Name: Bezpośrednie dokomorowe dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Poznaj metody bezpośredniego dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni poprzez wszczepianie katetera z pompą osmotyczną lub pojedynczy zastrzyk do komory bocznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Curtowi Mazerowi z Isis Pharmaceuticals za udzielenie porad dotyczących operacji bolusa ICV, a także Isis Pharmaceuticals jako całości za zaopatrzenie naszego laboratorium w ASOs. Ponadto chcielibyśmy podziękować Carey Shaner za zrecenzowanie tego artykułu. TMM i SLD są wspierane przez granty NIH P50AG005681, K08NS074194 i R01NS078398.

Poniższy protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St Louis i jest zgodny z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych. Jeśli po raz pierwszy wykonujesz operacje, zalecamy zapoznanie się z artykułem JoVE na temat operacji na gryzoniach jako wprowadzeniem przed rozpoczęciem 14 roku.
ASO mogą być dostarczane do ośrodkowego układu nerwowego myszy zarówno poprzez infuzję pompy osmotycznej, jak i pojedyncze wstrzyknięcie bolusa ICV. Z tego powodu procedura opisana poniżej jest podzielona na dwa segmenty. Plusy i minusy każdej metody zostaną omówione w sekcji Dyskusja. Współrzędne używane w protokołach dotyczą dorosłych myszy C57BL6 i B6C3. Odpowiednie współrzędne szczura można znaleźć w tabeli 1.
POMPA OSMOTYCZNA ALZET
1. Przygotowanie pomp osmotycznych Alzet
<ol>
	<li>Połóż sterylną serwetę i ostrożnie upuść na nią następujące przedmioty, uważając, aby niczego bezpośrednio nie dotknąć, aby zachować sterylność: pompę osmotyczną (pompy), modulator (modulatory) przepływu, sterylną strzykawkę (strzykawki) o pojemności 1 ml, ostrze skalpela i odcinki rurki (1 sztuka rurki = 5 pompek). W przypadku myszy istnieją trzy opcje pomp: 14 dni, 28 dni i 42 dni (rysunek 2A).</li>
	<li>Odkręć i napełnij sterylne probówki stożkowe o pojemności 50 ml 15-20 ml roztworem soli fizjologicznej. Do jednej stożkowej rury można dodać do 6 zmontowanych pomp.</li>
	<li>Napełnij szalkę Petriego p60 100% etanolem. Dodać odpowiednią liczbę cewników do etanolu. W przypadku myszy długość cewnika wynosi 2,5 mm.</li>
	<li>Przefiltruj każdy ASO do tylu probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml, ile potrzeba. Dołącz probówkę Eppendorf wypełnioną sterylnym 0,9% soli fizjologicznej, aby napełnić rurkę.</li>
	<li>Gdy wszystko jest już przygotowane, załóż sterylne rękawiczki. Upewnij się, że nie dotykasz niczego, co nie jest sterylne. W razie potrzeby zmień rękawice.</li>
	<li>Dla każdego ASO, które ma być użyte, napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml i pompki, umieszczając igłę w górnym otworze i powoli napełniaj, aż nadmiar wycieknie. Kontynuuj, aż wszystkie pompy zostaną napełnione.</li>
	<li>Odkręć modulatory przepływu i włóż je do pomp. Wsunąć modulator przepływu prawie do końca, pozostawiając odstęp 3-5 mm.</li>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela pokrój każdy kawałek rurki na 5 równych segmentów. Weź jeden kawałek rurki, napełnij sterylną solą fizjologiczną za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i włóż górną część modulatora przepływu do jednego końca rurki. Następnie wyjmij kaniulę z etanolu i podłącz ją do drugiego końca rurki. Pompa jest teraz w pełni zmontowana.</li>
	<li>Umieść w pełni zmontowaną pompę w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml z solą fizjologiczną w celu zalania. Zalewanie pozwala pompom wchłonąć płyn, aby zainicjować dostarczanie leku, a także osiągnąć odpowiednią temperaturę. Czas zalewania: 14 pomp dniowych: 4-6 godzin, 28 pomp dniowych: 40 godzin, 42 pomp dniowych: 60 godzin. Po zakończeniu montażu pomp zakryj stożkowe rurki i umieść w czystej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do czasu zabiegu.</li>
</ol>
2. Zabieg przedoperacyjny
<ol>
	<li>Przetrzyj wszystko 70% etanolem, aby wysterylizować obszar i połóż sterylne zasłony na blacie stołu i stereotax, aby stworzyć sterylne pole. Ważne jest, aby pamiętać o sterylnym polu podczas całego zabiegu. Włącz następujące elementy: sterylizator kulkowy, poduszkę grzewczą, światło, odczyt cyfrowy i system tlenu/izofluranu (rysunek 1).</li>
	<li>W przypadku wykonywania pojedynczej operacji lub całej serii operacji, jak to zwykle robimy, wymagane będą następujące elementy: 1 para kleszczy, 1 zakrzywiony hemostat, 1 para małych nożyczek, 1 para małych zakrzywionych nożyczek, 1 obcinak do kości szczura, 1 hemostat prosty, 5-0 szwy nylonowe, 1 stożkowe rurki z 70% etanolem, 1 stożkowa tubka z 95% etanolem, 1 stożkowa rurka z jodem, 1 stożkowa rurka z nadtlenkiem wodoru, opakowanie sterylnych wacików bawełnianych, 1 butelka super kleju, 1 tubka maści antybiotykowej, 1 tubka lubrykantu do oczu i 1 golarka elektryczna.</li>
	<li>Umieść końcówki obu par nożyczek, kleszczyków i zakrzywionego hemostatu w sterylizatorze perełkowym na 15 sekund. Wyjmij i umieść w 70% etanolu. W przypadku wykonywania więcej niż jednej operacji należy ponownie wysterylizować końcówki narzędzi między zwierzętami.</li>
	<li>Obrócić izofluran do 4% i O2 do 0,4 l/min i skierować przepływ gazu do komory. Nasz system izofluranowo-tlenowy jest kalibrowany co najmniej raz w roku, aby upewnić się, że podajemy odpowiednią ilość znieczulenia. Umieść mysz w komorze i poczekaj, aż oddech znacznie spowolni. Wyjmij mysz i uszczypnij palec u nogi, aby upewnić się, że mysz jest całkowicie nieprzytomna.</li>
	<li>Ogol włosy od czubka ramienia do przestrzeni między oczami. Jeśli mysz zacznie się budzić, umieść ją z powrotem w komorze, aż mysz znów będzie całkowicie nieprzytomna, potwierdzając uszczypnięciem palca u nogi. Umieść znieczuloną mysz na stereotakcie i wsuń stożek nosowy na nos. Bądź delikatny, ponieważ zęby i kości są kruche.</li>
	<li>Skieruj przepływ gazu do stereotax, aby utrzymać mysz w stanie znieczulenia. Ważne jest, aby od czasu do czasu sprawdzać, czy mysz jest całkowicie nieprzytomna z uszczypnięciem palca u nogi podczas całej operacji. Zabezpiecz głowę za pomocą nauszników. Preferujemy wypoziomowanie nauszników, chociaż aby celować w komorę boczną, idealnie wypoziomowana czaszka nie jest konieczna ze względu na duży rozmiar komory.</li>
	<li>Zmniejsz poziom izofluranu do 2,0% w celu konserwacji. Nanieś maść na oko na każde oko. Jak widać na filmie, połóż sterylną zasłonę na myszy tak, aby odsłonięta była tylko podstawa szyi i głowy. Następnie zdezynfekuj obszar operacyjny, wycierając czubek głowy i szyję okrężnymi ruchami, zaczynając od środka ogolonego obszaru i przesuwając się najpierw na zewnątrz bawełnianym wacikiem zamoczonym w 95% etanolu, a następnie bawełnianym wacikiem zamoczonym w jodzie.</li>
	<li>Zalecamy stosowanie systemu ogrzewania z kontrolowaną temperaturą sprzężenia zwrotnego sondy doodbytniczej, który zapewnia, że temperatura myszy pozostaje na stabilnym poziomie 37 °C. Jeśli temperatura myszy spadnie podczas operacji, rekonwalescencja po operacji może potrwać dłużej, a wynikająca z tego hipotermia może prowadzić do nieprawidłowej aktywności białka, w tym hiperfosforylacji białka związanego z mikrotubulami Tau15. Po skonfigurowaniu systemu grzewczego jesteś teraz gotowy do rozpoczęcia zabiegu.</li>
</ol>
3. Implantacja pompy osmotycznej Alzet
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do zabiegu należy założyć nową parę sterylnych rękawiczek. Następnie, za pomocą kleszczy i małej pary nożyczek, wykonaj nacięcie w skórze od podstawy szyi nad czaszką zwierzęcia do góry między oczami</li>
	<li>Weź nożyczki z krzywizną skierowaną do góry i wsuń się pod skórę u podstawy szyi z powrotem w kierunku lewej kończyny tylnej. Nie powinno być żadnego oporu. Jeśli tak, wyjmij nożyczki i spróbuj ponownie. Tworzy to kieszeń podskórną dla pompy osmotycznej.</li>
	<li>Wytrzyj czaszkę do czysta sterylnymi bawełnianymi wacikami, a następnie bawełnianym wacikiem zamoczonym w nadtlenku wodoru, aby wzmocnić bregma.</li>
	<li>Wytrzyj stożkowe probówki o pojemności 50 ml, w których znajdują się pompki, aby zachować ich sterylność. Ostrożnie wyjmij pompkę z rurki stożkowej za pomocą zakrzywionego hemostatu, zwracając szczególną uwagę, aby pompa nie dotykała boków rurki stożkowej. Przytrzymaj podstawę pompy za pomocą kleszczy i popchnij modulator przepływu do końca za pomocą zakrzywionego hemostatu.</li>
	<li>Trzymaj pompę w miejscu, w którym modulator przepływu i rurka stykają się z zakrzywionym hemostatem. Włóż pompkę pod skórę u podstawy szyi i popchnij ją z powrotem w kierunku lewej kończyny tylnej tak daleko, jak to możliwe, bez oporu. Uważaj, aby cewnik niczego nie dotykał.</li>
	<li>Za pomocą zakrzywionego hemostatu chwyć kaniulę w rowku, w którym górna część styka się z cokołem. Przesuń sterownik kaniuli na miejsce i zabezpiecz na miejscu.</li>
	<li>Umieść pojedynczą kroplę super kleju na podstawie kaniuli. Wciśnij górną część kaniuli do sterownika i ustaw tak, aby rurka była skierowana prosto do tyłu.</li>
	<li>Dotknij końcówki cewnika do bregma i wyzeruj współrzędne na wyświetlaczu cyfrowym. Podnieś cewnik i przesuń go o 1,1 mm w bok w prawo i 0,5 mm do tyłu (ryc. 2B). Trzymaj skórę z dala od drogi za pomocą zakrzywionego hemostatu.</li>
	<li>Przeprowadź cienki metalowy cewnik przez czaszkę, aż plastikowa podstawa kaniuli zostanie bezpiecznie dociśnięta do górnej części czaszki. Metalowy cewnik może być wprowadzany bezpośrednio przez czaszkę u myszy ze względu na stosunkowo cienką czaszkę. Jeśli używasz szczurów, wywierć otwór w czaszce przed opuszczeniem cewnika.</li>
	<li>Odciągnij skórę, na której znajduje się klej, od czaszki. Gdy sterownik kaniuli przytrzymuje kaniulę/cewnik na miejscu, odczekaj 1-2 minuty, aż klej całkowicie wyschnie.</li>
	<li>Podczas ćwiczeń, aby ocenić umiejscowienie cewnika, wstrzyknij 20-40 μl 2,5% barwnika FastGreen Dye przez rurkę (ryc. 2C). Odczekaj 2-3 minuty, przelej mysz 1X PBS 0,03% heparyny i usuń mózg. Przeciąć koronowo w miejscu cewnika. Jeśli cewnik został umieszczony w komorze, barwnik zostanie ukrwiony w całym układzie komorowym myszy (ryc. 2D).</li>
	<li>Przytrzymaj cewnik na miejscu z zakrzywionym hemostatem, jednocześnie podnosząc sterownik. Powoli zwolnij hemostat, aby upewnić się, że kaniula jest prawidłowo przymocowana do czaszki.</li>
	<li>Za pomocą bawełnianego wacika dociśnij górną część kaniuli. Dopasuj maszynkę do strzyżenia kości szczura do rowka między górną a dolną częścią kaniuli. Odetnij górną część kaniuli, nadal dociskając bawełnianym wacikiem. Staraj się trzymać maszynkę do strzyżenia poziomo, aby nie odczepić kaniuli od czaszki. Jeśli kaniula zostanie odklejona, szybko przyklej ją ponownie i dociśnij bawełnianym wacikiem przez dodatkowe 2 minuty.</li>
	<li>Używając nici do szwów 5-0, zwykłego hemostatu i kleszczy, zszyj wzdłuż pełnego otworu, zwracając szczególną uwagę tuż nad kaniulą. Używamy poziomego szwu materacowego do biegania (patrz ryc. 5) ze względu na większe nacięcie nad czaszką.</li>
	<li>Nałóż odrobinę maści z antybiotykiem na głowę i szyję. Odkręć nauszniki i poluzuj stożek nosowy. Wyjmij mysz ze stereotaxa i umieść ją na podkładce rozgrzewającej w celu odzyskania. Uważnie monitoruj myszy przez cały czas rekonwalescencji, zwykle od 10 do 30 minut. Sprawdzaj co 2-3 minuty, aż mysz zacznie chodzić i pielęgnować się.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Monitoruj myszy codziennie po operacji przez pierwszy tydzień.</li>
	<li>Jeśli mysz wydaje się odczuwać ból lub niepokój, zalecamy podanie jej podskórnego zastrzyku 5 mg/kg karprofenu raz na 24 godziny przez okres do 5 dni w celu złagodzenia bólu.</li>
	<li>Jeśli wydaje się, że występuje infekcja, codziennie obficie nakładaj maść z antybiotykiem na obszar i skonsultuj się z lekarzem weterynarii, aby upewnić się, że rana prawidłowo się goi.</li>
	<li>Usuń nylonowy szew 5-0 7-10 dni po zabiegu, aby zapobiec podrażnieniu nici szwu.</li>
</ol>
5. Wymiana lub demontaż pompy osmotycznej Alzet
Po zakończeniu aktywnego napełniania ASO, pompa może zostać zmieniona lub całkowicie usunięta.
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z tą samą procedurą przedoperacyjną, co powyżej, z następującymi zmianami: 1) nie będziesz potrzebować zakrzywionych nożyczek, zakrzywionych hemostatów, obcinaczy kości szczurów ani wyświetlacza cyfrowego, oraz 2) zamiast przygotowywać głowę myszy, ogol i zdezynfekuj tył myszy na styku pompy i rurki.</li>
	<li>Wykonaj 1,5 cm nacięcie z tyłu myszy, prostopadle do złącza pompa/rurka, za pomocą kleszczy i nożyczek. Ostrożnie wyciągnij pompę z nacięcia, nie ciągnąc znacząco/nie naciskając na rurkę, ponieważ może to spowodować uszkodzenie cewnika.</li>
	<li>Aby wyjąć pompę, przypnij rurkę około 0.5 cm nad modulatorem przepływu i przyłóż klej do rurki, aby ją uszczelnić. Odczekaj 1-2 minuty, aż klej wyschnie. Umieść rurkę z powrotem w nacięciu i zamknij szew. Nanieś maść z antybiotykiem na zszytą skórę i umieść mysz na podgrzewanej podkładce regeneracyjnej.</li>
	<li>Aby wymienić pompę, przygotuj świeżo przygotowane pompy wraz z 10 cm naczyniem wypełnionym 95% etanolem. W przypadku nowych pomp cewniki nie są potrzebne.</li>
	<li>Chwyć nową pompę za pomocą kleszczy. Zanurz palce w etanolu, chwyć pompę i wyrzuć modulator przepływu. Następnie ostrożnie i powoli zdejmij starą pompę z modulatora przepływu podłączonego do rurki i kaniuli. Jak tylko zostanie wyłączony, powoli wsuń nową pompę, upewniając się, że modulator przepływu nigdy nie dotyka zewnętrznej części myszy.</li>
	<li>Ponownie włóż nową pompę przez nacięcie z powrotem do opakowania podskórnego i zszyj skórę. Nałóż maść z antybiotykiem na ranę i umieść mysz na podkładce regeneracyjnej.</li>
	<li>Podobnie jak w przypadku implantacji pompy, należy codziennie monitorować myszy po operacji, aby sprawdzić, czy nie ma bólu/dyskomfortu i infekcji. Leczenie karprofenem i antybiotykami, jeśli uzna się to za konieczne.</li>
</ol>
bolus ICV
6. Zabieg przedoperacyjny
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z tą samą procedurą przedoperacyjną, jak w sekcji 2 powyżej, z następującymi zmianami: 1) nie będziesz potrzebować zakrzywionych nożyczek, zakrzywionych hemostatów ani obcinaczy kości szczurów; 2) wyczyść strzykawkę i igłę Hamiltona o pojemności 10 μl wysterylizowaną wodą i załaduj ASO; oraz 3) podłączyć strzykawkę i igłę do aparatu stereotaktycznego, w którym znajdował się sterownik kaniuli.</li>
</ol>
7. Wstrzyknięcie bolusa ASO
<ol>
	<li>Za pomocą kleszczy i małej pary nożyczek wykonaj nacięcie od podstawy szyi do między oczami.</li>
	<li>Wytrzyj czaszkę do czysta sterylnymi bawełnianymi wacikami, a następnie bawełnianym wacikiem zamoczonym w nadtlenku wodoru, aby wzmocnić bregma.</li>
	<li>Przesunąć strzykawkę/igłę na miejsce i zabezpieczyć. Upewnij się, że ścięta część igły jest skierowana do tyłu. Opuścić igłę, aż dotknie bregmy. Wyzeruj wszystkie współrzędne. Przesunąć igłę w bok w prawo na 1,0 mm i do przodu na 0,3 mm (Rysunek 3A).</li>
	<li>Powoli wbijaj igłę w czaszkę, aż otwór na igłę zrówna się z górną częścią czaszki. Ponownie, można to zrobić ze względu na cienką czaszkę myszy. Wyzeruj współrzędną Z i opuść wskazówkę do -3,0 mm z prędkością 1 mm/s (Rysunek 3B). Odczekaj 2-3 minuty, aż mózg uszczelni się wokół igły.</li>
	<li>Dostarcz pełne 10 μl ASO w tempie 1 μl na sekundę. Odczekaj 2-3 min. W przypadku ASO do komory stosuje się dawkę 1 μl, chociaż szybkość ta może się różnić w zależności od leku. Podczas ćwiczeń sprawdź, czy igła jest prawidłowo umieszczona, podając 10-20 μl 2,5% barwnika FastGreen. Perfuzję myszy z 1X PBS 0,03% heparyny wkrótce po infuzji barwnika i wykonanie sekcji koronalnych mózgu, aby sprawdzić, czy barwnik znajduje się w układzie komorowym (ryc. 3C).</li>
	<li>Przyłóż bawełniany wacik do czaszki u podstawy igły. Podnosić igłę z szybkością 1 mm na sekundę. Gdy tylko igła znajdzie się poza czaszką, przetocz bawełniany wacik po otworze igły i przytrzymaj przez 1 minutę, aby zapobiec wyciekowi ASO.</li>
	<li>Zszyj skórę szczelnie, nałóż maść z antybiotykiem i umieść mysz na podgrzanej podkładce regeneracyjnej. W zależności od stężenia ASO, pełne odzyskanie sprawności może zająć od 20 minut do kilku godzin.</li>
	<li>Podobnie jak w przypadku implantacji pompy, należy codziennie monitorować myszy po operacji, aby sprawdzić, czy nie ma bólu/dyskomfortu i infekcji. Leczenie karprofenem i antybiotykami, jeśli uzna się to za konieczne.</li>
</ol>

