzbietowej. Strona przednia znajduje się po lewej, a tylna po prawej.
<img alt="Postępowanie zmian w VNC w czasie, obrazowanie aksonów G9-GFP, glej repoGAL4&gt;UASDsRed, analiza czasowa." src="/files/ftp_upload/50306/50306fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Postępowanie zmian w VNC w czasie. Mikroskopia konfokalna żywych VNC z aksonami znakowanymi GFP i komórkami glejowymi znakowanymi DsRed. Genotyp: UASDsRed/+;G9/+;repoGAL4/+. (A) Zmianę rozpoznaje się po braku fluorescencji neuropila aksonalnego. Po nakłuciu pojawiają się ubytki ujemne pod względem GFP, które następnie zwiększają swoją wielkość i liczbę. Projekcje 5 przekrojów optycznych z każdego punktu czasowego po urazie nakłuciowym. (B) Zmiana w neuropilu aksonalnym zmniejsza się od 9 h po nakłuciu. Obrazy te stanowią pojedyncze przekroje optyczne z różnych punktów czasowych po urazie nakłuciowym. Aby zidentyfikować równoważne pozycje w każdej próbce, z każdego punktu czasowego w stosie danych time-lapse wybrano ten sam numer przekroju. Porównując wzorce wizualizowane za pomocą G9 i repoGAL4&gt;UASmCD8GFP w obszarze nieobjętym nakłuciem, zweryfikowano, że przekroje pochodzą z równoważnych pozycji w osi Z. Linie przerywane w (A,B) wskazują krawędź rany. (C) Duże powiększenie ran w neuropilu. Ubytki ujemne pod względem GFP zostały wypełnione DsRed-dodatnimi wypustkami glejowymi, a następnie zniknęły (groty strzałek). Widok poziomy. Góra to strona przednia.
<img alt="Charakterystyka uszkodzenia VNC; obraz mikroskopowy; repoGAL4&gt;mCD8GFP, markery GS2; badanie komórkowe." src="/files/ftp_upload/50306/50306fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Charakterystyka komórkowa uszkodzenia VNC. VNC z reporterem GFP przytwierdzonym do błony dla wszystkich komórek glejalnych (z wyjątkiem glejów linii środkowej), barwione przeciwciałem anty-GFP oraz anty-GS2, markerem komórek glejalnych związanych z neuropilem. Genotyp: +/+;UASmCD8GFP/+;repoGAL4/+. (A) VNC zostały nakłute od strony grzbietowej, co spowodowało wgniecenie od strony brzusznej (groty strzałek). Widok strzałkowy pojedynczych przekrojów optycznych, góra – strona grzbietowa, lewo – przód. (A, B) Uraz nakłuciowy dotyka w większym stopniu komórek glejalnych związanych z neuropilem niż komórek glejowych kory i powierzchniowych. Uraz prowadzi do powstania GS2-dodatnich szczątków komórkowych (groty strzałek w B). (B) Widok poziomy pojedynczych przekrojów optycznych, góra – przód. Groty strzałek wskazują szczątki komórek GS2+. (C) Kolokalizacja markera apoptotycznego anty-cleaved-Caspase-3 oraz markera neuronalnego anty-Elav wykazująca, że po urazie niektóre z obumierających komórek w korze są neuronami. np, neuropil; cx, kora.
<img alt="Automatyczne liczenie komórek przy użyciu DeadEasy w badaniach nad glejem i apoptozą; obrazy fluorescencyjne, wyniki." src="/files/ftp_upload/50306/50306fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Automatyczne liczenie komórek glejowych i komórek apoptotycznych przy użyciu DeadEasy. (A) Przykład użycia funkcji 'DeadEasy Larval glia' do liczenia komórek glejowych pozytywnych pod kątem REPO. Po lewej: połowy brzuszne VNC barwione przeciwciałami anty-REPO; w środku: wynik z DeadEasy Larval glia pokazujący komórki zidentyfikowane przez wtyczkę; po prawej: nałożenie obrazów. Liczby po prawej stronie oznaczają liczbę komórek pozytywnych pod kątem REPO, przeliczonych automatycznie w całym stosie optycznych przekrojów konfokalnych w około 30 sekundach. Liczba komórek glejowych wzrasta w uszkodzonych (nakłutych) VNC. (B) Przykład użycia funkcji 'DeadEasy Caspase larva'. Po lewej: projekcje 5 optycznych przekrojów konfokalnych barwionych przeciwciałami anty-cleaved-CASPASE 3; w środku: wynik pokazujący komórki zidentyfikowane przez wtyczkę; po prawej: nałożenie obrazów. Liczby po prawej stronie oznaczają liczbę komórek pozytywnych pod kątem CASPASE, przeliczonych automatycznie w całym stosie optycznych przekrojów konfokalnych w około 30 sekundach. Liczba komórek apoptotycznych wzrasta w uszkodzonym (nakłutym) VNC.
<img alt="Degenerujące VNC, obrazy mikroskopowe przedstawiają struktury nerwowe, podkreślając degenerację u Drosophila." src="/files/ftp_upload/50306/50306fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
 Rycina 5. Przykłady degeneracji. (A) Zdrowe VNC. Brak oznak degeneracji. (B) Degeneracja boku klatki piersiowej (groty strzałek) w preparacie nakłutym. Gwiazdka wskazuje miejsce uszkodzenia. (C) Otwory w neuropilu klatki piersiowej (biały grot strzałki) i korze (pomarańczowy grot strzałki) w VNC nienakłutym. Preparaty z uszkodzonym neuropilem i rozległą wakuolizacją muszą zostać odrzucone. Tutaj VNC zostały barwione przeciwciałem anty-Ebony, markerem glii związanej z neuropilem. Widok poziomy, przód u góry.

