Name: PRP jako nowe podejście do zapobiegania infekcjom: przygotowanie i właściwości przeciwdrobnoustrojowe PRP in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Poznaj metodę przygotowania osocza bogatopłytkowego i oceny jego właściwości przeciwdrobnoustrojowych in vitro. Protokół obejmuje izolację PRP od królika, aktywację trombiną oraz pomiar jednostek koloniotwórczych w celu zapobiegania infekcjom związanym z implantami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Therwie Hamzie, Johnowi E. Tidwellowi, Ninie Clovis i Suzanne Smith za pomoc w eksperymentach oraz Suzanne Smith za korektę. Autorzy dziękują również dr Johnowi Thomasowi za dostarczenie izolatów klinicznych bakterii i dr Johnowi B. Barnettowi za wsparcie i wykorzystanie laboratorium bezpieczeństwa biologicznego na Wydziale Mikrobiologii, Immunologii i Biologii Komórki na Uniwersytecie Zachodniej Wirginii. Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Fundacji Osteosyntezy i Opieki nad Trauma oraz Narodowej Fundacji Nauki (#1003907). Eksperymenty mikroskopowe i analizę obrazu przeprowadzono również w West Virginia University Imaging Facility, który jest częściowo wspierany przez Mary Babb Randolph Cancer Center i grant NIH P20 RR016440.
Wykorzystanie zwierząt do pobierania krwi zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Zachodniej Wirginii. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi.

1. Przygotowanie i aktywacja PRP
1.1 Pobieranie krwi
<ol>
	<li>Znieczulenie królika należy przez inhalację izofluranu (2% wO2 w celu indukcji i 1% w leczeniu podtrzymującym).</li>
	<li>Pobrać 2 ml 0,129 M cytrynianu trisodowego (roztwór przeciwzakrzepowy) do strzykawki o pojemności 20 ml. Roztwór cytrynianu trisodowego przygotowuje się przez rozpuszczenie 1,897 g cytrynianu trisodowego w 50 ml destylowanegoH2Oi przefiltrowanie za pomocą sterylnego filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Wysterylizuj ucho królika przy użyciu 70% etanolu.</li>
	<li>Pobrać krew (np. 5 ml) z żyły ucha królika za pomocą igły motylkowej (25 G) podłączonej do strzykawki.</li>
	<li>Wymieszać krew z roztworem cytrynianu trójsodu, delikatnie mieszając. Stosunek objętości krwi do roztworu cytrynianu trójsodowego wynosi 9:1.</li>
</ol>
1.2 Przygotowanie do PRP (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Przenieść antykoagulowaną krew do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Pobrać podwielokrotność 10 μl krwi, aby określić wyjściową liczbę płytek krwi za pomocą hemocytometrii.</li>
	<li>Odwirować krew przy stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) w wirówce z odchylanym wirnikiem. Ustaw przyspieszenie i prędkość hamowania na niską (rysunek 1).</li>
	<li>Po odwirowaniu krew jest rozdzielana na trzy warstwy. Dolna warstwa to głównie czerwone krwinki, środkowa warstwa (powszechnie określana jako "kożuch") składa się ze skoncentrowanych płytek krwi i leukocytów, a górna warstwa to głównie osocze, które jest płynnym składnikiem krwi i płytek krwi (ryc. 1). Ostrożnie przetransportować probówkę wirówkową do okapu do hodowli komórkowych; Nie naruszaj warstw. Przenieś całe osocze, kożuchową sierść i warstwę czerwonych krwinek o grubości 2-3 mm do plastikowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą plastikowego pipetora o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Odwirować przeniesioną próbkę po raz drugi przy 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Górna warstwa (supernatant) jest uważana za osocze ubogie w płytki krwi (PPP) i jest przenoszona do nowej probówki.</li>
	<li>Uzyskuje się PRP, dostosowując stężenie płytek krwi w pozostałej próbce krwi za pomocą PPP w celu uzyskania 2,0 x 106 płytek krwi/μl (oznaczone za pomocą hemocytometrii).</li>
</ol>
1.3 Aktywacja PRP
<ol>
	<li>Przygotować roztwór aktywujący PRP, rozpuszczając 5 000 j.m. trombiny bydlęcej w 5 ml 10% chlorku wapnia do stężenia roboczego 1 000 j.m./ml.</li>
	<li>Dodać roztwór aktywacyjny do PRP i PPP, a następnie wymieszać roztwór, wielokrotnie pipetując, aby uzyskać żele PRP i PPP. Stosunek objętościowy roztworu aktywacyjnego do PRP lub PPP wynosi 1:4.</li>
</ol>
2. Test przeciwbakteryjny PRP in vitro z wykorzystaniem testu krzywej zabijania (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, dodaj kilka kolonii S. aureus z nocnej hodowli na płytce do 5 ml bulionu Mueller Hinton (MHB) w plastikowej probówce. Krótko przeprowadzić wirowanie, a następnie inkubować próbkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie za pomocą spektrofotometru oznaczono gęstość optyczną pożywki bakteryjnej i dostosowano do gęstości optycznej równej ~1 x 108 CFU/ml w oparciu o wcześniej ustaloną krzywą wzorcową.</li>
	<li>Wykonać 100-krotne rozcieńczenie za pomocą PBS, aby uzyskać 1 x 106 jtk/ml i umieścić inokulum na lodzie.</li>
	<li>Ustawić i oznaczyć sterylne, jednorazowe probówki z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml i przygotować następujące grupy próbek, jak wskazano w tabeli 1, dla końcowej objętości 2 ml w każdej probówce.</li>
	<li>Najpierw dodaj PRP, PPP lub PBS do probówek polistyrenowych, a następnie roztwór trombiny do aktywacji (tworzenia żelu). Następnie dodać MHB, a następnie inokulum S. aureus (1 x 106 jtk/ml), aby uzyskać końcowe stężenie 1 x 105 jtk/ml.</li>
	<li>Inkubować probówki w temperaturze 37 °C z mieszaniem orbitalnym przy 150 obr./min.</li>
	<li>W określonych punktach czasowych (np. 0, 1 i 2 godziny) wymieszaj roztwory w każdej probówce, powtarzając pipetowanie (ten krok jest ważny, ponieważ bakterie mogą zostać uwięzione w żelu PRP). Pobrać 10 μl próbki, rozcieńczyć kolejno sterylnym 0,9% roztworem soli fizjologicznej i odpipetować 100 μl porcji każdego rozcieńczenia na płytkę z tryptycznym agarem sojowym (TSA, z 5% krwią owczą) w celu policzenia CFU.</li>
	<li>Hodować płytki agarowe przez noc w temperaturze 37 °C, a następnie policzyć i zapisać kolonie płytek. Wykreśl dane w skali logarytomicznej z czasem (hr) na osi x i jtk/ml na osi y.</li>
</ol>

