Name: In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metodę pomiaru warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy in vivo przy użyciu mikroskopii intrawitalnej DIC i fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia dokładne badanie dynamiki naczyń w ruchomym narządzie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy doktorom Arata Tabuchi i Wolfgangowi Kueblerowi (Uniwersytet w Toronto) za instrukcje dotyczące mikroskopii przyżyciowej. Dziękujemy Andrew Cahillowi (Nikon Instruments) za pomoc w projektowaniu i wdrażaniu mikroskopii. Praca ta została sfinansowana z grantów NIH/NHLBI P30 HL101295 i K08 HL105538 (dla EPS).

1. Przygotowanie rurki chirurgicznej, cewników naczyniowych, okna ściany klatki piersiowej
<ol>
	<li>Etap mikroskopii przyżyciowej. Na zamówienie wykonaliśmy stolik z pleksi, na którym leży znieczulona mysz podczas mikroskopii. Na tym etapie znajduje się zarówno elastyczna plastikowa deska do krojenia o wymiarach 15 cm na 10 cm (na której leży mysz podczas indukcji znieczulenia, zakładania tracheostomii i cewnikowania żylnego), jak i element grzejny o podobnej wielkości (umieszczony pod deską do krojenia).</li>
	<li>Przygotowanie rurki do toracostomii myszy (ryc. 1). Cięty jest przewód PE 50 o długości 10 cm (Intramedic, średnica wewnętrzna 0,58 mm, średnica zewnętrzna 0,965 mm). Jeden koniec jest przymocowany do końca zakrzywionej igły o rozmiarze 23; Igła ta będzie używana do przepuszczenia rurki przez ścianę klatki piersiowej (wewnątrz → na zewnątrz) przed zamknięciem okna klatki piersiowej. 
	Dystalny koniec rurki (o długości 1,5 cm, naprzeciwko dołączonej igły o rozmiarze 23) jest wielokrotnie nakłuwany igłą o rozmiarze 30, tworząc "boczne porty" ułatwiające skuteczne zasysanie powietrza w klatce piersiowej. 
	Ta część z okienkiem jest następnie oddzielana od reszty rurki kilkoma obwodowymi pętlami jedwabnego szwu 4:0; Pętle te będą służyć jako "stoper", ostatecznie zakotwiczając 1,5 cm fenestrowaną część w jamie klatki piersiowej.</li>
	<li>Cewniki do żył szyjnych. Cięte są dwie rurki PE 10 o długości 15 cm (Intramedic, średnica wewnętrzna 0,28 mm, średnica zewnętrzna 0,61 mm). Skalpel służy do fazowania końców rurki, zwiększając w ten sposób łatwość nakłucia żyły. Rurkę przepłukuje się za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml zawierającej 6% roztworu dekstranu o stężeniu 150 kDa (w PBS) przymocowanej do niefazowanego końca rurki.</li>
	<li>Przygotowanie okna w ścianie klatki piersiowej (ryc. 2). Przezroczysta membrana z poliwinylidenu (New Kure Wrap, Kuresha, Tokio) jest cięta na owalny kształt (oś główna 6 cm, oś mniejsza 4 cm). Okrągłe szkiełko nakrywkowe #1 o grubości 5 mm (Bellco) jest mocowane do membrany za pomocą kleju α-cyjanoakrylowego (Pattex flüssig, Henkel, Düsseldorf).</li>
	<li>Rurka do indukcji odmy opłucnowej ("rurka wydmuchiwana"). Rurka o długości 10 cm (średnica wewnętrzna 3 mm, średnica zewnętrzna 5 mm) jest dołączona do strzykawki o pojemności 5 ml; Przeciwległy koniec zostanie wykorzystany do wprowadzenia powietrza do klatki piersiowej zwierzęcia przed wszczepieniem okna w ścianie klatki piersiowej.</li>
	<li>Strzykawka do zanurzenia w wodzie obiektywu. Igła o rozmiarze 23 jest przymocowana do strzykawki o pojemności 30 ml zawierającej wodę destylowaną. Końcówka igły jest stępiona (za pomocą metalowego pilnika), aby zapobiec uszkodzeniu obiektywu.</li>
</ol>
2. Znieczulenie myszy
<ol>
	<li>Mysz jest znieczulana mieszaniną ketaminy (10 mg/ml) i ksylazyny (2 mg/ml), podawaną dootrzewnowo w dawce 8 μl na gram masy ciała myszy. Sedacja następuje w ciągu 3 - 6 minut i nie powinna utrudniać spontanicznego oddychania.</li>
	<li>Za pomocą elektrycznej maszynki do golenia ogol gardło, klatkę piersiową, brzuch i prawą stronę myszy.</li>
	<li>Za pomocą taśmy przymocuj mysz do cienkiej plastikowej deski do krojenia. Głowa myszy powinna być skierowana w stronę operatora (Rysunek 3). Delikatne napięcie zapewniane przez pętlę szwu przechodzącą pod górnymi zębami służy utrzymaniu wyprostu głowy. Deskę do krojenia umieszcza się na poduszce grzewczej, utrzymując eutermię myszy podczas tracheostomii i zakładania cewnika żylnego.</li>
	<li>Ogolone na mokro obszary ze 100% etanolem.</li>
	<li>Potwierdź odpowiednie znieczulenie za pomocą uszczypnięcia ogona/łapy. Kontynuuj, jeśli odpowiedź jest minimalna; Podać dodatkowy bolus ketaminy/ksylazyny, jeśli nie jest odpowiednio znieczulony.</li>
</ol>
3. Tracheostomia
<ol>
	<li>Nad gardłem wykonuje się 1 cm nacięcie. Leżąca pod spodem tkanka łączna jest preparowana, a gruczoły ślinowe są oddzielane i odbijane bocznie. Mięsień mostkowo-gnykowy bezpośrednio przed tchawicą jest wycinany.</li>
	<li>Pod tchawicą przesuwa się pętlę szwu 4:0 (ryc. 4). Pętla jest następnie przecinana, tworząc dwa oddzielne pasma szwu pod tchawicą. Szew ogonowy zostanie użyty do zabezpieczenia rurki tracheostomijnej; Szew czaszkowy zostanie wykorzystany do zapewnienia napięcia tchawicy podczas zakładania tracheostomii.</li>
