Name: In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj technikę obrazowania wapnia w pojedynczych neuronach C. elegans przy użyciu wskaźników fluorescencyjnych GCaMP i Chameleon. Metoda umożliwia analizę aktywności neuronalnej w odpowiedzi na bodźce sensoryczne i uszkodzenia komórkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kilka osób przyczyniło się do pracy opisanej w tym artykule. CVG zbudowało konfigurację eksperymentalną, a LS, SHC i CVG przeprowadziły eksperymenty. CVG i SHC napisały manuskrypt. Następnie wszyscy autorzy wzięli udział w procesie korekty i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu. Dziękujemy Paulowi Sternbergowi za szczep GCaMP. Niektóre szczepy nicieni użyte w tej pracy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center (CGC), które jest finansowane przez NIH National Center for Research Resources (NCRR). Program do analizy obrazu MATLAB został zaadaptowany z tego używanego w 18. Autorzy byli wspierani przez Uniwersytet Bostoński i Massachusetts Life Sciences Center.

1. Konfiguracja optyczna
 <ol>
 <li>Użyj standardowego mikroskopu złożonego z możliwością obrazowania epifluorescencyjnego. Używamy mikroskopu odwróconego Nikon Eclipse Ti-U z oświetlaczem Intensilight HG Illuminator.</li>
 <li>Aby uzyskać najlepszą jakość obrazu i sygnału, należy użyć obiektywu o dużym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej. Zazwyczaj używamy obiektywu immersyjnego Nikon X60 1.4 N.A. z olejkiem. W niektórych przypadkach możliwe jest użycie mniejszego powiększenia (X40, X20) w zależności od poziomu ekspresji fluoroforu i siły sygnału.</li>
 <li>Użyj chłodzonej kamerą CCD o wysokiej czułości, takiej jak kamera Andor Clara, aby zmaksymalizować czułość obrazu i zminimalizować szumy tła.</li>
 <li>W przypadku fluoroforów jednokolorowych należy użyć standardowego zestawu filtrów fluorescencyjnych mikroskopu zaprojektowanego dla określonej długości fali fluoroforu. W przypadku GCaMP należy użyć standardowego zestawu filtrów GFP zoptymalizowanego pod kątem wzbudzenia przy 488 nm i emisji przy 525 nm. Nie są wymagane żadne dalsze modyfikacje optyczne.</li>
 <li>W przypadku fluoroforów ratiometrycznych, takich jak cameleon, należy użyć podwójnego systemu obrazowania, tak aby identyczne obrazy mogły być jednocześnie rejestrowane na dwóch oddzielnych długościach fal. Osiąga się to poprzez projekcję dwóch obrazów obok siebie w aparacie. Prosta konfiguracja, aby to osiągnąć, wykorzystująca podstawowe komponenty optyczne na płytce prototypowej klasy optycznej, jest zilustrowana na rysunku 1. Składa się z: 
 <ol class="ualpha">
 <li>Zestaw filtrów mikroskopowych z filtrem wzbudzenia 440 ±20 nm i zwierciadłem dichroicznym 455 nm. </li>
 <li>Maska obrazu umieszczona na początkowej płaszczyźnie obrazu bezpośrednio poza portem obrazowania mikroskopu (gdzie zwykle znajduje się czujnik CCD aparatu). Ogranicza to pole widzenia tak, że wypełni ono tylko połowę matrycy aparatu. Umieszczenie tej maski na pierwszej płaszczyźnie obrazu powoduje uzyskanie ostrych obramowań obrazu i brak nakładania się, gdy oba obrazy są rzutowane obok siebie.</li>
 <li>Pierwsza soczewka przekaźnikowa ustawiała jedną ogniskową od początkowej płaszczyzny obrazu, tak aby kolimowała światło.</li>
 <li>Lustro dichroiczne, które rozdziela światło na dwie oddzielne długości fal lub kanały obrazowania, odbijając jeden kolor (>515 nm, żółty), jednocześnie transmitując drugi (<515 nm, cyjan).</li>
 <li>filtry emisyjne (filtry pasmowo-przepustowe) dodatkowo ograniczające przepuszczane światło do określonych długości fal obrazowania (cyjan przy 485 ± 40 nm i żółty przy 535 ± 30 nm),</li>
 <li>Drugie soczewki przekaźnikowe (po jednej na każdy kanał) umieszczane są na ścieżkach wiązki w taki sposób, że ponownie skupiają światło na drugiej płaszczyźnie obrazu w kamerze CCD.</li>
 <li>Para luster i drugie zwierciadło dichroiczne kierują ścieżki wiązki w taki sposób, że oba obrazy łączą się ponownie i są rzutowane obok siebie na matrycę CCD kamery. Rysunek 4A przedstawia przykładowy obraz wynikowy.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wstępne wyrównanie optyczne: Zainicjuj konfigurację i wyrównanie optyki z obrazem o wysokim kontraście przy użyciu obiektywu o małym powiększeniu i przechodzącego oświetlenia światłem szerokokątnym (dobrze sprawdza się sharpie narysowany na szkiełku mikroskopowym). Ustaw ostrość obrazu przez okulary mikroskopu, a następnie przełącz się na port mikroskopu, który ma być używany. Przy silnym oświetleniu można wyświetlić obraz na karcie katalogowej w początkowej płaszczyźnie ogniskowej (kilka cm poza portem mikroskopu). Umieść pierwszą soczewkę przekaźnikową (C) na ścieżce wiązki tak, aby znajdowała się w jednej odległości ogniskowej od początkowej płaszczyzny ogniskowej i kolimowała światło, nie odchylając ścieżki wiązki (tj. była bezpośrednio wyśrodkowana na ścieżce wiązki). Umieść maskę na pierwszej płaszczyźnie ogniskowej, dostosowanej tak, aby ograniczyć połowę pola widzenia i uzyskać ostrą granicę na obrazie. Ustawić lustra i filtry (D, E, G) tak, aby ścieżka wiązki pozostawała równoległa do powierzchni stołu i przebiegała w dwóch równoległych ścieżkach obok siebie, jak pokazano na rysunku 1B. Wyśrodkuj drugie soczewki przekaźnikowe (F) w odpowiednich ścieżkach wiązki i przesuwaj je do przodu iz powrotem wzdłuż ścieżek, aby ustawić ostrość obrazów na karcie indeksowej umieszczonej w miejscu, w którym będzie znajdował się czujnik CCD kamery. Jeśli zostanie to wykonane poprawnie, oba obrazy powinny być parafokalne z mikroskopem, okularami i innymi portami kamery. Na koniec ustaw kamerę w odpowiedniej pozycji i dostosuj wyrównanie.</li>
 <li>Dostrajanie wyrównania optycznego: Użyj podwójnego obrazu viewed przez kamerę CCD, aby dostroić wyrównanie optyczne. Użyj obrazu o wysokim kontraście i zacznij od mniejszego powiększenia, przełączając się na większe powiększenie w celu ostatecznego wyrównania. Ustaw przesyłany obraz (kanał błękitny na rysunku 1B) tak, aby obejmował połowę pola widzenia kamery, przesuwając kamerę w X i Y. Ustaw odbity obraz (żółty kanał na rysunku 1B) tak, aby obejmował drugą połowę pola widzenia, regulując dwa ostatnie lustra (G) na ścieżce wiązki. Zoptymalizuj ostrość, przesuwając drugą soczewkę przekaźnikową dla każdego kanału do przodu iz powrotem wzdłuż ścieżki wiązki. Jeśli nie zostanie zmieniona, konfiguracja optyczna powinna być stabilna i wymagać jedynie rzadkiej precyzyjnej regulacji.</li>
 </ol>
 2. Przygotowanie próbki i akwizycja danych.
 <ol>
 <li>Pozyskaj zwierzęta wykazujące ekspresję wrażliwego na wapń fluoroforu w interesującym neuronie z Caenorhabditis Genetics Center (CGC) lub z innych źródeł. Alternatywnie, zwierzęta transgeniczne mogą być konstruowane przy użyciu standardu C. techniki elegans. Ekspresja pojedynczej komórki nie jest konieczna (a czasami nie jest pożądana, jeśli ma być zbadanych wiele neuronów, patrz 12), o ile obrazy i pomiary z wielu komórek można łatwo rozdzielić. Jeśli transgen fluoroforu nie zostanie zintegrowany z genomem, może wystąpić znaczna różnica w ekspresji między zwierzętami. W tym przypadku wstępna selekcja zwierząt o wyższym poziomie ekspresji przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego zwiększa stosunek sygnału do szumu i poprawia pomiary. Poziomy ekspresji fluoroforu muszą być wystarczające, aby można je było łatwo zobrazować za pomocą kamery przy parametrach akwizycji wymaganych w eksperymencie.</li>
 <li>Przygotować płatki agarozowe wymagane do pożądanej techniki unieruchomienia (patrz ppkt 2.3 poniżej), naciskając małą kroplę stopionej agarozy między dwoma szkiełkami podstawowymi oddalonymi od siebie dwoma kawałkami taśmy laboratoryjnej. W razie potrzeby podkładki z agarozy można przenieść na szklane szkiełko nakrywkowe przed zamontowaniem zwierząt. Zobacz rysunek 2.</li>
 <li>Unieruchomić C. elegans do obrazowania przy użyciu jednej z następujących technik:
 <ol class="ualpha">
 <li>Paraliż farmakologiczny: Dodaj 0,05% lewamizolu do 2% watworek agarozowych (mieszając go ze stopioną agarozą przed przygotowaniem płatków w 2,2). Wybierz 5-10 zwierząt na podkładkę i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Nałóż niewielkie ilości mieszanki gorącego wosku (50% wosku parafinowego i 50% wazeliny) na rogi szkiełka nakrywkowego, aby utrzymać go na miejscu. Odczekaj 5-10 minut, aż lewamizol zacznie działać, a zwierzęta całkowicie się znieruchomą.</li>
 <li>Unieruchomienie sztywnej agarozy: C. elegans można fizycznie unieruchomić za pomocą sztywnych 10% wkładek agarozowych i nanocząstek polistyrenu o średnicy 0,05 μm. Przygotować 10% płatki agarozowe (10% wagowo agarozy w buforze NGM) jak w ppkt 2.2. Dodaj ~3 μl roztworu kulek (mikrosfery polistyrenu 1:10 do objętości NGM) na wierzch podkładki. Szybko zbierz 5-10 C. elegans do kałuży roztworu kulek na podkładce i delikatnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Użyj stopionego wosku nałożonego na rogi szkiełka nakrywkowego, aby utrzymać go na miejscu. (Dodatkowe informacje na temat tej techniki znajdują się w punkcie 7, jak również w poprzednim artykule 8 JoVe)</li>
 <li>Klejenie: C. elegans można przykleić za pomocą niewielkich ilości kleju weterynaryjnego nałożonego na jedną stronę zwierzęcia.</li>
 <li>Urządzenia mikroprzepływowe: Wiele urządzeń mikroprzepływowych zostało zaprojektowanych do fizycznego utrzymywania C. elegans w miejscu do obrazowania.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Umieść przygotowane szkiełko pod mikroskopem i skup się na pożądanym neuronie. Często najłatwiej jest znaleźć C. elegans przy użyciu jasnego oświetlenia pola i małego powiększenia. Następnie przełącz się na obrazowanie w dużym powiększeniu i fluorescencji, aby znaleźć i skupić się na konkretnym neuronie. </li>
 <li>Bodziec: Jeśli pożądana jest reakcja neuronalna na określony bodziec (światło, pole elektryczne, sygnały smakowe i węchowe, temperatura itp.), aparat bodźcowy musi być zaprojektowany w konfiguracji mikroskopu, tak aby mógł być podawany zwierzętom w przygotowaniu próbki podczas obrazowania. </li>
 <li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopowej kamery CCD. Czasy ekspozycji i poziom światła wzbudzającego będą zależeć od sygnału podstawowego i poziomu ekspresji fluoroforu, przy czym słabsze sygnały wymagają dłuższych czasów ekspozycji przy odpowiednio mniejszej rozdzielczości czasowej. Zazwyczaj używamy czasów naświetlania ~300 ms.</li>