<ol><li>Gristina, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-centered+infection%3A+microbial+adhesion+versus+tissue+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-centered infection: microbial adhesion versus tissue integration.</a> Science. 237, 1588-1595 (1987).</li>
<li>Gristina, A. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adherence+to+biomaterials+and+tissue.+The+significance+of+its+role+in+clinical+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Bacterial adherence to biomaterials and tissue. The significance of its role in clinical sepsis.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 67, 264-273 (1985).</li>
<li>Everts, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reviewing+the+structural+features+of+autologous+platelet-leukocyte+gel+and+suggestions+for+use+in+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Reviewing the structural features of autologous platelet-leukocyte gel and suggestions for use in surgery.</a> Eur. Surg. Res. 39, 199-207 (2007).</li>
<li>Marx, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasma+%28PRP%29%3A+what+is+PRP+and+what+is+not+PRP%5BTitle%5D)+AND+%22Implant.+Dent%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP.</a> Implant. Dent. 10, 225-228 (2001).</li>
<li>Toscano, N., Holtzclaw, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+considerations+in+the+use+of+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Compend.+Contin.+Educ.+Dent%22%5BJournal%5D)">Surgical considerations in the use of platelet-rich plasma.</a> Compend. Contin. Educ. Dent. 29, 182-185 (2008).</li>
<li>Cieslik-Bielecka, A., Gazdzik, T. S., Bielecki, T. M., Cieslik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+the+platelet-rich+gel+has+antimicrobial+activity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg.+Oral+Med.+Oral+Pathol.+Oral+Radiol.+Endod%22%5BJournal%5D)">Why the platelet-rich gel has antimicrobial activity?</a> Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 103, 303-306 (2007).</li>
<li>Yeaman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+platelets+in+antimicrobial+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of platelets in antimicrobial host defense.</a> Clin. Infect. Dis. 25, 951-970 (1997).</li>
<li>Tang, Y. Q., Yeaman, M. R., Selsted, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+from+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides from human platelets.</a> Infect Immun. 70, 6524-6533 (2002).</li>
<li>El-Sharkawy, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasma%3A+growth+factors+and+pro-+and+anti-inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasma: growth factors and pro- and anti-inflammatory properties.</a> J. Periodontol. 78, 661-669 (2007).</li>
<li>Krijgsveld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombocidins%2C+microbicidal+proteins+from+human+blood+platelets%2C+are+C-terminal+deletion+products+of+CXC+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thrombocidins, microbicidal proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion products of CXC chemokines.</a> J. Biol. Chem. 275, 20374-20381 (2000).</li>
<li>Trowbridge, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+platelet+gel+and+its+effects+on+infection+in+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Extra+Corpor.+Technol%22%5BJournal%5D)">Use of platelet gel and its effects on infection in cardiac surgery.</a> J. Extra Corpor. Technol. 37, 381-386 (2005).</li>
<li>Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+from+biomaterials+and+implants%3A+a+race+for+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Prog.+Technol%22%5BJournal%5D)">Infections from biomaterials and implants: a race for the surface.</a> Med. Prog. Technol. 14, 205-224 (1988).</li>
<li>Subbiahdoss, G., Kuijer, R., Grijpma, D. W., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilm+growth+vs.+tissue+integration%3A+%22the+race+for+the+surface%22+experimentally+studied%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilm growth vs. tissue integration: "the race for the surface" experimentally studied.</a> Acta Biomater. 5, 1399-1404 (2009).</li>
<li>Klevens, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infections+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States.</a> JAMA. 298, 1763-1771 (2007).</li>
<li>Foster, T. E., Puskas, B. L., Mandelbaum, B. R., Gerhardt, M. B., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasma%3A+from+basic+science+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications.</a> Am. J. Sports Med. 37, 2259-2272 (2009).</li>
<li>Carlson, N. E., Roach, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasma%3A+clinical+applications+in+dentistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Dent.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasma: clinical applications in dentistry.</a> J. Am. Dent. Assoc. 133, 1383-1386 (2002).</li>
<li>Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+autologous+platelet-rich+plasma+%28platelet+gel%29+and+autologous+platelet-poor+plasma+%28fibrin+glue%29+in+cosmetic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Plast.+Reconstr.+Surg%22%5BJournal%5D)">The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery.</a> Plast. Reconstr. Surg. 107, 229-237 (2001).</li>
<li>Fridkin, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+and+microbiological+characterization+of+infections+caused+by+Staphylococcus+aureus+with+reduced+susceptibility+to+vancomycin%2C+United+States%2C+1997-2001%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiological and microbiological characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin, United States, 1997-2001.</a> Clin. Infect. Dis. 36, 429-439 (1997).</li>
<li>Jackson, C. R., Fedorka-Cray, P. J., Davis, J. A., Barrett, J. B., Frye, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+species+distribution+and+antimicrobial+resistance+of+enterococci+isolated+from+dogs+and+cats+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prevalence, species distribution and antimicrobial resistance of enterococci isolated from dogs and cats in the United States.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 1269-1278 (2009).</li>
<li>Murray, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+multidrug-resistant+bacteria+from+combat+personnel+evacuated+from+Iraq+and+Afghanistan+at+a+single+military+treatment+facility%5BTitle%5D)+AND+%22Mil.+Med%22%5BJournal%5D)">Recovery of multidrug-resistant bacteria from combat personnel evacuated from Iraq and Afghanistan at a single military treatment facility.</a> Mil. Med. 174, 598-604 (2009).</li>
<li>Durr, M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+meet+defensins%3A+the+merging+concepts+of+chemoattractants+and+antimicrobial+peptides+in+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Chemokines meet defensins: the merging concepts of chemoattractants and antimicrobial peptides in host defense.</a> Infect Immun. 70, 6515-6517 (2002).</li>
<li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Peptide antibiotics.</a> Lancet. 349, 418-422 (1997).</li>
<li>Dohan Ehrenfest, D. M., Rasmusson, L., Albrektsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+platelet+concentrates%3A+from+pure+platelet-rich+plasma+%28P-PRP%29+to+leucocyte-+and+platelet-rich+fibrin+%28L-PRF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF).</a> Trends Biotechnol. 27, 158-167 (2009).</li>
<li>Kalen, A., Wahlstrom, O., Linder, C. H., Magnusson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+content+of+bone+morphogenetic+proteins+in+platelets+varies+greatly+between+different+platelet+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The content of bone morphogenetic proteins in platelets varies greatly between different platelet donors.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 375, 261-264 (2008).</li>
<li>Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+levels+in+platelet-rich+plasma+and+correlations+with+donor+age%2C+sex%2C+and+platelet+count%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Craniomaxillofac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count.</a> J. Craniomaxillofac. Surg. 30, 97-102 (2002).</li>
<li>Mazzucco, L., Balbo, V., Cattana, E., Guaschino, R., Borzini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+every+PRP-gel+is+born+equal.+Evaluation+of+growth+factor+availability+for+tissues+through+four+PRP-gel+preparations%3A+Fibrinet%2C+RegenPRP-Kit%2C+Plateltex+and+one+manual+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Not every PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure.</a> Vox Sang. 97, 110-118 (2009).</li>
<li>Lei, H., Gui, L., Xiao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+anticoagulants+on+the+quality+and+biological+efficacy+of+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of anticoagulants on the quality and biological efficacy of platelet-rich plasma.</a> Clin. Biochem. 42, 1452-1460 (2009).</li>
<li>Redler, L. H., Thompson, S. A., Hsu, S. H., Ahmad, C. S., Levine, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasma+therapy%3A+a+systematic+literature+review+and+evidence+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Sportsmed%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasma therapy: a systematic literature review and evidence for clinical use.</a> Phys. Sportsmed. 39, 42-51 (2011).</li>