<ol><li>Crooke, S. T., Bennett, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+antisense+oligonucleotide+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Progress in antisense oligonucleotide therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 107-129 (1996).</li>
<li>Sazani, P., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+antisense+oligonucleotides+as+modulators+of+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991-1995 (2002).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li>
<li>Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-Targeted+Therapies+for+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System.</a> Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).</li>
<li>Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Reduction+of+Target+RNAs+by+Small+Interfering+RNA+and+RNase+H-dependent+Antisense+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).</li>
<li>Smith, R. A., Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+Oligonucleotide+therapy+for+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).</li>
<li>Rosen, D. R., Siddique, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cu%2FZn+superoxide+disumutase+gene+are+associated+with+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature. 362, 6415-62 (1993).</li>
<li>Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+from+familial+and+sporadic+ALS+patients+are+toxic+to+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons.</a> Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).</li>
<li>Furukawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+roles+of+wild-type+Cu%2CZn-superoxide+dismutase+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Research+International%22%5BJournal%5D)">Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).</li>
<li>Hua, Y., Sahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).</li>
<li>Passini, M. A., Bu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+Oligonucleotide+Delivered+to+the+Mouse+CNS+Ameliorate+Symptoms+of+Severe+Spinal+Muscular+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy.</a> Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).</li>
<li>Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Therapeutic+Reversal+of+Huntington%27s+Disease+by+Transient+Repression+of+Huntingtin+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis.</a> Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586(2011).</li>
<li>Planel, E., Richter, K. E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+Leads+to+Tau+Hyperphosphorylation+through+Inhibition+of+Phosphatase+Activity+by+Hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).</li>
<li>Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotide+therapeutics+for+inherited+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. , In press, corrected proof (2012).</li>
<li>Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+therapeutics%3A+beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).</li>
</ol>

Autorzy otrzymują oligonukleotydy antysensowne od Isis Pharmaceuticals. Opłaty za otwarty dostęp sponsorowane przez Alzet Osmotic Pumps.

