Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie obrazów pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości w przypadku komórek progenitorowych pochodzących z szpiku kostnego, po prześledzeniu wzorców ich rekrutacji do naczyń krwionośnych normalnego mózgu oraz naczyń związanych z guzem mózgu w czasie. Cel ten osiąga się poprzez usunięcie piszczeli i kości udowej u myszy donora w celu pozyskania fluorescencyjnych komórek progenitorowych szpiku kostnego, a następnie wstrzyknięcie tych komórek napromieniowanym myszom biorcy. Drugim krokiem jest wygenerowanie wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów GBM u myszy chimerycznych wewnątrz komory okna czaszkowego.

Następnie myszy zostają poddane różnym reżimom terapeutycznym, w tym radioterapii stereotaktycznej. Ostatnim krokiem jest obrazowanie myszy za pomocą dwufotonowego mikroskopu konfokalnego. Ostatecznie metodologia ta może być wykorzystana do dynamicznego badania mechanizmów unaczynienia wewnątrzczaszkowego w wielu modelach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak histopatologia tkanek ex vivo, jest możliwość badania krytycznych informacji dynamicznych związanych z formowaniem naczyń w mózgu. Dzięki temu możemy odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mechanizmów wewnątrzczaszkowej neowaskularyzacji. Choć metoda ta może służyć do pogłębienia wiedzy na temat neowaskularyzacji wewnątrzczaszkowej, może być ona również stosowana w badaniach nad innymi układami i procesami chorobowymi w mózgu, takimi jak niedokrwienie wewnątrzczaszkowe, udar, choroby neurodegeneracyjne oraz mechanizmy przerzutowania komórek nowotworowych do mózgu.

Na potrzeby tego filmu nie byliśmy w stanie zastosować rygorystycznych zasad aseptyki. W związku z tym komora z laminarnym przepływem powietrza została otwarta szerzej niż 12 cali, a zwierzęta nie zostały przykryte sterylnymi ściereczkami, aby widz mógł uzyskać wyraźniejszy obraz i lepszy wgląd w orientację procedur podczas pracy eksperymentalnej. W rzeczywistych warunkach należy ściśle przestrzegać zasad aseptyki.

Rozpocznij tę procedurę od potwierdzenia ekspresji fluorescencji u myszy donora GFP, a następnie przeprowadź eutanazję zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami. Następnie, pracując w warunkach aseptycznych, oczyść obie kończyny tylne i wyizoluj kość piszczelową oraz kość udową. Usuń wszystkie nadmiarowe tkanki z kości.

Następnie należy usunąć płytki końcowe z obu końców czterech wyekstrahowanych kości. Przepłucz je za pomocą igły 22G i 1 ml sterylnego PBS. Staną się przezroczyste, gdy cały szpik kostny zostanie wypłukany.

Następnie wymieszaj zawiesinę wyekstrahowanego szpiku kostnego. Powinna ona zawierać około 20 milionów komórek, co wystarczy do rekonstytucji u trzech myszy biorców. Następnie przygotuj 3 igły tuberkulinowe o rozmiarze 27G i pobierz do każdej z nich 300 µL zawiesiny szpiku kostnego.

Podczas gdy mysz znajduje się w ograniczniku, zaznacz grzbietową powierzchnię ogona, aby ułatwić orientację. Następnie wstrzyknij zawiesinę do bocznej żyły ogonowej trzech wcześniej napromieniowanych osobników.

W tej procedurze należy pracować z myszami nod skid w warunkach aseptycznych. Zanestezjuj chimeryczne myszy nod skid z przeszczepionym szpikiem kostnym i podaj przeciwbólowe leki profilaktyczne zatwierdzone przez IACUC. Nałóż żel do oczu, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.

Najpierw oczyść głowę roztworem Betadine, a następnie alkoholem i usuń nadmiar włosów. Następnie dodatkowo oczyść skórę głowy alkoholem. Wykonaj nacięcie od punktu środkowego między uszami do miejsca tuż nad oczami.

Usuń skórę i powięź z obu stron pierwszego nacięcia, aby odsłonić około pięciu milimetrów podległej im czaszki. Następnie zidentyfikuj punkty orientacyjne na powierzchni czaszki. W kolejnym kroku zidentyfikuj i odwarstw okostną, wstrzykując 2% roztwór lidokainy z epinefryną.

Następnie odwarstw okostną od powierzchni czaszki za pomocą ostrego narzędzia. Użyj wiertła precyzyjnego TR 2,7 mm, aby osłabić okrągły fragment kości o średnicy 2,7 mm na prawej półkuli czaszki, w odległości ekwidystansowej od punktów Lambda i bgma. Nie przebijaj kości wiertłem, aby chronić leżącą pod nią oponę twardą oraz tkankę.

Następnie, usuń osłabiony płat kostny, używając narzędzi do dyssekcji, pęsety i haczyka stomatologicznego, przykładając przemyślaną, lecz kontrolowaną siłę. Następnie pobierz do strzykawki Hamiltona o rozmiarze 30 G 10 µL zawiesiny komórkowej i zamocuj igłę w ramie stereotaktycznej. Następnie umieść mysz w ramie stereotaktycznej.

Ustaw igłę w punkcie centralnym powstałego okna, a następnie obniż ją, aż dotknie powierzchni kory. Następnie zresetuj współrzędne cyfrowe. Teraz wprowadź igłę na głębokość 3.2 millimeters w tkankę kory.

Następnie cofnij igłę o 0,2 mm i wykonaj wtryskiwanie na głębokości 3 mm. Iniekcja wgłębna powinna być przeprowadzana z prędkością 10 µL/min. Po zakończeniu wtryskiwania pozostaw igłę w miejscu przez jedną minutę, a następnie powoli ją wycofaj.

Następnie wyjmij mysz z ramy. Po tym czasie utrzymuj powierzchnię mózgu w stanie nawilżonym, stosując krople sterylnego PBS.

Na powierzchni mózgu, w celu zamknięcia okna o średnicy 2,7 mm, należy umieścić szkiełko okrywne o grubości 3 mm. Następnie należy osuszyć otaczającą kość czaszki. W kolejnym kroku należy nanieść klej wet bond, aby przykleić tkankę skóry głowy do kości czaszki i utrwalić szkiełko okrywne w miejscu.

Nie należy nakładać zbyt dużej ilości, ponieważ substancja może wycieknąć spod szkiełka, co obniży jakość obrazowania. Następnie w dygestorium należy wymieszać świeży proszek akrylu dentystycznego z roztworem i nanieść mieszaninę na vet bond za pomocą igły o rozmiarze 22 G. Aby zapewnić szczelność, należy nałożyć akryl tak, aby lekko nachodził na krawędź szkiełka nakrywkowe, lecz nie zakrywał samego szkiełka.

Na tym etapie umieść znieczurzoną mysz w specjalnie dopasowanym uchwycie głowy wewnątrz irradiationera stereotaktycznego XAD 2 25 opracowanego wewnętrznie. Wykonaj 360-stopniowy skan CT w technice cone beam, przy napięciu szczytowym lampy rentgenowskiej 40 kV i prądzie 0,05 mA, stosując filtr aluminiowy o grubości 2 mm. Wykorzystaj uzyskany obraz do ustawienia stołu w taki sposób, aby izocentrum promieniowania było skierowane na prawą półkulę i znajdowało się w centrum w kierunku grzbietowo-brzusznym.

Dostępna jest szeroka gama kolimatorów umożliwiających kierowanie promieniowania, co świadczy o adaptacyjności modelu. W tym przypadku do naświetlania hemisferycznego wykorzystujemy kolimator o wymiarach 8 mm na 11 mm. Włóż kolimator hemisferyczny do irradiatora stereotaktycznego X RAD 2 25.

Wykonaj pojedyncze ortogonalne obrazy TK z góry i z dołu przez kolimator, aby zapewnić prawidłowe ustawienie głowy poprzez zlokalizowanie anatomicznych struktur kostnych i ręczne dostrojenie pozycji stołu na monitorze. Zmień filtr aluminiowy naświetlacza XAD 2 25 IRRADIATOR na filtr miedziany o grubości 0,93 mm. Następnie uruchom program lampy rentgenowskiej przy napięciu szczytowym 225 kV i natężeniu 13 mA i podaj połowę dawki promieniowania z góry w kierunku AP.

Zwróć gantry do dolnej pozycji i podaj drugą połowę dawki promieniowania od dołu w kierunku PA. W tej procedurze znieczul mysz z wcześniej wykonanym oknem wewnątrzczaszkowym i oczyść okno za pomocą sprayu alkoholowego. Skonfiguruj kanały w mikroskopie konfokalnym zgodnie z fluorochromami zintegrowanymi w wygenerowanej myszy chimerycznej.

Alternatywnie można zastosować poprzednie ustawienia, aby zmniejszyć zmienność między sesjami obrazowania. W takim przypadku wstrzyknij do bocznej żyły ogonowej wszelkie znaczniki wymagane do obrazowania, np. dekstran do wizualizacji naczyń krwionośnych. Umieść mysz w specjalnie skonstruowanym uchwycie do głowy, stabilizując ją za pomocą plastycznej plasteliny, upewniając się, że głowa jest prostopadła do wiązki lasera, a następnie zamocuj uchwyt na ruchomym stoliku mikroskopu.

Włącz laser pierwszego kanału i ustaw go w centrum okna wewnątrzczaszkowego, patrząc bezpośrednio na punkt przecięcia wiązki lasera na oknie komory. Wykonaj obraz każdego kanału dla całego okna przy użyciu obiektywu 5x i wykorzystaj go jako mapę dla pozostałych obrazów o wyższej rozdzielczości wykonanych obiektywami dalekiego zasięgu 10x i 20x. Ten schemat podkreśla błędy techniczne związane z procesem chirurgicznym i demonstruje wpływ, jaki każdy z nich będzie miał na otrzymane obrazy.

Powietrze uwięzione pod okienkiem będzie widoczne na obrazach w postaci pęcherzyków. Osady akrylu na szkle wykazują autofluorescencję w kanale dalekiej czerwieni i będą blokować część pola widzenia. Podobnie, zanieczyszczenia na okienku podczas obrazowania objawiają się na zdjęciach jako autofluorescencyjne smugi.

Nawet idealne okno wewnątrzczaszkowe może sprawiać problemy po umieszczeniu preparatu pod mikroskopem. Artefakty oddechowe powodują powstawanie prążkowanych obrazów, natomiast niewłaściwe ułożenie myszy w ramie skutkuje obrazem segmentowym. Ponieważ laser przecina tylko część tkanki, dzięki późniejszej obróbce obrazu możliwe jest dodanie dodatkowego kanału dla komórek znakowanych CFP, co pozwala na odjęcie obrazów GFP od obrazów CFP w celu wyodrębnienia rzeczywistego sygnału CFP.

Ponadto, wykorzystując charakterystykę autofluorescencji generacji drugiej harmonicznej włókien kolagenu typu IV, jesteśmy w stanie obrazować błonę podstawną naczyń krwionośnych. Dostępność pięciu kanałów fluorescencyjnych zapewnia użytkownikowi dużą elastyczność i możliwość adaptacji nowatorskiego modelu lustrzanego opisanego w niniejszej pracy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o niebezpiecznych produktach stosowanych w trakcie zabiegów chirurgicznych.

Niezbędna jest również skrupulatność i szczególna dbałość o szczegóły, aby zapewnić, że tkanka mózgowa pozostanie nieuszkodzona podczas długoterminowego obrazowania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak stworzyć mysz chimeryczną z fluorescencyjnymi komórkami progenitorowymi, a w konsekwencji być w stanie zarejestrować obrazy w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości z naczyń krwionośnych wewnątrzczaszkowych po implantacji komórek nowotworowych, z zastosowaniem interwencji terapeutycznej lub bez niej.