 <li>Rób zdjęcia pojedynczo lub jako film poklatkowy. Ponieważ neurony C. elegans na ogół wykazują powolną dynamikę aktywacji (tj. brakuje im potencjałów czynnościowych opartych na sodzie), stosunkowo niska liczba klatek na sekundę wynosząca ~1 sekundę jest często wystarczająca do zmierzenia dynamiki neuronów. Zastosowano szybkości akwizycji do ~90 klatek na sekundę, chociaż mogą one być ograniczone czasem integracji niezbędnym do słabej fluorescencji. Pojedyncze filmy pojedynczego neuronu mogą z łatwością rozciągać się na kilka minut (~5-10 minut) lub dłużej, jeśli przygotowanie do unieruchomienia jest stabilne, a liczba klatek na sekundę stosunkowo niska.</li>
 </ol>
 3. Analiza danych
 <ol>
 <li>Dostępnych jest wiele różnych pakietów oprogramowania do obrazowania fluorescencyjnego z możliwością analizy dynamicznej i ratiometrycznej, w tym ImageJ i NIS-Elements. Używamy prostego, niestandardowego programu MATLAB, który mierzy średni sygnał fluorescencyjny w wybranym obszarze zainteresowania.</li>
 <li>W przypadku pojedynczych obrazów (lub filmów poklatkowych, które pozostają idealnie nieruchome) wybierz obszar zainteresowania (ROI) w obrazowanym neuronie i oddzielny pobliski obszar do pomiaru tła. W przypadku obrazów ratiometrycznych wybierz podobny obszar zwrotu z inwestycji i obszary tła dla każdego z podwójnych obrazów. </li>
 <li>Niewielki ruch zobrazowanego neuronu w filmie poklatkowym wymaga dodatkowej analizy, aby automatycznie wybrać ROI w każdej klatce, co można osiągnąć za pomocą wielu schematów śledzenia obiektów. Nasz program wyświetla skompresowany obraz wszystkich obrazów w filmie, z których ręcznie wybierana jest przybliżona granica (obejmująca obiekt zainteresowania we wszystkich klatkach) i wybierany jest niezależny obszar tła. W przypadku pierwszej klatki obszar zwrotu jest wybierany ręcznie z obszaru granicznego. Dla każdej kolejnej klatki program wybiera najjaśniejsze piksele z obszaru granicy, aby wygenerować ROI o odpowiednim rozmiarze (tj. taką samą liczbę pikseli, jak ręczny ROI pierwszej klatki). W przypadku obrazów, na których obiekt zainteresowania jest wystarczająco jasny niż otaczające tło w obszarze granicznym, protokół ten wybiera rozsądny zwrot z inwestycji dla każdej klatki.</li>
 <li>Sygnał fluorescencyjny F dla każdej klatki jest obliczany jako średnia intensywność pikseli w ROI pomniejszona o średnią intensywność w obszarze tła. Wartości ratiometryczne są obliczane jako stosunek dwóch sygnałów (tło YFP-YFP)/(tło CFP-CFP)-0,65. Współczynnik 0,65 kompensuje przenikanie kanału CFP do kanału YFP, co będzie zależało od zastosowanych fluoroforów, a także konkretnego zestawu filtrów (wartość ta wynosi zwykle ~0,6 dla konfiguracji cameleon).</li>
 <li>Względny poziom wapnia dla każdej ramki oblicza się jako procentową zmianę intensywności znormalizowaną do początkowej wartości podstawowej mierzonej od pierwszej klatki (lub serii ramek): ΔF/F=(F(t)-Fo)/ Fo, gdzie F(t) jest fluorescencją w czasie t, a Fo jest początkową wartością wyjściową.</li>
 <li>Zwrot z inwestycji: wybór ciała komórki generuje najsilniejsze, najbardziej niezawodne sygnały, ale możliwe jest również wybranie i zmierzenie sygnałów z ROI wzdłuż procesów nerwowych.</li>
 </ol>
 4. Rozwiązywanie problemów
 <ol>
 <li>Wybielanie: Ekspozycja na światło wzbudzające może powodować bielenie fluoroforu i charakteryzuje się stałym spadkiem sygnału, który zależy od poziomu ekspozycji. Pomiary ratiometryczne pomagają to skompensować. Jednak selektywne wybielanie o jednej długości fali może nadal występować (zazwyczaj CFP wybiela się szybciej niż YFP). Jeśli dojdzie do bielenia, zmniejsz poziom ekspozycji na światło, skracając czas ekspozycji i/lub intensywność wzbudzenia (z filtrami o neutralnej gęstości w ścieżce oświetlenia). W razie potrzeby można skompensować bielenie, przeprowadzając próbne próby (z tą samą ekspozycją na wzbudzenie, ale bez bodźca neuronalnego) i określając ilościowo stałą czasową zaniku sygnału.</li>
 <li>Unieruchomienie: W przypadku opisanej tutaj prostej analizy obrazu bardzo ważne jest, aby zwierzę pozostawało względnie nieruchome przez cały okres rejestracji. C. elegans reaguje na ekspozycję na światło i bodźce eksperymentalne, co sprawia, że najprawdopodobniej poruszają się w momencie nagrywania. Niewielki ruch może spowodować znaczne zakłócenia podczas pomiaru, zwłaszcza w przypadku pomiarów z procesów aksonowych. Analiza ratiometryczna pomaga w pewnym stopniu złagodzić te skutki, a pomiary z korpusu komórki są bardziej wiarygodne. Staranne wykonanie i dopracowanie procedur unieruchomienia spowoduje, że zwierzęta będą całkowicie nieruchome.</li>
 <li>Wybór tła: Staranny wybór obszaru tła jest niezbędny do pomyślnej analizy obrazu. Obszary tła powinny być w miarę jednolite i ciemniejsze niż obrazowany neuron. Musi być wystarczająco usunięty, aby uniknąć rozproszonego światła (a tym samym odebrać sygnał) z obrazowanego neuronu. Znajdujemy jednolity obszar 20-50 μm od ROI, który działa dobrze w większości przypadków.</li>
 <li>Optyka ratiometryczna: Prawidłowe ustawienie optyki obrazowania ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wyraźnego podwójnego obrazu. Dostępne są komercyjne przystawki mikroskopowe do obrazowania ratiometrycznego. Alternatywną techniką jest zastosowanie szybkiego obrazowania sekwencyjnego przy użyciu szybkiego koła filtrów, aby szybko przełączać się między długościami fal emisji podczas rejestrowania oddzielnych obrazów dla każdej z nich.</li>
 <li>Analiza ratiometryczna: Opisana tutaj analiza jest stosunkowo prostą techniką, która generuje solidne sygnały dzięki uśrednieniu zwrotu z inwestycji. Wymaga rozpoznawalnie jasnego obiektu, aby wybrać ROI. Bardziej wyrafinowana analiza ratiometryczna jest możliwa dzięki precyzyjnemu wyrównaniu i odwzorowaniu podwójnych obrazów, tak aby współczynnik fluorescencji można było obliczyć piksel po pikselu. </li>
 </ol>

<ol><li>Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerr%2C+R+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Reseach Community. (2006).</li>
<li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875(2009).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
<li>Rand, J. B. Acetylcholine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRand%2C+JB+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Reseach Community. (2005).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), e53419(2013).</li>
<li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), e2707(2011).</li>
<li>Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26, 583-594 (2000).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li>
<li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).</li>
<li>Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Core+Apoptotic+Executioner+Proteins+CED-3+and+CED-4+Promote+Initiation+of+Neuronal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 10, e1001331(2012).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30(2006).</li>
<li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca%282%2B%29+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).</li>
<li>Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+mediates+context-dependent+modulation+of+sensory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 55, 662-676 (2007).</li>
<li>Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 63-70 (2007).</li>
<li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).</li>
<li>Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diacylglycerol+kinase+modulates+long-term+thermotactic+behavioral+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans.</a> Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).</li>
<li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li>
<li>Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxic+MEC-4%28d%29+DEG%2FENaC+sodium+channel+conducts+calcium%3A+implications+for+necrosis+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation.</a> Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia są szeroko stosowane w neurobiologii C. elegans. Wiele grup wykorzystało te techniki do zbadania reakcji pierwotnych neuronów czuciowych na bodźce zewnętrzne, jak pokazano tutaj w przypadku odpowiedzi ASJ na pole elektryczne. Wybitnymi przykładami są odczuwanie mechanicznego dotyku, określone substancje chemiczne, temperatura i pole elektryczne 12, 16-19. Monitorowano również aktywność komórek interneuronalnych i mięśniowych zarówno w odpowiedzi na bodźce, jak i w...

Tutaj prezentujemy praktyczne metody obrazowania in vivo wapnia w neuronach C. elegans. Rozwój genetycznie kodowanych, wrażliwych na wapń fluoroforów o wysokim stosunku sygnału do szumu sprawia, że C. elegans jest stosunkowo prostym i opłacalnym systemem pomiaru neurofizjologii i aktywności. Nasze obrazowanie odbywa się za pomocą standardowego mikroskopu złożonego z wykorzystaniem szerokokątnego obrazowania fluorescencyjnego powszechnie dostępnych fluoroforów. Przedstawiamy kilka technik wykorzystujących różne fluorofory i różne preparaty próbek, omawiając mocne i słabe strony każdej z nich. Następnie prezentowane są dane z dwóch przykładowych eksperymentów. Doskonałe dodatkowe źródło informacji na temat opisanych tu technik można znaleźć w WormBook, "Obrazowanie aktywności neuronów i mięśni" R. Kerra, (<a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a>) 3.
 Dwie główne klasy genetycznie kodowanych fluorescencyjnych reporterów wapnia są powszechnie używane u C. elegans: jednokanałowy GCamp i cameleon oparty na FRET. Opiszemy metody i pokażemy przykłady dla danych generowanych przez każdą z nich. 
 GCaMP opiera się na zmodyfikowanym białku zielonej fluorescencji (GFP), które jest wrażliwe na stężenie wapnia w otoczeniu. Osiąga się to poprzez fuzję GFP i białka kalmoduliny o wysokim powinowactwie do wapnia, tak że wiązanie wapnia przez kalmodulinę doprowadza cząsteczkę GFP do skutecznego potwierdzenia fluorescencyjnego 2. Ostatnie postępy w tych fluoroforach generują wyjątkową wielkość sygnału z nawet 500% wzrostem intensywności fluorescencji w fizjologicznym zakresie poziomów wapnia i rozsądnie szybką kinetyką czasu narastania ~95 ms i czasu zaniku ~650 ms4. W stosunkowo krótkich okresach czasu (minuty) te duże sygnały mogą pozwolić na obrazowanie w niższej rozdzielczości (mniejsze powiększenie) i, biorąc pod uwagę dobrze zachowany początkowy pomiar linii bazowej, negować konieczność ciągłych pomiarów podstawowych lub porównawczych.
