Name: Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę TED do bezpośredniego obrazowania dynamiki wapnia w retikulum endoplazmatycznym żywych komórek. Technika ta umożliwia badanie sygnałowania wapniowego z wysoką rozdzielczością czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantami Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 i Friedrich-Baur-Stiftung. Chcielibyśmy podziękować Rogerowi Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego za dostarczenie nam Tag-RFP-T2. Dziękujemy Davidowi Baltimore'owi z California Institute of Technology w Pasadenie i Didierowi Trono z Uniwersytetu Genewskiego w Genewie za dostarczenie nam plazmidów lentiwirusowych FUGW i psPAX2/pMD2.G.

<ol><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+calcium+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li>
<li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59, 861-872 (2008).</li>
<li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+ER+calcium+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li>
<li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li>
<li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+Ca2%2B+from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li>
<li>Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On%2Foff-regulation+of+phospholipase+C-gamma+1-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Enzyme+Regulation%22%5BJournal%5D)">On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction.</a> Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+as+cellular+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRP channels as cellular sensors.</a> Nature. 426, 517-524 (2003).</li>
<li>Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIMulating+store-operated+Ca%282%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">STIMulating store-operated Ca(2+) entry.</a> Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).</li>
<li>Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+cellular+stress+through+STIM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sensing cellular stress through STIM proteins.</a> Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).</li>
<li>Erdmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61alpha+limits+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).</li>
<li>Schäuble, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP-mediated+closing+of+the+Sec61+channel+limits+Ca%282%2B%29+leakage+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER.</a> The EMBO Journal. , (2012).</li>
<li>Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+as+an+integrator+of+multiple+dendritic+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist+%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%2C+neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).</li>
<li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+compartments+serve+multiple+hippocampal+dendritic+spines+from+a+widespread+rather+than+a+local+store+of+recycling+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).</li>
<li>Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+endoplasmic+reticulum+controls+metabotropic+signaling+and+plasticity+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).</li>
<li>Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+network+of+endoplasmic+reticulum+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J. Vis. Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca%282%29%28%2B%29+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730(2011).</li>
<li>Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+forward+to+seeing+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking forward to seeing calcium.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).</li>
<li>Mank, M., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators.</a> Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+changes+in+free+Ca2%2B+concentration+in+the+endoplasmic+reticulum+of+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells.</a> The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).</li>
<li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li>
<li>Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+shuttling+between+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+underlying+Ca2%2B+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations.</a> EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).</li>
<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).</li>
<li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+in+situ+measurement+of+calcium+in+intracellular+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate-sensitive+stores+using+the+fluorescent+indicator+mag-fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).</li>
<li>Solovyova, N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+free+calcium+in+the+neuronal+endoplasmic+reticulum%3A+an+overview+of+modern+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).</li>
<li>Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+dynamics+in+the+lumen+of+the+endoplasmic+reticulum+in+sensory+neurons%3A+direct+visualization+of+Ca%282%2B%29-induced+Ca%282%2B%29+release+triggered+by+physiological+Ca%282%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry.</a> The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).</li>
<li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).</li>
<li>Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+R+%22Calcium+imaging+of+intracellular+organelles%3A+endoplasmic+reticulum%22">Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum</a>. 43, Humana Press. (2010).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5, 545-551 (2008).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zufferey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).</li>
<li>Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+dyes+enter+via+a+store-operated+calcium+channel+and+modify+calcium+signaling+of+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).</li>
<li>Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+R+%22Calcium+measurement+methods%22">Calcium measurement methods</a>. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+esterase-ester+pair+for+targeting+small+molecules+with+cellular+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).</li>
<li>Samtleben, S., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+direct+ER+calcium+imaging+with+targeted-estersase+induced+dye+loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading.</a> , In preparation (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zalety i wady metody TED zostały obszernie omówione w najnowszych publikacjach 34,35. W porównaniu z innymi metodami opisanymi powyżej, TED omija problem zakłócania i perfuzji komórek. Ponadto należy podkreślić dwa aspekty. Zasada TED do obrazowania wapnia ER wymaga (1.) ukierunkowanej ekspresji aktywnej karboksyloesterazy w świetle ER za pomocą konstruktów wektorowych TED oraz (2.) wydajnego i preferencyjnego uwalniania syntetycznych estrów AM barwników wapniowych o niskim powinowactwie w świetle ER.
	<p ...

