Name: Obrazowa prędkość mikrocząstek do pomiarów profilu prędkości mikroprzepływów krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj mikro-PIV do pomiaru profilu prędkości przepływu krwi w mikrokanałach. Ta metoda umożliwia analizę charakterystyki przepływu, współczynnika ścinania i maksymalnej prędkości w warunkach kontrolowanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować NSERC (Kanadyjska Rada Nauk Przyrodniczych i Inżynierii) za dofinansowanie, Catherine Pagiatikis za pomoc w początkowych uruchomieniach, Surze Abu-Mallouh i Frederickowi Fahimowi za przetestowanie protokołu, Richardowi Prevostowi z LaVision, Inc za wsparcie techniczne, oraz Guyowi Cloutierowi z Uniwersytetu w Montrealu za wypożyczenie szybkiej kamery Dalsa.

1. Produkcja mikroprocesorów
Pierwszym krokiem jest stworzenie lub zakup swojego mikrokanału. Istnieje wiele opcji materiału mikroczipowego.
Jednym z najczęściej wybieranych materiałów jest poli(dimetylosiloksan) (PDMS). Istnieje wiele publikacji na temat kierunków wytwarzania PDMS za pomocą miękkiej litografii 16,17,18.
Po wyprodukowaniu kanału PDMS, dostępnych jest kilka metod obróbki powierzchni, które pozwalają odwrócić jego naturalną hydrofobowość. Częstą opcją jest leczenie plazmą natlenioną.
Zhou, Ellis, and Voelcker (2009) dają przegląd obróbki powierzchni i jej wpływu na PDMS. Wyniki te dotyczą jednak wody, a krew ma różne właściwości. Badanie nad tym, co ta obróbka powierzchniowa oznacza dla krwi, zostało przeprowadzone przez Pitts i in. (2012a).
Dla wyników przedstawionych tutaj, powierzchnie mikroczipów i szkiełka, do których były połączone, były wystawione na działanie natlenionej plazmy przez 45 sekund, a następnie mocno ściskane razem, co spowodowało trwałe połączenie.
2. Przygotowanie krwi
<ol>
	<li>Pobieraj próbki krwi z akredytowanej placówki. Na przykład krew świń może być stosowana z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) jako antykoagulant. Dodaj 1 g EDTA z 4 ml wody, a następnie dodaj roztwór do 1 l krwi pełnej, mieszając delikatnie 10x.</li>
</ol>
Podczas pobierania próbek krwi, pozwól im powoli schłodzić się do RT. Próbki krwi powinny być świeże i najlepiej używane w dniu ich pobrania, aby zachować właściwości reologiczne krwi.
Próbki mogą być raz schłodzone w temperaturze RT; jednak pełna krew bez antykoagulantu będzie bezużyteczna po schłodzeniu. W zależności od antykoagulantu, erytrocyty mogą być przechowywane w lodówce do 42 dni, a krew pełna może być przechowywana w lodówce przez 35 dni, ale zanieczyszczenie byłoby możliwe w placówce niemedycznej 21.
Dodatkowo, uważaj na metodę pobierania próbek bydła lub świń i unikaj zanieczyszczenia szpikiem kostnym.
<ol start="2">
	<li>Odwirować próbki krwi 3 razy z prędkością 3 000 obr./min przez 10 minut za każdym razem. Po pierwszym odwirowaniu usuń osocze i kożuch, wyrzuć. Na ogół najłatwiej jest najpierw usunąć osocze, a następnie wyrzucić lub zachować do wykorzystania w przyszłości, a następnie usunąć samą powłokę buffy.</li>
</ol>
Wprowadzaj pipetę powoli, aby nie mieszać kożucha z powrotem z krwią. Po usunięciu otoczki kożuchowej dodać około 20 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i delikatnie wymieszać, ponownie odwirować. Powtórz ostatni krok. Po trzecim odwirowaniu usuń PBS i pozostałą warstwę kożuchową, wyrzuć.
Możliwe jest również użycie natywnego osocza zamiast PBS, jeśli chcesz zachować właściwości agregujące krwi. Upewnij się, że nie mieszasz z osoczem żadnego kożucha ani białych krwinek.
<ol start="3">
	<li>Weź oczyszczone czerwone krwinki (RBC) i zawiesić w PBS lub osoczu w pożądanych stężeniach (hematokryty). Sprawdź hematokryt za pomocą mikrowirówki (CritSpin FisherSci, USA).</li>
</ol>
Krew o stężeniu od 10 do 20% hematokrytu powinna być łatwiejsza do wyobrażenia niż 40 czy 50% (hematokryt fizjologiczny). W mikrokrążeniu krew jest na ogół o połowę mniejsza od hematokrytu krążenia makro, więc H=20 jest odpowiednie 15.
<ol start="4">
	<li>Dodać fluorescencyjne cząstki znacznikowe o pożądanym stężeniu do próbek krwi. Ogólna zasada mówi, że w oknie korelacji znajduje się 10 cząstek, które można obliczyć z wyprzedzeniem.</li>
</ol>
Na przykład, 30 μl cząsteczek dodaje się do 1 ml roztworu krwi dla konfiguracji przedstawionej na filmie. Alternatywnie, same erytrocyty mogą być znakowane fluorescencyjnie.
<ol start="5">
	<li>Dodatkowo przygotuj roztwór kalibracyjny z wodą i cząstkami fluorescencyjnymi. Konieczna będzie kalibracja układu za pomocą rozwiązania newtonowskiego.</li>
</ol>
Na przykład, przy użyciu obiektywu 10X z kanałem w skali 100 μm, odpowiednim stężeniem jest 300 μl cząsteczek zmieszanych z 15 ml wody destylowanej. Inną opcją jest użycie glicerolu rozcieńczonego wodą destylowaną do lepkości 3cP, która jest bliższa makrolepkości krwi.
3. Pomiary μPIV
<ol>
	<li>Bezpieczeństwo lasera: Sprawdź temperaturę i wilgotność. Nosić odpowiednie okulary ochronne do lasera. Zamknij kurtynę laserową lub włącz znak laserowy na drzwiach laboratorium, aby zapobiec narażeniu osób, które nie są chronione.</li>
	<li>Procedura z oprogramowaniem Davis jest pokazana na filmie. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z instrukcją obsługi konkretnego systemu.</li>
	<li>Przed pobraniem danych skala kamery musi zostać skalibrowana za pomocą mikrometru.</li>
	<li>Aby zmniejszyć podatność systemu, należy użyć jak najkrótszej ilości rurki i najmniejszej sztywnej strzykawki, takiej jak strzykawka Hamilton Gastight o pojemności 15 lub 50 μl. Aby zmniejszyć wyciek krwi lub powietrza wlotowego do systemu, należy uszczelnić rurkę do strzykawki i do chipa. Można to zrobić za pomocą kleju, PDMS lub wazeliny (uważając, aby nie zanieczyścić krwi).</li>
</ol>
Aby napełnić mikrostrzykawkę wodą z cząsteczkami znacznika, użyj metody przepływu zwrotnego, ponieważ objętość mikrostrzykawki jest zwykle znacznie mniejsza niż objętość do napełnienia.
Nasza metoda przepływu zwrotnego polega na napełnieniu mikrostrzykawki i kanału razem przez wyjście kanału za pomocą dodatkowej plastikowej strzykawki. W tym celu najpierw wyjmij tłok mikrostrzykawki, a następnie wepchnij płyn za pomocą klasycznej plastikowej strzykawki przymocowanej do wylotu kanału, pozwól płynowi wypłynąć z mikrostrzykawki, aż wszystkie mikropęcherzyki wyjdą z mikrostrzykawki, rurki lub chipa, na koniec włóż tłok z powrotem i odłącz plastikową strzykawkę. Obecność lub brak mikropęcherzyków można zweryfikować pod mikroskopem.
<ol start="5">
	<li>Wypoziomuj pompę strzykawkową, aby uzyskać poziome rurki. Zaprogramuj pompę strzykawkową na żądane natężenie przepływu.</li>
</ol>
Bądź świadomy możliwych przejściowych efektów, takich jak "efekt wąskiego gardła", dla sztywnego systemu lub zgodności systemu, które modyfikują rzeczywiste natężenie przepływu. Czasy charakterystyczne systemu można oszacować jako funkcję materiałów i wymiarów systemu. (Rozdział 2, str. 77-81, Tabeling, 2005)
<ol start="6">
	<li>Umieść mikroczip na stoliku mikroskopu i uruchom pompę. Użyj wody z cząstkami, aby skalibrować system do średniego profilu prędkości i skalibrować dT (czas między impulsowymi obrazami).</li>
</ol>
Cząsteczki powinny poruszać się między 5 a 10 pikselami między klatkami, aby uzyskać dobrą korelację 11. Podczas kalibracji należy uważać, aby mierzyć w środku kanału. Płaszczyzna ostrości pośrodku ma największą prędkość 8.
Jeśli używasz okrągłego kanału, uważaj na efekty cieniowania.
Przykładowy obraz jest pokazany na rysunku 2, przy użyciu kamery pulsacyjnej, podczas gdy górny obraz to pierwszy impuls, a dolny obraz to drugi impuls. Na rysunku widać, że najjaśniejsze punkty (cząstki fluorescencyjne) są najbardziej ostre.
<ol start="7">
	<li>OPCJONALNIE: Pobierając dane na różnych wysokościach, można zrekonstruować profil prędkości 3D, dodając różne wektory do jednego obrazu. Film przedstawia rutynę, która została opracowana w celu automatyzacji procesu.</li>
	<li>Podczas pobierania danych z krwią należy napełnić strzykawkę żądaną ilością krwi w taki sam sposób jak wodę. Zaprogramuj pompę strzykawkową na żądane natężenie przepływu i zbierz żądane dane. Przykład uzyskanych obrazów surowych przedstawiono na rysunku 2. Uważaj również na sedymentację RBC. Napełnianie strzykawki co lub co drugi cykl zmniejszy osadzanie się krwinek czerwonych.</li>
	<li>Po uzyskaniu obrazów przeprowadzana jest korelacja krzyżowa na parach obrazów w celu uzyskania pól wektorowych prędkości między obrazami. Ważne jest, aby mieć dobre obrazy, aby mieć dobrą korelację. Przed korelacją można wykonać wstępne przetwarzanie w celu usunięcia szumu tła.</li>
</ol>
Korelacja krzyżowa odbywa się między oknami na sąsiednich obrazach, które mogą być zróżnicowane pod względem wielkości i kształtu, aby wpłynąć na korelację. Po korelacji krzyżowej można wykonać przetwarzanie końcowe obrazu w celu usunięcia błędnych wektorów lub wartości odstających.
Szczegółowy opis różnych dostępnych opcji i ich dokładności można znaleźć w Pitts et al. (2012b), gdzie najlepszym przetwarzaniem krwi okazała się metoda "nakładania obrazów" z oknami wydłużonymi i wyrównanymi z przepływem. Operacje te można wykonać ręcznie w programie takim jak MATLAB lub w pakiecie oprogramowania z systemem. Oprogramowanie nie jest ważne, ważniejsza jest matematyka stojąca za operacjami, a każda operacja może wpłynąć na dokładność końcowego profilu prędkości.
Wynikowe wektory mogą być uśrednione w przestrzeni w poprzek kanału, aby uzyskać profile prędkości chwilowej, a następnie ponownie uśrednione w czasie, aby uzyskać średni, reprezentatywny profil prędkości. Kloosterman i in. (2011) podają wyjaśnienie błędu w pomiarach μPIV, gdzie głębia ostrości jest duża. Dyskusje na temat błędu przetwarzania danych przedstawione tutaj można znaleźć w Pitts et al. (2012b) dla pomiarów pulsacyjnych oraz Chayer et al. (2012) dla pomiarów z dużą prędkością.
Przykłady profili prędkości są przedstawione na rysunkach 3 i 4. Rysunek 3 przedstawia pojedynczy profil prędkości dla linii środkowej przepływu RBC o prędkości 10 μl/h przy H=10 w kanale o szerokości 140 μm.
Ten pojedynczy profil uzyskuje się poprzez uśrednienie skorelowanych wektorów w kanale, aby uzyskać profil prędkości, a następnie uśrednienie w czasie, aby uzyskać reprezentatywny pomiar. W tym przypadku 100 par zostało uśrednionych w czasie w całym polu widzenia.
Przykład zrekonstruowanego profilu 3D wykonanego dla przepływu kalibracyjnego wody w kanale kwadratowym 100 μm z zaprogramowanym natężeniem przepływu 30 μl/h znajduje się na rysunku 4. Na rysunku 4 profile są mierzone w odstępach co 1 μm.
<ol start="10">
	<li>OPCJONALNIE: W przedstawionej konfiguracji można wykonywać zdjęcia z dużą prędkością w tych samych warunkach, przełączając kamery (i systemy akwizycji danych). Może to być przydatne do wizualizacji warstwy wolnej od komórek w kanale oraz do ilościowego określania agregacji. Analiza danych jest nieco inna (Chayer i in., 2012).</li>
</ol>
Przykłady obrazów światła białego z agregacją RBC i bez niej są przedstawione na rysunku 5 w H=20. Górne obrazy pokazują H=20 w PBS, co usuwa zdolność RBC do agregacji, przy 1 μl/h. Dolny obraz to H=20 w natywnym osoczu przy 0,5 μl/h. Na dolnym obrazie widoczna jest agregacja.
<ol start="11">
	<li>Wyłącz system w bezpieczny sposób po zakończeniu pomiarów. Stosuj odpowiednie procedury bezpieczeństwa lasera, dopóki źródło zasilania lasera nie zostanie całkowicie wyłączone.</li>
</ol>

<ol><li>Santiago, J. G., Wereley, S. T., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+particle+image+velocimetry+system+for+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">A particle image velocimetry system for microfluidics.</a> Experiments in Fluids. 25, 316-319 (1998).</li>
<li>Evaluation of Velocity Measurement in Micro Tube by Highly Accurate PIV Technique. Sugii, Y., Okamoto, K., Nishio, S., Nakano, A. 4th International Symposium on Particle Image Velocimetry (PIV '01), 17-19 Sept. 2001, , 1-5 (2001).</li>
<li>Park, J. S., Choi, C. K., Kihm, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sliced+micro-PIV+using+confocal+laser+scanning+microscopy+%28CLSM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Optically sliced micro-PIV using confocal laser scanning microscopy (CLSM).</a> Exp. Fluids. 37 (1), 105-119 (2004).</li>
<li>King, M. R., Bansal, D., Kim, M. B., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hematocrit+and+leukocyte+adherence+on+flow+direction+in+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+of+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">The effect of hematocrit and leukocyte adherence on flow direction in the microcirculation.</a> Ann. of Biomed. Eng. 32 (6), 803-814 (2004).</li>
<li>Lima, R., Wada, S., Tsubota, K., Yamaguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+micro-PIV+measurements+of+three-dimensional+profiles+of+cell+suspension+flow+in+a+square+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Meas.+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Confocal micro-PIV measurements of three-dimensional profiles of cell suspension flow in a square microchannel.</a> Meas. Sci. Tech. 17 (4), 797-808 (2006).</li>
<li>Wereley, S. T., Santiago, J. G., Chiu, R., Meinhart, C. D., Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-resolution+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Micro-+and+Nanofabricated+Structures+and+Devices+for+Biomedical+Environmental+Applications%22%5BJournal%5D)">Micro-resolution particle image velocimetry.</a> Micro- and Nanofabricated Structures and Devices for Biomedical Environmental Applications. 3258, 122-133 (1998).</li>
<li>Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Gray, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+illumination+for+two-dimensional+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Volume illumination for two-dimensional particle image velocimetry.</a> Measurement Science and Technology. 11, 809-814 (2000).</li>
<li>Chayer, B., Pitts, K. L., Cloutier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velocity+measurement+accuracy+in+optical+microhemodynamics%3A+experiment+and+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Measurement%22%5BJournal%5D)">Velocity measurement accuracy in optical microhemodynamics: experiment and simulation.</a> Physiological Measurement. , In Press (2012).</li>
<li>Tabeling, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTabeling%2C+P+%22Introduction+to+Microfluidics%22">Introduction to Microfluidics</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2005).</li>
<li>Olson, M. G., Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out-of-focus+effects+on+particle+image+visibility+and+correlation+in+microscopic+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">Out-of-focus effects on particle image visibility and correlation in microscopic particle image velocimetry.</a> Experiments in Fluids. 29, S166-S174 (2000).</li>
<li>Wereley, S. T., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+micro-particle+image+velocimetry+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Recent advances in micro-particle image velocimetry techniques.</a> Ann. Rev. Fluid Mech. 42, 557-576 (2010).</li>
<li>Williams, S. J., Park, C., Wereley, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+applications+on+microfluidic+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Advances and applications on microfluidic velocimetry.</a> Microfluid. Nanofluid. 8 (6), 709-726 (2010).</li>
<li>Chiu, J. J., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium%3A+Pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiol. Rev. 91 (1), 327-387 (2011).</li>
<li>Secomb, T. W., Pries, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microcirculation%3A+Physiology+at+the+mesoscale%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The microcirculation: Physiology at the mesoscale.</a> J. Physiol. 589 (5), 1047-1052 (2011).</li>
<li>Popel, A. S., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+and+hemorheology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechancis%22%5BJournal%5D)">Microcirculation and hemorheology.</a> Annual Review of Fluid Mechancis. 37, 43-69 (2005).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+England%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 37, 551-577 (1998).</li>
<li>Whitesides, G. M., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+methods+for+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Today%22%5BJournal%5D)">Flexible methods for microfluidics.</a> Physics Today. , 42-48 (2001).</li>
<li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+of+poly%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated of poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24, 3563-3576 (2003).</li>
<li>Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+PDMS+surface+modifications+for+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Recent developments in PDMS surface modifications for microfluidic devices.</a> Electrophoresis. 31, 2-16 (2009).</li>
<li>Pitts, K. L., Abu-Mallouh, S., Fenech, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+angle+study+of+blood+dilutions+on+common+microchip+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Contact angle study of blood dilutions on common microchip materials.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. , (2012).</li>
<li>Hovav, T., Yedgar, S., Manny, N., Barshtein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+red+blood+cell+aggregability+and+shape+during+blood+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Alteration of red blood cell aggregability and shape during blood storage.</a> Transfusion. 39, 277-281 (1999).</li>
<li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow%3A+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Measurement Science and Technology. 23, 105302(2012).</li>
<li>Kloosterman, A., Poelma, C., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+rate+estimation+in+large+depth-of-field+micro-PIV%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Flow rate estimation in large depth-of-field micro-PIV.</a> Exp. Fluids. 50 (6), 1587-1599 (2011).</li>
<li>Goldsmith, H. L., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 7, 213-247 (1975).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykorzystanie μPIV do pomiarów przepływu krwi w skali mikrokrążenia może dać wgląd w wiele istotnych procesów inżynierii biomedycznej, mechanicznej i chemicznej. Niektóre z kluczowych czynników, które należy wziąć pod uwagę, to gęstość samych erytrocytów, agregacja i odkształcalność erytrocytów, agregacja lub ruch fluoryzujących mikrocząstek oraz osadzanie się erytrocytów w kanałach. Wszystko to można uwzględnić, jeśli przestrzegane są ogólne wytyczne przedstawione powyżej. Istnieje podstawowa lista kontrolna, o której n...

Ciało ludzkie zawiera liczne naczynia o średnicy mniejszej niż 50 μm, które są głównym miejscem wymiany między krwią a tkankami. Badanie przepływu krwi w tych naczyniach stanowi spore wyzwanie zarówno ze względu na skalę pomiarów, jak i właściwości płynów krwi. Pomiary te, w tym gradient ciśnienia, ścinanie na ścianie oraz profile prędkości w tętniczkach i żyłkach, są kluczowymi czynnikami związanymi z reakcjami fizjologicznymi. Obecnie istnieją bezprecedensowe możliwości rozwiązania tych wyzwań pomiarowych dzięki nowym technikom eksperymentalnym w skali mikro w celu zbadania mikrokrążenia i rozwiązania tego wieloskalowego problemu.
Prędkość obrazowa mikrocząstek (μPIV) to technika wizualizacji przepływu oparta na cząstkach, która służy do oceny profili prędkości przepływu krwi w mikrokanałach poprzez korelację krzyżową. μPIV, po raz pierwszy opracowana przez Santiago et al., jest używana w badaniach hemorheologicznych od czasu, gdy Sugii et al. w 2001 roku wykorzystali tę technikę do pomiaru przepływu krwi w okrągłych szklanych rurkach o średnicy 100 μm 1,2. Istnieją różne podejścia do μPIV. Szybkie kamery mogą być używane do korelacji ruchu czerwonych krwinek (RBC), a obrazy pulsacyjne mogą być używane do korelacji ruchu cząstek znacznikowych. Każda z tych opcji może być sprzężona z mikroskopem pionowym lub odwróconym, w zależności od zastosowania. W obu przypadkach wynikiem jest profil prędkości 2D. Innym podejściem jest użycie mikroskopu konfokalnego w celu uzyskania profili 2D i 3D. Metodę tę zastosowano do krwi 3,4,5.
Mikroskalowy PIV ma kilka komplikacji w porównaniu z makro PIV. W skali makro PIV dane mogą być ograniczone do jednej płaszczyzny za pomocą arkuszy światła, ale w skali mikro oświetlenie objętościowe jest konieczne. Oświetlenie objętościowe stanowi większy problem w obrazowaniu mikroprzepływów krwi, ponieważ same erytrocyty są duże w porównaniu z kanałami, a użycie erytrocytów jako cząstek znacznikowych prowadzi do głębokości korelacji (DOC), co może znacznie zmniejszyć dokładność wyników korelacji krzyżowej 6,7,8. Podążając za Wereley i in. (1998), DOC dla kanału o wysokości 40 μm z RBC jako znacznikami wynosi 8,8 μm, podczas gdy dla cząstki znacznikowej 1 μm DOC wynosi 6,7 μm. Różnica ta staje się bardziej wyraźna przy zmianie wysokości i powiększenia kanału. Ponadto erytrocyty są nieprzezroczyste, a zwiększenie gęstości erytrocytów w przepływie powoduje trudności w obrazowaniu. Fluorescencyjne cząstki znacznikowe, po raz pierwszy użyte przez Santiago i in. (1998), były zalecane jako narzędzie do zmniejszania wpływu nieostrych cząstek, przy użyciu najmniejszych możliwych cząstek. Użycie mikrocząstek fluoryzujących o średnicy 1 μm w połączeniu z laserem jest jednym z podejść, które może zmniejszyć problem z głębią ostrości w obrazowaniu mikroprzepływu krwi 10. Istnieje kilka aktualnych przeglądów stanu technologii μPIV, z których każdy podkreśla znaczenie μPIV w badaniach przepływu krwi 11,12. Podczas stosowania μPIV we krwi należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii. Na poziomie mikro, skali mikrokrążenia, krwi nie można uznać za jednorodny płyn, ponieważ jest to zawiesina elastycznych czerwonych krwinek (RBC), dużych białych krwinek, płytek krwi i innych białek zawieszonych w płynie newtonowskim (osoczu).
Profile prędkości zmierzone tutaj mogą być użyte do zmierzenia pewnych cech mikroprzepływów krwi. Ważnymi czynnikami w mikrohemorheologii są szybkość przepływu krwi, kształt profilu prędkości oraz naprężenie ścinające na ścianie naczynia. Informacje te mają implikacje kliniczne, ponieważ mikrokrążenie jest miejscem wymiany składników odżywczych w organizmie, a wymiana ta jest zależna od ścinania. Obecnie istnieje również kilka badań przeglądowych dotyczących stanu badań nad mikrokrążeniem 13,14,15.
Prezentowany tutaj jest protokół do pomiarów μPIV przepływu krwi w mikrokanałach polidimetylosiloksanu (PDMS). Kanały PDMS zostały wyprodukowane wewnętrznie zgodnie ze źródłami w sekcji 1 protokołu. Próbki krwi świń pobrano z akredytowanej rzeźni i oczyszczono zgodnie z sekcją 2 protokołu. Wszystkie dane uzyskano przy użyciu systemu LaVision MITAS μPIV, zgodnie z opisem w punkcie 3 protokołu. Zestaw składa się z lasera Nd:YAG (New Wave Research, USA) i kamery CCD (Image Intense, Lavision) sterowanych przez programowalną jednostkę wyzwalającą, mikroskopu fluorescencyjnego sprzężonego ze stolikiem poruszającym się w 3 osiach oraz komputera, a także kamery o dużej prędkości (Dalsa 1M150, Holandia) do wizualizacji samych erytrocytów. Obie kamery są podłączone do 2-portowej skrzynki optycznej (Custom by Zeiss, Niemcy). W typowych pomiarach przepływu krwi in vivo do śledzenia samych erytrocytów używa się mikroskopu pionowego, natomiast w typowych zastosowaniach in vitro do śledzenia cząstek znacznikowych używa się mikroskopu odwróconego. W tej unikalnej podwójnej konfiguracji skrzynka optyczna umożliwia obrazowanie obu znaczników za pomocą odwróconego mikroskopu. Krew została wprowadzona do mikroczipów za pomocą precyzyjnej pompy strzykawkowej (Nexus3000, Chemyx Inc., USA). Schemat systemu pokazano na rysunku 1, gdzie górna część rysunku przedstawia prostokątne kanały o wymiarach 140 μm na 40 μm wykonane z PDMS, a dolna część przedstawia cały system, w tym obie kamery, laser, pompę strzykawkową i mikroskop.
Obecnie dostępne są konfiguracje μPIV, zwykle z zastrzeżonym oprogramowaniem, takie jak TSI, Dantec Dynamics i LaVision. Standardowe algorytmy korelacji krzyżowej można osiągnąć za pomocą wielu opcji oprogramowania, w tym MATLAB. Oprogramowanie nie jest kluczem, zrozumienie, czemu odpowiadają matematycznie okna dialogowe, będzie służyć użytkownikowi znacznie lepiej. W tym protokole wykorzystywane są DaVis, zastrzeżone oprogramowanie LaVision lub MATLAB. Protokół nie jest specyficzny dla oprogramowania, ale opcje menu mogą znajdować się w różnych miejscach w różnych pakietach oprogramowania.

<table><tbody><tr><td>poli(dimetylosiloksan) (PDMS), i.e. Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>buforowana sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>fluoryzujące mikrocząsteczki</td><td>Mikrogeniki/FisherSci</td><td>R900</td><td></td></tr><tr><td>glicerol (OPCJONALNIE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6279-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>mikrowirówka, i.e. strzykawka CritSpin</td><td>FisherSci</td><td>22-269-291</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. 50 &mu; l Gazoszczelna</td> kamera <td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. Imager Intense, szybki</td><td>mikroskop LaVision, mikroskop Dalsa</td><td>Imager Intensive</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. Nexus3000</td><td>Chemyx, Inc.</td><td>Przewód elastyczny Nexus-3000</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. Tygon</td><td>FisherSci</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie do przetwarzania danych, i.e. Wirówka DaVis</td><td></td><td>LaVision DaVis</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowa prędkość mikrocząstek do pomiarów profilu prędkości mikroprzepływów krwi

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Prędkość obrazowania mikrocząstek (μPIV) służy do wizualizacji sparowanych obrazów mikrocząstek zasianych w przepływach krwi. Obrazy są skorelowane krzyżowo, aby uzyskać dokładny profil prędkości. Przedstawiono protokół do pomiarów μPIV przepływów krwi w mikrokanałach. W skali mikrokrążenia krwi nie można uznać za płyn jednorodny, ponieważ jest to zawiesina elastycznych cząstek zawieszona w osoczu, płynie newtonowskim. Na podstawie tych pomiarów można uzyskać szybkość ścinania, prędkość maksymalną, kształt profilu prędkości i natężenie przepływu. Przedstawiono kilka kluczowych parametrów, takich jak głębokość ogniskowej, stężenie cząstek i zgodność systemu, w celu zapewnienia dokładnych, użytecznych danych wraz z przykładami i reprezentatywnymi wynikami dla różnych hematokrytów i warunków przepływu.

Na wszystkich rysunkach przepływ na surowych obrazach przebiega od lewej do prawej, a na obliczonych profilach prędkości – w górę. Przykład surowych danych uzyskanych dla krwi o hematokrycie H=10 płynącej z prędkością 10 μl/hr przedstawiono na Rysunku 2. Surowe dane mogą być poddawane korelacji wzajemnej bez żadnego przetwarzania wstępnego w celu uzyskania profili prędkości. Wpływ metod wstępnego i właściwego przetwarzania danych został omówiony przez Pitts, et al., (2012b). Przykład wynikającyc...

Prędkość obrazowania mikrocząstek (μPIV) służy do wizualizacji sparowanych obrazów mikrocząstek zasianych w przepływie krwi, które są skorelowane krzyżowo, aby uzyskać dokładny profil prędkości. Na podstawie tych pomiarów można uzyskać szybkość ścinania, prędkość maksymalną, kształt profilu prędkości i natężenie przepływu, z których każdy ma zastosowania kliniczne.

Obrazowa prędkość mikrocząstek do pomiarów profilu prędkości mikroprzepływów krwi

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar profilu prędkości roztworu krwi w mikrokanale przy użyciu symetrii obrazowania mikrocząsteczek LOC. Osiąga się to najpierw poprzez kalibrację układu za pomocą roztworu newtonowskiego w mikrokanale w celu ustawienia skali, dostrojenia obrazu, czasu oraz wyznaczenia płaszczyzny środkowej kanału. W drugim kroku do układu kanału wprowadza się roztwór krwi, upewniając się, że nie występują mikropęcherzyki powietrza.Następnie obrazuje się przepływ krwi w wybranych płaszczyznach kanału, wykorzystując pary obrazów z kamery impulsowej lub nagranie z kamery wysokiej rozdzielczości. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie korelacji wzajemnej między parami obrazów lub sekwencją wideo w celu uzyskania pola wektorów przemieszczeń wewnątrz kanału. Ostatecznie pole wektorów przemieszczeń można uśrednić w poprzek kanału oraz w czasie trwania pomiaru, aby uzyskać reprezentatywny profil prędkości.Profil ten może zostać poddany dalszej analizie lub wykorzystany do obliczeń. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomedycyny i biocieczy, takie jak kształt profilu prędkości oraz szybkość ścinania przy ścianie mikronaczyni. Zazwyczaj osoby ro

micro-particle-image-velocimetry-for-velocity-profile-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pomiar prędkości mikrocząstek dla pomiarów profilu prędkości w mikro krążeniu krwi

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Opisano system echoskopowej welocymetrii obrazowej cząstek (EPIV), który umożliwia pozyskiwanie dwuwymiarowych pól prędkości w płynach nieprzezroczystych optycznie lub przez geometrie nieprzezroczyste optycznie, oraz przedstawiono pomiary walidacyjne w przepływie w rurze.

Echo Particle Image Velocimetry

Procedura badania przepływów przejściowych w pobliżu granic za pomocą wysokiej rozdzielczości, szybkiej prędkości obrazowania cząstek (PIV) jest opisana tutaj. PIV to nieinwazyjna technika pomiarowa mająca zastosowanie do każdego optycznie dostępnego przepływu poprzez optymalizację kilku ograniczeń parametrów, takich jak właściwości obrazu i zapisu, właściwości arkusza laserowego i algorytmy analizy.

Szybkie obrazowanie cząstek w pobliżu powierzchni

Mikroskopia przyżyciowe może być używana u zwierząt do wizualizacji i pomiaru średnic naczyń krwionośnych siatkówki, prędkości przepływu krwi i całkowitego przepływu krwi w siatkówce.

Przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy

Protokół opisuje szczegółowo eksperymentalną procedurę ilościowego oznaczania agregatów krwinek czerwonych (RBC) pod kontrolowaną i stałą szybkością ścinania, w oparciu o techniki przetwarzania obrazu. Celem tego protokołu jest odniesienie rozmiarów agregatów RBC do odpowiedniej szybkości ścinania w kontrolowanym środowisku mikroprzepływowym.

Kontrolowane środowisko mikroprzepływowe do dynamicznego badania agregacji czerwonych krwinek

To badanie wprowadza nowatorską technikę pomiaru i analizy zmiennych prędkości mikrokrążenia krwi w jednym eksperymencie przy użyciu laserowego obrazowania kontrastowego plamek.

Nowatorskie podejście do przezwyciężania artefaktów ruchowych przy użyciu laserowego systemu obrazowania z kontrastem plamkowym do zmiany prędkości mikrokrążenia krwi

Eksperymentalnie dostępna analogowa metoda badania molekularnych procesów hydrodynamicznych w gęstych płynach jest prezentowana. Technika ta wykorzystuje obrazowanie prędkości cząstek wibrujących pryzm zboża o wysokiej restytucji i umożliwia bezpośrednią, makroskopową obserwację procesów dynamicznych, o których wiadomo i przewiduje się, że zachodzą w silnie oddziałujących gazach i cieczach o dużej gęstości.

Analogowa technika makroskopowa do badania molekularnych procesów hydrodynamicznych w gęstych gazach i cieczach

Technika opisana tutaj oferuje tanią i stosunkowo prostą metodę jednoczesnego pomiaru kinematyki cząstek i turbulencji w przepływach o niskich stężeniach cząstek. Turbulencje są mierzone za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV), a kinematyka cząstek jest obliczana na podstawie obrazów uzyskanych za pomocą szybkiej kamery w nakładającym się polu widzenia.

Jednoczesny pomiar turbulencji i kinematyki cząstek z wykorzystaniem technik obrazowania przepływowego

Tutaj prezentujemy uproszczone metody wytwarzania przezroczystych fantomów nerwowo-naczyniowych i charakteryzowania przepływu w nich. Zwracamy uwagę na kilka ważnych parametrów i pokazujemy ich związek z dokładnością pola.

Badania szybkościomierzy obrazu cząstek w mezoskali, przepływów nerwowo-naczyniowych in vitro

Aby określić ilościowo przepływ mikronaczyniowy na podstawie sekwencji obrazów przepływu kapilarnego o dużej prędkości, opracowaliśmy oprogramowanie STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Na całym polu obrazu i w czasie STAFF ocenia prędkości przepływu i generuje sekwencję oznaczonych kolorami map przestrzennych do wizualizacji i tabelarycznych danych wyjściowych do analiz ilościowych.

Przestrzenna analiza czasowa przepływu w terenie w mikrokrążeniu

Obecny protokół opisuje pomiary prędkości obrazu cząstek (PIV) wykonywane w celu zbadania przepływu zatokowego przez układ in vitro przezcewnikowej zastawki aortalnej (TAV). Określane są również parametry hemodynamiczne na podstawie prędkości.

Badanie hemodynamiki za pomocą wizji obrazu cząstek za pomocą fantomu aorty

Poznaj mikro-PIV do pomiaru profilu prędkości przepływu krwi w mikrokanałach. Ta metoda umożliwia analizę charakterystyki przepływu, współczynnika ścinania i maksymalnej prędkości w warunkach kontrolowanych.

Obrazowa prędkość mikrocząstek do pomiarów profilu prędkości mikroprzepływów krwi

Przeglądaj więcej filmów