	<li>Za pomocą dwóch palców chwyta się górny szew i delikatnie napina tchawicę. W tchawicy wykonuje się poziome nacięcie między szwami górnymi i dolnymi. Nacięcie to powinno przecinać około dwóch trzecich obwodu tchawicy. Rurka tracheostomijna z kołnierzem (aparat Harvarda, średnica zewnętrzna 1,22 mm) jest wprowadzana do dystalnej tchawicy i mocowana na miejscu za pomocą szwu ogonowego tchawicy.</li>
	<li>Tracheostomia jest podłączona do respiratora dla małych zwierząt o kontrolowanej objętości (Inspira, Harvard Apparatus), a mysz jest wentylowana 40% wdychanym tlenem i objętościami oddechowymi 9 ml/kg (ustawienia zoptymalizowane pod kątem utrzymania odpowiedniego natlenienia/wentylacji w naszym laboratorium). Dodatnie ciśnienie końcowo-wydechowe (PEEP) nie rozpoczyna się w tym momencie. Należy zauważyć, że ustawienia respiratora powinny być zoptymalizowane do unikalnych warunków panujących w poszczególnych laboratoriach. Różne długości nadmiarowych przewodów (umieszczonych między łącznikiem Y a tracheostomią) mogą być używane do regulacji martwej przestrzeni, zapewniając stabilną wentylację pęcherzyków płucnych dla dowolnej wybranej objętości oddechowej.</li>
</ol>
4. Cewnikowanie żylne
<ol>
	<li>Połączenie żyły szyjnej wewnętrznej i zewnętrznej można zidentyfikować, śledząc proksymalnie dystalne gałęzie żylne. Zewnętrzna szyja znajduje się pod odbitymi gruczołami ślinowymi; Można to prześledzić proksymalnie, aby znaleźć zewnętrzno-wewnętrzne połączenie szyjne.</li>
	<li>Użyj delikatnego rozwarstwienia, aby oddzielić połączenie szyjne od otaczającej tkanki łącznej.</li>
	<li>Za pomocą szwów 4:0 zwiąż żyłę szyjną zewnętrzną i żyłę szyjną wewnętrzną dystalną (czaszkową) do połączenia szyjnego.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w carina połączenia szyjnego; krwawienie powinno być minimalne.</li>
	<li>Dwa cewniki mogą być stopniowo wprowadzane przez nacięcie i do tułowia szyjnego. Po delikatnym zasysaniu, aby zapewnić powrót krwi, cewniki są zabezpieczane w żyle za pomocą szwów 4:0.</li>
	<li>Przyklej cewniki żylne do deski do krojenia, aby zapobiec przypadkowemu przemieszczeniu.</li>
</ol>
5. Chirurgia mikroskopii płuc myszy przyżyciowej (zaadaptowana z Tabuchi et al.18)
<ol>
	<li>Deska do krojenia (zawierająca skrępowaną, znieczuloną mysz oraz zaklejone taśmą cewniki żylne) jest przenoszona do etapu mikroskopii przyżyciowej, gdzie zostaną wykonane pozostałe interwencje chirurgiczne. Umieszcza się sondę temperatury doodbytniczą; Łączy się to z adaptacyjnym systemem ogrzewania (umieszczonym pod deską do krojenia), co pozwala na utrzymanie eutermii myszy.</li>
	<li>Jeden cewnik do żyły szyjnej jest podłączony do pompy strzykawkowej, która dostarcza mieszaninę ketaminy (10 mg/ml) i ksylazyny (2 mg/ml) w ilości 200 μl na godzinę. Odpowiednie znieczulenie jest ponownie potwierdzane za pomocą uszczypnięcia ogona/łapy.</li>
	<li>Nacięcie w linii środkowej jest przedłużone od szyi do wyrostka ksyloidalnego, a następnie przebiega bocznie w prawą stronę (ryc. 5).</li>
	<li>Za pomocą elektrokoagulacji usuwa się mięśnie klatki piersiowej, odsłaniając klatkę piersiową. Dokłada się wszelkich starań, aby zapewnić pełną hemostazę.</li>
	<li>Skrzyżuj prawą tylną nogę myszy z lewą stroną i przyklej taśmę. Powstałe skręt brzucha nieznacznie obraca klatkę piersiową, co ułatwia operację.</li>
	<li>Ustaw stolik pod kątem 45 stopni (ryc. 6); takie ustawienie pozwala płucu na oddalenie się od ściany klatki piersiowej po wywołaniu odmy opłucnowej.</li>
	<li>Pierwsze żebro (najniższe żebro) chwyta się kleszczami i podnosi; zakrzywione kleszcze są tępo wpychane pod żebro. To oddziela opłucną ciemieniową od ściany klatki piersiowej. Opłucna powinna pozostać nienakłuta.</li>
	<li>Za pomocą rurki wydmuchowej i strzykawki powietrze jest na siłę wprowadzane do opłucnej ciemieniowej. Prowadzi to do pęknięcia powierzchni opłucnej i odmy opłucnowej bez uszkodzenia leżącego poniżej płuca. Płuco znajdujące się pod spodem odpadnie od ściany klatki piersiowej, co pozwoli na wprowadzenie kleszczyków do elektrokoagulacji bez uszkodzenia płuca. Na tym etapie zazwyczaj nie jest wymagane zmniejszenie objętości oddechowej respiratora.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy do elektrokoagulacji rozetnij mięśnie ściany klatki piersiowej i przetnij 5. i 6. żebro / opłucną ciemieniową, tworząc okrągły otwór o średnicy ~ 8 mm w ścianie klatki piersiowej. Istotne jest, aby utrzymać pełną hemostazę, ponieważ obecność krwawienia będzie zasłaniać mikroskopię (ryc. 7).</li>
	<li>Za pomocą wkrętaka igłowego włóż rurkę torakostomii do otworu w ścianie klatki piersiowej. Igła powinna przebić ścianę klatki piersiowej i wyjść z jamy piersiowej poniżej i bocznie do okna piersiowego (ryc. 7). Uważaj, aby nie przebić membrany. Rurka jest następnie delikatnie wyciągana ze ściany klatki piersiowej, aż pojawi się opór ze strony "korka" szwu znajdującego się na krawędzi fenestrowanej części rurki.</li>
	<li>Ustaw scenę płasko.</li>
	<li>Dodaj 3 cm H2O PEEP do respiratora, aby wspomóc reekspansję płuc</li>.