 Cameleon ma tę zaletę, że jest fluoroforem opartym na FRET, który generuje pomiar ratiometryczny porównujący dwa niezależne kanały lub długości fal 1. Składa się z dwóch oddzielnych fluoroforów (białek fluorescencyjnych emitujących cyjan i żółcień, CFP i YFP) połączonych białkiem kalmoduliny. Kompleks jest oświetlony niebieskim światłem (440 nm), które wzbudza CFP. Wiązanie wapnia zbliża fluorofory do siebie, zwiększając transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) z CFP (donora) do YFP (akceptora) i powodując zmniejszenie emisji CFP (480 nm) i wzrost emisji YFP (535 nm). Względny poziom wapnia jest mierzony jako stosunek intensywności YFP/CFP. Kinetyka kameleonu jest wolniejsza niż w przypadku GCaMP, mierzona in vivo, aby mieć czas narastania ~1 s i czas zaniku ~3 s 5. Jednak stosunek przeciwnie poruszających się sygnałów zwiększa rozmiar sygnału i kompensuje szereg możliwych artefaktów spowodowanych zmianami stężenia fluoroforu, ruchem lub dryfem ostrości i bieleniem. 
 Genetycznie kodowane reportery fluorescencyjne negują większość wymaganego przygotowania próbki za pomocą egzogenicznie podawanych sond i C. Mały przezroczysty korpus Elegans umożliwia obrazowanie w nienaruszonym zwierzęciu przy użyciu prostej fluorescencji szerokokątnej. Głównym wyzwaniem technicznym związanym z przygotowaniem próbki jest zatem bezpieczne unieruchomienie zwierząt. Istnieje wiele różnych powszechnie stosowanych technik, z których każda ma zalety i wady. Użycie środka farmakologicznego do sparaliżowania zwierząt jest łatwe do wdrożenia i pozwala na zamontowanie wielu zwierząt na jednym preparacie (zwykle stosuje się lewamizol, agonistę cholinergicznego, który powoduje zatarcie tkanki mięśniowej 6). C. Elegany można również fizycznie unieruchomić poprzez zamontowanie ich na sztywnej 10% agarozie 7, 8. Minimalizuje to wpływ na fizjologię zwierząt, umożliwia długoterminowe obrazowanie (godziny) i rekonwalescencję wielu zwierząt, ale jest trudniejsze technicznie. Obie te techniki ograniczają fizyczny dostęp do zwierząt (które znajdują się pod szkiełkiem nakrywkowym) i dlatego mogą być stosowane tylko w przypadku niektórych bodźców eksperymentalnych (takich jak światło, temperatura, pole elektryczne lub uszkodzenie lasera). W przypadku bodźców, do których wymagany jest fizyczny dostęp, takich jak dotyk lub podawanie chemikaliów, w wielu badaniach udało się skleić C. elegans (przy użyciu kleju weterynaryjnego) 9. Jest to technicznie trudniejsze, jest to przygotowanie dla jednego zwierzęcia i nie pozwala na powrót do zdrowia zwierząt. Wreszcie, zastosowano liczne urządzenia mikroprzepływowe, które fizycznie powstrzymują C. elegans, zachowując fizjologię zwierząt, umożliwiając ekspozycję na większość rodzajów bodźców (w zależności od konstrukcji urządzenia) i może umożliwić szybką wymianę i powrót zwierząt do zdrowia 10, 11. Mikrofluidyka wymaga jednak dodatkowych umiejętności i możliwości technicznych w zakresie projektowania, produkcji i wdrażania. U unieruchomionych zwierząt aktywność i reakcję na bodziec można ogólnie mierzyć w neuronach czuciowych i interneuronach. Aktywność neuronów ruchowych wymaga bardziej wyrafinowanych technik obrazowania u poruszających się zwierząt. W tym miejscu przedstawimy szczegółowe metody wykorzystujące dwie najprostsze techniki farmakologicznego paraliżu i unieruchomienia za pomocą sztywnej agarozy.
 Przedstawione tutaj metody mogą być używane do pomiaru aktywności neuronalnej i fizjologii komórki u C. elegans. Podajemy przykład każdego z nich: za pomocą GCaMP do pomiaru odpowiedzi sensorycznej neuronu ASJ na zewnętrzne pole elektryczne oraz za pomocą cameleonu do pomiaru fizjologicznej odpowiedzi wapnia na laserowe uszkodzenie neuronu. Przykłady te pokazują zalety i wady tych dwóch rodzajów fluoroforów i ilustrują, co jest możliwe dzięki systemowi.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop odwrócony Eclipse Ti-U</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensilight HG Illuminator</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Fluorescencyjne źródło światła</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60X Olej</td> Stół optyczny <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lub płytka stykowa optyczna 3'X3' klasy 3'X3' </td><td>Thor Labs</td><td></td><td>Jeśli stół optyczny nie jest używany, płytka prototypowa klasy optycznej na solidnym stole laboratoryjnym a powinna wystarczyć .</td></tr><tr><td>Kamera Clara Interline Technologia</td><td></td><td>Andor </td><td>Kamera CCD o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>z technologią GFP Longpass Emission</td><td>Chroma Corp.</td><td>41015</td><td>Zestaw filtrów GFP do obrazowania Filtr GCaMP</td></tr><tr><td>440 +/- 10 nm</td> Filtr wzbudzenia <td>Chroma</td><td>D440/20x EX</td><td>do cameleon</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne > 455 nm długoprzepustowe</td><td>Chroma</td><td>455DCLP BS</td><td>Dichroiczny do obrazowania Cameleon </td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne > 515 nm długoprzepustowe</td><td>Chroma</td><td>515DCLP BS</td><td>zwierciadło dichroiczne do cameleon Filtr obrazowania</td></tr><tr><td>535 +/- 15 nm</td><td>Chroma</td><td>D535/30m Filtr emisji EM</td><td>YFP</td></tr><tr><td>Filtr 480 +/- 20 nm</td><td>Filtr emisyjny Chroma</td><td>D485/40m EM</td><td>CFP</td></tr><tr><td>Obiektyw, 200 mm, achromatyczny</td><td>Thor Labs</td><td>AC508-200-A1</td><td>Soczewka przekaźnikowa do optyki FRET (3)</td></tr><tr><td>Srebrne lustro szerokopasmowe</td><td>Thor Labs</td><td>ME2S-P01</td><td>optyka FRET (2)</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> NGM<td></td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08691-10, objętość 2,5% by , nanocząstki polistyrenu o średnicy 50 nm </td><td>dla C. elegans immobilizacja</td></tr><tr><td>Szczep transgeniczny, Szczep gpa-9::GCaMP3(w fazie-1; him-5 bkg) </td><td>Sternberg Lab</td><td>Strain PS6388</td><td></td></tr><tr><td>Transgeniczny szczep, mec- 4::YC3.60</td><td>Gabel Lab</td><td>Szczep CG1B</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) obrazowanie wapnia neuronów u c. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Nicienie C. elegans to idealny organizm modelowy do stosunkowo prostego, taniego obrazowania neuronów in vivo. Jego małe, przezroczyste ciało i prosty, dobrze scharakteryzowany układ nerwowy umożliwiają identyfikację i obrazowanie fluorescencyjne dowolnego neuronu w nienaruszonym zwierzęciu. Proste techniki unieruchamiania przy minimalnym wpływie na fizjologię zwierzęcia pozwalają na wydłużone obrazowanie poklatkowe. Opracowanie genetycznie kodowanych wrażliwych na wapń fluoroforów, takich jak cameleon 1 i GCaMP 2, umożliwia obrazowanie in vivo neuronalnego wapnia związanego zarówno z fizjologią komórki, jak i aktywnością neuronalną. Liczne szczepy transgeniczne wykazujące ekspresję tych fluoroforów w określonych neuronach są łatwo dostępne lub mogą być konstruowane przy użyciu dobrze znanych technik. W tym miejscu opisujemy szczegółowe procedury pomiaru dynamiki wapnia w pojedynczym neuronie in vivo przy użyciu zarówno GCaMP, jak i cameleonu. Omawiamy zalety i wady obu, a także różne metody przygotowania próbek (unieruchomienie zwierząt) i analizy obrazu. Na koniec przedstawiamy wyniki dwóch eksperymentów: 1) Użycie GCaMP do pomiaru odpowiedzi sensorycznej określonego neuronu na zewnętrzne pole elektryczne oraz 2) Użycie cameleonu do pomiaru fizjologicznej odpowiedzi wapniowej neuronu na urazowe uszkodzenie lasera. Techniki obrazowania wapnia, takie jak te, są szeroko stosowane u C. elegans i zostały rozszerzone na pomiary u swobodnie poruszających się zwierząt, wielu neuronów jednocześnie i porównania między tłami genetycznymi. C. Elegans prezentuje solidny i elastyczny system do obrazowania neuronów in vivo, który ma przewagę nad innymi systemami modelowymi pod względem prostoty technicznej i kosztów.

W niniejszej pracy przedstawiamy wyniki dwóch oddzielnych eksperymentów. Pierwszy z nich wykorzystuje GCaMP do pomiaru odpowiedzi konkretnego neuronu sensorycznego na określony bodziec zewnętrzny, stanowiąc dobry przykład wykorzystania fluorescencyjnych reporterów wapnia do optycznego monitorowania aktywności neuronalnej w nienaruszonych C. elegans. Drugi eksperyment wykorzystuje kameleon do pomiaru wewnątrzkomórkowego stanu przejściowego wapnia wywołanego w neuronie w odpowiedzi na specyficzne uszkodzenie laser...

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie genetycznie kodowanych czwórek fluorowych do pomiaru dynamiki wapnia pojedynczych neuronów w nicieniach. Zobacz elegancję, osiąga się to poprzez pierwsze zamontowanie i demobilizację nienaruszonej elegancji C, która wyraża wrażliwy na wapń fluorofor w neuronach będących przedmiotem zainteresowania na standardowym szkiełku mikroskopowym. Następnie poszczególne neurony są obrazowane in vivo za pomocą mikroskopii wideo i standardowych technik obrazowania fluorescencyjnego epi.Następnie wideo jest analizowane w celu zmierzenia intensywności fluorescencji w określonych miejscach neuronu dla dwóch powszechnie używanych obozów Fluor fours G, co daje solidny sygnał jednokanałowy o dużej amplitudzie i kameleon oparty na progach, który generuje współczynnik dwukanałowy. Wyniki pomiarów metrycznych uzyskuje się wykazaną aktywność neuronalną w odpowiedzi na określone bodźce czuciowe, a także fizjologię wapnia w odpowiedzi na uszkodzenie komórki, przy czym oba te czynniki opierają się na optycznym pomiarze względnego poziomu wapnia w obrazowanym neuronie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z podobnymi metodami w systemach kręgowców lub konwencjonalnej elektrofizjologii jest to, że CL elgan reprezentuje solidny, elastyczny i genetycznie wykonalny system do obrazowania neuronów in vivo, który jest technicznie prosty i opłacalny.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w szerokim zakresie biologii neuronów w terenie, umożliwiając pomiary zarówno aktywności, jak i sinusoidy z pojedynczymi neuronami in vivo. Zacznij od standardowego mikroskopu złożonego z możliwością obrazowania fluorescencji epi, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu i sygnału. Użyj obiektywu o dużym powiększeniu, dużej aperturze numerycznej i chłodzonej kamerą CCD o wysokiej czułości, aby zmaksymalizować rozdzielczość i czułość obrazu, jednocześnie minimalizując szumy tła dla jednokolorowych czwórek flory.Użyj standardowego zestawu filtrów fluorescencyjnych mikroskopu zaprojektowanego dla określonej długości fali Fluor four dla obozu G. Użyj standardowego zestawu filtrów GFP zoptymalizowanego pod kątem wzbudzenia w 488 nanometrach i emisji w 525 nanometrach, czterech proporcji metrycznych flory cztery, takich jak kameleon, użyj podwójnego