Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja dynamiki wapnia bezpośrednio w świetle retikulum endoplazmatycznego żywych komórek. Osiąga się to poprzez transdukcję komórek za pomocą ukierunkowanego barwnika indukowanego esterazy lub konstruktu wektora TED w celu nadekspresji esterazy karboksowej CS dwa w retikulum endoplazmatycznym. Następnie komórki są inkubowane z estrem acetometylowym wapnia o wskaźniku grypy o pięć NA, który dyfunduje przez błony plazmy i ER.

Następnie esterazy karboksylowe odszczepiają się. Grupa estrowa uwalnia wskaźnik wrażliwy na wapń w er. Powstają kompleksy wapnia świetlnego i fluorescencyjnego.

Uzyskuje się wyniki, które pokazują zmiany w stężeniu wolnego wapnia w ER na podstawie obrazowania żywych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji homeostazy wapnia w komórkach. Sygnały wapniowe są najczęściej monitorowane w cytozolu, dlatego nie można łatwo odróżnić, gdzie wapń wpływa do cytozolu z przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub z wewnątrzkomórkowego magazynu wapnia ER.

Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy celowane pobieranie wywołane esterazyzą. Dzięki tej metodzie wapń uwalniany z ER jest bezpośrednio monitorowany. Podejście nie powoduje zakłóceń.

Błona plazmatyczna pozostaje nienaruszona, a wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne są zachowane. Ogólnie rzecz biorąc, osoby stosujące tę metodę będą miały trudności, ponieważ potrzebują doświadczenia. W wyrażeniu TED Vector opracowaliśmy konstrukty wektorowe wyrażające białko centowe połączone z karboksylazą CES dwa.

Dzięki temu możemy łatwo zidentyfikować komórki nadające się do obrazowania wapnia AR podczas eksperymentów, które będą komórkami charakteryzującymi się silną czerwoną fluorescencją i tylko umiarkowaną do silnej fluorescencją wskaźnika wapnia. Te fluorescencyjne znaczniki powinny być równomiernie rozmieszczone w siateczce endoplazmatycznej i nie występują w obszarze jądrowym. Przed rozpoczęciem.

Przygotuj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy lub płyn mózgowo-rdzeniowy A i grypę o pięć NAM zgodnie z protokołem tekstowym. Rozgrzej A CSF do temperatury pokojowej i dodaj głęboką glukozę, napowietrzaj A CSF karbogenem przez pięć minut. Następnie dodać jeden molowy roztwór podstawowy chlorku wapnia i chlorku magnezu do końcowych stężeń dwóch milimolowych każdy.

Po uruchomieniu mikroskopu do obrazowania na żywo i programu komputerowego rozpocznij obfitowanie w atrapie komory obrazowania i zrównoważ system probówek, rozgrzej wstępnie grzałkę roztworu w linii i komorę obrazowania na stoliku mikroskopu i zrównoważ system do 32 do 37 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem procedury pobierania w celu załadowania barwnika do komórek, dodaj 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanego CSF do jednej 0,5 mikrolitrowej porcji pięciomilimolowej grypy o pięciu NAM i rozpuścić roztwór w łaźni wodnej sonikować przez 90 sekund, przenieś 400 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu obrazowania do jednego dołka cztero- lub 24-dołkowej płytki. Dodaj roztwór D do tej samej studzienki, aby uzyskać 500 mikrolitrów roztworu o pięciu mikromolach.

Następnie ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami w studzience, inkubuj przez odpowiedni okres czasu: W inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza, czas ładowania DI i stężenie D zależą od typu komórki, gęstości komórek i specyficznych potrzeb eksperymentów. Długi czas inkubacji może uszkodzić komórki, zwłaszcza pierwotne niuanse i komórki glejowe, a to ma kluczowe znaczenie dla reakcji na bodźce fizjologiczne. Inkubacja trwająca dłużej niż 30 minut będzie przydatna tylko w eksperymentach lokalizacji wapnia ER w celu zbadania dystrybucji wapnia ER w małych mikrodomenach, na przykład MUE kolców Natychmiast po inkubacji przenieś szkiełko nakrywkowe do innej hodowli komórkowej, studzienki zawierającej roztwór do obrazowania.

Aby przygotować się do montażu komórek w komorze obrazowania, należy za pomocą pędzla nałożyć smar wysokopróżniowy na komorę obrazowania. Używamy samodzielnie wykonanych komór obrazowania do szkiełek nakrywkowych o średnicy od 10 do 12 milimetrów o małej objętości, co pozwala na uzyskanie wysokich prędkości perfuzji do 15-krotnej wymiany bufora na minutę. Podnieś szkiełko nakrywkowe z grypą i załadowanymi komórkami i dodaj małą kroplę roztworu do obrazowania, aby było mokre.

Następnie odwróć szkiełko nakrywkowe do góry nogami i zamontuj ogniwa w komorze obrazowania. Za pomocą bawełnianego wacika wciśnij szkiełko nakrywkowe w klej silikonowy i zetrzyj resztki buforu ze spodu szklanego szkiełka nakrywkowego. Następnie zamień atrapę komory obrazowania na eksperymentalną komorę obrazowania.

Myj komórki przez pięć do 10 minut przez ciągłą perfuzję w celu wyboru komórek. Użyj minimalnej ilości oświetlenia laserowego, aby zapobiec szybkiemu wybielaniu zdjęć grypy oh five i calcium two w ostrym dyżurze, wysokiej częstotliwości skanowania od dwóch do czterech herców, małego rozmiaru obrazu i wysokiego wzmocnienia ustawionego pod mikroskopem. Zgodnie z eksperymentem roślinnym.

Na początku eksperymentu należy udokumentować rozmieszczenie komórkowe znacznika grypy oh five i wapnia oraz czerwonej fluorescencyjnej etykiety konstruktu esterazy celowej czerwonego karboksu. W interesującej Cię komórce, reprezentatywne neurony o wysokiej rozdzielczości X, stosy obrazów YZ wykonują obrazowanie XYT w celu monitorowania dynamiki wapnia ER w określonych warunkach eksperymentalnych. Typowe ustawienia dla naszego systemu są wymienione w tabeli drugiej protokołu tekstowego Monitoruj zmiany wapnia ER pod wpływem ciągłej perfuzji z roztworem do obrazowania, szybkość wymiany buforu wynosi 1,5 mililitra na minutę dla mycia komórek i wyczerpania zapasów poprzez blokowanie wapnia retikulum endoplazmatycznego sarco, dwa TPA A i trzy mililitry na minutę dla stymulacji przez TP i DHPG oraz agonistę metabotropowego receptora glutaminianu.

Tutaj komórki glejowe są stymulowane 200 mikromolami A TP przez 10 sekund. Aby przetworzyć obrazy, otwórz stos obrazów w programie Image J do obrazowania wielokolorowego. Podziel kanały RBG, gdy zostaniesz o to poproszony przez oprogramowanie.

Zidentyfikuj obszary zainteresowania. W zależności od przeznaczenia narysuj obszary zainteresowania wokół całego ER lub małych regionów ER. Użyj wtyczki analizatora szeregów czasowych, aby odczytać średnią intensywność pikseli w obszarze zainteresowania.

Oblicz względne zmiany fluorescencji skorygowane tłem o deltę F nad zerem F, korzystając z tego wzoru. Przedstaw względne zmiany fluorescencji jako ślad z deltą F nad F zero dla osi Y i czasem dla osi x. Na tym rysunku astrocyty korowe komórek A i neurony hipokampa wyrażają czerwony fluorescencyjny wektor TED i są oznaczone wskaźnikiem wapnia o niskim powinowactwie.

Grypa o pięć N. Fluorescencyjny kompleks wskaźnikowy wapnia jest zlokalizowany w retikulum endoplazmatycznym wszystkich typów komórek. Ten rysunek przedstawia grypę o pięć komórek glejowych znakowanych N. Podczas leczenia CIN widoczne jest jasne znakowanie cytozolowe, jeśli błona plazmatyczna komórki jest uszkodzona zarówno przed, jak i po leczeniu CIN.

Ujawnia to, że grypa oh five N jest również uwalniana w cytozolu przez endogenne esterazy. W tym eksperymencie, po znakowaniu TED grypą o pięć Ner niedobór wapnia w hodowanych neuronach hipokampa jest spowodowany przez kwas cyklonowy circa bloker. Zauważ, że ogromna zmiana średniej gęstości fluorescencji na obszar zainteresowania, którą obserwuje się tutaj, to seria poklatkowa z mysimi komórkami korowymi GL, które są stymulowane przez TP. Fluorescencja gwałtownie spada i odzyskuje równowagę, co oznacza uwalnianie i uzupełnianie wapnia ER Jednocześnie fluorescencja białka czerwonej fluorescencji nieznacznie spada w wyniku wykresów bielenia łupków pokazujących zmianę intensywności fluorescencji w czasie w niektórych, ale nie wszystkich eksperymentach.

Wartości fluorescencji nie wracają do początkowych poziomów intensywności fluorescencji, ponieważ niektóre kompleksy N grypy lub pięciu N są tracone podczas stymulacji. Ten film pokazuje karboksylazę dwie zakażone komórką BHK 21 w wysokiej rozdzielczości znakowane przez grypę lub pięć kompleksów wapniowych N i stymulowane TP. Należy zauważyć, że wywołane przez TP uwalnianie wapnia i uzupełnianie zapasu wapnia ER jest wizualizowane w drobnych strukturach kanalików ER. Podczas tej procedury należy pamiętać, że tylko całkowicie zdrowe komórki wykazują fizjologiczne reakcje wapniowe.

Dlatego zalecamy wykonanie serii powiązanych ze sobą eksperymentów homeostazy wapnia w ciągu jednego dnia na tej samej partii komórek. Z naszego doświadczenia wynika, że najlepiej działa grypa barwnikowa pięciu N, ale ten wskaźnik wapnia nie jest bardzo odporny na naruszenia. W związku z tym metoda ta skorzysta na opracowaniu bardziej odpornych na wybielanie wskaźników wapnia o niskim powinowactwie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować przejściowy wapń E za pomocą syntetycznych wskaźników wapnia o niskim powinowactwie. Wskaźniki te umożliwiają monitorowanie dynamiki wapnia z wysoką rozdzielczością czasową. Z tego powodu nasza metoda może być korzystna dla badania kaskad sygnalizacji wapniowej zaangażowanych w plastyczność synaptyczną oraz do monitorowania zmian homeostazy wapnia w modelach komórkowych chorób neurodegeneracyjnych.