Name: Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Poznaj technikę mikroskopii fluorescencyjnej in vivo do wizualizacji interakcji płytek krwi z neutrofilami na aktywowanym śródbłonku u żywych myszy. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z National Institutes of Health (P30 HL101302 i RO1 HL109439 dla J.C.) oraz American Heart Association (SDG 5270005 do J.C.). A. Barazia była wspierana przez grant szkoleniowy T32HL007829 NIH.

1. Przygotowanie mikroskopu przyżyciowego (Rysunek 1A)
<ol>
	<li>Przygotować bufor do przekonfuzji (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 i 17 mM NaHCO3, pH 7,4).</li>
	<li>Włączyć obiegową łaźnię wodną w celu utrzymania temperatury buforu i termokontrolowanego koca na poziomie 37 °C. Napowietrzyć bufor gazowym azotem (5% CO2 zrównoważony azotem).</li>
	<li>Włącz system mikroskopowy (szybki zmieniacz długości fal Sutter Lambda DG-4, komputer stacji roboczej, mikroskop Olympus BX61W, multimanipulator MPC-200, kontroler stopnia ROE-200, kamera szybkoobrotowa, wzmacniacz).</li>
	<li>Do modelu zapalenia naczyń krwionośnych użyj 100% dichroicznego lustra. Aby wywołać tworzenie się skrzepliny w wyniku urazu laserowego, zastąp lustro 100% lustrem lustro 50/50% i włącz system ablacji laserowej mikropunktów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mięśnia Cremaster do mikroskopii przyżyciowej (Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Znieczulić samca myszy (6-8 tygodni, C57BL/6) poprzez wstrzyknięcie dożylnie ketaminy (125 mg/kg masy ciała)) i ksylazyny (12,5 mg/kg masy ciała). Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Illinois zatwierdził wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i procedury eksperymentalne. W przypadku modelu zapalenia naczyń krwionośnych wstrzyknij mysi TNF-α (0,5 μg w 250 μl soli fizjologicznej) dochoszowo myszy 3 godziny przed obrazowaniem (2-2,5 godziny przed operacją).</li>
	<li>Umieść mysz na kocu z kontrolowaną temperaturą 37 °C na tacy mikroskopu przyżyciowego.</li>
	<li>Podciągnij skórę na powierzchni szyi za pomocą kleszczy i naciąć poziomo linię środkową skóry szyi do 1 cm nożyczkami.</li>
	<li>Delikatnie otwórz mięsień szyjny za pomocą nożyczek i usuń mięsień otaczający tchawicę.</li>
	<li>Wprowadź rurkę PE90 do tchawicy, aby wyeliminować trudności w oddychaniu.</li>
	<li>Delikatnie usuń lewą stronę mięśnia szyjnego i odizoluj żyłę szyjną od otaczających tkanek.</li>
	<li>Cnależy wprowadzić rurkę PE10 do lewej żyły szyjnej w celu infuzji przeciwciał i dodatkowych środków znieczulających.</li>
	<li>Delikatnie wyciągnij i nacinaj skórę moszny poziomo. Aby zachować integralność tkanek przez cały czas trwania eksperymentu, wstępnie podgrzany bufor został przelej rozlejany nad polem operacyjnym.</li>
	<li>Naciśnij dolną część brzucha jednym kleszczem i ostrożnie wyciągnij jądro drugim kleszczem.</li>
	<li>Usuń otaczające tkanki łączne wokół jądra.</li>
	<li>Naciąć mięsień cremaster pionowo i spłaszczyć mięsień nad szklanym szkiełkiem nakrywkowym na tacy mikroskopu przyżyciowego, przypinając obrzeża.</li>
	<li>Odczekaj 10-20 minut, aby mięsień się ustabilizował przed zebraniem danych. Do naszych badań wybrano tętniczki mięśniowe Cremaster (do tworzenia skrzepliny) i żyłki (do zapalenia naczyń) o średnicy 30-45 μm. </li>
	<li>Aby utrzymać warunki znieczulające, należy podawać 30-50 ml tego samego środka znieczulającego mniej więcej co 30 minut przez kaniulę szyjną.</li>
</ol>
3. Mikroskopia przyżyciowa w stanach zapalnych naczyń wywołanych przez TNF-α
<ol>
	<li>Po umieszczeniu myszki na mikroskopie przyżyciowym otwórz oprogramowanie SlideBook 5.0 i kliknij "Okno ostrości" na pasku menu, aby ustawić odpowiednią optykę i obiektyw (60X).</li>
	<li>Wstrzyknąć sprzężone z Dylight 488 szczurze przeciwciała anty-mysie CD42c (0,1 μg/g BW w 100 μl soli fizjologicznej) i sprzężone ze szczurem przeciwciała anty-mysie Gr-1 Alexa Fluor 647 (0,05 μg/g BW w 100 μl soli fizjologicznej) przez kaniulę szyjną.</li>
	<li>Przejdź do paska menu i kliknij "Przechwytywanie obrazu" na pasku narzędzi.</li>
	<li>Pojawi się nowe menu; W "Obrazie" wybierz "Bin Factor" jako 1x1 i wybierz "640" na szerokości i "460" na wysokości.</li>
	<li>W polu "Filter Set" (Zestaw filtrów) zaznacz pola wyboru dla kanałów, które chcesz naświetlić, i ustaw czas ekspozycji dla każdego z nich. Na przykład kanał otwarty: 10 ms, kanał FITC: 50 ms i kanał Cy5: 50 ms.</li>
	<li>Wybierz "Time-Lapse Capture", aby dostosować liczbę punktów czasowych i interwał. W przypadku modelu zapalenia liczbę punktów czasowych ustawia się na 1 000-1 500 w odstępie 200 ms (Całkowity czas, który upłynął: 5 min).</li>
	<li>Kliknij "Testuj", aby zobaczyć obraz jednopłaszczyznowy przy określonym czasie ekspozycji dla tego kanału. Dostosuj czas ekspozycji i/lub światło mikroskopu, aż histogram pokaże odpowiedni rozkład intensywności (w przypadku przechwytywania wielokanałowego powtórz ten proces dla każdego kanału).</li>
	<li>Po ustawieniu wszystkich parametrów (kanały, czasy ekspozycji itd.) w "Przechwytywaniu obrazu" wybierz "Start", aby rozpocząć przechwytywanie.</li>
	<li>Monitoruj toczące się i przylegające płytki krwi i neutrofile przez 5 minut w górnej połowie zapalnej żyłki cremaster w modelu zapalenia naczyń krwionośnych. W jednej myszy rejestruje się od ośmiu do dziesięciu różnych żyłek.</li>
	<li>Zdjęcia zostały wykonane przy użyciu całkowitego powiększenia 60X (obiektyw zanurzeniowy 1,0 NA), co dało rozmiar okna 157 μm x 118 μm.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu myszy zostały poddane eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>
4. Analiza danych dla modelu zapalenia komór
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie SlideBook 5.0 i kliknij "Folder" na pasku menu, aby otworzyć plik.</li>
	<li>Kliknij menu rozwijane kanału i wybierz "Otwórz, FITC, Cy5 itp."</li>
	<li>Kliknij "Normalizuj ponownie (czerwone i zielone paski)" i wybierz kanał. Przeciągnij czerwony i zielony pasek w lewo lub w prawo, aby z grubsza zoptymalizować sygnał fluorescencji.</li>
	<li>Kliknij "Zastosuj" i "OK", aby zaktualizować obraz.</li>
	<li>Kliknij "Przycisk miniatury", aby wybrać bieżący wyświetlacz jako domyślny.</li>
	<li>Odtwórz przechwycony obraz poklatkowy i policz toczące się i przylegające neutrofile w ciągu 5 minut.</li>
	<li>Aby przeanalizować tworzenie się skrzepliny płytkowej, przejdź do "Maska" i wybierz "Utwórz".</li>
	<li>Nazwij maskę i zaznacz "Na bieżącym obrazie".</li>
	<li>Kliknij "Ikona dużego ołówka" w "Narzędziu do zaznaczania" w widoku głównym.</li>
	<li>Pokoloruj obszar na zewnątrz naczynia w widoku głównym, aby ustawić maskę tła.</li>
	<li>Przejdź do "Maska", kliknij "Kopiuj tę płaszczyznę", kliknij "Kopiuj maskę w bieżącym punkcie czasowym" i wybierz "Wszystkie punkty czasowe", a następnie kliknij "OK".</li>
	<li>Aby obliczyć sygnał tła, przejdź do "Statystyki" i kliknij "Statystyki maski".</li>
	<li>Kliknij "Bieżący upływ czasu 2D lub obrazy 4D" w Zakresie obrazu i wybierz "Cała maska" w Zakresie maski. W Funkcjach wybierz "Czas, który upłynął (gg:mm:ms)" w polu Data przechwycenia, wybierz "Obszar (piksele)" w obszarze Morfometria, wybierz "Maksymalna intensywność" w obszarze Intensywność i kliknij "Eksportuj" (Ta metoda statystyczna pozwala nam obliczyć intensywność autofluorescencji (sygnał tła)).</li>
	<li>Otwórz plik tekstowy w MS Office Excel i oblicz średnią wartość sygnału tła w całym okresie nagrywania. Jest to intensywność fluorescencji tła.</li>
	<li>Aby określić intensywność skrzepliny, kliknij ponownie "Ikona dużego ołówka" w "Narzędziu do zaznaczania" w widoku głównym.</li>
	<li>Pokoloruj wnętrze naczynia w widoku głównym, aby ustawić sygnał płytek krwi.</li>
	<li>Przejdź do "Maska", kliknij "Kopiuj tę płaszczyznę", kliknij "Kopiuj maskę w bieżącym punkcie czasowym", wybierz "Wszystkie punkty czasowe" i kliknij "OK".</li>
	<li>Przejdź do "Statystyki" i kliknij "Statystyki maski".</li>
	<li>Kliknij "Bieżący upływ czasu 2D lub obrazy 4D" w Zakresie obrazu i wybierz "Cała maska" w Zakresie maski. W Obiektach wybierz "Czas, który upłynął (gg:mm:ms)" w sekcji Data schwytania, wybierz "Obszar (piksele)" w sekcji Morfometria, wybierz "Suma intensywności" w sekcji Intensywność i kliknij "Eksportuj" (ta metoda statystyczna pozwala nam obliczyć intensywność fluorescencji wewnątrz naczynia).</li>
	<li>Otwórz plik tekstowy w programie MS Office Excel. Sygnał fluorescencyjny płytek krwi oblicza się poprzez odjęcie średniej wartości natężenia tła x Powierzchnia (piksel) od sumy intensywności wnętrza naczynia. Jest to intensywność fluorescencji skrzepliny płytkowej.</li>
	<li>Powtórz to w 30 różnych żyłkach u 3-5 różnych myszy. Następnie oblicz medianę intensywności fluorescencji płytek krwi.</li>
	<li>Aby przeanalizować toczenie i adhezję neutrofili, przepływ neutrofili określono w ciągu 5 minut w każdej żyłce i przedstawiono jako liczbę komórek na minutę. Liczba przylegających neutrofili, które były nieruchome przez >30 sekund i powoli pełzały (<10 μm w ciągu 30 sekund), ale nie przewróciły się, została policzona i przedstawiona jako liczba komórek na 5 minut.</li>
</ol>
5. Mikroskopia przyżyciowa w przypadku zakrzepicy tętnic wywołanej laserem
5-1 Kalibracja lasera ablacyjnego
<ol>
	<li>Umieść lustrzane szkiełko na stoliku mikroskopu, nałóż niewielką kroplę wody destylowanej na górną część szkiełka i wyreguluj intensywność i ostrość za pomocą okularu.</li>
	<li>Otwórz "Focus Window" i wybierz zakładkę "FRAP" w oprogramowaniu SlideBook 5.0.</li>
	<li>Ustaw moc lasera na 40-50 i ustaw zarówno "Powtórzenia podwójnego kliknięcia", jak i "Rozmiar podwójnego kliknięcia" na 8. Zaznacz pole "Przewodnik", aby wyświetlić zestaw celowników.</li>
	<li>Wybierz ikonę "Strzałka" na pasku zadań u góry ekranu.</li>
	<li>W zakładce "Wyrównanie FRAP" kliknij "Uruchom dalej". W lewym dolnym rogu monitora powinien pojawić się mały punkt. Gdy pojawi się miejsce, kliknij dwukrotnie jego środek. Po kliknięciu powinno pojawić się kolejne miejsce powyżej i po prawej stronie pierwszego miejsca; Kliknij go dwukrotnie. Powtórz to dla 16 punktów (16. miejsce pojawi się w prawym dolnym rogu). Kliknij "Zapisz" po zakończeniu, aby zaktualizować parametry kalibracji.</li>
	<li>Aby przetestować dokładność kalibracji, kliknij przycisk "Środek" - na środku ekranu powinna pojawić się mała plamka. Jeśli nie, powtarzaj kalibrację, aż do uzyskania żądanej dokładności.</li>
</ol>
5-2 Powstawanie skrzepliny tętniczej wywołanej laserem
<ol>
	<li>Umieść znieczuloną mysz (patrz procedura 2-2 do 2-12) na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>W oknie "Przechwyć" wybierz protokół lub utwórz nowy. Ustawienia są następujące: CY5 (ekspozycja 70 ms), Otwarta (ekspozycja 10 ms) i FITC (ekspozycja 50 ms). Obraz jest rejestrowany w ciągu 20 minut (około 2 400 punktów czasowych z interwałem 500 ms).</li>
	<li>Infuzja sprzężonych z mysim przeciwciałami anty-mysim CD42c Dylight 488 i Alexa Fluor 647 sprzężonymi z mysimi przeciwciałami Gr-1, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Zoptymalizuj parametry mikroskopu, w tym intensywność fluorescencji i obraz w jasnym polu, zgodnie z opisem w 3-3 do 3-7.</li>
	<li>Kliknij przycisk "Test", aby zapewnić odpowiednią intensywność jasnego pola lub sygnał przeciwciała, umiejscowienie tętniczki i ostrość.</li>
	<li>Kliknij "Start", aby rozpocząć proces przechwytywania obrazu.</li>
	<li>Przed oddaniem strzału z lasera ablacyjnego upewnij się, że ikona wskaźnika myszy została wybrana, a ściana naczynia jest wyraźnie ostra.</li>
	<li>Aby wyzwolić laser, kliknij dwukrotnie w miejsce oddalone o 2-3 μm od ściany naczynia. Uszkodzenie komórek śródbłonka tętniczki powoduje wizualną zmianę kształtu, która powinna być widoczna na obrazie w jasnym polu, po której następuje akumulacja płytek krwi. Monitoruj tworzenie się skrzepliny przez 5 minut po urazie laserem.</li>
	<li>Pięć minut po urazie laserowym (rozmiar skrzepliny powinien być teraz stabilny) wstrzymaj i anuluj przechwytywanie. Następnie rozpocznij przechwytywanie z 2400 punktami czasowymi w odstępie 500 ms, aby rejestrować przylegające płytki krwi i toczące się/przylegające neutrofile przez 20 minut. U jednej myszy rejestruje się od trzech do pięciu tętniczek.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu myszy zostały poddane eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>
6. Analiza danych dla modelu zakrzepicy tętniczej
<ol>
	<li>Przejdź do kroków od 4.1 do 4.5.</li>
	<li>Aby uzyskać intensywność fluorescencji tła podczas tworzenia skrzepliny płytkowej, wykonaj kroki od 4.7 do 4.14.</li>
	<li>Przejdź do "Maska", kliknij "Segment", wybierz FITC w kanale i wstaw średnią wartość sygnału tła na Niskim. Kliknij "Zastosuj" i "OK".</li>
	<li>Aby przeanalizować intensywność fluorescencji skrzepliny płytkowej (przeciwciało anty-CD42c sprzężone z Dylight 488), wykonaj kroki od 4.18 do 4.19. Aby obliczyć sygnał przeciwciała, "Suma intensywności" jest odejmowana przez sygnał tła ("Maksymalna intensywność" x "Obszar (piksele)"). Jest to intensywność fluorescencji skrzepliny płytkowej.</li>
	<li>Aby określić ilościowo toczące się i przylegające neutrofile, odtwórz film poklatkowy i policz liczbę komórek, które w widoczny sposób przetaczają się przez skrzeplinę płytkową w ciągu 20 minut. Walcowanie definiuje się jako zmniejszenie prędkości neutrofili podczas interakcji ze skrzepliną płytkową przez co najmniej 2 sekundy. Przylegające neutrofile definiuje się jako wszelkie neutrofile, które pozostają przyczepione do skrzepliny płytkowej przez co najmniej 2 minuty. Liczbę toczących się i przylegających neutrofili przedstawiono jako liczbę komórek na 20 minut. Prędkość toczenia została obliczona za pomocą systemu śledzenia cząstek.</li>
</ol>

<ol><li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemic+stroke%3A+a+thrombo-inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease.</a> J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).</li>
<li>Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1%3A+its+role+as+a+selectin+counterreceptor+in+leukocyte-endothelial+and+leukocyte-platelet+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction.</a> Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).</li>
<li>Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-neutrophil-interactions%3A+linking+hemostasis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation.</a> Blood Rev. 21, 99-111 (2007).</li>
<li>Chen, J., Lopez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+platelets+with+subendothelium+and+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Interactions of platelets with subendothelium and endothelium.</a> Microcirculation. 12, 235-246 (2005).</li>
<li>Konstantopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+levels+of+shear+support+neutrophil-platelet+adhesion+and+neutrophil+aggregation+in+blood+via+P-selectin+and+beta2-integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin.</a> Circulation. 98, 873-882 (1998).</li>
<li>Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+platelet-polymorphonuclear+leukocyte+interactions%3A+new+clues+to+the+antithrombotic+properties+of+parnaparin%2C+a+low+molecular+weight+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin.</a> Haematologica. 90, 833-839 (2005).</li>
<li>Hidalgo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+interactions+enabled+by+polarized+neutrophil+microdomains+mediate+thromboinflammatory+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury.</a> Nat. Med. 15, 384-391 (2009).</li>
<li>Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+extracellular+protein+disulfide+isomerase+during+thrombus+formation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+isomerase+capture+during+thrombus+formation+in+vivo+depends+on+the+presence+of+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins.</a> Blood. 120, 647-655 (2012).</li>
<li>Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-versus+microparticle-mediated+tissue+factor+transfer+during+arteriolar+thrombus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development.</a> Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).</li>
<li>Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+imaging+of+platelets%2C+tissue+factor+and+fibrin+during+arterial+thrombus+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse.</a> Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).</li>
<li>Barthel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+1%2C3+fucosyltransferases+are+master+regulators+of+prostate+cancer+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).</li>
<li>Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule%3A+more+than+a+carcinoma+marker+and+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule.</a> The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li>
<li>Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+multiple+functions+of+Gr-1%28%2B%29+cell+subpopulations+during+microbial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection.</a> Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół fluorescencji w mikroskopii przyżyciowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji heterotypowych interakcji płytk-neutrofili na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i zakrzepicy. Wcześniej opisywano podobne podejścia mikroskopii fluorescencyjnej do badania molekularnego mechanizmu powstawania skrzepliny i zapalenia naczyń krwionośnych. 8,12 Ponieważ heterotypowa interakcja komórka-komórka może być ważna dla zamknięcia naczyń krwionośnych w miejscu urazu, technol...

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>0,9% NaCl Saline</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Hospira</td><td>0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Xylazine</td><td>Lloyd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intramedic (PE 90)</td><td>Diagnostyka BD</td><td>427421</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Intramedic (PE 10)</td><td>Diagnostyka BD 427401</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysia TNF-&alfa;</td><td>R& D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488 znakowane szczurzym przeciwciałem anty-mysim CD42b </td><td>Emfret Analytics</td><td>X488</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-sprzężone przeciwciało anty-mysie Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)</td><td>BioLegend</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna/cyrkulator NESLAB EX</td><td>Termonaukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop Olympus BX61W</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH4-100 Moc</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4</td><td>Multimanipulator Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPC-200</td> Kontroler sceniczny <td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R&#8211;-200</td> Szybka kamera <td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C9300</td> Wzmacniacz <td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zakres</td><td>wideo Międzynarodowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laser ablacyjny</td><td>Instrumenty fotoniczne, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr>Innowacje w zakresie <td>inteligentnego obrazowania</td><td></td><td></td> <td>SlideBook 5.0</td></tr></tbody></table>

obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interakcja aktywowanych płytek krwi i leukocytów (głównie neutrofili) na aktywowany śródbłonek pośredniczy w zakrzepicy i zapaleniu naczyń. 1,2 Podczas tworzenia się skrzepliny w miejscu uszkodzenia tętniczek płytki krwi przylegające do aktywowanego śródbłonka i białek macierzy podśródbłonkowej wspomagają rolowanie i adhezję neutrofili. 3 I odwrotnie, w komorowych stanach zapalnych neutrofile przylegające do aktywowanego śródbłonka mogą sprzyjać adhezji i akumulacji krążących płytek krwi. Heterotypowa agregacja płytek krwi i neutrofili wymaga sekwencyjnych procesów poprzez specyficzne interakcje receptor-receptor licznik między komórkami. 4 Wiadomo, że aktywowane komórki śródbłonka uwalniają cząsteczki adhezyjne, takie jak czynnik von Willebranda, inicjując w ten sposób adhezję i akumulację płytek krwi w warunkach wysokiego ścinania. 5 Ponadto aktywowane komórki śródbłonka wspomagają rolowanie i adhezję neutrofili poprzez ekspresję odpowiednio selektyn i cząsteczki adhezji międzykomórkowej-1 (ICAM-1) w warunkach niskiego ścinania. 4 Selektyna P płytek krwi oddziałuje z neutrofilami poprzez ligand-1 glikoproteiny selektyny P (PSGL-1), indukując w ten sposób aktywację integryn β2 neutrofili i silną adhezję między dwoma typami komórek. Pomimo postępów w eksperymentach in vitro, w których heterotypowe interakcje płytk-neutrofile są określane we krwi pełnej lub izolowanych komórkach,6,7 badania te nie mogą manipulować warunkami stresu oksydacyjnego podczas choroby naczyniowej. W tym raporcie, używając znakowanych fluorescencyjnie, specyficznych przeciwciał przeciwko mysiemu markerowi płytek krwi i neutrofili, opisujemy szczegółowy przyżyciowy protokół mikroskopowy do monitorowania heterotypowych interakcji płytek krwi i neutrofili na aktywowany śródbłonek podczas zapalenia wywołanego przez TNF-α lub po urazie wywołanym laserem w mikronaczyniach mięśniowych cremaster żywych myszy.

Wykorzystując szczegółową analizę za pomocą mikroskopii intravitalnej, zwizualizowano heterotypowe oddziaływania płytek krwi i neutrofili na aktywowanym śródbłonku poprzez wstrzyknięcie żywym myszom przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie przeciwko markerowi płytek krwi (CD42c) lub markerowi neutrofili (Gr-1).
W modelu stanu zapalnego żyłek indukowanego przez TNF-α, większość toczących się neutrofili stabilnie przylegała do śródbłonka, prawdopodobnie wskutek oddziaływania aktywowanych integry...

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja typowych interakcji między płytkami krwi a neutrofilami na aktywowanym śródbłonku podczas choroby naczyniowej. Jest to realizowane za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii intravitalnej w czasie rzeczywistym u żywych myszy w celu wizualizacji mikrokrążenia w mięśniu kremastor. W drugim kroku wprowadzane są infuzyjnie przeciwciała znakowane fluorescencyjnie, a następnie inicjowany jest stan zapalny naczyń lub uraz, aby umożliwić bezpośrednią wizualizację wynikających z tego interakcji między płytkami krwi a neutrofilami.Następnie analizowane są zapisane dane w celu określenia liczby komórek oraz ich dynamiki. Ostatecznie, na podstawie sygnału fluorescencyjnego wprowadzonych przeciwciał w mikroskopii intravitalnej w czasie rzeczywistym, można ocenić bezpośrednie interakcje typowe między płytkami krwi a neutrofilami na aktywowanym śródbłonku. Nasza technika mikroskopii intravitalnej pozwala uzyskać wgląd w interakcje w czasie rzeczywistym między płytkami krwi a neutrofilami na aktywowanym śródbłonku podczas stanu zapalnego naczyń i tworzenia się zakrzepu.Tę technologię można zastosować również w innych układach, na przykład do ocen

real-time-imaging-heterotypic-platelet-neutrophil-interactions-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytek krwi i neutrofili na aktywowanym endotelium podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

W tym filmie demonstrujemy wizualizację interakcji krwinek i śródbłonka w żyłach krezkowych w modelu myszy, któremu wstrzyknięto dootrzewnowo lipopolisacharyd.

Mikroskopia przyżyciowa do analizy interakcji komórka-śródbłonek krwi w mysim modelu zapalenia

Aby zbadać interakcję bakterii z naczyniami krwionośnymi pod wpływem naprężeń ścinających, opisano komorę przepływową oraz model mikroskopii przyżyciowej in vivo, które pozwalają na analizę czynników bakteryjnych i gospodarza przyczyniających się do adhezji naczyniowej.

Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Opisujemy tutaj metodę obrazowania megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kości czaszki żywych myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Poznaj technikę mikroskopii fluorescencyjnej in vivo do wizualizacji interakcji płytek krwi z neutrofilami na aktywowanym śródbłonku u żywych myszy. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Przeglądaj więcej filmów