Aby rozwiązać fizjologiczne reakcje wapniowe ER, opracowaliśmy nową strategię, aby poprawić wychwytywanie syntetycznych barwników wrażliwych na wapń w ER. Metoda ta umożliwia bezpośrednie, niezakłócające monitorowanie w czasie rzeczywistym wolnego wapnia ER w obecności wapnia zewnątrzkomórkowego.	
	Funkcja i sygnalizacja ER Calcium
	Sygnały wapniowe znajdują się w różnych typach komórek, np. komórkach mięśniowych, neuronach i komórkach glejowych, a ich funkcje wahają się od pośredniczenia w skurczu mięśni do udziału w transmisji synaptycznej w uczeniu się i pamięci 1,2. Zmiany w stężeniu wolnego wapnia są przedmiotem dużego zainteresowania naukowego, ponieważ wapń bierze udział w regulacji transkrypcji genów, proliferacji komórek, pobudliwości neuronów, śmierci komórki i innych zdarzeń sygnalizacji komórkowej 1-7. Wszystkie te komórkowe sygnały wapniowe są funkcjonalnie połączone i przyczyniają się do wewnątrzkomórkowej dynamiki magazynowania wapnia 8-10. 
	Wspólną cechą wszystkich sygnałów wapniowych jest przepływ wapnia między przestrzenią zewnątrzkomórkową, cytozolem i organellami, głównie ER i mitochondriami. Powoduje to dynamiczne zmiany stężenia wapnia w tych organellach, które są wyczuwane przez różne składniki sygnalizacyjne. Ogólnie rzecz biorąc, stężenie wapnia w ER waha się od 100 do 800 μM, w cytozolu stężenie wapnia jest bliskie 100 nM, aw przestrzeni zewnątrzkomórkowej stężenie wynosi około 1-2 mM. W związku z tym istnieje duża chemiczna siła napędowa przepływu wapnia w kierunku cytozolu 2,9,10.
	Najczęściej badane sygnały wapniowe pochodzące z ER zależą od stymulacji receptorów sprzężonych z białkiem G (GpcR), które następnie aktywują fosfolipazę C (PLC). PLC z kolei wytwarza 1,4,5-trifosforan inozytolu (IP3) 1. Po związaniu IP3 z jego receptorem (IP3-Rec, ryc. 1) w błonie ER, jony wapnia są uwalniane ze światła ER. Historycznie rzecz biorąc, uwalnianie wapnia z ER za pośrednictwem IP3 zostało po raz pierwszy - choć pośrednio - zmierzone w zrazikowanych komórkach trzustki przez Streba i wsp. w 1983 r. 11. Publikacja ta po raz pierwszy zasugerowała kaskadę sygnalizacyjną obejmującą acetylocholinę, fosfolipazę C i IP3. Ten sposób uwalniania wapnia jest ogólnie określany jako uwalnianie wapnia indukowane przez IP3 (IiCR) (ryc. 1). Zależna od kinazy aktywacja fosfolipazy Cγ przez receptorowe kinazy tyrozynowe łączy działanie czynników wzrostu i czynników neurotroficznych z sygnalizacją wapnia ER po podniesieniu IP3 12. Oprócz IiCR, w podwyższeniu stężenia wapnia może pośredniczyć jonotropowe wnikanie wapnia, na przykład przez kanały wapniowe bramkowane napięciem (CaV), a następnie indukowane wapniem uwalnianie wapnia (CiCR) przez receptory ryanodyny (RyR). IiCR i CiCR są fizjologicznie związane z wprowadzaniem wapnia przez magazyn (SOCE). SOCE obejmuje działanie STIM (cząsteczki oddziałującej ze zrębem), która jest czujnikiem uwalniania wapnia przez ER. Wykazano, że STIM stymuluje zewnątrzkomórkowe wnikanie wapnia przez przejściowe kanały potencjału receptora (Trp) 13, kanały wapniowe Orai 14, a nawet kanały wapniowe bramkowane napięciem 15 (ryc. 1). Utrata wapnia ER jest dynamicznie ratowana przez działanie ATPazy wapniowej retikulum sarko-endoplazmatycznego (SERCA), która aktywnie pompuje wapń z powrotem do ER. Zablokowanie SERCA za pomocą leków, takich jak thapsigargina, ujawnia ciągłą utratę wapnia ER do kompartmentu cytozolowego. Ten "wyciek" wapnia ER jest spowodowany przez wewnątrzbłonowe kompleksy porowe ER, takie jak kompleks białkowy Sec61 16,17 (ryc. 1).