	<li>Klej (żel Pattex, Henkel) umieszcza się obwodowo wokół okienka klatki piersiowej. Membrana jest przymocowana, ze szkiełkiem pokrywającym skierowanym na zewnątrz do jamy klatki piersiowej. Ostrożnie (i obwodowo) przybliż membranę do kleju za pomocą bawełnianego aplikatora.</li>
	<li>Podczas wykonywania manewru rekrutacji płuc (3 objętości oddechowe, podczas których port respiratora PEEP jest zatkany), do rurki klatki piersiowej stosuje się ssanie -3 mm Hg. Płuco powinno stale zbliżać się do błony, poruszając się swobodnie podczas wentylacji oddechowej (ryc. 8).</li>
	<li>Prawa przednia noga myszy jest skrzyżowana na lewą stronę, co powoduje lewą boczną pozycję odleżynową myszy. Kliny gąbkowe mogą być używane do prawidłowego ustawiania myszy tak, aby okno klatki piersiowej było wyrównane z obiektywem zanurzenia w wodzie mikroskopowej.</li>
	<li>Woda destylowana jest umieszczana na szkiełku nakrywkowym przed mikroskopią, co pozwala na wizualizację płuc za pomocą obiektywu do zanurzenia w wodzie. Woda będzie musiała być okresowo uzupełniana podczas obrazowania.</li>
</ol>
6. Pomiar grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego
<ol>
	<li>Bezpośrednio po zamknięciu ściany klatki piersiowej przez drugi (bez znieczulenia) cewnik do żyły szyjnej podaje się 500 μl znakowanego FITC dekstranu 150 kDa (6% roztwór w PBS). Ten bolus służy jako resuscytacja objętościowa, a także znacznik naczyniowy do pomiaru ESL. Bolus dekstranu nie wpływa na adhezję neutrofili ani tworzenie obrzęku płuc2.</li>
	<li>Obiektyw zanurzenia w wodzie jest wyśrodkowany nad szkiełkiem nakrywkowym. Wybór obiektywu jest niezbędny - aby uwidocznić niewielkie różnice w grubości ESL, potrzebna jest duża apertura numeryczna (> 0,8) przy jednoczesnym zachowaniu odległości roboczej 2 - 3 mm (umożliwiającej penetrację przez okienko płuc i powierzchnię opłucnej). Używamy do tego celu obiektywów Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0.8) i CFI 75 LWD 25x (NA 1.1).</li>
	<li>Aby dokładnie zmierzyć grubość ESL w poruszającym się narządzie, konieczne jest jednoczesne wykonywanie badań w jasnym polu i fluorescencyjnych szerokościach naczyń. Można to osiągnąć za pomocą rozdzielacza obrazu (Dual View, Photometrics), który pozwala na jednoczesne przechwytywanie kontrastu różnicowego interferencyjnego światła odbitego (DIC, brightfield) i obrazów FITC (ilustracja 9).</li>
	<li>Podczas 5-sekundowej przerwy wdechowej wykonywane i rejestrowane jest ciągłe obrazowanie. Później obrazy te mogą zostać przejrzane w celu zidentyfikowania ostrych klatek.</li>
	<li>Za pomocą ostrej ramki identyfikuje się mikronaczynia podopłucnowe (< średnicy 20 μm); co najmniej 3 mikronaczynia zwykle znajdują się na jednej klatce. Po zakończeniu eksperymentu mierzy się szerokości naczyń DIC i FITC-dekstran (przez zaślepionego obserwatora) poprzez uśrednienie długości trzech prostopadłych przecięć na mikronaczynie. Zakładając równą grubość ESL na obu krawędziach naczynia, rozmiar ESL można zdefiniować jako połowę różnicy między szerokościami naczyń DIC i FITC-dekstranu, jak opisano w sekcji Reprezentatywne wyniki.</li>
	<li>Zazwyczaj mikroskopia przyżyciowa może być wykonywana przez > 90 minut bez żadnych oznak uszkodzenia płuc lub niedociśnienia2. Należy przeprowadzić wstępne eksperymenty w celu potwierdzenia stabilności myszy (ciśnienie krwi, natlenienie, wentylacja, uszkodzenie płuc) w okresie obserwacji. Eksperymentalne leki mogą być wprowadzane przez drugi (nieznieczulający) cewnik szyjny w dowolnym momencie zabiegu.</li>
</ol>
7. Alternatywny pomiar integralności warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego
Nienaruszona warstwa powierzchniowa śródbłonka służy (częściowo) do wykluczania krążących elementów z powierzchni śródbłonka2. Integralność ESL można zatem zmierzyć za pomocą zdolności elementu krążącego (np. mikrosfery fluorescencyjnej) do dostępu i interakcji z cząsteczkami adhezyjnymi na powierzchni komórki (takimi jak ICAM-1).
<ol>
	<li>Mikrosfery fluorescencyjne znakowane anty-ICAM-1 są przygotowywane przed zabiegiem. Pokryte streptawidyną mikrosfery fluorescencyjne 0,97 μm inkubuje się z biotynylowanym przeciwciałem anty-ICAM-1 (klon YN1/1.7.4, 1:50, eBioscience) lub kontrolą izotypu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Mikrosfery są przemywane trzykrotnie i zawieszane w PBS w ilości 1 x 109 mikrosfer na ml.</li>
	<li>Podczas mikroskopii przyżyciowej zawiesina mikrosfery (100 μl) jest wstrzykiwana do cewnika do żyły szyjnej. Po 15 minutach cyrkulacji obrazy fluorescencyjne są rejestrowane w ciągu 5 minut. Mikrosfery nieruchome przez > 5 minut są uważane za przylegające i określane ilościowo za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
</ol>
8. Eutanazja
Po zakończeniu procedury, znieczulone myszy są poddawane eutanazji przez wykrwawienie poprzez bezpośrednie nakłucie serca. Eutanazja jest potwierdzana za pomocą obustronnej odmy opłucnowej, po której płuca są pobierane i zamrażane do późniejszej analizy.