<li>Whitman, D. H., Berry, R. L., Green, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+gel%3A+an+autologous+alternative+to+fibrin+glue+with+applications+in+oral+and+maxillofacial+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Maxillofac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial surgery.</a> J. Oral Maxillofac. Surg. 55, 1294-1299 (1997).</li>
<li>Anitua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+rich+in+growth+factors%3A+preliminary+results+of+use+in+the+preparation+of+future+sites+for+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oral+Maxillofac.+Implants%22%5BJournal%5D)">Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants.</a> Int. J. Oral Maxillofac. Implants. 14, 529-535 (1999).</li>
<li>Whitman, D. H., Berry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+improving+the+handling+of+particulate+cancellous+bone+and+marrow+grafts+using+platelet+gel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral.+Maxillofac.+Surg%22%5BJournal%5D)">A technique for improving the handling of particulate cancellous bone and marrow grafts using platelet gel.</a> J. Oral. Maxillofac. Surg. 56, 1217-1218 (1998).</li>
<li>Currie, L. J., Sharpe, J. R., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fibrin+glue+in+skin+grafts+and+tissue-engineered+skin+replacements%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Plast.+Reconstr.+Surg%22%5BJournal%5D)">The use of fibrin glue in skin grafts and tissue-engineered skin replacements: a review.</a> Plast. Reconstr. Surg. 108, 1713-1726 (2001).</li>
<li>Nikulin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+calcium%2C+thrombin+and+nucleotides+%28ADP%2C+cAMP%2C+cGMP%29+on+blood+platelet+glycolysis+and+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Farmakol.+Toksikol%22%5BJournal%5D)">Effect of calcium, thrombin and nucleotides (ADP, cAMP, cGMP) on blood platelet glycolysis and energy metabolism.</a> Farmakol. Toksikol. 43, 585-590 (1980).</li>
<li>Hantgan, R. R., Taylor, R. G., Lewis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+interact+with+fibrin+only+after+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets interact with fibrin only after activation.</a> Blood. 65, 1299-1311 (1985).</li>
<li>Hantgan, R., Fowler, W., Erickson, H., Hermans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+assembly%3A+a+comparison+of+electron+microscopic+and+light+scattering+results%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibrin assembly: a comparison of electron microscopic and light scattering results.</a> Thromb. Haemost. 44, 119-124 (1980).</li>
<li>Li, B., Jiang, B., Boyce, B. M., Lindsey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+polypeptide+nanoscale+coatings+incorporating+IL-12+for+the+prevention+of+biomedical+device-associated+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multilayer polypeptide nanoscale coatings incorporating IL-12 for the prevention of biomedical device-associated infections.</a> Biomaterials. 30, 2552-2558 (2009).</li>
<li>Li, B., Jiang, B., Dietz, M. J., Smith, E. S., Clovis, N. B., Rao, K. M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+local+MCP-1+and+IL-12+nanocoatings+for+infection+prevention+in+open+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of local MCP-1 and IL-12 nanocoatings for infection prevention in open fractures.</a> J. Orthop. Res. 28, 48-54 (2010).</li>
<li>Boyce, B. M., Lindsey, B. A., Clovis, N. B., Smith, E. S., Hobbs, G. R., Hubbard, D. F., Emery, S. E., Barnett, J. B., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additive+effects+of+exogenous+IL-12+supplementation+and+antibiotic+treatment+in+infection+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Additive effects of exogenous IL-12 supplementation and antibiotic treatment in infection prophylaxis.</a> J. Orthop. Res. 30 (2), 196-202 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Osocze bogatopłytkowe jest coraz częściej stosowane w zastosowaniach klinicznych ze względu na swoje właściwości wspomagające gojenie 15-17. W niniejszej pracy osocze bogatopłytkowe (PRP) zostało przedstawione jako nowe podejście do zapobiegania zakażeniom. Stwierdzono, że PRP ma silne właściwości przeciwdrobnoustrojowe przeciwko MRSA, MSSA, paciorkowcom grupy A i Neisseria gonorrhoeae. Główne zalety PRP, w porównaniu z konwencjonalnymi antybiotykami, w zapobieganiu zakażeniom obejmują: (1) O...