	W 1998 roku Berridge opublikował model "neuron w modelu neuronu", który sugeruje zasadniczą fizjologiczną rolę ER w integracji neuronalnego wapnia 5. Model ten uwzględnia istnienie ciągłego systemu błon ER tworzącego wewnątrzkomórkowy "obraz" błony plazmatycznej neuronów 5. Twierdzono, że ten binarny system błon eukariotycznych jest podstawowym warunkiem wstępnym czasowej i przestrzennej integracji szybkich i wolnych sygnałów wapniowych w neuronach. Sygnały wapniowe, które występują jednocześnie lub później w różnych kolcach lub dendrytach tego samego neuronu, są przekazywane do somy lub jądra komórki za pośrednictwem ER, gdzie są sumowane 5,18. Wówczas ich suma może mieć wpływ na pobudliwość neuronu, regulację transkrypcji genów czy integrację kaskad sygnałowych. W ten sposób ER wspiera integrację sygnałów wapniowych. Jednym z warunków wstępnych tej koncepcji jest ciągłość ER w pojedynczej komórce, co zostało stwierdzone w kilku badaniach i które zostało udowodnione przynajmniej dla obszarów somato-dendrytycznych i krótkodystansowych projekcji aksonalnych 19-21. To, czy istnieje ciągłość ER w długich projekcjach aksonalnych, jest kwestią dyskusyjną.
	Strategie pomiaru przepływu wolnego wapnia przez błonę ER
	Sygnały wapniowe są najczęściej monitorowane w cytozolu 22,23. Dlatego nie można łatwo odróżnić, czy Ca2+ wpływa do cytozolu z zapasów zewnątrzkomórkowych czy wewnątrzkomórkowych 6,24. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano strategie metodologiczne bezpośredniego obrazowania wapnia ER. Podsumowując, stosowane są następujące strategie: (1) Genetycznie modyfikowane wskaźniki białkowe ukierunkowane na ER 25-27. Oparte na białku wskaźniki Ca2 + o niskim powinowactwie wykorzystują bioluminescencyjne białko aequorin lub GFP w połączeniu z białkiem wykrywającym wapń. Te genetycznie zmodyfikowane wskaźniki Ca2 + (GECI) mogą być kierowane do ER za pomocą peptydu sygnałowego i są aktywnie utrzymywane w ER za pomocą motywu retencji i odzyskiwania. Wspólne wskaźniki ER Ca2+ opierają się na zasadzie Cameleon i są to Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon podzielił YC7.3ER 29 i Cameleon D1 30. (2) Bezpośrednie obciążenie barwnikiem na bazie esterazy wskaźników Ca 2+ o niskim powinowactwie estru AM 31,32. Pochodne AM barwników wskaźnikowych (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM lub Fluo5N-AM) przechodzą przez błony biologiczne w stanie lipofilowym, niewrażliwym na wapń. Następnie w cytozolu, a także w ER, endogenne esterazy rozszczepiają grupę estrów AM i uwalniają wskaźnik Ca2+, pozostawiając pewną ilość aktywnego barwnika w cytozolu i ER. Dlatego podejście to jest przydatne w warunkach wysokiego stężenia wapnia w ER, o ile stężenie wapnia w cytozolu pozostaje znacznie poniżej granicy wykrywalności wskaźników niskiego powinowactwa, szczególnie podczas charakterystycznych sygnałów wapniowych (np. nM do niskiego μM). (3) Obciążenie estrem AM w połączeniu z przepuszczalnością błony plazmatycznej 32. Pozostały cytozolowy wskaźnik Ca2+ jest usuwany przez przenikanie błony plazmatycznej niewielkimi ilościami "łagodnego" detergentu (np. saponiny) w