Zdolność do globalnego dostarczania leków do OUN, jak pokazano na filmie, jest niezwykle potężną techniką, która jest łatwa zarówno do nauczenia, jak i stosowania. Przy odrobinie wprawy implantację pojedynczej pompy lub bolus ICV można wykonać w ciągu 10 minut, co pozwala na jednoczesne leczenie dużych kohort myszy. Jest to szczególnie przydatne w przypadku badań z odczytem behawioralnym, ponieważ większe liczby dotyczące zachowania myszy mają kluczowe znaczenie dla zobaczenia znaczących różnic.
Opierając się na naszych doświadczeniach w dostarczaniu ASO za pomocą pomp i wstrzyknięć w bolusie, zaobserwowaliśmy pewne zalety i wady każdej metody. Należy zauważyć, że są to opinie w naszym laboratorium i mogą nie być prawdziwe dla wszystkich modeli myszy i szczurów.
Uważamy, że zaletą stosowania pomp jest ich zdolność do dostarczania dużej ilości ASO, ponieważ ASO jest rozprowadzane przez znacznie dłuższy okres czasu. Zwykle jest to równoznaczne z dłuższym długotrwałym knockdownem lub splicingiem po aktywnej infuzji ASO, chociaż nie zawsze tak jest. Pompy pozwalają również na dokładne ramy czasowe dostarczania ASO (14 dni, 28 dni lub 42 dni), a pompy można wymienić raz, aby umożliwić jeszcze dłuższy aktywny wlew ASO. Zauważyliśmy jednak, że wielokrotna zmiana pomp zwiększa zmienność ze względu na tworzenie się włóknistych kieszeni wokół pompy, które uniemożliwiają pompie prawidłowe wchłanianie płynu. Wadą pomp jest to, że niektóre myszy nie tolerują pompy tak dobrze, jak inne. Jeśli linia transgeniczna, z którą pracujesz, jest bardziej delikatna, pompa może być zbyt uciążliwa. Pompy należy również usunąć po ostatnim wlewie, poddając myszy kolejnej operacji i dodanemu znieczuleniu. Jeśli wykonujesz pracę behawioralną, szczególnie ważne jest, aby usunąć pompę i pozwolić na co najmniej 1-2 tygodnie rekonwalescencji, ponieważ obecność pompy wpłynie na niektóre zachowania u myszy.
W przypadku wstrzyknięć w bolusie ICV jedną z zalet jest koszt. Zakup strzykawek i igieł wiąże się z początkową inwestycją, ale z biegiem czasu zastrzyki w bolusie są bardziej opłacalne, ponieważ nie trzeba kupować pomp/rurek/cewników. Ogólnie rzecz biorąc, wstrzyknięcia bolusa ICV są mniej kosztowne ze względu na brak kaniul i pomp. Odkryliśmy również, że bolus ICV może być używany do dostarczania ASO młodszym i/lub bardziej delikatnym myszom. Wadą bolusa ICV jest to, że jest to pojedyncze wstrzyknięcie. Tą drogą nie można dostarczyć tak dużej ogólnej ilości ASO, a jeśli czas działania używanego ASO jest krótki, efekty knockdown/splicing również będą krótkotrwałe.
Zarówno pompy osmotyczne, jak i bolus ICV mają zdolność dostarczania ASO, które mogą niszczyć białka lub zmieniać splicing genów w całym OUN gryzoni, technika ta ma szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach związanych z neurobiologią. Sugerujemy pilotaż obu metod podawania, jeśli nie masz pewności, która droga podania jest najbardziej odpowiednia dla Twojego konkretnego badania.

Niektóre leki nie są w stanie przekroczyć bariery krew-mózg (BBB), co wymaga bezpośredniego dostarczenia do ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Aby obejść barierę krew-mózg, leki mogą być dostarczane bezpośrednio do mózgu przy użyciu opisanych metod. Podczas gdy nasze laboratorium i artykuł opisany w niniejszym dokumencie koncentrują się na oligonukleotydach antysensownych (ASO), inne leki, takie jak małe cząsteczki, przeciwciała, wektory terapii genowej itp., mogą być również dostarczane za pomocą dokładnie tego samego podejścia.
Niektóre białka odgrywają zasadniczą rolę w patogenezie chorób neurodegeneracyjnych. Takie białka często tworzą toksyczne gatunki i gromadzą się w agregaty, prowadząc do ostatecznej śmierci neuronów i późniejszej choroby neurologicznej 3-4. W celu spowolnienia lub nawet zatrzymania postępu tych chorób, jedną z opcji terapeutycznych może być bezpośrednie ukierunkowanie i zmniejszenie białka wywołującego. Jednak białka te często znajdują się wszędzie w OUN, co utrudnia skuteczne ich zwalczanie w skali globalnej.
Aby celować w geny w całym OUN, podajemy ASO do płynu mózgowo-rdzeniowego myszy (CSF) przez boczną komorę, aby ominąć barierę krew-mózg. Ta specyficzna metoda wykorzystuje układ komorowy myszy, który obmywa cały mózg i rdzeń kręgowy, umożliwiając szeroką dystrybucję ASO. Używamy ASO, które są 18-20 cząsteczkami podobnymi do merów RNA, które bezpośrednio wiążą docelową sekwencję mRNA i, w zależności od modyfikacji chemicznych ASO, albo A) rekrutują RNazę-H do degradacji mRNA prowadzącą do knockdownu, albo B) przesuwają alternatywny splicing 1,2,16,17. Należy zauważyć, że istnieje wiele cząsteczek do powalania określonego białka in vivo, w tym shRNA. Ponieważ te cząsteczki nie są przedmiotem tego artykułu, kierujemy czytelnika do przejrzenia artykułów, które lepiej opisują mechanizmy działania knockdown oraz zalety/wady każdej z nich.
W poprzednich pracach używaliśmy ASO do celowania w białkową dysmutazę ponadtlenkową 1 (SOD1) w transgenicznym szczurzym modelu stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) 7 (Rysunek 4). Mutacje w SOD1 występują w około 2% wszystkich przypadków ALS 8, chociaż ostatnio wysunięto hipotezę, że SOD1 może również odgrywać ważną rolę w sporadycznym ALS 9-10. Poprzez zmniejszenie całkowitego poziomu SOD1 u transgenicznego szczura z ALS, przeżycie po wystąpieniu choroby znacznie się zwiększyło 7. Te ważne dane były pierwszymi, które pokazały, że leczenie ASO w OUN może mieć głęboki pozytywny wpływ na model choroby neurologicznej. Od tego czasu ASO ukierunkowane na SOD1 u ludzi weszły w fazę I badania klinicznego na ludziach z minimalnymi skutkami ubocznymi (Clnicaltrails.gov NCT01041222), jak zaprezentowano na 64. dorocznej konferencji American Academy of Neurology w 2012 r. Obecnie trwają prace nad przejściem ASO do fazy II badań.
Podczas gdy celowanie w SOD1 było pierwszym dowodem użycia ASO do leczenia chorób neurologicznych, od tego czasu przeprowadzono kilka innych badań, które dotyczyły różnych chorób i ich odpowiednich celów białkowych. W 2010 i 2011 roku ASO, które przesuwają splicing przeżycia białka neuronu ruchowego 2 (SMN2), zastosowano w transgenicznych mysich modelach rdzeniowego zaniku mięśni (SMA) i spowodowały znaczną poprawę fenotypów choroby 11,12. Te splicing ASO są obecnie w fazie I badań klinicznych u dzieci z SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Dodatkowo, niedawno wykazano, że przejściowe podawanie ASO ukierunkowanych przeciwko genowi huntingtyny było w stanie radykalnie uratować mysi model Huntingtona, nawet po tym, jak poziom białka huntingtyny powrócił do wartości wyjściowej 13.
We wszystkich tych badaniach, ASO były dostarczane do bocznej komory, aby zmniejszyć całkowity poziom genów lub zmienić splicing genów przez cały OUN. Zarówno pompy osmotyczne, jak i pojedyncze wstrzyknięcie bolusa mogą być używane do dostarczania ASO do płynu mózgowo-rdzeniowego. Pompy pozwalają na powolne, ciągłe podawanie, podczas gdy bolus domózgowo-komorowy (ICV) to szybkie, jednorazowe wstrzyknięcie. Z powodzeniem zastosowaliśmy obie te metody, chociaż nie odnotowaliśmy bezpośredniego porównania między pompą a bolusem w jednej linii transgenicznej.
Używanie ASO w CNS to skuteczny sposób na zmniejszenie całkowitego poziomu białka i/lub zmianę splicingu kilku białek. Chociaż używamy ASO wyłącznie w leczeniu zaburzeń neurologicznych, zdajemy sobie sprawę, że inne dziedziny również mogą skorzystać z tej techniki. Tak długo, jak białko będące przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji w OUN, a ostatecznym celem jest osiągnięcie zmian w ekspresji genów w całym OUN, zastosowanie ASO w zademonstrowanych technikach może być bardzo przydatne.