systemu obrazowania, dzięki czemu identyczne obrazy mogą być jednocześnie rejestrowane na dwóch oddzielnych długościach fal. Można to osiągnąć za pomocą dostępnego na rynku lub zbudowanego w domu systemu, który wyświetla dwa obrazy obok siebie w aparacie w następujący sposób.Zestaw filtrów mikroskopowych z filtrem wzbudzenia 440 plus minus 20 nanometrów i 455 nanometrowym zwierciadłem długoprzepustowym iic maska obrazu umieszczona na początkowej płaszczyźnie obrazu bezpośrednio poza portem obrazowania mikroskopu, gdzie zwykle znajduje się czujnik CCD kamery, pierwszy zestaw soczewek przekaźnikowych, oddalony o jedną ogniskową od początkowej płaszczyzny obrazu, tak aby zbierał światło, Lustro dichroiczne, które rozdziela światło na dwie oddzielne długości fal lub kanały obrazowania, odbijające jeden kolor, jednocześnie transmitując inne filtry emisyjne. Dalsze ograniczenie przesyłanego światła do określonych długości fal obrazowania. Drugie soczewki przekaźnikowe, po jednej dla każdego kanału, umieszczone na ścieżkach wiązki w taki sposób, że ponownie skupiają światło na drugiej płaszczyźnie obrazu w kamerze CCD.Para luster i drugie zwierciadło dichroiczne kierują ścieżki wiązki w taki sposób, że oba obrazy ponownie się łączą i są rzutowane obok siebie na kamerę. Czujnik CCD. Oto przykład wynikowego obrazu.Po skonfigurowaniu obrazy można regulować i dostrajać w następujący sposób: Przesuń pozycję kamery tak, aby przesyłany obraz obejmował połowę pola widzenia kamery. Przesuń odbity obraz, aby pokrył drugą połowę pola widzenia, dostosowując dwa ostatnie lustra na jego ścieżce wiązki i zoptymalizuj ostrość, przesuwając drugą soczewkę przekaźnikową dla każdego kanału do przodu iz powrotem wzdłuż ścieżki wiązki. Pozyskaj zwierzęta wyrażające wrażliwy na wapń fluorofor w interesującym neuronie z centrum genetycznego Citis lub innych źródeł.Alternatywnie, skonstruuj transgeniczne zwierzęta przy użyciu standardowych technik elgana fok. Następnie użyj jednej z poniższych technik, aby unieruchomić elegancję uszczelki w celu paraliżu farmakologicznego przy 0,05% leal do 2% aros i wykonaj podkładki aros do obrazowania, naciskając kroplę stopionego aros między dwoma szklanymi szkiełkami, które mają dwa kawałki taśmy laboratoryjnej jako przekładki. Po zdjęciu górnego szkiełka wybierz od pięciu do 10 zwierząt i przenieś je na podkładkę.Przykryj podkładkę szkiełkiem nakrywkowym i nałóż niewielkie ilości gorącej, mieszaniny parafiny i wazeliny jeden do jednego na rogi, aby utrzymać ją na miejscu. Odczekaj od pięciu do 10 minut, aż lemisol zacznie działać, a zwierzęta całkowicie się uspokoją. Aby unieruchomić zwierzęta metodą sztywnego aros, należy wykonać 10%aros poduszki.Dodaj około trzech mikrolitrów roztworu mikrosfery polistyrenowej od jednego do 10 na powierzchnię podkładek i szybko zbierz od pięciu do 10 czystej morskiej elegancji do basenu roztworu buraków. Delikatnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym i nałóż stopiony wosk na rogi. Typowe eksperymenty wymagają podania zwierzęciu określonego bodźca lub stanu podczas nagrywania wideo odpowiedzi pojedynczego neuronu.Do pozyskiwania wideo. Często obrazujemy z prędkością około jednej klatki na sekundę z czasem naświetlania około 300 milisekund. Wideo musi być analizowane w celu zmierzenia intensywności fluorescencji dla każdej klatki w obszarze zainteresowania lub ROI obrazowanego neuronu w stosunku do pobliskiego obszaru tła.Nasz program analityczny wyświetla skompresowany obraz wszystkich obrazów w filmie, z którego ręcznie wybierana jest przybliżona granica obejmująca obiekt zainteresowania we wszystkich klatkach i wybierany jest niezależny obszar tła. W pierwszym przypadku zwrot z inwestycji jest wybierany ręcznie z poziomu regionu granicznego. Dla każdej kolejnej klatki program wybiera najjaśniejsze piksele z obszaru granicy, aby wygenerować ROI o odpowiednim rozmiarze dla obrazów metrycznych proporcji generowanych za pomocą kameleona, wybiera podobny przybliżony obszar ROI i tła dla każdego z podwójnych obrazów lub kanałów, a następnie ROI z jednego obrazu w pierwszej klatce, sygnał fluorescencyjny F dla każdej klatki jest obliczany jako średnia intensywność pikseli w ROI pomniejszona o średnią intensywność w obszarze tła.Względny poziom wapnia dla każdej klatki jest obliczany jako procentowa zmiana intensywności znormalizowana do początkowej wartości bazowej mierzonej od pierwszej klatki lub serii klatek. Wartości metryk współczynnika są obliczane jako stosunek dwóch kanałów. Zwrot z inwestycji wybrany w ciele komórki generuje najsilniejsze, najsolidniejsze sygnały, ale możliwe jest również wybranie i zmierzenie sygnałów z ROI wzdłuż procesów nerwowych.Ekspozycja na światło wzbudzające może powodować bielenie flory czwartej i charakteryzuje się stałym spadkiem sygnału, który zależy od poziomu ekspozycji, jeśli dochodzi do bielenia. Skróć czas naświetlania i/lub intensywność wzbudzenia dzięki filtrom o neutralnej gęstości, aby zminimalizować szumy powstające w wyniku ruchu morskiej elegancji podczas nagrywania. W odpowiedzi na ekspozycję na światło i bodźce eksperymentalne należy ostrożnie wykonywać zabiegi unieruchamiania przy użyciu czystych preparatów.Aby pomyślnie przeprowadzić analizę obrazu, należy wybrać obszary tła, które są w miarę jednolite, ciemniejsze niż obraz do neuronu i wystarczająco oddalone, aby uniknąć rozproszonego światła. Pokazano tutaj pojedynczą elegancję C, neuron SJ wyrażający obóz G reagujący na zewnętrzne pole elektryczne o napięciu trzech woltów na centymetr w trzech oddzielnych próbach, z których każda trwa 10 sekund. Zwierzę zostało unieruchomione za pomocą lemisolu, ale na filmie widać niewielkie wady zarówno ruchu, jak i ostrości.Intensywność fluorescencji dryfu mierzono w ciele komórki. Sygnał jest solidny, mimo że błędy wideo wykazują duży wzrost fluorescencji o około 250% w odpowiedzi zarówno na pierwszy, jak i trzeci bodziec. Wynik z drugiego bodźca jest znacznie zmniejszony.Wykazanie zmienności w bieleniu odpowiedzi neuronalnej jest minimalne, o czym świadczy powrót do stałego poziomu wyjściowego. Urazowe uszkodzenie komórkowe wyzwala duży przejściowy wapń w neuronach, który odgrywa istotną rolę w fizjologicznej odpowiedzi komórki. Ten film pokazuje reakcję pojedynczego neuronu na wywołaną uszkodzeniem na laserową ex-sodomię.Zastosowano podwójną optykę obrazowania do rejestrowania sygnałów zarówno z kanałów fluorescencyjnych CFP, jak i YFP reportera kameleona. Ten rysunek pokazuje wynikowy sygnał progowy mierzony na ciele komórki w trakcie eksperymentu chirurgii laserowej. W odpowiedzi na uszkodzenie lasera i wzrost cytoplazmatycznego wapnia przy T wynosi zero sekund.CFP gwałtownie spada, a YFP wzrasta, co powoduje natychmiastowy wzrost sygnału metrycznego wskaźnika o około 200%, który utrzymuje się przez około 90 sekund, zanim spadnie do poziomów bliskich wartości wyjściowej. Wybielanie jest minimalne, jak wynika ze spójnej linii bazowej. Ten rysunek przedstawia wynikowy sygnał progu mierzony w segmencie aksonu w pobliżu punktu odcięcia w tym miejscu.Lokalna ilość fluoru czwartego zmienia się w trakcie trwania eksperymentu. Skomplikowanie operacji laserowej powoduje przerwanie aksonu i krótkotrwałe pęknięcie błony, umożliwiając ucieczkę flory czwartej i tymczasowo zmniejszając jej lokalne stężenie cytoplazmatyczne. Świadczy o tym początkowy spadek śladu YFP w późniejszych punktach czasowych.Odcięty koniec pęcznieje w ramach jego ciągłej regeneracji, co skutkuje bardziej zlokalizowanym fluorem czwórkowym i wzrostem intensywności. Jest to najbardziej widoczne w powoli rosnącym śladzie CFP, jednak zmiany te wpływają na oba kanały w równym stopniu, a stosunek progów skutecznie kompensuje, dając solidny sygnał. Uzyskany pomiar pokazuje odpowiedź podobną do ciała komórki z natychmiastowym wzrostem sygnału o około 150%, dramatycznym powrotem do wartości zbliżonej do wartości wyjściowej po około 90 sekundach, a następnie dodatkową mniejszą odpowiedzią wtórną po około 150 sekundach.Dostępne są komercyjne przystawki mikroskopowe do obrazowania wskaźnikowego, a także bardziej wyrafinowane oprogramowanie do analizy obrazu, które generuje pomiary metryczne proporcji piksel po pikselu Po opanowaniu techniki te można wykonać ze stosunkowo łatwością i bez skomplikowanego przygotowywania próbki, sekcji tkanek lub technik obrazowania wymaganych przez inne systemy lub metody modelowe. Całe eksperymenty można przeprowadzić w ciągu godziny lub dwóch, jeśli zostaną przeprowadzone prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak unieruchomić elegancję obrazowania, wykonać kopię wideo max na poszczególnych neuronach in vivo i przeanalizować powstały film w celu zmierzenia względnego poziomu wapnia w oparciu o neuron.

in-vivo-neuronal-calcium-imaging-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In vivo Obrazowanie wapnia neuronalnego u C. elegans

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Ten film demonstruje technikę obrazowania wapnia w pojedynczych neuronach zachowujących się Caenorhabditis elegans za pomocą genetycznie kodowanych fluorescencyjnych białek reporterowych. Przedstawiono w nim etapy związane z obrazowaniem ruchu robaków i pomiarem współczynników fluorescencji reporterowej z neuronów w celu skorelowania wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia z aktywnością neuronów i zmianami behawioralnymi podczas składania jaj.

Obrazowanie wapnia w poszczególnych neuronach regulujących składanie jaj u Caenorhabditis elegans

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Zgłoszono tutaj system do obrazowania wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami. System ten pozwala naukowcom na wywoływanie niezlokalizowanych wibracji o dobrze kontrolowanych właściwościach przy przemieszczeniu w skali nano oraz na ilościowe określenie prądów wapniowych podczas reakcji C. elegans na wibracje.

Obrazowanie wapnia u swobodnie zachowujących się Caenorhabditis elegans z dobrze kontrolowanymi, niezlokalizowanymi wibracjami

Kolce dendrytyczne są ważnymi cechami komórkowymi układu nerwowego. W tym miejscu opisano metody obrazowania na żywo służące do oceny struktury i funkcji kolców dendrytycznych u C. elegans. Podejścia te wspierają rozwój zmutowanych badań przesiewowych dla genów, które definiują kształt lub funkcję kolców dendrytycznych.

Obrazowanie kolców dendrytycznych u Caenorhabditis elegans

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Poznaj technikę obrazowania wapnia w pojedynczych neuronach C. elegans przy użyciu wskaźników fluorescencyjnych GCaMP i Chameleon. Metoda umożliwia analizę aktywności neuronalnej w odpowiedzi na bodźce sensoryczne i uszkodzenia komórkowe.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów