Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja typowej interakcji między płytkami krwi i neutrofilami na aktywowany śródbłonek podczas choroby naczyniowej. Osiąga się to za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej intrażyciowej w czasie rzeczywistym u żywych myszy w celu wizualizacji mikrokrążenia w mięśniu cremaster. W drugim etapie podaje się przeciwciała znakowane fluorescencyjnie i inicjuje się zapalenie lub uraz umięśniowy, aby ułatwić bezpośrednią wizualizację wynikowych typowych interakcji neutrofili płytkowych.

Następnie zapisane dane są analizowane w celu ilościowego określenia liczby komórek i ich dynamiki. Ostatecznie bezpośrednie typowe interakcje między płytkami krwi i neutrofilami na aktywowanym śródbłonku można ocenić na podstawie sygnału fluorescencyjnego przeciwciał w infuzji w mikroskopii przyżyciowej w czasie rzeczywistym. Nasza przyżyteczna technika mikroskopowa może zapewnić wgląd w interakcje w czasie rzeczywistym między płytkami krwi i neutrofilami na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń krwionośnych i tworzenia skrzepliny.

Technologia ta może być również stosowana w innych systemach, takich jak ocena interakcji komórek nowotworowych i komórek krwi. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy włączyć system mikroskopowy dla modelu zapalenia naczyń krwionośnych. Intra growly wstrzyknąć lustrzane TNF alfa trzy godziny przed wstrzyknięciem IP środków znieczulających.

Po potwierdzeniu sedacji przez uszczypnięcie palca u nogi wprowadź rurkę PE 90 do tchawicy myszy, aby wyeliminować wszelkie trudności w oddychaniu. Następnie należy wprowadzić rurkę PE 10 do lewej żyły szyjnej w celu infuzji fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał i dodatkowych środków znieczulających. Następnie delikatnie wyciągnij i poziomo naciąć skórę moszny i spryskaj ją wstępnie ciepłym buforem nad polem operacyjnym.

Teraz naciskając na dolną część brzucha jednym kleszczem, ostrożnie wyciągnij jądro drugim kleszczem wielkości kleszcza, samochód opanuj mięsień pionowo i spłaszcz mięsień na szklanym szkiełku nakrywkowym na tacy mikroskopu dojelitowego, przypinając tkankę obwodową do tacy. Rozpocznij ten krok od wstrzyknięcia najpierw sprzężonych szczurów DITE 4 88, anty myszy CD 42 C i Alexa floor 6 47 sprzężonych przeciwciał anty mysich GR one przez wcześniej ustawioną kaniulę szyjną. Następnie w zestawie filtrów mikroskopu zaznacz pole wyboru dla kanałów, które zostaną naświetlone i ustaw czas ekspozycji dla każdego wybranego ujęcia poklatkowego.

Aby ustawić liczbę punktów czasu na 1000 do 1500 z interwałem 200 milisekund, aby uzyskać łączny czas, który upłynął od pięciu minut. Po ustawieniu wszystkich parametrów w przechwytywaniu obrazu wybierz start, aby rozpocząć przechwytywanie w powiększeniu 60 x z oknem 157 mikrometrów na 118 mikrometrów. Monitoruj rządzące i przylegające płytki krwi do neutrofili przez pięć minut w górnej połowie miejsca z zapalnym cremasterem.

Aby przeanalizować tworzenie się skrzepliny płytkowej, przejdź do maski i wybierz utwórz. Następnie pod narzędziem zaznaczania w widoku głównym kliknij dużą ikonę ołówka. Użyj ołówka, aby pokolorować obszar na zewnątrz naczynia w widoku głównym.

Aby ustawić maskę tła, przejdź do maski, kliknij kopiuj tę płaszczyznę, kliknij kopiuj maskę. W polu Bieżący punkt czasu zaznacz wszystkie punkty czasowe i kliknij przycisk OK. Aby obliczyć sygnał tła, przejdź do statystyk i kliknij statystyki maski.

Następnie w zakresie obrazu kliknij bieżący film poklatkowy 2D lub cztery obrazy D w zakresie maski, wybierz całą maskę w obiektach. W polu Data przechwycenia wybierz czas, który upływa. W obszarze Geometria kształtu wybierz obszar w pikselach, a w polu Intensywność wybierz maksymalną intensywność.

Teraz kliknij eksport. Otwórz plik tekstowy w programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych i oblicz średnią wartość sygnału tła w całym okresie nagrywania. Do określenia intensywności fluorescencji tła.

Po obliczeniu intensywności fluorescencji tła podczas skrzepliny płytkowej, jak właśnie pokazano w modelu zapalenia ubocznego, przejdź do maski, kliknij segment, wybierz dopasuj e i kanał, a następnie wstaw średnią wartość sygnału tła przy niskim kliknięciu zastosuj i dobrze. Następnie przejdź do statystyk i kliknij maskuj statystyki. Teraz w zakresie obrazu kliknij bieżący film poklatkowy 2D lub cztery obrazy D w zakresie maski, wybierz całą maskę w obiektach pod datą przechwycenia wybierz czas, który upłynął w obszarze geometria morfozy, wybierz obszar w pikselach i w obszarze intensywność wybierz intensywność.

Następnie kliknij przycisk eksportuj. Otwórz plik tekstowy w programie arkusza kalkulacyjnego i oblicz intensywność fluorescencji skrzepliny płytkowej. Do analizy zakrzepicy tętniczek zacznij od podania DITE 4 88 sprzężonych przeciwciał anty mysich CD 42 C ANDOR 6 47 przeciwko myszom GR one, jak właśnie pokazano.

Po kliknięciu przycisku start, aby rozpocząć proces przechwytywania obrazu, kliknij dwukrotnie miejsce znajdujące się w odległości od dwóch do trzech mikrometrów od ściany naczynia, aby uruchomić laser. Uszkodzenie komórek śródbłonka tętniczek powoduje wizualną zmianę kształtu, która powinna być widoczna na obrazie jasnego pola, po której następuje akumulacja płytek krwi. Pięć minut po zranieniu laserem wstrzymaj i anuluj przechwytywanie.

Następnie rozpocznij przechwytywanie z 2 400 punktami czasowymi w odstępie 500 milisekund, aby rejestrować przylegające płytki krwi oraz toczące się i przylegające neutrofile przez 20 minut. Po obliczeniu intensywności fluorescencji tła podczas skrzepliny płytkowej w podobny sposób jak w modelu zapalenia umięśnionego, przejdź do maski, kliknij segment, wybierz dopasowanie i kanał i wstaw średnią wartość sygnału tła na niskim kliknij zastosuj i dobrze. Teraz w zakresie obrazu kliknij bieżące obrazy poklatkowe 2D lub 40 D w zakresie maski, wybierz całą maskę w obiektach pod datą przechwycenia wybierz czas, który upłynął pod Morpho wybierz obszar w pikselach i pod intensywnością wybierz intensywność.

Następnie kliknij przycisk eksportuj. Otwórz plik tekstowy w programie arkusza kalkulacyjnego i oblicz intensywność fluorescencji skrzepliny płytkowej. Aby określić ilościowo toczące się i przylegające neutrofile, odtwórz upływ czasu i policz liczbę komórek, które widocznie się przewracają.

Skrzeplinę płytkową w ciągu 20 minut toczenia definiuje się jako zmniejszenie prędkości neutrofili podczas interakcji ze skrzepliną płytkową przez co najmniej dwie sekundy. Przylegające neutrofile definiuje się jako wszelkie neutrofile, które pozostają przyczepione do skrzepliny płytkowej przez co najmniej dwie minuty. Tutaj zreprezentatywne obrazy wyglądu sygnałów fluorescencyjnych związanych z neutrofilami na czerwono i płytkami krwi na zielono.

Podczas zapalenia umięśnionego pokazany jest strzałka pokazuje kierunek przepływu krwi w naczyniu. Liczbę toczących się i przylegających neutrofili na komórkach śródbłonka objętych stanem zapalnym określono odpowiednio na 0,25 komórki na minutę i 18,5 komórek na pięć minut. Dane są reprezentatywne dla średniej plus minus błąd standardowy średniej 30 różnych E u czterech myszy typu dzikiego.

Tutaj mediana zintegrowanego sygnału fluorescencyjnego płytek krwi jest wykreślana jako funkcja czasu. Stwierdzono, że większość płytek krwi w kolorze czerwonym przylega do przylegających i pełzających neutrofili w kolorze zielonym, a nie do ściany naczynia w stanie zapalnym. Teraz przechodzimy do interakcji płytek neutrofili po indukowanym laserem uszkodzeniu tętniczek.

Obrazy te ilustrują pojedynczy neutrofil w kolorze czerwonym i oznaczony żółtą strzałką toczącą się po skrzeplinie płytkowej na zielono z drugim neutrofilem na czerwono i wskazywane białą strzałką szybko toczącą się po komórkach śródbłonka tętniczki, oba w ciągu pięciu sekund wychwytywania tutaj, pojedynczy neutrofil ponownie w kolorze czerwonym jest pokazany przewracający się i przylegający do skrzepliny płytkowej na zielono w odstępie 15 sekund. Grot strzałki identyfikuje toczące się i przylegające neutrofile, a gruba szara strzałka wskazuje kierunek przepływu krwi. W tym przypadku mediana zintegrowanego sygnału fluorescencyjnego płytek krwi jest wykreślana jako funkcja czasu.

Liczbę toczących się i przylegających neutrofili określono odpowiednio na 21,5 i 1,6 komórki w ciągu 20 minut. Początkowe szybkie zwijanie neutrofili nastąpiło na komórkach śródbłonka. Gdy neutrofile zetknęły się ze skrzepliną płytkową, prędkość toczenia neutrofili na skrzeplinie płytkowej zmieniała się w zakresie 8,2 mikrometra na sekundę i jest pośredniczona przez oddziaływanie pektyny i psgl L.

Dane są reprezentatywne dla średniej plus lub minus, błędu standardowego średniej 14 różnych skrzeplin u siedmiu myszy typu dzikiego pięć minut po urazie laserowym. Wielkość skrzepliny płytkowej pozostaje względnie stała podczas obrazowania, a neutrofile przetaczają się na skrzeplinę i przylegają do niej. Sygnał fluorescencyjny z krążących płytek krwi jest znikomy.

W porównaniu z tym z zakrzepu płytek krwi, Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować system mikroskopu przyżyciowego z żywymi myszami, co pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji między płytkami krwi i neutrofilami na aktywowanym śródbłonku w obrębie mikrokrążenia.