Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja typowych interakcji między płytkami krwi a neutrofilami na aktywowanym śródbłonku podczas choroby naczyniowej. Jest to realizowane za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii intravitalnej w czasie rzeczywistym u żywych myszy w celu wizualizacji mikrokrążenia w mięśniu kremastor. W drugim kroku wprowadzane są infuzyjnie przeciwciała znakowane fluorescencyjnie, a następnie inicjowany jest stan zapalny naczyń lub uraz, aby umożliwić bezpośrednią wizualizację wynikających z tego interakcji między płytkami krwi a neutrofilami.

Następnie analizowane są zapisane dane w celu określenia liczby komórek oraz ich dynamiki. Ostatecznie, na podstawie sygnału fluorescencyjnego wprowadzonych przeciwciał w mikroskopii intravitalnej w czasie rzeczywistym, można ocenić bezpośrednie interakcje typowe między płytkami krwi a neutrofilami na aktywowanym śródbłonku. Nasza technika mikroskopii intravitalnej pozwala uzyskać wgląd w interakcje w czasie rzeczywistym między płytkami krwi a neutrofilami na aktywowanym śródbłonku podczas stanu zapalnego naczyń i tworzenia się zakrzepu.

Tę technologię można zastosować również w innych układach, na przykład do oceny oddziaływań między komórkami nowotworowymi a komórkami krwi. Przed rozpoczęciem eksperymentu włącz system mikroskopowy dla modelu zapalenia naczyń. Wykonaj wewnątrzustrojowy zastrzyk lustrzany TNF alpha na trzy godziny przed podaniem środków znieczulających drogą IP.

Po potwierdzeniu sedacji za pomocą ucisku palców stopy, wprowadź kaniulę PE 90 do tchawicy myszy, aby wyeliminować wszelkie trudności z oddychaniem. Następnie wprowadź kaniulę PE 10 do lewej żyły szyjnej w celu infuzji przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie oraz dodatkowych środków znieczulających. Następnie delikatnie odciągnij i wykonaj poziome nacięcie skóry moszny oraz przemyj pole operacyjne wcześniej podgrzanym buforem.

Następnie, uciskając jedną pęsetą dolną część brzucha, ostrożnie wyciągnij drugą pęsetą jądro, chwyć pionowo mięsień opuszkowy i rozprostuj mięsień na szkiełku nakrywowym w kuwecie mikroskopowej, przypinając tkankę obwodową do kuwety. Rozpocznij ten etap od infuzji przeciwciał rat CD42C sprzężonych z DiT 488 oraz przeciwciał anty-mysich GR1 sprzężonych z Alexa Fluor 647 przez wcześniej wprowadzoną kaniulę żylną. Następnie w ustawieniach filtra mikroskopu zaznacz pola wyboru dla kanałów, które mają zostać naświetlone, i ustaw czas ekspozycji dla każdego wybranego ujęcia w trybie time-lapse.

Ustaw liczbę punktów czasowych w zakresie od 1000 do 1500 z interwałem 200 milisekund, tak aby całkowity czas trwania wynosił pięć minut. Po ustawieniu wszystkich parametrów w module przechwytywania obrazu, wybierz start, aby rozpocząć akwizycję przy powiększeniu 60x z oknem o wymiarach 157 mikrometr na 118 mikrometr. Monitoruj tocznię oraz przylegające płytki krwi do neutrofili przez pięć minut w górnej połowie stanu zapalnego naczynia kremaster.

Aby przeanalizować tworzenie się zakrzepu płytkowego, przejdź do opcji maski i wybierz utwórz. Następnie w narzędziu zaznaczania w głównym widoku kliknij dużą ikonę ołówka. Użyj ołówka, aby zaznaczyć kolorami obszar poza naczyniem w głównym widoku.

Aby ustawić maskę tła, przejdź do zakładki mask, kliknij copy this plane, a następnie click copy mask. W punkcie current time point zaznacz wszystkie punkty czasowe i kliknij okay. Aby obliczyć sygnał tła, przejdź do zakładki statistics i kliknij mask statistics.

Następnie w zakresie obrazu (image scope) kliknij aktualny obraz 2D time-lapse lub cztery obrazy D w zakresie maski (mask scope), a w sekcji cech (features) zaznacz całą maskę (entire mask). W sekcji daty przechwytywania (date of capture) wybierz czas upływu (elapse time). W sekcji geometrii morfologicznej (morph geometry) wybierz powierzchnię w pikselach (area in pixels), a w sekcji intensywności (intensity) wybierz intensywność maksymalną (maximum intensity).

Teraz kliknij eksport. Otwórz plik tekstowy w programie arkuszy kalkulacyjnych i oblicz średnią wartość sygnału tła w całym okresie rejestracji, aby określić intensywność fluorescencji tła.

Po obliczeniu intensywności fluorescencji tła podczas tworzenia zakrzepu płytkowego, zgodnie z zaprezentowanym modelem zapalenia naczyniowego, przejdź do zakładki mask, kliknij segment, wybierz fit e oraz channel, a następnie wprowadź średnią wartość sygnału tła dla niskich wartości, kliknij apply i okay. Następnie przejdź do zakładki statistics i kliknij mask statistics. Teraz w image scope kliknij current 2D time-lapse lub four D images, a w mask scope wybierz entire mask; w sekcji features w polu date of capture wybierz elapsed time, w morph geometry wybierz area in pixels, a w intensity wybierz sum intensity.