<ol><li>Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+degradation+of+matrix+proteoglycans+and+edema+development+in+rabbit+lung%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung.</a> AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).</li>
<li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).</li>
<li>Florian, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+mechanosensor+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells.</a> Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).</li>
<li>Chappell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Glycocalyx+of+the+Human+Umbilical+Vein+Endothelial+Cell%3A+An+Impressive+Structure+Ex+Vivo+but+Not+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture.</a> Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).</li>
<li>Potter, D. R., Damiano, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydrodynamically+relevant+endothelial+cell+glycocalyx+observed+in+vivo+is+absent+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro.</a> Circ. Res. 102, 770-776 (2008).</li>
<li>Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+and+Function+of+the+Endothelial+Glycocalyx+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).</li>
<li>Pittet, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li>
<li>Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+tomato+%28Lycopersicon+esculentum%29+lectin+with+its+deglycosylated+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative.</a> Biochem. J. 220, 843-847 (1984).</li>
<li>Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-wall+micro-PIV+reveals+a+hydrodynamically+relevant+endothelial+surface+layer+in+venules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo.</a> Biophys. J. 85, 637-645 (2003).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circ. Res. 79, 581-589 (1996).</li>
<li>Marechal, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+damage+during+endotoxemia+coincides+with+microcirculatory+dysfunction+and+vascular+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress.</a> Shock. 29, 572-576 (2008).</li>
<li>Presson, R. G. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Imaging+within+the+Murine+Thorax+without+Respiratory+and+Cardiac+Motion+Artifact%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact.</a> The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).</li>
<li>Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ventilation+on+vascular+permeability+and+cyclic+nucleotide+concentrations+in+ischemic+sheep+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs.</a> J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).</li>
<li>Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+synthesis+enhances+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+human+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature.</a> Journal of Inflammation. 9, 28(2012).</li>
<li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+guanylyl+cyclase+contributes+to+ventilator-induced+lung+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice.</a> AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).</li>
<li>Mead, J., Takishima, T., Leith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+distribution+in+lungs%3A+a+model+of+pulmonary+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity.</a> J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).</li>
<li>Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilator-induced+lung+injury%3A+the+anatomical+and+physiological+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework.</a> Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).</li>
<li>Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Lung+Injury+Causes+Pendelluft+Between+Adjacent+Alveoli+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490(2011).</li>
<li>Roebuck, K. A., Finnegan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1+%28CD54%29+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression.</a> J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Równolegle z rosnącym zastosowaniem mikroskopii in vivo , coraz częściej docenia się zarówno znaczny rozmiar ESL, jak i jego liczny wkład w funkcjonowanie naczyń krwionośnych. Te pojawiające się dane pochodzą jednak przede wszystkim z badań nad układem naczyniowym. Rzeczywiście, zastosowanie mikroskopii in vivo w płucach jest technicznie trudne, biorąc pod uwagę znaczne artefakty ruchu płuc i serca.
	Kilka ostatnich osiągnięć technicznych pozwoliło na stabilizację poruszając...

Glikokaliks śródbłonka to zewnątrzkomórkowa warstwa proteoglikanów i związanych z nimi glikozaminoglikanów wyściełająca błonę wewnętrzną naczyń krwionośnych. In vivo glikokaliks jest silnie uwodniony, tworząc pokaźną warstwę powierzchniową śródbłonka (ESL), która reguluje różne funkcje śródbłonka, w tym przepuszczalność płynów1, adhezję neutrofili i śródbłonka2 oraz mechanotransdukcję naprężeń ścinających płyn3.
	Historycznie rzecz biorąc, glikokaliks był niedoceniany ze względu na jego aberrację w preparatach komórkowychhodowlanych 4, 5 i jego degradację podczas standardowego utrwalania i przetwarzania tkanek6. Corazpowszechniejsze stosowanie mikroskopii przyżyciowej (mikroskopia in vivo, IVM) zbiegło się w czasie ze wzrostem zainteresowania naukowego znaczeniem ESL dla funkcjonowania naczyń krwionośnych w czasie choroby i zdrowia. ESL jest niewidoczny dla mikroskopii świetlnej i nie można go łatwo oznaczyć in vivo, biorąc pod uwagę skłonność fluorescencyjnych lektyn wiążących glikokaliks do powodowania aglutynacji RBC8 i śmiertelnej zatorowości płucnej (obserwacje niepublikowane). W związku z tym opracowano kilka pośrednich podejść do wydedukowania grubości ESL (a co za tym idzie, integralności glikokaliksu) w nieruchomych łożyskach naczyniowych, takich jak mikrokrążenia krezkowe i krezkowe. Techniki te obejmują pomiar różnic w prędkości krążących mikrocząstek w funkcji odległości od błony śródbłonka (prędkość obrazu mikrocząstek9), a także pomiar wykluczenia dużych, znakowanych fluorescencyjnie markerów naczyniowych (np. dektransu) z powierzchni śródbłonka (technika wykluczania dekstranu10, 11). Spośród tych technik tylko wykluczenie dekstranu jest w stanie oszacować grubość ESL na podstawie pomiarów wykonanych w jednym momencie. Poprzez jednoczesny pomiar szerokości naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii jasnego pola (szerokość obejmująca "niewidoczny" ESL) i mikroskopii fluorescencyjnej znacznika naczyniowego wyłączonego z ESL, grubość ESL można obliczyć jako połowę różnicy między szerokościami naczyń2.
	Użycie natychmiastowej miary grubości ESL jest dobrze odpowiednie do badania glikokaliksu płucnego. Mikroskopia przyżyciowa płuc jest trudna, biorąc pod uwagę znaczny artefakt ruchu płuc i serca. Podczas gdy ostatnie postępy pozwalają na unieruchomienie płuc myszy in vivo12, 13, istnieją obawy dotyczące fizjologicznego wpływu zastoju płuc. Unieruchomienie płuc wiąże się ze zmniejszoną sygnalizacją śródbłonka tlenku azotu14, szlakiem sygnałowym, który wpływa zarówno na adhezję neutrofili15, jak i uszkodzenie płuc16. Ponadto unieruchomienie obszaru płuc naraża otaczające pęcherzyki płucne na szkodliwe siły ścinające (tzw. "atelectrauma"), zgodnie z klasycznymi fizjologicznymi koncepcjami współzależności pęcherzyków płucnych17.
	W 2008 roku Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler i współpracownicy opracowali technikę chirurgiczną pozwalającą na mikroskopię przyżyciową swobodnie poruszającego się płuca myszy18. Artefakty oddechowe powstające w wyniku tej techniki można zniwelować za pomocą szybkiego obrazowania, w tym jednoczesnego pomiaru jasnego pola i mikroskopii fluorescencyjnej. W tym raporcie szczegółowo opisujemy, w jaki sposób można zastosować natychmiastowe obrazowanie wykluczenia dekstranu do pomiaru grubości ESL w mikrokrążeniu podopłucnowym swobodnie poruszającego się płuca myszy in vivo. Technikę tę można łatwo zmodyfikować w celu określenia funkcji glikokaliksu - specyficznie dla zdolności nienaruszonego ESL do wykluczania krążących elementów z powierzchni śródbłonka. Ostatnio wykorzystaliśmy te techniki do określenia znaczenia integralności ESL płuc dla rozwoju ostrego uszkodzenia płuc podczas ogólnoustrojowych chorób zapalnych, takich jak sepsa2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Nazwa odczynnika</td></tr><tr><td>FITC-dekstran (150 kDa)</td><td>Sigma</td><td>FD150S</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-dekstran (150 kDa)</td><td>Sigma</td><td>T1287</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery fluorescencyjne pokryte streptawidyną</td><td>Bangs Laboratories</td><td>CP01F/10428</td><td>Dragon Green fluorescencja (podobna do FITC)</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Moore Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Moore Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-ICAM-1 biotynylowane przeciwciało</td><td>eBioscience</td><td>Clone YN1/1.7.4</td><td>1:50 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Izotyp biotynylowane przeciwciało</td><td>eBioscience</td><td>IgG2b eB149/10H5</td><td>1:50 rozcieńczenie</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Wentylator mechaniczny</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Inspira</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik tracheostomijny</td><td>Aparat Harvard 730028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat do elektrokoagulacji</td><td>DRE Medical</td><td>Valleylab SSE-2L</td><td></td></tr><tr><td>Bipolarne kleszcze kauteryczne</td><td>Olsen Medical</td><td>10-1200I</td><td>9,9 cm System kontroli temperatury McPhersona </td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>ATC1000</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Pompa do aparatów Harvard</td><td>11 Elite</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (szerokokątny)</td><td>Mikroskop Nikon</td><td>LV-150</td><td></td></tr><tr><td>(konfokalny)</td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz obrazu</td><td>Fotometria</td><td>DV2</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Fotometria</td><td>CoolSNAP HQ2</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr><tr><td>Membrana z poliwinylidenu</td><td>Kure Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe okrągłe</td><td>Bellco</td><td>5CIR-1-BEL</td><td>5 mm, grubość #1</td></tr><tr><td>Klej (szkiełko nakrywkowe do membrany)</td><td>Pattex</td><td>Flussig (płyn)</td><td>Do przyklejania szkiełka nakrywkowego do membrany</td></tr><tr><td>Klej (szkiełko nakrywkowe do myszy)</td><td>Pattex</td><td>Żel</td><td>Do mocowania membrany do myszy</td></tr><tr><td>Rurka chirurgiczna</td><td>Intramedic</td><td>PE50, PE10</td><td></td></tr><tr><td>Szew</td><td>Fisher</td><td></td><td>4:0 jedwab</td></tr><tr><td>Elektryczna maszynka do golenia</td><td>Oster</td><td>78997</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze chirurgiczne</td><td>Roboz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proste kleszcze chirurgiczne</td><td>Roboz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Roboz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki chirurgiczne</td><td>Roboz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterownik igieł chirurgicznych</td><td>Roboz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gąbki kuchenne (pocięte na kliny)</td><td>różne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

Glikokaliksem śródbłonka to warstwa proteoglikanów i związanych z nimi glikozaminoglikanów wyściełająca światło naczyń. In vivo glikokaliks jest silnie nawodniony, tworząc pokaźną warstwę powierzchniową śródbłonka (ESL), która przyczynia się do utrzymania funkcji śródbłonka. Ponieważ glikokaliks śródbłonka jest często nieprawidłowy in vitro i jest tracony podczas standardowych technik utrwalania tkanek, badanie ESL wymaga użycia mikroskopii przyżyciowej. Aby jak najlepiej przybliżyć złożoną fizjologię mikrokrążenia pęcherzyków płucnych, idealnie nadaje się do obrazowania przyżyciowego płuc w swobodnie poruszającym się płucu. Preparaty te jednak zazwyczaj cierpią z powodu rozległych artefaktów ruchowych. Pokazujemy, w jaki sposób mikroskopia przyżyteczna z zamkniętą klatką piersiową swobodnie poruszającego się płuca myszy może być wykorzystana do pomiaru integralności glikokaliksu poprzez wykluczenie ESL znakowanego fluorescencyjnie dektransu o wysokiej masie cząsteczkowej z powierzchni śródbłonka. Ta nieregenerująca technika chirurgiczna, która wymaga jednoczesnego obrazowania płuc myszy w jasnym polu i fluorescencyjnym, pozwala na podłużną obserwację mikrokrążenia podopłucnowego bez dowodów na wywołanie mylącego uszkodzenia płuc.

Podejście eksperymentalne opisane w krokach 1-6 umożliwi zarejestrowanie wielu klatek jednoczesnych obrazów DIC (w jasnym polu) i fluorescencyjnych. W celu wyznaczenia grubości ESL, zarejestrowane obrazy są analizowane przez oślepiego obserwatora po zakończeniu protokołu eksperymentalnego. Na klatce znajdującej się w ostrości identyfikuje się naczynia mikrokrążenia podpleuralne (średnica &lt; 20 μm); zazwyczaj na jednej klatce znajduje się co najmniej 3 takie naczynia (Rycina 10). Przy użyciu oprogramowa...

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca. Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest pomiar szerokości warstwy powierzchniowej śródbłonka naczyniowego płuc (ESL) poprzez pomiar wykluczenia fluorescencyjnie znakowanych dekstryn o wysokiej masie cząsteczkowej z powierzchni naczyń. Osiąga się to najpierw poprzez przeprowadzenie intravitalnej mikroskopii DIC w celu zidentyfikowania błon komórek śródbłonka mikronaczyń podpleuralnych w poruszającym się płucu myszy. Następnie myszom wstrzykuje się fluorescencyjnie znakowaną dekstrynę o wysokiej masie cząsteczkowej, która jest odpychana od ściany naczynia przez w przeciwnym razie niewidoczną warstwę powierzchniową śródbłonka.Następnie z jednej klatki w płaszczyźnie ostrości rejestrowane są jednoczesne obrazy DIC i fluorescencyjne, co umożliwia pomiar szerokości naczyń odpowiednio z uwzględnieniem i bez uwzględnienia grubości ESL. Różnica między szerokością naczyniową w obrazowaniu DIC a fluorescencyjnym służy do wyznaczenia grubości podpleuralnej ESL mikronaczyniowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak velosymetria mikrocząsteczkowa, jest możliwość jej dokładnego przeprowadzenia w ruchomym organie, np. w płucach; procedurę tę zaprezentuj

in-vivo-measurement-of-the-mouse-pulmonary-endothelial-surface-layer

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

In vivo pomiar warstwy powierzchniowej endotelialnej płuc myszy

Przedstawiono nową, wszechstronną metodę obserwacji mikrokrążenia. Jest ona uważana za odpowiednią do długotrwałej obserwacji oraz do łączenia z interwencjami farmakofizjologicznymi lub biologii molekularnej.

Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

Prezentujemy test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych. Test ten opiera się na dożylnym wstrzyknięciu barwnika, a następnie wizualizacji jego dyfuzji do przestrzeni śródmiąższowych.

Test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Tutaj prezentujemy protokół prostego i wiarygodnego pomiaru krzywej ciśnienia i objętości płuc u myszy, pokazując, że jest ona wystarczająco czuła, aby wykryć fenotypowe zmiany miąższowe w dwóch powszechnych patologiach płuc, zwłóknieniu płuc i rozedmie płuc. Ta metryka zapewnia sposób na ilościowe określenie zmian strukturalnych płuc wraz z rozwijającą się patologią.

Pomiar krzywej ciśnienie-objętość w płucach myszy

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Wiele zagrażających wzrokowi chorób oczu jest związanych z dysfunkcyjnymi mikronaczyniami siatkówki. Dlatego pomiar odpowiedzi tętniczek siatkówki jest ważny dla zbadania podstawowych mechanizmów patofizjologicznych. W artykule opisano szczegółowy protokół izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do oceny wpływu substancji wazoaktywnych na średnicę naczyń krwionośnych.

Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Tutaj prezentujemy protokół barwienia immunofluorescencyjnego, aby bezpośrednio obserwować komórki śródbłonka aorty myszy. Technika ta jest przydatna podczas badania fenotypu komórkowego i molekularnego komórek śródbłonka w różnych wzorcach przepływu oraz w rozwoju miażdżycy.

Stosowanie barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

W obecnym protokole, funkcja bariery śródbłonkowej gruczołu podżuchwowego (SMG) została oceniona poprzez wstrzyknięcie różnych molekularnych znaczników fluorescencyjnych do żył kątowych badanych modeli zwierzęcych in vivo pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym.

In vivo (in vivo) Wykrywanie przepuszczalności naczyń krwionośnych w mysim gruczole podżuchwowym

Tutaj opisujemy prosty i ekonomiczny protokół do przeprowadzenia bezstronnej kwantyfikacji gęstości mikrokrążenia płuc dla całej tkanki płucnej myszy za pomocą pojedynczego barwienia izolektyny B4.

Kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy w poprzek zrazików

Poznaj metodę pomiaru warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy in vivo przy użyciu mikroskopii intrawitalnej DIC i fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia dokładne badanie dynamiki naczyń w ruchomym narządzie.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Przeglądaj więcej filmów