<table><tbody><tr><td colspan="4">PRZYGOTOWANIE POMP OSMOTYCZNYCH ALZET </td></tr><tr><td>Pompa osmotyczna Alzet 14 dni Pompa osmotyczna</td><td>DURECT</td><td>Model 1002</td><td></td></tr><tr><td>Alzet 28 dni</td><td>DURECT</td><td>Model 2004</td><td></td></tr><tr><td>Pompa osmotyczna Alzet 42 dni</td><td>DURECT</td><td>Model 2006</td><td></td></tr><tr><td>Cewniki 2,5 mm</td><td>PlasticsOne</td><td>3280PM/SPC</td><td>Niestandardowe zamówienie do długości cewnika 2,5 mm</td></tr><tr><td>Rurka do cewnika winylowego</td><td>DURECT</td><td>7760</td><td>ID: 0,027 ", OD: 0,045"</td></tr> <tr><td>0,9% Chlorek sodu, Nawadnianie, USP</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>NIE do stosowania w pompach lub rurkach</td></tr><tr><td>0,9% chlorek sodu, do wstrzykiwań, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>p60 szalka Petriego (sterylizowana)</td><td>TRP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza chirurgiczne (sterylne)</td><td>Butler Schein</td><td>#007319</td><td></td></tr><tr><td>Lateksowe rękawice chirurgiczne (sterylne)</td><td>Micro-Touch</td><td></td><td>CatNie zależy to od rozmiaru potrzebnych rękawic</td></tr><tr><td>Sterylna serweta na ręczniki</td> Filtry strzykawkowe <td>Dynarex</td><td>4410.2um</td><td></td></tr> <tr><td>PALL</td><td></td><td>4192</td><td></td></tr> 1 <tr><td>ml Strzykawka (sterylna)</td> <td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>stożkowe<td>100% etanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PUMP & PROTOKOŁY CHIRURGICZNE BOLUSA</mocne> </td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11001-12</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione</td><td>narzędzia Hemostat Fine Science</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie, ostre nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Obcinacz do kości</td><td>Fine Science Tools</td><td>16104-14</td><td></td></tr><tr><td>Proste narzędzia do</td> <td>hemostatu</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 &mu; l gazoszczelny z wyjmowanymi igłami</td></tr><tr><td>Igły</td><td>Hamilton</td><td>7758-04</td><td>26 gauge, Point Style: 2</td></tr><tr><td>5-0 Nylonowa nić do szwów</td><td>Covidient</td><td>SN-871</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki alkoholowe</td><td>Select</td><td>#521</td><td></td></tr><tr><td>Waciki bawełniane (sterylne)</td> <td>Puritan</td><td>REF 806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td></td><td>Butelki z długą szyjką</td></tr><tr><td>UWAGA: FastGreen Dye</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>Noś osłony oczu i rękawice podczas pracy z tym produktem</td></tr><tr><td>Antybiotyk w kremie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maść</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pod oczy Golarka</td><td></td><td></td><td></td>elektryczna</tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% Provadone jod</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% Nadtlenek</td><td></td><td></td> Hydogenu<td></td></tr><tr><td>Podkładka rozgrzewająca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator kulek</td><td>SouthPointe Chirurgiczny</td><td>GRM5-1450</td><td></td></tr><tr><td>Małe zwierzę Stereotaktyczny</td><td></td><td>Kopf Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Stożek nosowy</td><td>Kopf</td><td>Model 923-B</td><td></td></tr><tr><td>Listwy nauszne</td><td>Kopf</td><td>Model 921</td><td>Ten model jest opcjonalny</td></tr><tr><td>Sterownik kaniuli</td><td>Kopf</td><td>Model 1966</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt strzykawki</td><td>Kopf</td><td>Model 1972</td><td></td></tr><tr><td>System kontroli temperatury</td><td>Kopf</td><td>Model TCAT-2LV</td><td>Opcjonalny</td></tr><tr><td>system</td><td></td><td></td><td></td> tlenu / izofluranu</tr></tbody></table>

bezpośrednie dokomorowe dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Ze względu na niemożność przekroczenia bariery krew-mózg, niektóre leki muszą być bezpośrednio dostarczane do ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Nasze laboratorium koncentruje się w szczególności na oligonukleotydach antysensownych (ASO), chociaż techniki pokazane na filmie mogą być również wykorzystywane do dostarczania wielu innych leków do OUN. Oligonukleotydy antysensowne (ASO) mają zdolność do powalania celów specyficznych dla sekwencji 1, a także do zmiany proporcji izoform określonych genów 2. Aby osiągnąć powszechne knockdown lub splicing genów w OUN myszy, ASO mogą być dostarczane do mózgu za pomocą dwóch oddzielnych dróg podawania, z których obie pokazujemy na filmie.
Pierwszy używa pomp osmotycznych Alzet, połączonych z cewnikiem, który jest chirurgicznie wszczepiany do bocznej komory. Pozwala to na ciągłe podawanie ASO do OUN przez określony czas. Drugi polega na pojedynczym wstrzyknięciu w bolusie wysokiego stężenia ASO do prawej komory bocznej. Obie metody wykorzystują układ komorowy mózgu myszy do dostarczania ASO do całego mózgu i rdzenia kręgowego, chociaż w zależności od potrzeb badania, jedna metoda może być preferowana nad drugą.

Po infuzji z pompy lub w wyznaczonym czasie po wstrzyknięciu bolusa do komór mózgu (ICV) (rutynowo stosujemy okres czterech tygodni), ważne jest przetestowanie skuteczności ASO. Zalecamy pobranie różnych obszarów mózgu i rdzenia kręgowego w celu pomiaru poziomów/izoform genu docelowego, zarówno na poziomie mRNA przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, jak i na poziomie białka przy użyciu Western Blot lub testu ELISA (Rysunek 4 jako opublikowany przykład). Pomoże to określić skuteczność ASO w różnych obszarach OUN. Jeśli okres półtrwania docelowego białka jest długi, zalecamy dłuższy czas oczekiwania po infuzji ASO, aby ocenić maksymalne wyciszenie białka lub splicing.
Ważne jest również przetestowanie rozkładu oligonukleotydów. Infuzje za pomocą pompy prowadzą do rozprzestrzenienia się substancji w obu półkulach, ipsilateralnej i kontralateralnej, choć wyższe stężenie ASO często obserwuje się w obszarach położonych bliżej układu komorowego 16. Iniekcje bolusowe do komór mózgu (ICV) zapewniają bardziej jednolity rozkład oligonukleotydów w całym OUN 16, choć ich efekty mogą być krótsze. W celu zapoznania się z bezpośrednim porównaniem rozkładu oligonukleotydów przy zastosowaniu pompy i metody bolusowej odsyłamy czytelnika do pracy Southwell et al. 16.
Zalecamy również testowanie wielu dawek, a także czasu działania ASO, ponieważ każde ASO będzie zachowywać się nieco inaczej in vivo. ASO zazwyczaj charakteryzują się stosunkowo długim czasem działania, przy czym wyciszenie docelowego genu lub zmiana splicingu utrzymują się przez kilka miesięcy po podaniu ASO. Ponadto niektóre ASO będą działać lepiej niż inne, a niektóre geny docelowe będą łatwiejsze do wyciszenia. Z tego powodu, podczas przesiewania ASO w celu wyłonienia głównego kandydata, zalecamy w pierwszym etapie przetestowanie co najmniej 3-5 ASO in vivo, z grupą n = 4-6 dorosłych myszy na każde ASO.
W przypadku stosowania leku innego niż ASO, istotne będzie również przeprowadzenie badań pilotażowych w celu ustalenia optymalnego stężenia leku, czasu jego działania oraz rozkładu leku w OUN dla konkretnego związku.
<img alt="Tabela współrzędnych pompy osmotycznej i bolusa ICV dla myszy/szczura; dane przednio-tylne i przyśrodkowo-boczne." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Współrzędne chirurgiczne. Współrzędne wykorzystywane do trafienia w prawą komorę boczną u myszy i szczurów podczas implantacji pomp osmotycznych, a także przy podawaniu bolusa dopracerebrowentrykularnego (ICV). Oba zestawy współrzędnych, zarówno dla pomp, jak i dla bolusa ICV, celują w prawą komorę boczną. Stosujemy dwa różne zestawy, ponieważ posiadamy z nimi największe doświadczenie i wiemy, że zapewniają one doskonałą dystrybucję ASO.
<img alt="Układ eksperymentalny kąpieli organowej w laboratorium; biomechanika; opisany sprzęt; badanie skurczu mięśni." src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1. Układ stereotaktyczny. (A) Niezbędny sprzęt stereotaktyczny do zabiegów wszczepienia pompy Alzet oraz iniekcji bolusa. i) Sterylizator szklanych kulek. ii) Cyfrowy wyświetlacz odczytu. iii) Podstawa stereotaktyczna z ruchomymi ramionami. iv) Podgrzewacz z kontrolą temperatury. v) System izofluran/tlen. vi) Komora izofluranowa. (B) Zbliżenie na stożek nosowy i pręty uszne. (C) Dwa wymagane akcesoria. Lewo: uchwyt strzykawki/igły do wewnątrzkomorowych (ICV) iniekcji bolusa. Prawo: prowadnica kaniuli do implantacji pompy osmotycznej.
<img alt="Metoda infuzji do mózgu szczura metodą stereotaksyczną z wykorzystaniem kaniuli, rurki, strzykawki oraz analiza wyniku barwienia komór." src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Implantacja pompy osmotycznej Alzet. (A) Opcje pomp osmotycznych Alzet dla myszy. Pompy 14-dniowe (0,25 μl/hr), pompy 28-dniowe (0,25 μl/hr), pompy 42-dniowe (0,15 μl/hr). (B) Współrzędne implantacji pompy względem bregmy: -0,5 mm Posterior (tylnie), -1,1 mm Lateral (bocznie, prawa strona) oraz -2,5 mm Ventral (brzusznie, długość cewnika). (C) Po wprowadzeniu cewnika przez czaszkę i przyklejeniu kaniuli, przez cewnik przepływany jest barwnik w celu oceny prawidłowego umiejscowienia cewnika w komorze bocznej. (D) Perfuzowany mózg bezpośrednio po podaniu barwnika, zgodnie z opisem w punkcie (C). Jeśli cewnik został pomyślnie umieszczony w komorze, barwnik rozprowadzi się w całym układzie komorowym myszy.
<img alt="Układ do iniekcji do mózgu; schemat stereotaksyczny, rozmieszczenie strzykawki i wyniki barwienia komór." src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Bolusowa iniekcja dokomorowa. (A) Współrzędne dla iniekcji bolusowej względem bregmy: +0.3 mm przednio, -1.0 mm bocznie (prawo) oraz -3.0 mm brzuchowo. (B) Po wprowadzeniu igły przez czaszkę na głębokość -3.0 mm brzuchowo, przez strzykawkę podaje się barwnik, aby ocenić prawidłowe umiejscowienie igły w komorze bocznej. (C) Perfuzjowany mózg krótko po podaniu barwnika zgodnie z opisem w (B). Jeśli igła została prawidłowo umieszczona w komorze, barwnik rozprowadzi się w całym systemie komorowym myszy.
<img alt="Analiza SOD1 u szczura; poziomy mRNA, białka; Western blot, wykresy słupkowe; wyniki eksperymentalne." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Oligonukleotydy antysensowne redukują poziom SOD1 u szczurów in vivo (rycina pochodzi bezpośrednio z publikacji Smith et al. 7). (A-D) Antysensowne oligonukleotydy SOD1 SODr146192 lub SODscrambled wprowadzano w ilości 100 μg/dobę przez 28 dni do prawego brzuszka bocznego u prawidłowych szczurów. (A) Poziomy endogennego mRNA SOD1 w mózgu i rdzeniu kręgowym zmierzone za pomocą qRT-PCR. (B) Poziomy białka SOD1 i α-tubuliny po infuzji ASO. (C i D) Ilościowe oznaczenia poziomów białka tubuliny i SOD1 dla różnych obszarów mózgu po infuzji. (E) ASO przeciwko presenilinie 1 lub GSK-3β wprowadzano przez 2 tygodnie do prawego brzuszka bocznego u myszy nietransgenicznych, a poziomy mRNA oceniano w prawej korze czołowej/skroniowej. Powielone za zgodą American Society for Clinical Investigation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Diagram ścieżki rozwiązywania labiryntu przez gryzonia, eksperymentalna analiza behawioralna." src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
 Rycina 5. Ciągły szew poziomy na materac. Nić nylonowa 5-0 jest prowadzona przeplatany przez skórę, zaczynając od strony przedniej i kierując się ku tylnej, z większym zagęszczeniem nad kaniulą. Po dotarciu do najbardziej tylnego punktu, nić jest prowadzona z powrotem w górę i ponownie przeplatana nad kaniulą. Zapewnia to prawidłowe zamknięcie rany i zapobiega przemieszczaniu się kaniuli/rurki przez skórę.

Opisujemy metodę kierowania leków do ośrodkowego układu nerwowego poprzez wszczepienie cewnika lub wykonanie wstrzyknięcia bolusa do prawej bocznej komory u myszy. Skupiamy się w szczególności na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych. Technika ta można łatwo dostosować do innych leków i szczurów.

Bezpośrednie dokomorowe dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest bezpośrednie podawanie leków, takich jak oligonukleotydy antysensowne, opisanych w niniejszym protokole, do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni poprzez komorę boczną. Jest to realizowane za pomocą dwóch różnych metod. Pierwsza z nich polega na chirurgicznym wszczepieniu metalowego cewnika połączonego z osmotyczną pompą zet do prawej komory bocznej myszy.Po zakończeniu podawania leku przez pompę, można ją całkowicie usunąć, co oznacza przerwanie leczenia, lub wymienić, co pozwala na kontynuację aktywnej terapii. Druga metoda podawania leku polega na pojedynczym wstrzyknięciu dawką bolus do prawego brzuszka komory bocznej. Metoda ta umożliwia szybkie wprowadzenie określonej ilości leku do całego ośrodkowego układu nerwowego, co pozwala zademonstrować skuteczne dostarczenie oligonukleotydów antysensownych do całego OUN gryzoni.Jak pokazano w niniejszym protokole, po infuzji oligo należy zmierzyć poziom mRNA i białka w kilku różnych obszarach mózgu. Choć metoda ta pozwala zrozumieć, w jaki sposób bezpośrednio podawać oligosonudy antysensowne do ośrodkowego układu nerwowego, można ją zastosować również w przypadku innych leków, w tym przeciwciał, terapii genowych, wektorów oraz małych cząsteczek.Wszystkie procedury chirurgiczne muszą być przeprowadzane w warunkach sterylnych, przy użyciu sterylnego sprzętu i roztworów, zgodnie z wytycznymi instytucji oraz przepisami rządowymi. Szczegółowe informacje znajdują się w protokole tekstowym oraz w instytucjonalnych wytycznych iacuc. Po znieczuleniu myszy w komorze indukcyjnej izofluranem, należy wyjąć zwierzę i wykonać ucisk palca u nogi, aby upewnić się, że mysz jest całkowicie nieprzytomna.Szybko ogol sierść od górnej części barku aż do obszaru między oczami. Następnie ostrożnie i delikatnie umieść znieczuczoną mysz w stereotaksie. Nasuń lejek na nos i skieruj przepływ gazu do stereotaksy.Aby utrzymać mysz w narkozie, należy unieruchomić głowę za pomocą prętów usznych. W tym przypadku zastosowano pręty poziomujące, jednak w celu celowania w komorę boczną idealnie poziome ustawienie czaszki nie jest konieczne ze względu na duży rozmiar komory. Obniż poziom izofluranu do 2% w celu podtrzymania znieczulenia i nanieś maść do oczu.Przetrzyj górną część głowy i szyi nad każdym okiem patyczkiem watnym nasączonym 95% Ethanolem, a następnie patyczkiem watnym nasączonym jodyną, aby zdezynfekować pole operacyjne. Na myszy należy również założyć jałowe pole operacyjne. Upewnij się, że temperatura ciała myszy utrzymuje się na poziomie 37 °C.Zastosowano tutaj system grzewczy sterowany temperaturą z pętlą sprzężenia zwrotnego za pomocą sondy rektalnej. Następnie należy przystąpić do implantacji pompy zat. Wybrać odpowiednią pompę w zależności od wymaganej liczby dni infuzji i przygotować ją zgodnie z instrukcjami zawartymi w części tekstowej protokołu.Po wykonaniu nacięcia od podstawy szyi do obszaru między oczami, ostrożnie wprowadź tępe nożyczki wygięciem do góry pod skórę u podstawy szyi. Przesuń nożyczki w stronę lewej kończyny tylnej i lekko je rozewrzyj, aby utworzyć kieszeń podskórną. Oczyść czaszkę za pomocą sterylnych patyczków watnych, a następnie przemyj ją patyczkiem nasączonym nadtlenkiem wodoru.Aby wzmocnić bgma, należy użyć zakrzywionej kleszczyków hemostatycznych, aby ostrożnie wyjąć pompę z probówki stożkowej, dbając o to, by pompa nie dotknęła ścianek probówki. Trzymając podstawę pompy pęsetą, należy docisnąć modulator przepływu do końca. Następnie należy użyć zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych, aby przytrzymać pompę w miejscu połączenia modulatora przepływu z cewką.Wprowadź pompkę pod skórę u podstawy szyi i ostrożnie przesuń ją w stronę lewej kończyny tylnej tak daleko, jak to możliwe bez napotykania oporu. Należy uważać, aby cewnik nie dotknął niczego za pomocą zakrzywionego kleszczyka hemostatycznego. Chwyć kaniulę w rowku, w miejscu połączenia górnej części z podstawą.Przesuń prowadnicę kaniuli do odpowiedniej pozycji i zabezpiecz ją w miejscu. Następnie nanieś jedną kroplę superglue na podstawę kaniuli, wciśnij górną część kaniuli do prowadnicy i ustaw ją tak, aby rurka była skierowana prosto do tyłu. Działając szybko, dotknij końcówką cewnika do bgma i wyzeruj współrzędne na wyświetlaczu cyfrowym, odsuwając jednocześnie skórę.Za pomocą zakrzywionej kleszczyczki hemostatycznej unieś cewnik i przesuń go o 1,1 mm bocznie w prawo oraz o 0,5 mm w kierunku tylnym. Zgodnie z tym schematem, szybko wprowadź cewnik przez czaszkę, aż podstawa kaniuli zostanie pewnie dociśnięta do kości czaszki. Ze względu na stosunkowo cienką czaszkę myszy, cewnik można wprowadzić bezpośrednio przez nią.Odsuń od czaszki wszelkie fragmenty skóry, na których znajduje się klej. Następnie, trzymając kaniulę w miejscu za pomocą prowadnika, odczekaj jedną do dwóch minut, aż klej całkowicie wyschnie. Następnie unieruchom kaniulę zakrzywioną kleszczykami hemostatycznymi, jednocześnie podnosząc prowadnik.Powoli zwolnij kleszczyki hemostatyczne, aby upewnić się, że kaniula jest prawidłowo przymocowana do czaszki. Za pomocą patyczka higienicznego dociśnij górną część kaniuli. Umieść sterylne kleszczyki do kości szczura w rowku między górną a dolną częścią kaniuli, utrzymując kleszczyki w poziomie.Aby uniknąć odłączenia kaniuli od klipsa czaszkowego, należy ją przytrzymać od góry, jednocześnie naciskając patyczkiem higienicznym. Używając nylonowej nici chirurgicznej 5-0, zwykłego kleszczyka hemostatycznego i pęsety, zaszyć cały otwór, zwracając szczególną uwagę na obszar nad kaniulą. Nanieść niewielką ilość maści z antybiotykiem na głowę i szyję.Odkręć uchwyty uszne i poluzuj uchwyt nosowy. Wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego i umieść ją na podgrzewaczu w celu rekonwalescencji. Monitoruj myszy codziennie po zabiegu, aby sprawdzić, czy nie występuje ból, dyskomfort lub infekcje, i w razie potrzeby podawaj leki przeciwbólowe, takie jak karprofen, zgodnie z zatwierdzonym protokołem.Aby usunąć zużytą pompę, należy ostrożnie wyciągnąć ją przez nacięcie o szerokości 1,5 centymetra, wykonane prostopadle do złącza pompy na grzbiecie myszy, unikając przy tym nadmiernego ciągnięcia lub pchania rurek. Następnie należy odciąć rurkę w odległości około 0,5 centymetra powyżej modulatora przepływu i nanieść superglue na koniec rurki, aby go uszczelnić. Odczekać od jednej do dwóch minut do wyschnięcia kleju.Wprowadź rurkę z powrotem do nacięcia i zaszyj ranę, a następnie nałóż maść z antybiotykiem na zaszytą skórę i umieść mysz na podgrzewanym podkładzie regeneracyjnym. W przypadku wymiany pompy, przygotuj nową pompę oraz szalkę o średnicy 10 cm wypełnioną 95% ethanol. Użyj pęsety, aby chwycić nową pompę.Następnie zanurz palce drugiej ręki w 95%ethanol i chwyć pompę. Usuń nowy modulator przepływu pompy i ostrożnie zdejmij starą pompę z jej modulatora przepływu. Podłącz do cewników i kaniuli. Gdy tylko stara pompa zostanie zdjęta, powoli nasuń nową pompę, dbając o to, aby modulator przepływu nigdy nie dotknął zewnętrznej strony ciała myszy.Wprowadź nową pompę przez nacięcie z powrotem do kieszonki podskórnej i zaszyj skórę. Po zszyciu skóry, podobnie jak wcześniej, nałóż maść z antybiotykiem na ranę i umieść mysz na podkładce regeneracyjnej. Ponownie monitoruj myszy codziennie po zabiegu, aby sprawdzić, czy nie występuje ból, dyskomfort lub infekcje, i podawaj leki przeciwbólowe w razie potrzeby. Aby podać bolus do komór mózgowych, wykonaj nacięcie skóry głowy tak jak wcześniej, a następnie przetrzyj czaszkę zwierzęcia do czystości i opracuj ją nadtlenkiem wodoru.Następnie umieść strzykawkę z lekiem w odpowiednim miejscu. Skieruj ścięty koniec igły w stronę tylną i unieruchom go. Obniżaj igłę, aż dotknie ona bgma.Wyzeruj wszystkie współrzędne, a następnie przesuń igłę bocznie w prawo o 1,0 mm oraz przednio o 0,3 mm. Powoli wprowadzaj igłę przez czaszkę, aż górna krawędź ścięcia igły zrówna się z górną powierzchnią czaszki. Ponownie, jest to możliwe dzięki niewielkiej grubości czaszki myszy.Ustaw współrzędną Z i opuść igłę do poziomu -3,0 mm z prędkością 1 mm/s. Odczekaj od dwóch do trzech minut, aby tkanka mózgowa uszczelniła się wokół igły. Podaj pełną objętość 10 µL oligonukleotydu antysensownego z prędkością 1 µL/s.Odczekać od dwóch do trzech minut. Do infuzji oligonukleotydów do komory mózgu stosuje się szybkość podawania 1 µL/s. Chociaż szybkość ta może się różnić w zależności od stosowanego leku, należy przytrzymać patyczek higieniczny przy czaszce u podstawy igły.Podnoś igłę z prędkością 1 mm/s. Gdy tylko igła wyjdzie z czaszki, przesuń patyczkiem kosmetycznym po otworze po igle i przytrzymaj przez jedną minutę, aby zapobiec wyciekowi leku. Po zaszyciu skóry i nałożeniu maści z antybiotykiem, umieść mysz na ogrzewanym podkładzie regeneracyjnym.W zależności od stężenia oligonukleotydów pełny powrót do sprawności może zająć od 20 minut do kilku godzin. Ponownie, należy codziennie monitorować myszy po zabiegu, aby sprawdzić, czy nie występują objawy bólu, dyskomfortu lub infekcje, i w razie potrzeby podawać leki przeciwbólowe. Na tym obrazie przedstawiono perfuzowany mózg bezpośrednio po podaniu barwnika fast green w celu zweryfikowania współrzędnych wprowadzenia pompy osmotycznej zet do komory mózgu.Jak pokazano w tym filmie, jeśli cewnik zostanie pomyślnie umieszczony w komorze, barwnik rozprowadzi się w całym systemie komorowym myszy, co widać tutaj. Ten obraz przedstawia perfundowany mózg krótko po podaniu barwnika fast green w celu przetestowania współrzędnych i procedury wewnątrzkomorowego wstrzyknięcia dawką bolus. Jeśli igła zostanie pomyślnie umieszczona w komorze, barwnik ponownie rozprowadzi się w całym systemie komorowym myszy.Poniższe obrazy przedstawiają wyniki eksperymentu z zastosowaniem oligonukleotydów antysensownych w celu redukcji So D one in vivo. Oligonukleotydy antysensowne So D one wlewano przez 28 dni do prawej komory bocznej zdrowych szczurów w dawce 100 micrograms na dobę. Obraz ten pokazuje, że poziomy endogennego mRNA OD one w mózgu i rdzeniu kręgowym uległy obniżeniu.Po infuzji oligonukleotydu przeciwko SOD1, przeprowadzonej zgodnie z pomiarami Q-R-T-P-C-R, obraz ten pokazuje, że poziomy białka SOD1 są również obniżone. Po infuzji antysensownego oligonukleotydu przeciwko SOD1, poziomy białka tubuliny oraz SOD1 zostały zmierzone w różnych obszarach mózgu, co wykazuje, że oligonukleotyd przeciwko SOD1 specyficznie powoduje wyciszenie SOD1. Dodatkowo, do prawego brzuszka bocznego myszy nietransgenicznych przez dwa tygodnie infundowano oligonukleotydy przeciwko presenilinie 1 lub GSK3β, a następnie oceniono poziomy mRNA.Wynik ten pokazuje szeroki wachlarz celów, które można modulować za pomocą oligosunukleotydów antysensownych. Po opanowaniu tych technik, zarówno infuzja ciągła, jak i wstrzyknięcie bolusa mogą zostać wykonane w ciągu 10 minut, pod warunkiem ich prawidłowego przeprowadzenia.

direct-intraventricular-delivery-drugs-to-rodent-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Bezpośrednie wprowadzanie leków do układu nerwowego ssaków laboratoryjnych

Gruntowne testy przedkliniczne leków działających w ośrodkowym układzie nerwowym często obejmują ocenę i porównanie biodystrybucji leku w zależności od konkretnych dróg podania. W niniejszym materiale zaprezentowano na myszach trzy powszechnie stosowane metody podania ogólnoustrojowego (dożylne, dosytnieniowe oraz doustne), a także metodę podania miejscowego (podanie wspomagane konwekcją).

Systemiczne i miejscowe dostarczanie leków w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego w modelach gryzoni

W niniejszym artykule zaprezentowano dwie bardzo różne metody iniekcji: 1) do mózgu (do komór mózgu) oraz 2) systemową (dożylną), w celu wprowadzenia czynników terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy.

Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy

Źródło: Poland, R. i wsp. Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania. J. Vis. Exp. (2015)W tym filmie zestaw do mikroiniekcji wypełniony wodą, składający się ze strzykawki i rurki do mikrowstrzykiwaczy, służy do precyzyjnego dostarczania leku. Szczur z wszczepioną kaniulą prowadzącą jest poddawany celowanej mikroiniekcji mózgu, umożliwiającej dokładne podawanie środków terapeutycznych obudzonym zwierzętom przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.

Oparte na mikroiniekcjach dostarczanie środka terapeutycznego do obudzonego mózgu gryzonia

Ten film pokazuje wstrzyknięcie domózgowo-komorowe za pośrednictwem ommaya na modelu mysim. Metoda umożliwia miejscowe dostarczanie potencjalnych kandydatów na leki i omija barierę krew-mózg.

Wstrzyknięcie do komory mózgowej u myszy: metoda bezpośredniego podawania leków za pośrednictwem firmy Ommaya w celu dostarczania leków do komór mózgowych mózgu myszy

Źródło: Chen, Y., et al. Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje dostarczanie badanego związku do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) przez cewnik wszczepiony w odcinek lędźwiowy kręgosłupa modelu szczurzego. Związek krąży wzdłuż płynu mózgowo-rdzeniowego do mózgu i rdzenia kręgowego, wnika do neuronów i oferuje potencjał terapeutyczny.

Dokanałowe podawanie badanego związku do ośrodkowego układu nerwowego szczura

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Tutaj opisujemy metodę dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego szczura poprzez wszczepienie cewnika w śródoponową przestrzeń lędźwiową kręgosłupa. Koncentrujemy się na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych, chociaż ta metoda nadaje się również do dostarczania innych metod terapeutycznych.

Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura

Zgłaszana jest metoda dostarczania nerwowych komórek macierzystych, przystosowanych do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin, przez wspólną tętnicę szyjną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) po udarze niedokrwiennym. Wstrzyknięte komórki są szeroko rozmieszczone w miąższu mózgu i można je wykryć do 30 dni po porodzie.

Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu

Tutaj opisane jest proste i szybkie podejście do wykonywania iniekcji domózgowo-komorowych u myszy metodą wolnej ręki (czyli bez urządzenia stereotaktycznego).

Iniekcje domózgowo-komorowe z wolnej ręki u myszy

Przedstawiamy protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego u szczurów, umożliwiający dostarczanie leku bezpośrednio do nerwu bez powikłań po wstrzyknięciu. Metoda ta ma zastosowanie w przedklinicznych badaniach neurologicznych obejmujących manipulację autonomicznego układu nerwowego. Może być stosowany do bezpośredniego wstrzykiwania nerwów dla innych nerwów u szczurów i innych gatunków, z niezbędnymi modyfikacjami.

Protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego dla szczurów

Poznaj metody bezpośredniego dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni poprzez wszczepianie katetera z pompą osmotyczną lub pojedynczy zastrzyk do komory bocznej.

Bezpośrednie dokomorowe dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Przeglądaj więcej filmów