sztucznym buforze wewnątrzkomórkowym. W ten sposób błony wewnątrzkomórkowe mogą być stymulowane np. IP3 w buforze wewnątrzkomórkowym, bezpośrednio przez "pory" w błonie komórkowej. (4) Dializa cytozolu w konfiguracji całokomórkowej i jednoczesne pomiary Ca2+ w świetle ER i cytozolu 32,33. Komórka jest najpierw ładowana wskaźnikiem Ca2+ o niskim powinowactwie (np. Mag-Fura2-AM, ratiometryczny, światło UV). Następnie, za pomocą pipety punktowej, wszelkie pozostałe cytozolowe wskaźniki Ca2+ o niskim powinowactwie są dializowane z cytozolu za pomocą buforu zawierającego wskaźnik Ca2+ o wysokim powinowactwie (np. Fluo-3, światło widzialne). Strategia ta umożliwia jednoczesne rejestrowanie sygnałów pochodzących z cytozolu i ER. (5) Obciążenie barwnikiem wywołane celowaną esterazą 8,34. Karboksylesterazy (CES) jest ukierunkowana na światło ER i zapewnia wysoką aktywność esterazy w celu skutecznego wychwytywania formy estru AM wskaźników Ca2 + o niskim powinowactwie.
	Ładowanie barwnikiem wywołane przez celowaną esterazę (TED)
	Aby poprawić ukierunkowanie wskaźników Ca2+ o niskim powinowactwie do światła ER, stworzono TED. TED wymaga nadekspresji mysiej karboksyloesterazy ukierunkowanej na ER (CES2) (Figura 2), którą osiąga się za pomocą konstruktów ekspresji. Komórki wyrażające rekombinowany konstrukt CES inkubuje się z formą estru AM barwnika wskaźnikowego wapnia (Fluo5N-AM, ryc. 2). Następnie, w ER, barwnik jest przekształcany w wrażliwy naCa2+, nieprzepuszczalny dla błony kompleks wskaźnikowy Ca2+ (Fluo5N / Ca2+) przez wysoką aktywność esterazy, zatrzymując w ten sposób barwnik w wysokim stężeniu w świetle ER 8,34. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania uwalniania wapnia przez szlaki IiCR, na przykład przez receptory metabotropowe, purynergiczne lub glutaminianu 8,34 oraz do wizualizacji ubytku wapnia w ER bezpośrednio przez "kanały przeciekowe", na przykład po blokadzie SERCA 17,34. Z naszego doświadczenia wynika, że wskaźnik Ca2+ o niskim powinowactwie Fluo5N-AM jest obecnie najlepszym dostępnym wskaźnikiem do stosowania w strategii ładowania barwnikiem TED. Fluo5N-AM ma niskie powinowactwo do Ca2+ (stała dysocjacji KD ~ 90 μM, ryc. 2), jest prawie niefluorescencyjny w swojej postaci AM, ale zapewnia wysoką emisję fluorescencji po związaniu wapnia 8,34. Kompleks Fluo5N/Ca2+ może być wzbudzany standardowym źródłem światła o długości fali ~490 nm, co odpowiada standardowym barwnikom, takim jak FITC, Alexa 488 lub eGFP. Cytozolowe sygnały wapniowe ledwo osiągają stężenie w niskim zakresie μM i dlatego są ledwo wykrywane przez Fluo5N w cytozolu 35.
	Aby poprawić wydajność TED, opracowano kilka rekombinowanych konstrukcji wektorowych (Rysunek 3). Pierwotnie, wektory TED oparte na sekwencji kodowania CES2 (numer dostępu Refseq NM_145603, CES2c) i najlepsze wyniki TED są obserwowane przy stabilnej ekspresji konstrukcji CES. Nowe wektory TED wyrażają podstawowy element CES2 połączony z białkiem czerwonej fluorescencji TagRFP-T2 36. Wektory te mają tę zaletę, że mogą być wykorzystywane do identyfikacji transdukowanych komórek i do wykorzystania czerwonej fluorescencji jako wewnętrznej kontroli normalizacji zmian we fluorescencji Fluo5N / Ca2 +. Czerwona fluorescencja daje również możliwość wizualizacji strukturalnego rozkładu ER i zmian dynamiki ER w warunkach stymulacji.

<table><tbody><tr><td>(S)-3,5-DHPG (Dihydroksyfenyloglicyna)</td><td>Tocris</td><td>0805</td><td></td></tr><tr><td>5';-ATP-Na2, hydrat soli disodowej ATP</td> suplement <td>Sigma</td><td>A26209-1G</td><td></td></tr><tr><td>B-27, 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek karbamoylcholiny (Charbachol)</td><td>Sigma</td><td>C4382-1g</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cyklopiazonowy (CPA)</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-300</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z Glutamax</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS bez Ca/Mg 1x</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu; g</td><td>Invitrogen</td><td>F14204</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka składników odżywczych Ham's F12</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>Hank's BSS(1x) bez Ca, bez Mg, z czerwienią fenolową, HBSS</td><td>PAA Laboratories</td><td>H15-010</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>SHD3250YK</td><td>Linearis</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycyna Sól Ca2+</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-116</td><td></td></tr><tr><td>mysi suplement EGF </td><td>PreproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>N2 100x</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neurobazalne</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127, niska absorbancja UV, 2g</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-DL-ornityny PORN</td><td>Sigma</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005-1mg</td><td></td></tr><tr><td>TryLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Worthington</td><td>LS-003707</td><td></td></tr><tr><td>Trypsynininhibitor z Glycine MAX (soja)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>System konfokalny: odwrócony laserowy mikroskop skaningowy: FV1000 z konfiguracją IX81</td><td>Olympus</td><td></td><td>dostosowaną do potrzeb użytkownika</td></tr><tr><td>System konfokalny: sumator laserowy FV10 i lasery diodowe (405, 473, 559, 635)</td><td>Olympus</td><td></td><td>konfiguracja specyficzna dla użytkownika</td></tr><tr><td>System konfokalny: głowica skanująca FV10-SPD z wykrywaczem spektralnym</td><td>Konfiguracja specyficzna dla użytkownika</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik grzałki TC-344B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0101</td><td>do sterowania grzałką roztworu w linii</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td> <td>NIH ImageJWS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cel: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td><td>Olympus</td><td>N2709100</td><td></td></tr><tr><td>Cel: UPLFLN40XO</td><td>Olympus</td><td>N1478700</td><td></td></tr><tr><td>Cel: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td><td>Olympus</td><td>N1480700</td><td></td></tr><tr><td>Komora perfuzyjna, odwrócona</td> na <td>zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora perfuzyjna, RC-49FS</td><td>Warner Instruments</td><td>W4 64-1709</td><td></td></tr><tr><td>Rurka perfuzyjna: PT-49</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1730</td><td>do perfuzji</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna MiniPlus 3 (4 kanały)</td><td>Pompa perfuzyjna</td> <td>Gilson</td><td>n.a.</td></tr> <tr><td>Pojedyncza grzałka roztworu liniowego SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>sterowany sterownikiem grzałki</td></tr><tr><td>Rury ssące: ST3R</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1407</td><td>do perfuzji</td></tr><tr><td>Wkład grzewczy: Tempocontrol 37-2 cyfrowy 2-kanałowy</td><td>Pecon</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednie obrazowanie wapnia er z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (ted)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Wizualizacja dynamiki wapnia jest ważna dla zrozumienia roli wapnia w fizjologii komórki. Aby zbadać dynamikę wapnia, popularne stały się syntetyczne fluorescencyjne wskaźniki Ca2 +. Tutaj pokazujemy TED (= ładowanie barwnikiem indukowane przez celowaną esterazyzę), metodę poprawy uwalniania barwników wskaźnikowych Ca2 + w świetle ER różnych typów komórek. Do tej pory TED był stosowany w liniach komórkowych, komórkach glejowych i neuronach in vitro. TED opiera się na skutecznym, rekombinowanym kierowaniu wysokiej aktywności karboksyloesterazy do światła ER przy użyciu konstruktów wektorowych eksprymujących karboksylesterazy (CES). Najnowsze wektory TED zawierają rdzeń CES2 połączony z białkiem czerwonej fluorescencji, umożliwiając w ten sposób jednoczesne obrazowanie dwukolorowe. Dynamika wolnego wapnia w ER jest obrazowana w jednym kolorze, podczas gdy odpowiednia struktura ER jest wyświetlana na czerwono. Na początku zabiegu komórki są transdukowane lentiwirusem. Następnie zainfekowane komórki są umieszczane na szkiełkach nakrywkowych, aby ostatecznie umożliwić obrazowanie żywych komórek. Następnie żywe komórki są inkubowane z estrem acetoksymetylowym (ester AM) wskaźników Ca2+ o niskim powinowactwie, na przykład Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM lub Mag-Fura2-AM. Aktywność esterazy w ER odcina hydrofobowe łańcuchy boczne od formy AM wskaźnika Ca2 + i powstaje hydrofilowy kompleks barwnik fluorescencyjny / Ca2 + i jest uwięziony w świetle ER. Po załadowaniu barwnikiem komórki są analizowane w odwróconym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. Komórki są w sposób ciągły perfundowane roztworami podobnymi do Ringera, a dynamika wapnia w ER jest bezpośrednio wizualizowana za pomocą obrazowania poklatkowego. Uwalnianie wapnia z ER identyfikuje się jako spadek intensywności fluorescencji w obszarach zainteresowania, podczas gdy ponowne napełnienie magazynu wapnia ER powoduje wzrost intensywności fluorescencji. Wreszcie, zmianę intensywności fluorescencji w czasie określa się za pomocą obliczeń ΔF/F0.

Niniejszy protokół przedstawia nieinwazyjne podejście do bezpośredniego obrazowania wolnego wapnia w siateczce śródplazmatycznej (ER). Syntetyczne wskaźniki Ca2+ o niskim powinowactwie są uwalniane i zatrzymywane w świetle ER dzięki aktywności rekombinowanego enzymu esterazy skierowanego do ER. Poprawione ładowanie barwników wskaźnikowych Ca2+ do światła ER umożliwia bezpośrednie i szybkie obrazowanie dynamiki zapasów wapnia w ER.
Typy komórek do TED
<p class="jove_conte...

Ładowanie barwnikiem indukowane przez esterazy celowane (TED) wspiera analizę dynamiki wewnątrzkomórkowego magazynowania wapnia za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda opiera się na ukierunkowaniu rekombinowanej karboksylesterazy na retikulum endoplazmatyczne (ER), gdzie poprawia miejscowe demaskowanie syntetycznych barwników wskaźnikowych Ca2+ o niskim powinowactwie w świetle ER.

Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest bezpośrednia wizualizacja dynamiki wapnia w świetle retikulum endoplazmatycznego żywych komórek. Jest to osiągane poprzez transdukcję komórek konstruktem wektora TED (targeted esterase induced dye), w celu nadekspresji karboksyestrylazy CS2 w retikulum endoplazmatycznym. Następnie komórki inkubuje się z wskaźnikiem wapnia w formie octometylowego estru, Fluo-5 NAc, który dyfunduje przez błonę komórkową oraz błony ER.Następnie następuje odszczepienie przez esterazę karboksylową. Grupa estrowa uwalnia wskaźnik wrażliwy na wapń do światła siateczki śródplazmatycznej, w wyniku czego powstają fluorescencyjne kompleksy wapnia.Uzyskano wyniki wykazujące zmiany stężenia wolnego wapnia w ER na podstawie obrazowania żywych komórek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regulacji komórkowej homeostazy wapniowej. Sygnały wapniowe są najczęściej monitorowane w cytosolu, w związku z czym nie można łatwo rozróżnić, czy wapń napływa do cytosolu z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, czy z wewnątrzkomórkowych magazynów wapnia w ER.Aby pokonać to ograniczenie, opracowaliśmy ukierunkowane uwalnianie indukowane esterazą. Dzięki tej metodzie bezpośrednio monitoruje się wapń uwalniany z ER. Podejście to jest nieinwazyjne.Błona plazmatyczna pozostaje nienaruszona, a wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne zostają zachowane. Zazwyczaj osoby korzystające z tej metody będą napotykać trudności ze względu na wymagane doświadczenie. W ramach ekspresji wektora TED opracowaliśmy konstrukty wektorowe wykazujące ekspresję białka cent połączonego z karboksylazą CES dwa.Pozwala to na łatwą identyfikację komórek odpowiednich do obrazowania wapnia w AR podczas eksperymentów; będą to komórki charakteryzujące się silną czerwoną fluorescencją oraz umiarkowaną do silnej fluorescencją wskaźnika wapnia. Te znaczniki fluorescencyjne powinny być równomiernie rozmieszczone w całej siateczce śródplazmatycznej i nie powinny występować w obszarze jądra. Przed rozpoczęciem.Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) oraz NAM flu-oh-5 zgodnie z protokołem tekstowym. Podgrzać aCSF do temperatury pokojowej i dodać glukozę. Napowietrzyć aCSF karbogenem przez pięć minut. Następnie dodać 1 M roztwory stokowe chlorku wapnia i chlorku magnezu do stężeń końcowych wynoszących 2 mM dla każdego z nich.Po uruchomieniu mikroskopu do obrazowania na żywo oraz programu komputerowego, rozpocznij perfuzję w kontrolnej komorze obrazującej i wyrównaj ciśnienie w systemie rurek, wstępnie podgrzej przepływowy podgrzewacz roztworu oraz komorę obrazującą na stoliku mikroskopu i ustabilizuj temperaturę systemu w zakresie od 32 do 37 °C. Przed rozpoczęciem procedury ładowania barwnika do komórek, dodaj 100 µL wstępnie podgrzanego A CSF do jednej 0,5 µL porcji 5 mM flu oh five NAM i rozpuść roztwór w łaźni wodnej, sonicując go przez 90 s. Przenieś 400 µL wstępnie podgrzanego roztworu do obrazowania do jednej studni płytki 4- lub 24-dołkowej. Dodaj roztwór D do tej samej studni, aby otrzymać 500 µL roztworu o stężeniu 5 µM.Następnie ostrożnie umieść szkiełko podstawowe z komórkami w dołku i inkubuj przez odpowiedni czas w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C. Czas ładowania DI oraz stężenie D zależą od typu komórek, gęstości komórkowej i specyficznych potrzeb eksperymentu. Długi czas inkubacji może uszkodzić komórki, zwłaszcza pierwotne neurony i komórki glejowe, co ma krytyczne znaczenie dla reaktywności na bodźce fizjologiczne. Inkubacja trwająca ponad 30 minut będzie przydatna jedynie w eksperymentach dotyczących lokalizacji wapnia w ER, aby zbadać rozkład wapnia w ER w małych mikrodomenach, na przykład w MUEs kolców. Bezpośrednio po inkubacji przenieś szkiełko podstawowe do innego dołka hodowli komórkowej zawierającego roztwór obrazujący.Aby przygotować się do zamocowania komórek w komorze obrazowania, należy za pomocą pędzla nałożyć smar próżniowy wysokiej próżni do wnętrza komory. Stosujemy wykonane we własnym zakresie komory obrazowania dla szkiełek nakrywkowych o wymiarach od 10 do 12 mm o małej objętości, co umożliwia uzyskanie wysokich prędkości perfuzji, pozwalających na nawet 15-krotną wymianę buforu na minutę. Należy podnieść szkiełko nakrywkowe z komórkami załadowanymi w flu oh five i dodać niewielką kroplę roztworu do obrazowania, aby zapobiec jego wysychaniu.Następnie należy odwrócić szkiełko nakrywkowe i zamocować komórki w komorze obrazowania. Za pomocą patyczka higienicznego dociśnij szkiełko nakrywkowe do kleju silikonowego i usuń pozostałości buforu z dolnej strony szklanej nakrywki. Następnie wymień roboczą komorę obrazowania na eksperymentalną komorę obrazowania.W celu selekcji komórek płucz je przez 5 do 10 minut poprzez ciągłą perfuzję. Aby zapobiec szybkiemu fotowybielaniu flu oh five oraz calcium two w ER, zastosuj w mikroskopie minimalne naświetlanie laserowe, wysoką częstotliwość skanowania od 2 do 4 Hz, niewielki rozmiar obrazu oraz wysokie wzmocnienie, zgodnie z protokołem eksperymentu roślinnego.Na początku eksperymentu należy udokumentować dystrybucję komórkową znacznika flu oh five i wapnia oraz czerwonego znacznika fluorescencyjnego konstruktu red carbox cel esterase. W wybranych komórkach, reprezentowanych przez neurony w stosach obrazów X, YZ o wysokiej rozdzielczości, należy przeprowadzić obrazowanie XYT w celu monitorowania dynamiki wapnia w ER w określonych warunkach eksperymentalnych. Typowe ustawienia dla naszego systemu są wymienione w tabeli 2 protokołu tekstowego. Monitoruj zmiany poziomu wapnia w ER podczas ciągłej perfuzji buforem do obrazowania; szybkość wymiany buforu wynosi 1,5 milliliter per minute podczas płukania komórek i wyczerpywania zapasów poprzez blokowanie sarco endoplasmic reticulum calcium two a TPAs oraz 3 milliliters per minute podczas stymulacji za pomocą a TP oraz DHPG, agonisty metabotropowego receptora glutaminianu.W tym przypadku komórki glejowe są stymulowane 200 µM ATP przez 10 sekund. Aby przetworzyć obrazy, otwórz stos obrazów w programie Image J do obrazowania wielokolorowego. Rozdziel kanały RGB, gdy zostanie o to poproszone przez oprogramowanie.Wyznacz obszary zainteresowania. W zależności od celu badania, obrysuj obszary zainteresowania obejmujące albo cały ER, albo niewielkie fragmenty ER. Użyj wtyczki time series analyzer, aby odczytać średnią intensywność pikseli w danym obszarze zainteresowania.Oblicz zmiany względne fluorescencji skorygowane o tło, stosując wzór na delta F przez F zero. Przedstaw względne zmiany fluorescencji w formie wykresu, gdzie oś Y reprezentuje delta F przez F zero, a oś X czas. Na tym rysunku astrocyty korowe i neurony hipokampa linii A wykazują ekspresję czerwonego fluorescencyjnego wektora TED i są znakowane niskopowinowactwowym wskaźnikiem wapnia.Fluo-5N. Fluorescencyjny kompleks wskaźnika wapnia jest zlokalizowany w retikulum endoplazmatycznym wszystkich typów komórek. Rysunek ten przedstawia komórki glejowe znakowane Fluo-5N. Podczas traktowania CIN, jasne znakowanie cytozolowe jest widoczne, jeżeli błona plazmatyczna komórki została uszkodzona zarówno przed, jak i po traktowaniu CIN.Wykazuje to, że Fluo-5N jest również uwalniany do cytosolu przez endogenne esterazy. W tym eksperymencie, po etykietowaniu Fluo-5N, deplecję wapnia z retikulum endoplazmatycznego (ER) w hodowlanych neuronach hipokampa wywołuje bloker receptora IP3, kwas cyklonikowy. Należy zwrócić uwagę na ogromną zmianę średniej gęstości fluorescencji na obszar zainteresowania (ROI), co widać tutaj w serii czasowej z komórkami glejowymi kory mysiej stymulowanymi ATP. Fluorescencja gwałtownie spada, a następnie powraca, co reprezentuje uwalnianie i ponowne napełnianie wapnia w ER. Jednocześnie fluorescencja czerwonego białka fluorescencyjnego nieznacznie maleje w wyniku fotoblaknięcia; wykresy przedstawiają zmianę intensywności fluorescencji w czasie w niektórych, lecz nie we wszystkich eksperymentach.Wartości fluorescencji nie wracają do początkowych poziomów intensywności, ponieważ część kompleksów fluo-5N ulega utracie podczas stymulacji. Ten film przedstawia w wysokiej rozdzielczości komórkę BHK 21 zainfekowaną karboksylozą 2, oznakowaną kompleksami wapnia fluo-5N i stymulowaną ATP. Należy zauważyć, że indukowane przez ATP uwalnianie wapnia oraz ponowne napełnianie magazynów wapnia w ER są widoczne w drobnych strukturach cewek ER. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że jedynie całkowicie zdrowe komórki wykazują fizjologiczne odpowiedzi wapniowe.Zalecamy zatem przeprowadzenie serii powiązanych ze sobą eksperymentów dotyczących homeostazy wapnia w ciągu jednego dnia z użyciem tej samej partii komórek. W oparciu o nasze doświadczenie, najlepiej sprawdza się barwnik flu-5N, jednak ten wskaźnik wapnia nie jest zbyt odporny na fotobleaching. W związku z tym, metoda ta zyska na opracowaniu bardziej odpornych na fotobleaching wskaźników wapnia o niskim powinowactwie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat obrazowania przejściowych zmian stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego przy użyciu syntetycznych wskaźników wapnia o niskim powinowactwie. Wskaźniki te umożliwiają monitorowanie dynamiki wapnia wewnątrzkomórkowego z wysoką rozdzielczością czasową. Z tego powodu nasza metoda może być przydatna w badaniu kaskad sygnalizacji wapniowej zaangażowanych w plastyczność synaptyczną oraz w monitorowaniu zmian w homeostazie wapnia w modelach komórkowych chorób neurodegeneracyjnych.

direct-imaging-er-calcium-with-targeted-esterase-induced-dye-loading

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Bezpośrednie Obrazowanie Wapnia w ER za pomocą Załadowania Barwnika Indukowanego przez Targeting-Esterazę (TED)

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody optymalizacji detekcji immunofluorescencyjnej receptora estrogenowego α (ERα) w skrawkach tętnic oponowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego.

Obrazowanie receptorów estrogenowych $\alpha$ w tętniczkach oplątwowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Homeostaza wapniowa retikulum endoplazmatycznego jest zaburzona w różnych patologiach.  Reporter wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) może być używany do wykrywania zakłóceń w magazynie wapnia ER.   Protokół ten opisuje zastosowanie Gaussia lucyferazy SERCaMP do badania homeostazy wapnia ER in vitro i in vivo.

Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

Prezentujemy protokoły zastosowania naszego ukierunkowanego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI) CatchER+ do monitorowania szybkich stanów przejściowych wapnia w retikulum endoplazmatycznym/sarkoplazmatycznym (ER/SR) HEK293 i komórkach C2C12 mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Omówiono również protokół pomiaru i kalibracji in situ Kd.

Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca2+ CatchER+

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

Obecny protokół opisuje całkowicie optyczną kontrolę i obserwację wyzwalanej aktywności komórkowej w kardiomiocytach pochodzących z iPSC (iPSC-CMs) dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności. Pokazano wieloparametryczną kwantyfikację wzorców fenotypowych w czasie i przestrzeni. Wykazano długoterminowe działanie leków w ciągu godzin lub sekwencyjne pomiary w ciągu kilku dni.

Wysokoprzepustowe sterowanie optyczne i rejestrowanie sygnału wapnia w kardiomiocytach pochodzących z iPSC do badań toksyczności i fenotypowych badań przesiewowych leków

Poznaj metodę TED do bezpośredniego obrazowania dynamiki wapnia w retikulum endoplazmatycznym żywych komórek. Technika ta umożliwia badanie sygnałowania wapniowego z wysoką rozdzielczością czasową.

Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)

Przeglądaj więcej filmów