Zakażenie związane z implantem jest poważnym powikłaniem klinicznym. Staphylococcus aureus (S. aureus) jest jednym z najczęstszych mikroorganizmów izolowanych z zakażeń związanych z implantami. Jest zdolny do wytwarzania biofilmu, który pokrywa powierzchnie implantów i może prowadzić do infekcji opornej na antybiotyki 1,2. Leczenie infekcji implantologicznej często wymaga długotrwałej hospitalizacji z powodu powtarzających się oczyszczeń i długotrwałej antybiotykoterapii pozajelitowej. W przypadkach oporności na antybiotyki może być konieczne usunięcie implantu. Rosnąca oporność bakterii na antybiotyki została również określona przez Centers for Disease Control and Prevention (CDC) jako "jeden z najbardziej palących problemów zdrowotnych na świecie". Z czasem, bez opracowania nowych i skutecznych metod leczenia przeciwdrobnoustrojowego, możliwe jest, że patogeny wielolekooporne będą nieuleczalne za pomocą konwencjonalnych antybiotyków. Zapobieganie zakażeniom związanym z implantami jest zatem ważne i potrzebne są nowe środki lub podejścia profilaktyczne w celu zapobiegania takim zakażeniom.
Osocze bogatopłytkowe (PRP) to stężenie krwi autologicznej, które zawiera ponad 30 czynników wzrostu, które mogą pomóc w gojeniu kości i przeszczepów kostnych 3-5. Zastosowanie PRP w celu poprawy regeneracji kości i dojrzewania tkanek miękkich jest coraz częściej zgłaszane w klinikach ze względu na wysokie stężenie różnych czynników wzrostu uwalnianych przez płytki krwi.
Kilka cech PRP wskazuje, że PRP może mieć również właściwości przeciwdrobnoustrojowe 6-9. PRP zawiera dużą liczbę płytek krwi, wysokie stężenie leukocytów (które mogą mieć działanie obronne gospodarza przed bakteriami i grzybami) oraz wiele peptydów przeciwdrobnoustrojowych 7,8,10. W niedawnym badaniu przeprowadzonym na dużej kohorcie pacjentów kardiochirurgicznych wykazano, że śródoperacyjne stosowanie żelu PRP podczas zamykania ran znacznie zmniejszyło częstość występowania powierzchownych i głębokich infekcji mostka 11. Z tych powodów i obserwacji postawiliśmy hipotezę, że PRP, oprócz dobrze zbadanych właściwości wspomagających gojenie, ma właściwości przeciwdrobnoustrojowe. Potencjalne korzyści płynące ze stosowania PRP w celu zapobiegania infekcjom mogą obejmować: (i) PRP jest mniej podatne na wywoływanie oporności w porównaniu z konwencjonalnymi antybiotykami. (ii) PRP ma również właściwości wspomagające gojenie, które mogą mieć synergiczny wpływ na zapobieganie infekcjom; Właściwości wspomagające gojenie PRP mogą zapewnić uszczelnienie zapobiegające przyczepianiu się bakterii, zmniejszając w ten sposób szanse na infekcję, ponieważ patogeny i komórki ludzkie ścigają się o powierzchnie implantów 12,13. (iii) PRP jest z natury biokompatybilne, bezpieczne i wolne od ryzyka chorób zakaźnych.
Naszym długoterminowym celem jest wykorzystanie PRP jako nowego podejścia do zapobiegania infekcjom związanym z implantami. Celem pracy było przygotowanie PRP przy użyciu podejścia opartego na dwukrotnym wirowaniu, zbadanie właściwości przeciwdrobnoustrojowych PRP in vitro oraz opisanie protokołów oceny takich właściwości przeciwdrobnoustrojowych.

<table><tbody><tr><td>Trombina bydlęca</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05</td><td>Trombina (pochodzenia bydlęcego)</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05</td><td>10% chlorek wapnia</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>Mueller Hinton bulion</td><td>Becton, Dickinson i spółka</td><td>275710</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trójsodowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny agar sojowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01202</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Kendro Produkty laboratoryjne</td><td>750043077</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr></tbody></table>

prp jako nowe podejście do zapobiegania infekcjom: przygotowanie i właściwości przeciwdrobnoustrojowe prp in vitro

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Zakażenie związane z implantami staje się coraz większym wyzwaniem dla branży medycznej na całym świecie ze względu na rosnącą oporność na antybiotyki, przenoszenie bakterii opornych na antybiotyki między zwierzętami a ludźmi oraz wysokie koszty leczenia infekcji.
W tym badaniu ujawniamy nową strategię, która może być skuteczna w zapobieganiu infekcjom związanym z implantami, w oparciu o potencjalne właściwości przeciwdrobnoustrojowe osocza bogatopłytkowego (PRP). Ze względu na dobrze zbadane właściwości wspomagające gojenie, PRP (produkt biologiczny) jest coraz częściej stosowany w zastosowaniach klinicznych, w tym w operacjach ortopedycznych, periodontologicznych i ustnych, operacjach szczękowo-twarzowych, operacjach plastycznych, medycynie sportowej itp.
PRP może być zaawansowaną alternatywą dla konwencjonalnych antybiotyków w zapobieganiu infekcjom związanym z implantami. Stosowanie PRP może być korzystne w porównaniu z konwencjonalnymi antybiotykami, ponieważ PRP jest mniej podatne na wywoływanie oporności na antybiotyki, a właściwości przeciwbakteryjne i wspomagające gojenie PRP mogą mieć synergiczny wpływ na zapobieganie infekcjom. Powszechnie wiadomo, że patogeny i komórki ludzkie ścigają się o powierzchnię implantu, a właściwości PRP w zakresie wspomagania gojenia mogą poprawić przyczepienie komórek ludzkich, zmniejszając w ten sposób ryzyko infekcji. Ponadto osocze bogatopłytkowe (PRP) jest z natury biokompatybilne, bezpieczne i wolne od ryzyka chorób zakaźnych.
Do naszego badania wybraliśmy kilka klinicznych szczepów bakterii, które są powszechnie spotykane w infekcjach ortopedycznych i sprawdziliśmy, czy PRP ma in vitro właściwości przeciwbakteryjne przeciwko tym bakteriom. Otworzyliśmy PRP przy użyciu metody dwukrotnego wirowania, która pozwala na uzyskanie tego samego stężenia płytek krwi dla wszystkich próbek. Osiągnęliśmy spójne wyniki dotyczące zwalczania drobnoustrojów i stwierdziliśmy, że PRP ma silne właściwości przeciwdrobnoustrojowe in vitro przeciwko bakteriom, takim jak wrażliwy na metycylinę i oporny na metycylinę Staphylococcus aureus, Streptococcus grupy A i Neisseria gonorrhoeae. W związku z tym stosowanie PRP może potencjalnie zapobiegać zakażeniom i zmniejszać potrzebę kosztownego leczenia pooperacyjnego zakażeń związanych z implantami.

PRP jest przygotowywane w sposób powtarzalny z zastosowaniem metody dwukrotnego wirowania (Rysunek 1). Stwierdzono, że PRP wykazuje silne właściwości przeciwdrobnoustrojowe in vitro (redukcja CFU do 100 razy) w odniesieniu do metycylinoopornych szczepów S. aureus (MRSA) (Rysunek 3), które są powszechnie występujące w szpitalach na całym świecie 14. Podobnie, PRP wykazuje silne właściwości przeciwdrobnoustrojowe wobec szczepów S. aureus wrażliwych na ...

Zakażenie związane z implantem jest poważnym powikłaniem klinicznym. W niniejszym badaniu opisano podejście wykorzystujące osocze bogatopłytkowe (PRP) w celu zapobiegania zakażeniom związanym z implantami, przedstawiono protokół przygotowania PRP ze stałym stężeniem płytek krwi oraz opisano nowo zidentyfikowane właściwości przeciwdrobnoustrojowe PRP i powiązane protokoły badania takich właściwości przeciwdrobnoustrojowych in vitro.

PRP jako nowe podejście do zapobiegania infekcjom: przygotowanie i właściwości przeciwdrobnoustrojowe PRP in vitro