Opisano paradygmat uszkodzeń wykorzystujący brzuszny rdzeń nerwowy larw Drosophila do badania regeneracji i naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Dźganie, a następnie laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna w próbkach poklatkowych i utrwalonych, w połączeniu z analizą ilościową za pomocą celowo opracowanego oprogramowania i genetyki, są wykorzystywane do badania molekularnych mechanizmów regeneracji i naprawy OUN.

Paradygmat urazów do badania naprawy ośrodkowego układu nerwowego u Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Celem tej procedury jest zadanie rany kłutej w obrębie brzusznego sznura nerwowego w obrębie OUN larwy drozyli oraz wywołanie odpowiedzi komórkowej na ten uraz. W tym celu najpierw określa się stadium rozwoju larw do 96 godzin po zniesieniu jaj. Następnie wypreparowuje się OUN larwy, a brzuszny sznur nerwowy nakłuwa się za pomocą cienkiej igły sterylnej.Ostatnie etapy polegają na hodowli, a następnie utrwaleniu nakłutych brzusznych sznurów nerwowych do barwienia immunocytochemicznego lub po prostu ich hodowli do rejestracji time-lapse. Ostatecznie mikroskopia konfokalna próbek pozwala zobrazować dynamikę postępu rany oraz zmiany w proliferacji, apoptozie i morfologii komórek glejowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami takimi jak uszkadzanie dorosłej muchy jest to, że choć larwalny OUN wciąż stanowi paradygmat funkcjonalnego ośrodkowego układu nerwowego, jest on technicznie bardziej dostępny.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ kod nerwu benal może ulec degeneracji, jeśli etap sekcji nie został przeprowadzony prawidłowo. Należy zacząć od zapewnienia warunków sanitarnych. Przetrzyj blat oraz dłonie 70% ethanol. Instrumenty powinny zostać owinięte w chusteczkę nasączoną 70% ethanol i odłożone na bok.Po przygotowaniu do pracy z larwami, rozwiń tkaninę i pozwól instrumentom wyschnąć na powietrzu. W przypadku tych protokołów kluczowe jest, aby końcówki pęsety idealnie do siebie przylegały. Jeśli tak nie jest, należy je wyregulować, używając kamieni arkansas lub ich odpowiedników.Napełnij jeden blok barwiący wodą destylowaną, a trzy bloki dwiema mililitrami pożywki M3 PS. Wybierz fiolkę z larwami w wieku 96 godzin i dodaj do niej nieco wody. Następnie, używając szpatułki, delikatnie przenieś pożywkę wraz z larwami z fiolki i rozłóż ją na mokrym ręczniku papierowym.Przenieś 10 larw z rozkładni do bloku barwiącego z wodą. Wymień wodę sześć razy, aby całkowicie oczyścić larwy. Następnie zastąp wodę pożywką M three PS.Przenieś jedną z larw do bloku barwiącego z pożywką M3 PS i umieść ją pod stereomikroskopem. Usuń VNC, minimalizując uszkodzenia tkanek. Najpierw ułóż larwę grzbietem do góry.Następnie, w odległości jednej trzeciej od końca przedniego, chwyć stronę grzbietową dwiema parami pincet. Następnie, używając pincet, odciągnij koniec tylny, rozdzierając naskórek. W kolejnym kroku przetnij przewód pokarmowy w miejscu najbliższym mózgowi, ponieważ w tym obszarze nie powinno znajdować się dużo pokarmu.Mózg oraz VNC są teraz widoczne od tylnej krawędzi przedniej połowy ciała. Ostrożnie usuń ciało tłuszczowe, jelita i naskórek. Odseparuj nerwy obwodowe od piersiowego odcinka VNC, używając dwóch par pęset umieszczonych blisko siebie i rozsuwając je w przeciwnych kierunkach.Nie należy wyrywać ani rozdzierać tarczek ani nerwów obwodowych z VNC klatki piersiowej, gdyż spowoduje to degenerację otworu gębowego. Niektóre elementy mogą pozostać przyczepione do VNC; tarczki imaginalne powinny pozostać przyczepione do mózgu. Teraz zwilżyć i rozszerzyć P 20.Zanurz końcówkę w medium M three PS i użyj jej do przeniesienia VNC do bloku barwiącego zawierającego świeże medium M three PS przed uszkodzeniem vnc. Upewnij się, że zebrano odpowiednią liczbę osobników. Do rejestracji time-lapse wymagane są cztery do pięciu osobników, natomiast do barwienia immunocytochemicznego wymaganych jest ponad 24.Przenieś jeden VNC do czystego bloku barwiącego zawierającego M trzy PS pod mikroskop stereoskopowy, ustawiając grzbietowy neuro pill w polu widzenia. Jest to najbardziej naturalna orientacja dla VNC z przyłączonymi płatami optycznymi. Teraz, tylko raz, użyj igły steno, aby manualnie przebić VNC od strony grzbietowej pod kątem niemal prostym. Celuj w brzuszną połowę VNC.Igła delikatnie uderzy w szklaną powierzchnię znajdującą się pod tkanką. Dlatego ważne jest, aby rutynowo sprawdzać, czy końcówka igły jest nadal wystarczająco ostra przed kolejną próbą. Jeśli końcówka jest stępiona, należy ją naostrzyć.Użycie kamienia arkansaskiego lub równoważnego narzędzia do ostrzenia, aby uzyskać odpowiednią ostrość igły do nakłuwania, jest najważniejszym krokiem w tej procedurze, ponieważ jest to paradygmat urazu. Jeśli igła będzie zbyt tępa, rana będzie zbyt obszerna, a osłona nerwu może ulec degeneracji. Podczas nakłuwania należy zapobiegać dotykaniu medium przez trzpień uchwytu igły; po prawidłowym wykonaniu zabiegu rana nie będzie widoczna nawet po immunocytochemicznym barwieniu fluorescencyjnym.W utrwalonym zdrowym VNC po 22 godzinach hodowli nie obserwuje się żadnych oznak degeneracji. Procedura ta może prowadzić do degeneracji komórkowej w obrębie VNC niezwiązanej z nakłuciem 22 godziny po wykonaniu zabiegu. Należy szukać chropowatych powierzchni, szczególnie w bocznej części brzusznej klatki piersiowej, wskazanej przez groty strzałek.W ekstremalnych przypadkach VNC jest wypchnięty. Należy również szukać otworów lub wakuol w grudce neuropilnej klatki piersiowej, które mogą być widoczne jako otwory po fluorescencyjnym barwieniu immunologicznym. Zwróć uwagę na otwory wskazane grotem strzałki.Próbki wykazujące jakiekolwiek z tych oznak degeneracji w neuro pill muszą zostać odrzucone. Aby zwizualizować aksonalną neuro pill w żywym VNC, należy użyć pułapki białka GFP o nazwie G nine, która znakuje wszystkie aksony. Aby zwizualizować wszystkie komórki glejowe z wyjątkiem gl linii środkowej, należy użyć drivera glejowego repo G four wraz z na przykład reporterem U-A-S-D-S red S 1 97 Y; muchy niosące oba reportery będą posiadać zielone aksony i czerwone GL, co można rejestrować w żywej tkance w trybie time lapse.Po wycięciu VNC od zwierząt posiadających wymagane raportery, przenieś wycięty VNC do szalki z szklanym dnem o średnicy 3,5 mm powleczonej poli-L-lizyną, zawierającej 1 ml pożywki M3 PS. Umieść VNC stroną grzbietową do dołu, a następnie delikatnie dociśnij go do dna szalki płaską stroną pęsety, aby przylgnął do powierzchni. Teraz ostrożnie dodaj 1 ml pożywki M3 PS z 15% FPS w komorze obrazowania z temperaturą kontrolowaną na 25 °C. Uzyskaj obrazy VNC przy użyciu mikroskopii konfokalnej na urządzeniu LIR SP2 o ograniczonych możliwościach.Użyj obiektywu 20x z czterokrotnym powiększeniem (zoom). Ustaw tryb skanowania na XYZT. Ustaw rozdzielczość pikseli na 512 kwadrat.Ustaw krok w osi Z na 1 µm i wykonuj zdjęcia w odstępach jednej lub dwóch godzin. Takie ustawienia pozwolą na zeskanowanie od ośmiu do dziewięciu punktów czasowych na innych mikroskopach konfokalnych. Dostosuj ustawienia, aby uzyskać stosy obrazów dla dłuższego czasu.Punkty do 24 godzin. Uszkodzenie VNC wizualizowano w odstępach czasu jako obszar negatywny pod kątem GFP wewnątrz neuropili okazów posiadających aksonalny marker G9; krótko po nakłuciu zaczęły pojawiać się małe obszary negatywne pod kątem GFP, które wyglądały jak otwory lub wakuole. Takie obszary negatywne pod kątem GFP zazwyczaj powiększały się do sześciu-ośmiu godzin po nakłuciu.Następnie obszary ujemne dla GFP bardziej się zmniejszyły, a niektóre z nich całkowicie zanikły do 22 godziny po nakłuciu. Powierzchnia zajmowana przez ranę była zazwyczaj mniejsza niż maksymalna powierzchnia zaobserwowana od sześciu do ośmiu godzin po nakłuciu. Podobnie obszar ujemny dla DS red w wypustkach glejowych początkowo uległ powiększeniu.Kurczyły się one jednak o 22 godziny po nakłuciu. Co ciekawe, przed ich zniknięciem w „neuro-pigułce” często pojawiały się wypełniające ubytki GFP-ujemne wypustki glejowe wykazujące ekspresję DS-red. Immunobarwienie utrwalonych preparatów z linii repo GAL4 i UAS-mCDHFGP, służące do znakowania błon komórek glejowych przeciwciałem anty-GFP, wykazało, że uraz w wyniku nakłucia strony grzbietowej doprowadził do powstania wcisku.Stwierdzono, że przebicie brzuszne wpłynęło na neuropleksus oraz powiązane z nim komórki glejne w stopniu bardziej dotkliwym niż na komórki glejne znajdujące się na powierzchni i w korze. Wypustki glejne w obrębie neuropleksusu wydawały się zdezorganizowane, podczas gdy w korze nadal otaczały VNC i zachowały swoją siatkowatą organizację. Uraz doprowadził do powstania debris komórkowego wykazującego pozytywną reakcję na GS two, co wskazano za pomocą grotów strzałek.Zanieczyszczenia te różnią się od prawidłowych komórek. Są znacznie mniejsze i nie są połączone z ciałem komórki. Wykazało to uszkodzenie komórek glejowych powiązanych z neuropill oraz obecność przeciwciał przeciwko rozszczepionej kaspazie.W neuronach i komórkach glejowych zaobserwowano trzy pozytywne zabarwienia na apoptozę, co wskazuje, że uległy one apoptozie w wyniku urazu kłutego. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w ciągu jednej do dwóch godzin.Wypreparowanie splotu nerwów brzusznych, ich unieruchomienie i przygotowanie do konfokalnej mikroskopii poklatkowej zajmuje jedną godzinę; w ciągu dwóch godzin można wypreparować, unieruchomić i przygotować do hodowli 24 sploty nerwów brzusznych, po czym próbkę można utrwalić w pożądanym punkcie czasowym.

an-injury-paradigm-to-investigate-central-nervous-system-repair

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Paradygmat urazu do badania naprawy ośrodkowego układu nerwowego w Drosophila

Ten film opisuje dwufotonową laserową ablację aksonów u larwy Drosophila melanogaster oraz przykładowy protokół wywoływania obrażeń i obrazowania miejsca urazu.

Uszkodzenie neuronów wywołane laserem dwufotonowym: metoda obserwacji zwyrodnienia i regeneracji aksonów u larw Drosophila

Film pokazuje wywoływanie neurodegeneracji w nerwach segmentowych larw Drosophila poprzez uraz mechaniczny. Brzuszny naskórek znieczulonych larw jest ściskany za pomocą kleszczy, aby spowodować uszkodzenie nerwów segmentowych. Uszkodzone larwy są utrzymywane z pożywieniem, co pozwala na uszkodzenie powoduje zwyrodnienie neuronów ruchowych w nerwach, powodując zakłócenie ich połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ).

Mechaniczne uszkadzanie nerwów segmentowych larw Drosophila w celu wywołania neurodegeneracji

Ten film pokazuje indukcję penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu w mózgu drosophila. Nowo wylęgłe muchy są selekcjonowane, znieczulane i umieszczane pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym we fluorescencję. Identyfikowany jest korpus grzyba wykazujący ekspresję GFP i wkładana jest szpilka Minutien w celu spowodowania obrażeń. Muchom pozwala się wyzdrowieć w celu dalszych badań.

Wywoływanie penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu u dorosłych much Drosophila

Embrionalny naskórek zarodków Drosophila w bardzo późnym stadium dostarcza systemu in vivo do szybkiej analizy reakcji na nakłucie rany i może być łączony z manipulacjami genetycznymi lub chemicznymi zabiegami mikroiniekcji w celu przyspieszenia badań nad gojeniem się ran w celu translacji na modele ssaków.

Test mikroiniekcji rany i lokalizacja in vivo reporterów odpowiedzi naskórka na ranę w zarodkach Drosophila.

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Tutaj opisujemy metodę zadawania zamkniętego urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) u Drosophila. Metoda ta stanowi bramę do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych, które leżą u podstaw patologii TBI, przy użyciu szerokiej gamy narzędzi i technik eksperymentalnych dostępnych dla much.

Metoda zadawania urazowego uszkodzenia mózgu z zamkniętą głową u Drosophila

Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną metodę uszkadzania nerwów segmentowych u larw Drosophila, aby uwidocznić i określić ilościowo neurodegenerację neuronów ruchowych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) larw trzeciego stadium rozwojowego.

Prosta metodologia mechanicznego urazu, metoda neuronów do badania zwyrodnienia neuronów ruchowych Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący model uszkodzenia neuronów neuronu czuciowego Drosophila - dendrytycznej arboryzacji (da), który łączy obrazowanie na żywo in vivo, dwufotonową laserową aksotomię/dendriotomię oraz potężny zestaw narzędzi genetycznych much, jako platformę do badań przesiewowych potencjalnych promotorów i inhibitorów neuroregeneracji.

Model uszkodzeń Drosophila in vivo do badania neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły zadawania penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu (PTBI) dorosłym Drosophila i badania wynikającej z tego neurogenezy.

Stymulowanie i analiza neurogenezy dorosłych w centralnym mózgu Drosophila

Poznaj paradygmat urazów kłujących w sznurze nerwowym brzusznym larw Drosophila do badania regeneracji ośrodkowego układu nerwowego. Ta metoda umożliwia analizę dynamiki komórkowej po urazie.

Paradygmat urazów do badania naprawy ośrodkowego układu nerwowego u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów