Name: Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj metodę generowania rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez długoterminowe stypendium EMBO (ABW), międzynarodowe stypendium podoktoranckie National Science Foundation (ABW), Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), stypendium DIGS-BB (AO) oraz Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Wspólnot Europejskich STG-207634 (DS, ACO). Dziękujemy Ravi Desai za pomocne komentarze na temat manuskryptu. Chcielibyśmy również podziękować zakładowi ekspresji białek MPI-CBG za produkcję fragmentu fibronetyny zebry pręgowanego1, personelowi zakładu MPI-CBG za opiekę i konserwację naszych linii rybnych oraz zakładowi mikroskopii świetlnej MPI-CBG za wsparcie w obrazowaniu.

1. Przed sekcją
<ol>
	<li>Na dzień przed sekcją należy pobrać zarodki z krzyżówki par danio pręgowanego heterozygotycznych pod względem allelu transgenicznego.
	<ol>
		<li>Wychowywać zarodki w pożywce E3 bez błękitu metylenowego w temperaturze 28 oC do fazy tarczy (6 godzin po zapłodnieniu).</li>
		<li>Przenieść zarodki w pożywce E3 bez błękitu metylenowego do 20 oC O/N. W temperaturze 20 oC zarodki będą tworzyć 1 somit na godzinę, gdy osiągną stadium pąka ogonowego. Po 17-20 godzinach O/N w temperaturze 20 oC, zarodki powinny być w stadium od 5 do 8 somitów następnego ranka, na początku protokołu preparacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz narzędzia i odczynniki potrzebne do sekcji.
	<ol>
		<li>Pipeta ze szkła polerowanego ogniowo do transferu zarodków i tkanek</li>
		<li>Para cienkich kleszczyków do usuwania kosmówki z zarodków</li>
		<li>Naczynie 35 mm z powłoką Sylgard do rozwarstwienia - Wlać polimer Sylgard do naczynia o średnicy 35 mm i utwardzić O/N w temperaturze 37 °C. Dobrze przeprowadzić sekcję za pomocą końcówki igły, aby usunąć niewielką objętość utwardzonego polimeru. Naczynie można wyczyścić, a następnie ponownie wykorzystać.</li>
		<li>Naostrzone, spłaszczone narzędzia z drutu wolframowego do manipulacji tkankami PSM</li>
		<li>Mikroskalpel do wycinania pożądanych kawałków PSM do hodowli</li>
		<li>35-milimetrowe plastikowe naczynie do inkubacji trypsyny</li>
		<li>L15 pożywka zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej</li>
		<li>0,25% roztwór trypsyny/EDTA</li>
		<li>Sigmacoted końcówki żelowe do dyspersji</li>
		<li>Płytki Petriego z tworzywa sztucznego zawierające pożywkę E3 bez błękitu metylenowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryj naczynie do obrazowania ze szklanym dnem substratem Fibronectin1 (10 μg/ml w PBS). Pozostaw naczynie na ławce, aby pokryło się podczas sekcji.</li>
	<li>Użyj stereoskopu z odpowiednimi filtrami fluorescencyjnymi, aby zidentyfikować i posortować dodatnie zarodki transgeniczne (stadium od 5 do 8 somitów).
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj zarodki transgeniczne, badając mezodermę presomatową (PSM) pod kątem ekspresji YFP w kanale fluorescencyjnym (ryc. 1A). Fluorescencja powinna być widoczna w obszarze od ostatniego utworzonego somitu do pąka ogonowego. Wybierz zarodki o najjaśniejszym sygnale; 25% potomstwa powinny być homozygotycznymi zarodkami noszącymi 2 kopie transgenu. Liczba potrzebnych zidentyfikowanych zarodków różni się w zależności od eksperymentu. Jeden wypreparowany kawałek pączka ogonowego da średnio 1,000 komórek. Zazwyczaj kilka dodatkowych dodatnich zarodków jest przydatnych w przypadku popełnienia błędów podczas sekcji.</li>
		<li>Użyj światła przechodzącego jako odniesienia pozycyjnego, aby odróżnić autofluorescencję, szczególnie w komórce żółtkowej, od sygnału.</li>
		<li>Przenieść dodatnie zarodki na oddzielną plastikową płytkę Petriego zawierającą pożywkę E3 bez błękitu metylenowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dystrybucja i rozproszenie PSM
<ol>
	<li>Przygotuj zarodki do sekcji.
	<ol>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym, za pomocą cienkich kleszczy, ostrożnie usuń kosmówkę z każdego zarodka w pożywce E3. Należy pamiętać, aby nie uszkodzić zarodka ani nie zakłócić działania komórki żółtka.</li>
		<li>Napełnij naczynie preparacyjne pokryte Sylgardem pożywką L15 z surowicą. Za pomocą kleszczy lub innego płaskiego narzędzia usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z powierzchni Sylgarda.</li>
		<li>Przenieść zdechorionowane zarodki za pomocą pipety z polerowanego ogniowo szkła do naczynia rozbiorowego.</li>
		<li>Za pomocą drucianych narzędzi przenieś wszystkie zarodki na jedną stronę naczynia preparacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparuj PSM z pojedynczego zarodka.
	<ol>
		<li>Ułóż pojedynczy zarodek na jego bocznej stronie w małym dołku wykonanym w warstwie Sylgarda w naczyniu preparacyjnym (ryc. 1B).</li>
		<li>Za pomocą mikroskalpela przeciąć zarodek i komórkę żółtka tuż przed tyłomózgowiem i przez brzuszny biegun zarodka (ryc. 1B, przerywana czerwona linia).</li>
		<li>Wyjmij przednią część zarodka ze studzienki, przesuwając ją na bok naczynia, a następnie użyj drucianych narzędzi, aby zeskrobać pozostałe granulki komórek żółtkowych z tylnej części, w tym PSM.</li>
		<li>Po zeskrobaniu żółtka spłaszcz i zorientuj PSM tak, aby przedni koniec był skierowany od eksperymentatora, a tylny skierowany w stronę eksperymentatora (ryc. 1C).</li>
		<li>Jeśli cienka warstwa ektodermy nie została oderwana do tego momentu, użyj drucianych narzędzi, aby oderwać ją od górnej części tkanki PSM.</li>
		<li>Za pomocą mikroskalpela odetnij pączek ogonowy, najbardziej wysunięty do tyłu koniec PSM za końcem struny grzbietowej, z dala od reszty tkanki (ryc. 1C, przerywana czerwona linia). UWAGA: Inne fragmenty tkanki z PSM, na przykład przedni PSM bliżej ostatniego utworzonego somitu, mogą być również wprowadzone do hodowli, w zależności od pytania eksperymentalnego.</li>
		<li>Przesuń część pączka ogonowego do jednego rogu naczynia z dala od obszaru preparowania. Użyj drucianych narzędzi, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i niechciane tkanki zarodkowe z pola preparacji.</li>
		<li>Powtórz z następnym zarodkiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz kawałki pąków ogonowych z wielu zarodków, w zależności od tego, ile komórek będzie potrzebnych do eksperymentu. Średnio z jednego kawałka tkanki pączka ogonowego powstaje 1,000 komórek.</li>
	<li>Napełnij puste plastikowe naczynie o średnicy 35 mm niewielką ilością trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo przenieś kawałki pąków ogonowych z naczynia do rozkroju do naczynia zawierającego trypsynę/EDTA. Inkubuj kawałki pączków ogonowych w trypszynie/EDTA przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas inkubacji tkanki w trypszynie, usuń roztwór Fibronectin1 z naczynia do obrazowania ze szklanym dnem.
	<ol>
		<li>Umyj roztwór ze szkła 3 razy wodą MilliQ. Użyj ssania, aby usunąć każde mycie i upewnij się, że naczynie jest całkowicie suche.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozproszyć kawałki pączka ogonowego w podłożu do obrazowania.
	<ol>
		<li>Odpipetować 100 μl pożywki L15 z surowicą do naczynia do obrazowania.</li>
		<li>Za pomocą powlekanej końcówki żelowej usuń kawałki pączka ogonowego z trypsyny/EDTA w jak najmniejszej objętości.</li>
		<li>Odpipetuj kawałki pączka ogonowego do pożywki w naczyniu do obrazowania. Kilkakrotnie pipetuj kawałki w górę i w dół, aby je rozdzielić i zawiesić komórki w podłożu. Uważaj, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Sprawdź, czy pod mikroskopem nie ma grudek komórek i w razie potrzeby rozproszyj więcej.</li>
		<li>Pozostawić rozproszone komórki w zawiesinie do osadzenia się na szkle pokrytym fibronektyną1 przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj niewielką objętość dodatkowej pożywki L15 z surowicą do komórek przed rozpoczęciem obrazowania. Zachowaj ostrożność, aby nie zakłócić osiadłych komórek.</li>
	<li>Biorąc pod uwagę pytanie eksperymentalne, dodaj do kultury wszelkie dodatkowe lub farmakologiczne zabiegi.</li>
</ol>
3. Obrazowanie rozproszonych komórek PSM
<ol>
	<li>Ustaw miskę obrazowania w komorze temperaturowej w mikroskopie do obrazowania poklatkowego. Ustaw komorę Warnera na żądaną temperaturę eksperymentu. Pozostaw danie do zrównoważenia przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem akwizycji obrazu. W razie potrzeby sprawdź temperaturę za pomocą zewnętrznej sondy temperatury umieszczonej w naczyniu. UWAGA: Ze względu na związek między temperaturą a szybkością somitogenezy 21, stabilna kontrola temperatury jest niezbędna do dokładnych pomiarów okresu w pojedynczych komórkach PSM.</li>
	<li>Wykonaj test obrazów w kanale fluorescencji, aby sprawdzić, czy czas ekspozycji i wzmocnienie zapewniają duży zakres dynamiczny intensywności bez nasycenia, aby zapewnić dobry stosunek sygnału do poziomu szumów. Typowy obraz fluorescencyjny uzyskany z rozproszonych komórek wygenerowanych z naszych linii przy użyciu tego protokołu wymaga 400 ms i 40 ms dla obrazu w świetle przechodzącym za pomocą kamery EMCCD działającej ze wzmocnieniem EM 85. Ponadto wzmocnienie przedwzmacniacza i prędkość odczytu z kamery są również niezbędne, aby zmaksymalizować sygnał w stosunku do szumów.</li>
	<li>Korzystając z kanału światła przechodzącego, wybierz pola komórek do akwizycji poklatkowej.</li>
	<li>Uruchom protokół akwizycji poklatkowej przez żądany okres czasu.
	<ol>
		<li>Uzyskaj jeden obraz światła przechodzącego i jeden obraz fluorescencyjny na pole. UWAGA: Ustaw interwał między rundami akwizycji, który uchwyci dynamikę czasową bez fotowybielania w trakcie przedłużonego obrazowania lub wywoływania toksyczności w komórkach. Ten protokół wykorzystuje interwał 2-minutowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Od czasu do czasu sprawdzaj ustawienia poklatkowe podczas nagrywania, aby upewnić się, że komórki pozostają ostre, nie ma błędów oprogramowania lub sprzętu itp.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie obrazów pozyskanych filmów poklatkowych
<ol>
	<li>Otwórz plik filmowy dla pozyskanego pola w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu. UWAGA: Fidżi był używany do całego przetwarzania w tym protokole.
	<ol>
		<li>Podziel ramki światła przechodzącego i fluorescencji z jednego pola, aby utworzyć 2 stosy obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śledź pojedynczą komórkę w kanale światła przechodzącego.
	<ol>
		<li>Umieść okrągły obszar zainteresowania (ROI) wokół wybranej komórki w pierwszej klatce w kanale światła przechodzącego. UWAGA: Tylko komórki, które 1. są zdrowi na końcu nagrania, 2. Nie wychodź poza pole i 3. Nie wchodź w kontakt z innymi komórkami są śledzone.</li>
		<li>Zapisuj ROI co kilka klatek w menedżerze ROI. Śledź komórkę do ostatniej klatki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz intensywność za pomocą zapisanych zwrotów akcji w kanale fluorescencji.
	<ol>
		<li>Wybierz stos fluorescencji i z zapisanymi ROI użyj niestandardowej wtyczki interpolatora okręgu i makra, aby zmierzyć intensywność śledzonej komórki w czasie.</li>
		<li>Sprawdź ślad wyjściowy z makra. Jeśli ślad jakościowo ujmuje cechy fluorescencji poklatkowej, wyeksportuj wartości do arkusza programu Excel.</li>
		<li>Zapisz listę ROI dla komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz śledzenie w kanale transmisyjnym i pomiar w kanale fluorescencyjnym dla innych komórek w terenie.</li>
	<li>Powtórz wszystkie kroki dla dodatkowych pól z eksperymentu.</li>
</ol>

<ol><li>Cooke, J., Zeeman, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clock+and+wavefront+model+for+control+of+the+number+of+repeated+structures+during+animal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis.</a> J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).</li>
<li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+embryos+with+oscillations%3A+structure%2C+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139, 625-639 (2012).</li>
<li>Dequeant, M. L., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+patterning+of+the+vertebrate+embryonic+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis.</a> Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).</li>
<li>Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches in developmental biology.</a> Nat Rev Genet. 10, 517-530 (2009).</li>
<li>Oates, A. C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy%2FE%28spl%29-related+%28Her%29+genes+are+central+components+of+the+segmentation+oscillator+and+display+redundancy+with+the+Delta%2FNotch+signaling+pathway+in+the+formation+of+anterior+segmental+boundaries+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish.</a> Development. 129, 2929-2946 (2002).</li>
<li>Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinhibition+with+transcriptional+delay%3A+a+simple+mechanism+for+the+zebrafish+somitogenesis+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator.</a> Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).</li>
<li>Schroter, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segment+Number+and+Axial+Identity+in+a+Segmentation+Clock+Period+Mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant.</a> Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).</li>
<li>Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrony+dynamics+during+initiation%2C+failure%2C+and+rescue+of+the+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock.</a> Science. 317, 1911-1915 (2007).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+synchronizes+the+zebrafish+segmentation+clock+but+is+not+needed+to+create+somite+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries.</a> PLoS Genet. 4, e15(2008).</li>
<li>Herrgen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Coupling+Regulates+the+Period+of+the+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock.</a> Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).</li>
<li>Sawada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf%2FMAPK+signalling+is+a+crucial+positional+cue+in+somite+boundary+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation.</a> Development. 128, 4873-4880 (2001).</li>
<li>Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+the+tempo+in+development%3A+an+investigation+of+the+zebrafish+somite+clock+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism.</a> PLoS Biol. 5, e150(2007).</li>
<li>Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+embryo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development.</a> Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+expression+of+the+bHLH+factor+Hes1+regulated+by+a+negative+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.</a> Science. 298, 840-843 (2002).</li>
<li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).</li>
<li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+circadian+timing+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li>
<li>Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+reporting+of+circadian-regulated+gene+expression+by+luciferase+imaging+in+plants+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells.</a> Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).</li>
<li>Soroldoni, D., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+transgenic+reporters+of+the+vertebrate+embryo%27s+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Live transgenic reporters of the vertebrate embryo's Segmentation Clock.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).</li>
<li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock%3A+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).</li>
<li>Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+transgenesis+with+meganuclease+constructs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish.</a> Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).</li>
<li>Schroter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237, 545-553 (2008).</li>
<li>Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546, 153-172 (2009).</li>
<li>Mould, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+integrin+beta1+homologs+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio).</a> BMC Cell Biol. 7, 24(2006).</li>
<li>Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+ligand-binding+pocket+of+integrin+alpha5beta1+using+a+gain-of-function+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach.</a> Biochem J. 424, 179-189 (2009).</li>
<li>Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+fibronectin+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish.</a> Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).</li>
<li>Westerfield, M. In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li>
<li>Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+protocols+for+zebrafish+cell+lines%3A+maintenance+and+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection.</a> Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).</li>
<li>Carr, A. J., Whitmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single+light-responsive+clock+cells+reveals+fluctuating+free-running+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods.</a> Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).</li>
<li>Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+acts+directly+on+organs+and+cells+in+culture+to+set+the+vertebrate+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock.</a> Nature. 404, 87-91 (2000).</li>
<li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, DOI. 222-225 (1126).</li>
</ol>

Wkład autora: 
ABW opracowało i udoskonaliło protokoły dyspersji, hodowli, obrazowania i śledzenia komórek. DS wygenerował linie transgeniczne i nadzorował projekt poklatkowego mikroskopu fluorescencyjnego użytego w tym protokole. AO był pionierem wstępnych eksperymentów typu proof-of-principle, mających na celu dysocjację i obrazowanie komórek PSM w hodowli. JS napisał na Fidżi narzędzie wtyczki interpolatora okręgu, używane do pomiaru intensywności fluorescencji z filmów poklatkowych. ABW i ACO napisały manuskrypt.

Aby zbadać proces komórkowy, który zachodzi w trakcie rozwoju embrionalnego, biolodzy zazwyczaj stosują podejście w kontekście całego zarodka. Jednak, aby w pełni zrozumieć, jak zachowuje się pojedyncza komórka w ramach rozwojowych, bardzo korzystna jest również metoda badania i zaburzania pojedynczych komórek w izolacji. Generując rozproszone hodowle komórkowe PSM przy użyciu transgenicznych zarodków danio pręgowanego, dysponujemy teraz narzędziem do bezpośredniego badania autonomicznej natury komórek oscylacji genetycznych w zegarze segmentacyjnym w sposób ilościowy. Możliwe jest zmierzenie dynamiki oscylacji w naszym reporterze fluorescencyjnym w setkach komórek w różnych warunkach.
Obserwowany okres pojedynczych komórek w hodowli jest dłuższy niż okres somitogenezy w nienaruszonym zarodku. Obserwujemy, że nienaruszony eksplant PSM w hodowli wykazuje również wolniejsze oscylacje niż nienaruszony zarodek (dane nie pokazane), co sugeruje, że dłuższy okres obserwowany w izolowanych komórkach nie jest spowodowany po prostu uszkodzeniem w wyniku dyspersji. Zmienny okres i amplituda są obserwowane w większości naszych jednokomórkowych szeregów czasowych. Źródło tej zmienności jest nieznane, ale powinno ujawnić ważne szczegóły na temat obwodów zegara segmentacyjnego tworzących tempo.
Dzięki tej metodzie możemy badać genetyczne komponenty segmentacji na poziomie komórkowym i odpowiadać na pytania, które są trudne do zbadania w całym zarodku. Na przykład, poprzez kontrolowane dodawanie znanych cząsteczek sygnałowych znajdujących się w rozwijającym się zarodku do naszych kultur, możemy zbadać ich wpływ na pojedynczy oscylator komórkowy PSM w solidnym i powtarzalnym teście. Nasz system hodowli PSM otwiera drzwi do rygorystycznej oceny, jakie czynniki, pojedynczo lub w połączeniu, sprzyjają oscylacjom w tych komórkach, jakie czynniki hamują te oscylacje, a także do testowania wzajemnych oddziaływań między takimi cząsteczkami. Mając te narzędzia w ręku, dążymy do oceny istniejących modeli somitogenezy, które opierają się na opublikowanych danych na poziomie tkanki, a także do wykorzystania wyników w pojedynczych komórkach do generowania prognoz, które można przetestować na całym zarodku. 
Według naszej wiedzy jest to pierwszy protokół hodowli komórek pierwotnych danio pręgowanego do ostrego poklatkowego zapisu fluorescencji w pojedynczych komórkach; Dalszy rozwój i udoskonalanie tego protokołu jest bez wątpienia możliwe. Inne protokoły często wykorzystują zarodki danio pręgowanego do generowania stabilnych linii komórkowych, które mogą być transfekowane za pomocą reporterów i wykorzystywane do długoterminowego obrazowania 27-29. Podczas gdy stabilne linie są przydatne do obrazowania procesu, który nie jest związany z czasem rozwoju, takiego jak zegar okołodobowy, kwestia segmentacji embrionalnej wymaga natychmiastowego obrazowania, gdy komórki są jeszcze w swoim oscylacyjnym, progenitorowym stanie. Gdy komórki przestają oscylować, przyjmują zróżnicowany los komórki, a gdy znajdą się w tkance, zostaną włączone do somitu. Możliwe, że przy odpowiednim czynniku lub czynnikach obecnych in vitro moglibyśmy wygenerować podobne do PSM linie hodowli komórek danio pręgowanego, które pozostałyby oscylacyjne, umożliwiając znacznie długoterminowe obserwacje, wielokrotne sekwencyjne perturbacje lub wysokoprzepustowe badania przesiewowe.
Spodziewamy się, że ta metoda przygotowania pierwotnych kultur rozproszonych komórek do obrazowania poklatkowego dobrze nadaje się do badania dowolnego procesu komórkowego, który zachodzi w ramach rozwojowych, które nie są dostępne przy użyciu stabilnych linii komórkowych danio pręgowanego. Izolacja różnych typów komórek w różnych stadiach rozwojowych z odpowiednich transgenicznych linii reporterowych, albo poprzez rozwarstwienie, albo przez FACS po dysocjacji embrionalnej, może dostarczyć komórek wyjściowych. Może być wymagana pewna optymalizacja warunków hodowli, kierująca się embrionalnym pochodzeniem komórek. Łącząc ten elastyczny i czuły protokół z szybko rosnącą kolekcją transgenicznych linii do danio pręgowanego, mamy nadzieję ułatwić podejście do biologii rozwojowej in vitro , które jest komplementarne z klasycznymi metodami genetycznymi i embriologicznymi.

Okresowe tworzenie się segmentów wzdłuż osi ciała kręgowca, czyli somitogeneza, jest dowodem na oscylator przestrzenny i czasowy w rozwijającym się zarodku. Preferowany mechanizm kontrolujący somitogenezę jest koncepcyjnie opisany przez model "zegara i czoła fali" 1, w którym "zegar" składający się z oscylatorów komórkowych, obecnie uważany za napędzany wewnątrzkomórkowo przez rytmiczną ekspresję zestawu cyklicznych genów2, odmierza powstawanie somitów z mezorynki presomitycznej (PSM). W miarę rozwoju zarodka dojrzewający "czoło fali" w PSM porusza się wraz z cofającą się tkanką w kierunku tylnym, spowalniając i zatrzymując oscylatory komórkowe podczas przechodzenia 3. Razem ten przestrzenno-czasowo dynamiczny system nazywany jest zegarem segmentacyjnym. Obecne podejścia do badania zegara segmentacji obejmują trzy rosnące poziomy organizacji, od oscylatora genetycznego w pojedynczych komórkach do lokalnego sprzężenia, które zachodzi między komórkami i wreszcie do globalnej regulacji informacji o położeniu w zbiorowej tkance PSM 4.
Poprzednie badania sugerują, że autonomiczny oscylator segmentacji komórek u danio pręgowanego składa się z genów i produktów białkowych z rodziny czynników transkrypcyjnych her/hes, które uważa się za tworzące pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego poprzez represję transkrypcyjną 5-7. Szlak sygnałowy Delta/Notch synchronizuje oscylacje między sąsiednimi komórkami i reguluje zbiorowy okres populacji 8-10. Cząsteczki sygnałowe Fgf wytwarzane w pąku ogonowym wydają się tworzyć gradient w poprzek PSM danio pręgowanego, a zatem przypuszcza się, że przyczyniają się do spowolnienia i zatrzymania oscylujących komórek w przedniej części 11. Do tej pory funkcjonalne role każdej z tych cząsteczek w somitogenezie były badane przez mutację genetyczną, wstrzyknięcie morfolinu, nadmierną ekspresję szoku cieplnego i antagonistyczne traktowanie lekami składników zegara i sygnalizacji między komórkami5,7,10,12 . Korzystając z tych perturbacji, funkcja zegara segmentacji została wywnioskowana z opisów defektów somitów na poziomie tkanek i utraty jednolitych oscylacji w ekspresji cyklicznych genów, takich jak her1, her7 i deltaC. Jednak prawie wszystkie te dane pochodzą z utrwalonych zarodków i nie są w stanie dokładnie uchwycić zmian, które są nieodłącznie związane z dynamiczną funkcją zegara segmentacyjnego. Niedawno obrazowanie poklatkowe wielu zarodków ujawniło pierwsze mutanty ze zmienionym okresem oscylacji, ale obserwacje te przeprowadzono również na poziomie tkanek 7,13 . W związku z tym nie zaobserwowano zachowania hipotetycznego oscylatora autonomicznego komórki podczas somitogenezy.
Statyczne migawki somitogenezy dają niepełny obraz, ponieważ, z natury, proces ten jest napędzany przez system oscylacyjny. Wcześniejsze prace na komórkach myszy i kurcząt wykazały, że poziomy transkryptu i białka rosną i spadają, ale pobieranie próbek oscylacji co około 2 godziny co 30 lub 45 minut z konieczności ogranicza zebrane dane, a tym samym wnioski, które można wyciągnąć14,15 . Badania nad innymi oscylatorami biologicznymi, w szczególności zegarami okołodobowymi, przeniosły się z etapowych pomiarów ekspresji genów i białek do monitorowania w czasie rzeczywistym za pomocą reporterów fluorescencyjnych i bioluminescencyjnych 16,17. Narzędzia te są niezbędne do wykazania właściwości zegara pojedynczych komórek 18. Bioluminescencyjny reporter cyklicznego genu Hes1 został opracowany i pokrótce scharakteryzowany w pojedynczych mysich komórkach PSM 19. Średni okres i wariancja zostały obliczone dla niewielkiej liczby komórek, co pokazuje, że oscylacje utrzymują się przez kilka cykli in vitro. Jednak badania te nie dotyczyły ilościowo stabilności i odporności częstotliwości i amplitudy oscylatorów, tego, czy komórki mogą spontanicznie wchodzić lub wychodzić z oscylacji oraz w jaki sposób komórki utrzymują swoje relacje fazowe. Ponadto wpływ cząsteczek sygnałowych znajdujących się w zarodku na autonomiczny zegar komórkowy nie został bezpośrednio przetestowany. W związku z tym te podstawowe właściwości oscylatora jednokomórkowego pozostają całkowicie nieznane.