Następnie kliknij eksport. Otwórz plik tekstowy w programie arkuszy kalkulacyjnych i oblicz intensywność fluorescencji skrzepu płytek krwi. Aby przeanalizować zakrzepicę tętniczek, rozpocznij od infuzji przeciwciał anti mouse CD 42 C koniugowanych z DITE 4 88 ORAZ przeciwciał anti mouse GR one koniugowanych z ANDOR 6 47, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.

Po kliknięciu start w celu rozpoczęcia procesu rejestracji obrazu, dwukrotnie kliknij w miejscu oddalonym o dwa do trzech mikrometrów od wewnętrznej ściany naczynia, aby uruchomić laser. Uszkodzenie komórek śródbłonka tętniczek powoduje widoczną zmianę kształtu, która powinna być zauważalna w obrazie w jasnym polu, a następnie następującą po niej akumulację płytek krwi. Pięć minut po uszkodzeniu laserowym wstrzymaj i anuluj rejestrację.

Następnie rozpocznij akwizycję z 2 400 punktami czasowymi w odstępach 500 ms, aby przez 20 minut rejestrować przylegające płytki krwi oraz toczące się i przylegające neutrofile. Po obliczeniu intensywności fluorescencji tła podczas tworzenia skrzepu płytkowego w sposób analogiczny do modelu stanu zapalnego w naczyniach, przejdź do zakładki mask, kliknij segment, wybierz fite oraz kanał i wprowadź średnią wartość sygnału tła, a następnie kliknij apply i okay. Teraz w image scope kliknij current 2D time-lapse lub 40 D images; w mask scope wybierz entire mask, a w sekcji features pod date of capture wybierz elapsed time, pod Morpho wybierz area in pixels, a w sekcji intensity wybierz sum intensity.

Następnie kliknij eksport. Otwórz plik tekstowy w programie arkusza kalkulacyjnego i oblicz intensywność fluorescencji zakrzepu płytkowego. Aby ilościowo określić liczbę neutrofili toczących się i przylegających, odtwórz nagranie poklatkowe i policz liczbę komórek, które widocznie się toczą.

Toczenie skrzepu płytkowego przez 20 minut definiuje się jako spadek prędkości neutrofili podczas oddziaływania ze skrzepem płytkowym przez co najmniej dwie sekundy. Neutrofile przylegające definiuje się jako wszystkie neutrofile, które pozostają przytwierdzone do skrzepu płytkowego przez co najmniej dwie minuty. Poniżej przedstawiono reprezentatywne obrazy ukazujące sygnały fluorescencyjne związane z neutrofilami w kolorze czerwonym i płytkami w kolorze zielonym.

Przedstawiono stan zapalny naczyń, gdzie strzałka wskazuje kierunek przepływu krwi w naczyniu. Ustalono, że liczba toczących się i przylegających neutrofili na zapalonych komórkach śródbłonka wynosiła odpowiednio 0,25 komórki na minutę oraz 18,5 komórki na pięć minut. Dane reprezentują średnią plus lub minus błąd standardowy średniej z 30 różnych naczyń w czterech myszach typu dzikiego.

Na wykresie przedstawiono medianowy zintegrowany sygnał fluorescencyjny płytek krwi w funkcji czasu. Stwierdzono, że większość płytek krwi (kolor czerwony) przylega do adherentnych i pełzających neutrofili (kolor zielony), a nie do stanu zapalnego ściany naczynia. Przejdźmy teraz do interakcji między neutrofilami a płytkami krwi po uszkodzeniu tętniczki indukowanym laserem.

Te obrazy przedstawiają pojedynczy neutrofil w kolorze czerwonym (oznaczony żółtą strzałką) toczący się po zakrzepie płytkowym w kolorze zielonym, podczas gdy drugi neutrofil w kolorze czerwonym (oznaczony białą strzałką) szybko toczy się po komórkach śródbłonka tętniczek; oba procesy zarejestrowano w odstępie pięciu sekund. Tutaj ponownie pokazano pojedynczy neutrofil w kolorze czerwonym, który toczy się i przylega do zakrzepu płytkowego w kolorze zielonym w odstępie 15 sekund. Groty strzałek identyfikują neutrofile toczące się oraz przylegające, a gruba szara strzałka wskazuje kierunek przepływu krwi. Tutaj naniesiono wykres mediany zintegrowanego sygnału fluorescencji płytek krwi jako funkcji czasu.

Ustalono, że liczba toczących się i przylegających neutrofili wynosiła odpowiednio 21,5 i 1,6 komórki w ciągu 20 minut. Początkowo zaobserwowano szybkie toczenie się neutrofili po komórkach śródbłonka. Po zetknięciu się neutrofili z zakrzepem płytkowym prędkość toczenia się neutrofili na zakrzepie płytkowym uległa zmianie, osiągając zakres 8,2 micrometers per second, co jest pośredniczone przez interakcję pektyny i psgl L one.

Dane reprezentują średnią plus lub minus błąd standardowy średniej dla 14 różnych zakrzepów u siedmiu myszy typu dzikiego pięć minut po urazie laserowym. Wielkość zakrzepu płytkowego pozostaje stosunkowo stała podczas obrazowania, a neutrofile toczą się i przylegają do zakrzepu. Sygnał fluorescencyjny z krążących płytek krwi jest pomijalny.

W porównaniu z tym z zakrzepem płytkowym, po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować system mikroskopii wewnątrzżyciowej z użyciem żywych myszy, co pozwoli Ci na wizualizację w czasie rzeczywistym heterotypowych oddziaływań między płytkami krwi a neutrofilami na aktywowanym śródbłonku w obrębie mikrokrążenia.