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie właściwości przeciwdrobnoustrojowych osocza bogatopłytkowego (PRP) in vitro. W pierwszej kolejności należy wyizolować osocze bogatopłytkowe od królika dawcy. Następnie należy przygotować inokulum bakteryjne, po czym aktywować PRP za pomocą trombiny i wymieszać je z inokulum bakteryjnym.Inkubuj mieszaninę i próbkę, a następnie zmierz powstałe jednostki tworzące kolonie. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe PRP wykazuje redukcja CFU w próbkach traktowanych PRP w porównaniu z próbkami kontrolnymi. Bez zastosowania PRP bogatopłytczkowa osocze z mniejszym prawdopodobieństwem indukuje oporność na BOL w porównaniu z konwencjonalnymi terapiami BOL.Posiada ono również właściwości sprzyjające gojeniu ran, co może wywierać synergistyczny wpływ na zapobieganie infekcjom. W obecnym protokole zastosowano podejście dwukrotne, a stężenie płytek krwi w PRP zestandaryzowano do poziomu 2 × 10⁶ płytek na około 10 razy powyżej wartości bazowej we krwi, wykorzystując PRP bogate w leukocyty. Ponieważ leukocyty biorą udział w bezpośrednim zabijaniu bakterii oraz w swoistej odpowiedzi immunologicznej przeciwantygenowej, co może przyczyniać się do właściwości przeciwdrobnoustrojowych PRP, w pierwszej kolejności należy znieczulić królika poprzez inhalację izofluranu.Naciągnąć 2 ml 0,129 mol/l cytrynianu trysodu do strzykawki o pojemności 20 ml. Zdezynfekować ucho królika za pomocą 70% etanolu.Używając igły motylkowej o rozmiarze 25 G, pobierz krew z żyły usznej królika i wymieszaj ją z roztworem cytrynianu trisodu poprzez delikatne potrząsanie. Przenieś przeciwkrzepląca krew do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.Pobierz 10 µL krwi w celu wyznaczenia bazowej liczby płytek krwi za pomocą hemocytometru w wirówce z ruchomymi statywami. Ustaw niską prędkość przyspieszania i hamowania, a następnie wiruj krew przy 300 G przez 10 minut. W temperaturze pokojowej ostrożnie przenieś probówkę do dygestorium do hodowli komórkowych, uważając, aby nie naruszyć warstw.Przenieś całą warstwę białkową (buffy coat) osocza oraz warstwę erytrocytów o grubości od dwóch do trzech milimetrów do plastikowej probówki o pojemności 15 ml. Odwiruj przeniesioną próbkę przy 3000 G przez 15 minut. W temperaturze pokojowej przenieś nadsącz w postaci osocza ubogopłytkowego do nowej probówki.Przygotuj osocze bogate w płytki krwi, dostosowując stężenie płytek w pozostałej próbce krwi za pomocą PPP, aby uzyskać stężenie 2 × 10⁶ płytek na mikrolitr, określone za pomocą hemocytometru z nocnie wysianej na agar krwi płytki z S. aureus. Zaszczep pięć kolonii do 5 mL bulionu Mueller-Hinton i wymieszaj w wortexie. Poluź zakrętkę i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.Zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru. Dostosuj stężenie inokulum do gęstości optycznej na podstawie wcześniej wyznaczonej krzywej wzorcowej. Przygotuj 100-krotne rozcieńczenie w PBS, aby uzyskać stężenie 1 × 10⁶ JCF/ml, a następnie umieść inokulum w lodzie.Przygotować i opisać sterylne jednorazowe probówki polistyrenowe o dnie okrągłym o pojemności 5 ml. Dla wskazanych grup próbek najpierw dodać P-R-P-P-P-P lub PBS. Następnie dodać roztwór trombiny w celu aktywacji.Następnie dodaj bulion Muellera-Hintona, a potem inokulum ESUs, aby uzyskać końcowe stężenie 1 × 10⁵ CFU/ml. Inkubuj probówki w temperaturze 37 °C przy agitacji orbitalnej z prędkością 150 RPM w określonych punktach czasowych. Wymieszaj roztwory w każdej probówce, aby upewnić się, że bakterie nie zostały uwięzione wewnątrz żelu PRP.Pobrać 10 µL każdej próbki. Wykonać rozcieńczenia seryjne w sterylnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej, a następnie nanieść 100 µL każdego rozcieńczenia na płytkę z podłożem sojowo-kazeinowym (tryptykowym). W celu liczenia jednostek tworzących kolonie (CFU), inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.Następnie należy policzyć i zapisać liczbę kolonii na płytkach. Dane należy nanieść na skalę logarytmiczną, z czasem na osi X i liczbą CFU na mililitr na osi Y. Osocze bogatopłytkowe jest przygotowywane w sposób powtarzalny przy użyciu metody dwukrotnego wirowania.PRP wykazuje silne właściwości przeciwdrobnoustrojowe wobec kilku gatunków bakterii, w tym szczepów gronkowca złocistego opornych i wrażliwych na metycylinę, paciorkowców grupowych oraz rzeżączki w punktach czasowych jednej i dwóch godzin. Bakterie MRSA są powszechnie spotykane w szpitalach na całym świecie. Niniejszy test aktywności bakteriobójczej pokazuje.PRP wykazuje silne właściwości przeciwdrobnoustrojowe in vitro przeciwko MRSA w punktach czasowych jednej i dwóch godzin. Analiza ilościowa wskazuje, że po jednej godzinie uzyskano do 100-krotną redukcję CFUs przy użyciu PRP w porównaniu z kontrolami PPP i PBS. Rozmazy krwi z PRP przygotowanego metodą dwukrotnego wirowania zawierają około 10-krotnie większą liczbę płytek krwi w porównaniu z pełną krwią, co sprzyja uzyskaniu spójnych i powtarzalnych wyników.Liczba i jakość płytek krwi są kluczowymi czynnikami wpływającymi na sukces tego eksperymentu. Po zastosowaniu tej procedury można ocenić inne szczepy bakteryjne, a PRP można również badać in vivo, aby sprawdzić jego właściwości przeciwdrobnowe w modelach infekcji zwierzęcych po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie PRP do zbadania potencjalnego zastosowania PRP w zapobieganiu infekcjom i wspomaganiu gojenia ran w warunkach zwierzęcych i klinicznych.

prp-as-new-approach-to-prevent-infection-preparation-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

PRP jako nowe podejście do zapobiegania infekcjom: Przygotowanie i in vitro właściwości przeciwdrobnoustrojowe PRP

Tutaj prezentujemy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI), protokół oparty na wstawianiu miejsc enzymów restrykcyjnych do sekwencji synonimów DNA i funkcjonalnym odzyskiwaniu plazmidu. Protokół ten jest szybką i tanią metodą fuzji genów kodujących białka.

CAPRRESI: Składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego

Ten artykuł ma na celu opisanie międzypęcherzykowych autologicznych ostrzyżeń osocza bogatopłytkowego (0,20 ml xcm2) w skórę głowy 23 pacjentów dotkniętych łysieniem androgenowym na głębokości 5 mm przy użyciu medycznego pistoletu iniekcyjnego wyposażonego w igłę o rozmiarze 30, w trzech sesjach.

Mechaniczne i kontrolowane iniekcje PRP u pacjentów dotkniętych łysieniem androgenowym

Protokół przedstawia selektywne wprowadzanie aminokwasów (ncAA) do laktokokowego peptydu przeciwbakteryjnego nizyny na bazie Escherichia coli. Jego właściwości mogą być zmieniane podczas ekspresji rekombinowanej poprzez podstawienie pożądanymi ncAA w zdefiniowanych pożywkach wzrostowych. Wynikające z tego zmiany bioaktywności są mapowane za pomocą testów hamowania wzrostu i mikroskopii fluorescencyjnej.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem

Opisujemy platformę, która wykorzystuje bibliotekę izogenicznych antybiotykoopornych Escherichia coli do dereplikacji antybiotyków. Tożsamość antybiotyku wytwarzanego przez bakterie lub grzyby można wywnioskować na podstawie wzrostu E. coli wyrażającego odpowiedni gen oporności. Ta platforma jest ekonomicznie efektywna i oszczędza czas.

Dereplikacja antybiotyków przy użyciu platformy oporności na antybiotyki

Ten protokół przedstawia urządzenie, które wytwarza PRP, aby przyspieszyć ekspansję in vitro komórek w 100% autologicznym systemie hodowli fibroblastów.

Produkcja autologicznego osocza bogatopłytkowego w celu zwiększenia ekspansji ludzkich fibroblastów in vitro

Ten protokół ma na celu opisanie sposobu badania zakresu internalizacji Staphylococcus aureus i jego zdolności do przetrwania wewnątrz ludzkiej komórki gospodarza, a także wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych.

Ulepszony test ochrony enzymatycznej do badania internalizacji Staphylococcus aureus i wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych

Wprowadzamy cztery metody oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząsteczek i powierzchni nanostrukturalnych za pomocą technik in vitro. Metody te można zaadaptować do badania interakcji różnych nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych z szeroką gamą gatunków drobnoustrojów.

Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych in vitro

Protokół podsumowuje najlepsze praktyki mające na celu zminimalizowanie obciążenia biologicznego mikroorganizmów w środowisku pomieszczeń czystych i zawiera strategie, takie jak monitorowanie środowiska, monitorowanie procesów i testowanie sterylności produktu. Jest to istotne dla zakładów produkcyjnych i badawczych, które są zobowiązane do spełniania aktualnych standardów dobrej praktyki tkankowej i aktualnych standardów dobrej praktyki wytwarzania.

Strategie kontroli i monitorowania mikrobiologicznego w pomieszczeniach czystych i terapiach komórkowych

Brakuje metody oceny powszechnie używanych obszarów w warunkach laboratoryjnych pod kątem zanieczyszczenia prionami i skutecznej dekontaminacji. Opisany tutaj protokół zawiera kluczowe podstawy do wdrożenia laboratoryjnego testu bezpieczeństwa prionów, który można łatwo modyfikować w celu spełnienia indywidualnych potrzeb określonych laboratoriów.

Test laboratoryjny bezpieczeństwa prionowego

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Poznaj metodę przygotowania osocza bogatopłytkowego i oceny jego właściwości przeciwdrobnoustrojowych in vitro. Protokół obejmuje izolację PRP od królika, aktywację trombiną oraz pomiar jednostek koloniotwórczych w celu zapobiegania infekcjom związanym z implantami.

PRP jako nowe podejście do zapobiegania infekcjom: przygotowanie i właściwości przeciwdrobnoustrojowe PRP in vitro

Przeglądaj więcej filmów