Niedawno opracowaliśmy transgeniczne linie ryb za pomocą rekombinacji BAC 20 do napędzania reporterów fluorescencji Wenus (YFP) o ekspresjiher1 30. Takie linie wykorzystują wskazówki regulacyjne nienaruszonego locus chromosomowego, w którym są osadzone, i podsumowują dynamikę czasową i wzorzec przestrzenny her1. To przełomowe odkrycie pozwala na monitorowanie w czasie rzeczywistym ekspresji genów w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego in vivo. Aby zbadać podstawowe właściwości autonomicznych oscylacji komórkowych i sposób, w jaki taka ekspresja jest regulowana w czasie, opracowaliśmy niedawno niezawodną metodę izolowania i rejestrowania z komórek PSM in vitro. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystaliśmy nasze transgeniczne linie reporterowe do generowania rozproszonych kultur komórkowych, na podstawie których możemy scharakteryzować oscylacje zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach. W ten sposób możemy zająć się nierozstrzygniętymi kwestiami w tej dziedzinie, które nie były dostępne za pomocą analizy statycznej lub na poziomie tkankowym, a także bezpośrednio manipulować zegarem segmentacji na poziomie pojedynczej komórki za pomocą cząsteczek sygnałowych i inhibitorów.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>Model: SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>X-cite Illumination</td><td>Series: 120Q</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>Model: SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce drobnoziarniste nr 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety transferowe</td><td>Assistent</td><td>567/2</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petriego 35 mm Plastikowe szalki Petriego 35 mm</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Polimer</td><td>Greiner</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>SASCO</td><td>266727</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia manipulacyjne</td><td>Wykonane we własnym</td><td></td> zakresie <td>Opis narzędzi manipulacyjnych Ref. 22</td></tr><tr><td>Nóż mikrochirurgiczny</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>L15 medium</td><td>Invitrogen</td><td>57322</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomiocyna</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Invitrogen</td><td>257322</td><td></td></tr><tr><td>0,05% trypsyny / 0,02% EDTA</td><td>PAA</td><td>L11-004</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do ładowania żelem</td><td>Fisher Scientific</td><td>253188</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>254589</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mikropipet</td><td>Gilson International</td><td>F167300</td><td></td></tr><tr><td>Danio pręgowany Fibronektyna1 70 kD fragment</td><td>MPI-CBG</td><td></td><td>białko Wygenerowane we własnym zakresie na podstawie konstruktu na podstawie wcześniej opublikowanej pracy Ref. 23-25</td></tr><tr><td>Naczynia do obrazowania ze szklanym dnem</td><td>Mattek (pojedyncza studzienka)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do obrazowania ze szklanym dnem</td><td>Greiner (CellView -multi-well)</td><td>262502</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże E3 bez błękitu metylenowego</td><td>Wykonane we własnym zakresie</td><td></td><td>z książki Zebrafish, 5th Ed. Ref. 26 </td></tr><tr><td>Plastikowe pipety transferowe</td><td>Ratiolab</td><td>260011</td><td></td></tr><tr><td>Komora grzewczo-chłodząca Warner</td> Kamera <td>EM-CCD Warner Instruments</td><td>TC-324B/344B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Model</td>: <td>iXOn 888</td><td></td></tr><tr><td>Szerokokątny mikroskop fluorescencyjny z zestawem</td> <td>filtrów VenusModel Zeiss</td><td>: Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny szerokokątny z zestawem filtrów Venus</td><td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td><td></td>Mikroskop fluorescencyjny szerokokątny z zestawem filtrów Venus Lumencor Light Engine Model: Spectra X Mikroskop fluorescencyjny szerokokątny z zestawem filtrów Venus BrightLine HC 575/15 F39-575 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentacja to okresowy i sekwencyjny proces morfogenetyczny u kręgowców. To rytmiczne tworzenie się bloków tkanki zwanych somitami wzdłuż osi ciała jest dowodem na istnienie genetycznego oscylatora kształtującego rozwijający się zarodek. U danio pręgowanego segmentacja napędzająca zegar wewnątrzkomórkowy składa się z członków rodziny czynników transkrypcyjnych Her/Hes zorganizowanych w pętle ujemnego sprzężenia zwrotnego. Niedawno wygenerowaliśmy transgeniczne fluorescencyjne linie reporterowe dla cyklicznego genu her1, które podsumowują czasoprzestrzenny wzorzec oscylacji w mezodermie presomitycznej (PSM). Korzystając z tych linii, opracowaliśmy system hodowli in vitro, który umożliwia analizę w czasie rzeczywistym oscylacji zegara segmentacyjnego w pojedynczych, izolowanych komórkach PSM. Usuwając tkankę PSM z transgenicznych embrionów, a następnie rozpraszając komórki z oscylujących obszarów na naczyniach ze szklanym dnem, uzyskaliśmy kultury nadające się do obrazowania poklatkowego sygnału fluorescencji z poszczególnych komórek zegara. Podejście to zapewnia eksperymentalne i koncepcyjne ramy do bezpośredniej manipulacji zegarem segmentacyjnym z bezprecedensową rozdzielczością pojedynczej komórki, umożliwiając rozróżnienie i przeanalizowanie jego właściwości autonomicznych komórek i na poziomie tkankowym.

Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie kultur żywotnych, rozproszonych, pojedynczych komórek PSM do obrazowania sygnału fluorescencyjnego w trybie time-lapse (Rysunek 2). Nasz transgen generuje reporter, którego cykl produkcji i degradacji przebiega z dynamiką zbliżoną do endogennego genu i białka w embrionie, w skali około pół godziny. Ze względu na szybki obrót, sygnał YFP w pojedynczych komórkach należy wykrywać szybko, aby zminimalizować fotobleaching, oraz z wysoką rozdzielczością czasową, aby uchwycić cechy każdego cyklu oscylacyjnego. Ponadto, biorąc pod uwagę relatywnie słabą intensywność sygnału, warunki hodowli i akwizycji zostały starannie zoptymalizowane w celu zapewnienia czułych i wiarygodnych wyników. Stwierdzono, że następujące czynniki są istotne dla uzyskania optymalnych kultur komórek PSM do obrazowania: 1. Podłoże ECM stosowane do powlekania szalek hodowlanych z szklanym dnem. 2. Dodatek surowicy do medium do sekcji i obrazowania. 3. Sekcja PSM z wyselekcjonowanych embrionów uzyskanych po krzyżowaniu par heterozygotycznych, których potomstwo potencjalnie posiada 2 kopie transgenu. 4. Akwizycja obrazów w optymalnym zakresie powiększenia, z użyciem obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej (NA), aby zapewnić wydajny zapis sygnału fluorescencyjnego. 5. Oświetlenie za pomocą stałego źródła światła (solid-state), aby zminimalizować fluktuacje intensywności, które mogłyby zwiększyć szum tła. 6. Detekcja sygnału za pomocą wysokoczułej kamery EM-CCD w celu maksymalizacji odczytu sygnału.
Kultury o suboptymalnych parametrach zawierają komórki, które nie zachowują okrągłego kształtu i dobrej kondycji przez cały czas rejestracji. Postawiliśmy hipotezę, że nasze podłoże ECM, będące fragmentem fibronektyny 1 rybki danio-pręgowanej, utrzymuje komórki w nieróżnicowanym stanie przypominającym PSM, w porównaniu do innych powszechnie stosowanych podłoży, takich jak poli-lizyna czy laminina. Inne testowane przez nas podłoża powodowały spłaszczanie się komórek na szkle oraz utratę oscylującego sygnału fluorescencji w trakcie rejestracji. Stwierdziliśmy również, że dodatek surowicy do medium podczas sekcji, dyspersji i rejestracji był nie tylko istotny dla neutralizacji trypsyny użytej do dysocjacji, ale także zwiększał intensywność fluorescencji względem tła, prawdopodobnie dzięki poprawie żywotności komórek. Aby zapewnić optymalne przechwytywanie sygnału z pojedynczych komórek, zastosowaliśmy obiektyw 40x o wysokiej aperturze numerycznej (NA), zaprojektowany specjalnie do obrazowania fluorescencyjnego (seria Zeiss Plan NeoFluor). Odnotowaliśmy również, że źródło światła w stanie stałym zapewnia stabilniejsze oświetlenie niż tradycyjne lampy rtęciowe, co jest kluczowe dla zminimalizowania fluktuacji tła przyczyniających się do szumów na obrazach. Modyfikacje te są istotne dla zapewnienia wiarygodnych wyników.
Stosując ten protokół, spodziewamy się kultur, w których większość komórek w danym polu widzenia wykazuje fluorescencję w pewnym momencie rejestracji. Zaobserwowaliśmy, że komórki fluorescencyjne zazwyczaj pozostają zaokrąglone i bywają dość ruchliwe podczas nagrań. Kilka komórek, w tym komórki fluorescencyjne, może przejść w stan apoptozy w trakcie rejestracji. Komórki te są wykluczane z jakiejkolwiek analizy. Wykluczamy również komórki, które wchodzą w kontakt z innymi komórkami lub przesuwają się poza pole widzenia. Średnio obserwujemy 12% redukcję liczby komórek na pole widzenia do końca 10-godzinnej rejestracji, co określono poprzez zliczenie liczby zdrowych komórek w kanale światła przechodzącego. Strata ta obejmuje zarówno śmierć komórek, jak i komórki, które opuściły pole widzenia. Biorąc pod uwagę te zastrzeżenia, możemy średnio śledzić 5 komórek fluorescencyjnych na pole widzenia, które pozostają żywotne i widoczne, a zazwyczaj rejestrujemy 6 pól na warunek. Na przykład eksperyment z 4 warunkami obejmie pozyskanie łącznie 24 pól i zazwyczaj około 30 śledzonych komórek na warunek. W standardowych warunkach obrazowania z użyciem pożywki L15 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej stwierdzamy, że komórki PSM (n=101 komórek z 4 powtórzeń eksperymentalnych) mogą generować od 2 do 7 pików, przy średniej i odchyleniu standardowym wynoszącym 3±1 piki (2-3 cykle). Mediana liczby pików, jak również 25. percentyl, wynosi 2 piki, a 75. percentyl to 3 piki. Dzięki naszemu półautomatycznemu śledzeniu i analizie możemy szybko generować wykresy intensywności fluorescencji w czasie dla poszczególnych komórek PSM; reprezentatywny wykres dla jednej komórki przedstawiono na Rysunku 2C. Te surowe wykresy mogą być następnie wykorzystane do ilościowych pomiarów właściwości oscylujących komórek PSM, takich jak częstotliwość, amplituda, liczba cykli i czas wystąpienia pików.
<img alt="Schemat analizy fluorescencyjnej ekspresji genów; wzorowanie osiowe; schemat rozwoju zarodka danio pręgowanego." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Identyfikacja zarodków transgenicznych i schematy ich sekcji. (A) Widok boczny transgenicznego zarodka danio pręgowanego wykazującego fluorescencję YFP w stadium ok. 5 somytów. Obraz stanowi nałożenie kanału światła przechodzącego i kanału fluorescencji. Strzałki wskazują obszary sygnału rozpoczynające się od konca pączka ogonowego, przechodzące przez PSM, w kierunku ostatnio utworzonego somytu. Wstawka przedstawia schemat transgenu reporterowego (po więcej informacji na temat jego opracowania i zachowania in vivo patrz Soroldoni et al.30). (B) Schemat widoku bocznego zarodka przed pierwszym cięciem podczas sekcji. Czerwona przerywana linia wskazuje pierwsze cięcie wykonane w poprzek tylnego mózgu, tuż za pączkiem ogonowym na komórce żółtka. (C) Schematyczny widok spłaszczonego PSM po usunięciu ziarnistych struktur żółtka i warstwy naskórka, zorientowany wzdłuż osi przednio-tylnej. Czerwona przerywana linia wskazuje drugie cięcie służące do usunięcia konca pączka ogonowego w celu dyspersji i hodowli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Dynamika komórkowa z sygnalizacją fluorescencyjną; obrazy mikroskopowe i wykres intensywności; analiza time-lapse." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywne obrazy i przebiegi z pojedynczej komórki w rozproszonej kulturze PSM. (A) Montaż obrazów w świetle przechodzącym pojedynczej komórki PSM z 6-godzinnego zapisu time-lapse. Należy zauważyć, że komórka pozostaje okrągła i zdrowa przez cały czas trwania zapisu. (B) Odpowiadający mu montaż obrazów fluorescencyjnych pojedynczej komórki PSM. Szczyty intensywności w komórce są ponumerowane w trakcie trwania zapisu. (C) Średnia intensywność w czasie zmierzona z ROI umieszczonego na tej komórce. Wartości pobrano z każdej klatki filmu o częstotliwości jednej klatki co 2 min, przy użyciu wtyczki circle interpolator oraz własnego makra napisanego w Fiji. Szczyty intensywności są ponownie ponumerowane na całym przebiegu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Somitogeneza to rytmiczny proces rozwojowy, który przestrzennie kształtuje oś ciała zarodków kręgowców. Wcześniej opracowaliśmy transgeniczne linie ryb danio pręgowanego, które wykorzystują fluorescencyjne reportery do obserwacji cyklicznych genów napędzających ten proces. Tutaj hodujemy rozproszone komórki z tych linii i obrazujemy ich oscylacje w czasie in vitro.

Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie rozproszonych kultur do długoterminowego obrazowania oscylacji fluorescencyjnych reporterów cyklicznej ekspresji genów w pojedynczych, izolowanych komórkach zegara segmentacyjnego danio pręgowanego. Jest to realizowane poprzez wstępne wycięcie tkanki mezodermy presomitycznej lub PSM z transgenicznych embrionów danio pręgowanego. Następnie z wielu embrionów wycina się najbardziej tylną część PSM, czyli pączek ogonowy, a uzyskane fragmenty łączy się w trypsynie.Następnie fragmenty pączka ogonowego są ręcznie rozdzielane za pomocą pipety w celu przygotowania zawiesiny komórkowej. Na koniec zawiesinę komórkową wysiewa się na szalki hodowlane pokryte fibronektyną do długoterminowej analizy obrazowej. W rezultacie, dzięki mikro-skopii fluorescencyjnej z rejestracją czasową (time-lapse), można uzyskać wyniki wykazujące wielokrotne oscylacje intensywności sygnału w czasie w pojedynczych komórkach PSM.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hybrydyzacja in situ w celu analizy ekspresji genów w tkance PSM, jest to, że nasz reporter fluorescencyjny umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki oscylacji zegara segmentacyjnego na poziomie pojedynczych komórek. Metoda ta może dostarczyć unikalnych informacji na temat zegara segmentacyjnego, ale może być również stosowana w innych systemach, takich jak organogeneza czy modele chorób, gdzie może dostarczyć informacji o zachowaniu na poziomie pojedynczych komórek, pod warunkiem dostępności odpowiednich linii transgenicznych. Dzień przed sekcją pozyskaj embriony z krzyżówki par ryb zebrafish heterozygotycznych pod kątem allelu transgenicznego.Hoduj zarodki w medium E3 bez błękitu metylenowego w temperaturze 28 stopni Celsjusza aż do stadium tarczy, około sześciu godzin po zapłodnieniu (HPF), a następnie przenieś zarodki do medium E3 bez błękitu metylenowego w temperaturze 20 stopni Celsjusza na noc. Zarodki będą rozwijać się w tempie jednego somytu na godzinę. Po osiągnięciu stadium pąka ogonowego, na początku protokołu sekcji następnego ranka, zarodki powinny znajdować się w stadium od pięciu do ośmiu somytów. Po przygotowaniu narzędzi do sekcji pokryj szalkę obrazową z szklanym dnem substratem z fibronektyny I.Pozostaw płytkę na blacie w celu powlekania podczas sekcji pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Zidentyfikuj embriony transgeniczne, badając przedni brzeg mezodermy lub PSM. W celu stwierdzenia ekspresji YFP.Fluorescencja powinna być widoczna w obszarze od ostatniego powstałego somitu do pąka ogonowego. Należy wybrać zarodki z najsilniejszym sygnałem. Wykorzystując światło przechodzące jako punkt odniesienia dla pozycji, 25% potomstwa powinno stanowić zarodki homozygotyczne niosące dwie kopie transgenu.Aby odróżnić autofluorescencję, przenieś pozytywne embriony do oddzielnej plastikowej szalki Petriego zawierającej medium E3 bez błękitu metylenowego. W celu przygotowania embrionów do sekcji pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu precyzyjnej pęsety, ostrożnie usuń chorion z każdego embrionu w medium E3. Należy upewnić się, że embrion nie został uszkodzony, a komórka jajowa nie została naruszona.Napełnić szalkę sekcyjną powleczoną cyl guard pożywką L 15 z surowicą, używając pincety lub innego płaskiego narzędzia. Usunąć pęcherzyki powietrza z powierzchni S guard za pomocą wypalanej szklanej pipety. Przenieść powlekłe embriony do szalki sekcyjnej i za pomocą narzędzi drucianych przesunąć wszystkie embriony na jedną stronę.Następnie w małym zagłębieniu wykonanym w warstwie sardyn w naczyniu sekcyjnym ułóż pojedynczy embrion bokiem. Następnie za pomocą mikroskalpela przetnij embrion i komórkę żółtkową tuż przed tylnym mózgiem oraz przez biegun brzuszny embrionu. Usuń przednią część embrionu z zagłębienia, przesuwając ją na bok naczynia.Następnie za pomocą narzędzi drucianych zeskrobać pozostałe ziarna komórek żółtka z sekcji tylnej, w tym z PSM. Następnie spłaszczyć i zorientować PSM tak, aby koniec przedni był skierowany w stronę przeciwną, a koniec tylny do przodu. Jeśli cienka warstwa ektodermy nie oddzieliła się do tego momentu, użyć narzędzi drucianych, aby odłuszczyć ją z górnej części tkanki PSM; za pomocą mikroskalpela odciąć najbardziej tylną końcówkę PSM za końcem sznura niechordalnego lub pączka ogonowego od reszty tkanki.Przenieś fragment pączka ogonowego w jeden z narożników szalki, z dala od obszaru sekcji, a następnie za pomocą narzędzi drucianych usuń wszelkie zanieczyszczenia i niepotrzebne tkanki embrionalne z pola sekcyjnego. Pobierz fragmenty pączka ogonowego z wielu embrionów, w zależności od tego, ile komórek będzie wymaganych do eksperymentu. Średnio jeden fragment tkanki pączka ogonowego dostarcza 1000 komórek.Napełnij pustą 35 milimetrową plastikową szalkę niewielką objętością trypsyny z EDTA, a następnie za pomocą wypalanej szklanej pipety przenieś fragmenty pączka ogonowego do szalki. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej; podczas inkubacji tkanki w trypsynie, dodaj wodę Milli-Q do roztworu fibronektyny 1 w szalki obrazowej z szklanym dnem.Usunąć roztwór i trzykrotnie przemyć szkło wodą Milli Q. Każdą porcję wody przemywającej usunąć za pomocą ssawki i upewnić się, że naczynie jest całkowicie suche. Aby obrazować fragmenty pączka ogonowego, pipetować 100 µL medium L 15 z surowicą do naczynia do obrazowania.Używając powlekanej końcówki do żelu, przenieś fragmenty pączka ogonowego w jak najmniejszej objętości trypsyny z EDTA do naczynia do obrazowania. Pipetuj fragmenty wielokrotnie w górę i w dół, aby je rozdzielić i zawiesić komórki w pożywce. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.Pozostawić komórki na 20 minut w temperaturze pokojowej, aby osiadły na szkle powleczonym fibronektyną I. Po inkubacji dodać do komórek niewielką objętość dodatkowego medium L 15 z surowicą. Wykonać to przed rozpoczęciem obrazowania.Należy zachować ostrożność, aby nie zakłócić osiadłych komórek. Aby obrazować komórki, należy najpierw umieścić szalkę w komorze temperaturowej mikroskopu do obrazowania time-lapse.Ustaw pożądaną temperaturę i pozwól naczyniu na wyrównanie temperatury przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem akwizycji obrazów. Stabilna temperatura jest niezbędna do dokładnych pomiarów okresu. W pojedynczych komórkach PSM wykonaj testowe obrazy fluorescencyjne, aby sprawdzić ekspozycję.Czas i wzmocnienie. Zapewniają szeroki zakres dynamiczny intensywności bez nasycenia, co gwarantuje korzystny stosunek sygnału do szumu. Typowy obraz fluorescencyjny uzyskany z rozproszonych komórek pochodzących z naszych linii.Stosowanie niniejszego protokołu wymaga 400 milisekund i 40 milisekund dla obrazu w świetle przechodzącym przy użyciu kamery E-M-C-C-D pracującej z wzmocnieniem EM wynoszącym 85. Ponadto, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu w kanale światła przechodzącego, niezbędne jest odpowiednie ustawienie wzmocnienia przedwzmacniacza oraz prędkości odczytu z kamery; następnie należy wybrać pole komórek do akwizycji time-lapse. Należy przeprowadzić protokół akwizycji time-lapse, rejestrując jeden obraz w świetle przechodzącym i jeden obraz fluorescencyjny na pole w odstępach czasu, np. co dwie minuty, co pozwoli uchwycić dynamikę czasową bez powodowania fotowyblakania lub indukcji toksyczności w komórkach.Aby przetworzyć filmy z serii czasowej (time-lapse), otwórz plik i rozdziel klatki światła przechodzącego oraz fluorescencyjne, aby utworzyć dwa stosy obrazów. W celu śledzenia pojedynczej komórki w kanale światła przechodzącego, wybierz okrągły obszar zainteresowania (ROI) wokół komórki, która pozostawała zdrowa do końca rejestracji, nie przemieszczała się poza pole widzenia i nie miała kontaktu z innymi komórkami.Zapisuj ROI co kilka klatek w menedżerze ROI i śledź komórkę aż do ostatniej klatki. Wybierz stos fluorescencyjny i przy użyciu zapisanych ROI wykorzystaj niestandardowy plugin oraz makro INTERPOLATOR circle, aby zmierzyć intensywność śledzonej komórki w czasie. Sprawdź wygenerowany przez makro wykres, aby upewnić się, że jakościowo oddaje on cechy obrazowania fluorescencyjnego w czasie.Wyeksportuj wartości do arkusza programu Excel. Zapisz listę ROI dla komórki. Przedstawione tutaj obrazy są reprezentatywne dla pojedynczej komórki PSM w 10-godzinnym zapisie poklatkowym.Zastosowany tutaj transgen generuje reporter, którego cykl produkcji i degradacji przebiega z dynamiką i poziomami ekspresji zbliżonymi do endogennego genu i białka w embrionie, przy zastosowaniu standardowych warunków obrazowania w pożywce L 15 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej. Stwierdzono, że komórki PSM mogą wytworzyć od dwóch do siedmiu szczytów, przy średniej i odchyleniu standardowym wynoszącym 3 ± 1 szczyty. Mediana liczby szczytów, jak i percentyl 25%, wynosi dwa szczyty, natomiast percentyl 75% wynosi trzy szczyty.Dzięki zastosowaniu naszej półautomatycznej metody śledzenia i analizy możemy szybko generować przebiegi intensywności fluorescencji w czasie dla poszczególnych komórek PSM. Surowe przebiegi te mogą być następnie wykorzystane do ilościowych pomiarów właściwości oscylujących komórek PSM, takich jak amplituda częstotliwości, liczba cykli oraz czas wystąpienia szczytów. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak dodawanie cząsteczek sygnałowych lub inhibitorów, aby odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób oscylator pojedynczej komórki reaguje na czynniki obecne na zewnątrz w embrionie. Mamy nadzieję, że technika ta umożliwi badaczom w dziedzinie cementogenezy prostą analizę zachowania pojedynczych komórek zegara segmentacyjnego, oddzielając je od złożoności oddziaływań międzykomórkowych i czynników na poziomie tkankowym, co w nienaruszonym embrionie czyni to zadanie niezwykle trudnym.

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy przedsomitycznej dla obrazowania zegara segmentacji rybki zebra w pojedynczych komórkach

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Tutaj prezentujemy protokół 3-D hodowli tkankowej tylnej osi ciała danio pręgowanego, umożliwiający badanie segmentacji kręgowców na żywo. Ten model eksplantatu zapewnia kontrolę nad wydłużaniem osi, zmianą źródeł morfogenu i obrazowaniem na żywo na poziomie tkankowym w rozdzielczości subkomórkowej.

Trójwymiarowa hodowla eksplantatów ogonowych w celu zbadania segmentacji kręgowców u danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poznaj metodę generowania rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego na poziomie pojedynczych komórek.

Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach

Przeglądaj więcej filmów