Name: Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Poznaj nową technikę obrazowania in vivo z użyciem mikroskopii dwufotonowej do badania dynamicznej neowaskularyzacji w mózgu. Metoda umożliwia obserwację rekrutacji komórek progenitorowych do naczyń krwionośnych guza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Zaawansowanemu Zakładowi Mikroskopii Optycznej w szpitalu księżniczki Małgorzaty, w szczególności Jamesowi Jonkmanowi za pomoc w początkowej konfiguracji kanałów w mikroskopie 2Photon. Autorzy pragną podziękować programowi Spatio-Temporal Targeting and Amplification of Radiation Response (STTARR) i powiązanym z nim agencjom finansującym. Dziękujemy dr Peterowi Tonge, dr Iacovosowi Michaelowi i dr Andrasowi Nagyowi za dostarczenie plazmidów VEGFTrap oraz za ich poprawki i opinie w manuskryptach. Nieustanne wsparcie i dyskusja ze strony pracowników BTRC były nieocenione i chcielibyśmy upamiętnić dr Abhijita Guha za jego wkład naukowy. Prace zostały sfinansowane z grantów CIHR i NIH.

CAŁA PRACA ZE ZWIERZĘTAMI ZOSTAŁA WYKONANA ZGODNIE Z ZATWIERDZONYM PROTOKOŁEM KOMITETU OPIEKI I UŻYTKOWANIA ZWIERZĄT I WYKONANA ZGODNIE ZE WSZYSTKIMI ODPOWIEDNIMI WYTYCZNYMI, PRZEPISAMI I AGENCJAMI REGULACYJNYMI.
Aby rozwiązać problem, zapoznaj się z Tabelą 2.
1. Rekonstytucja szpiku kostnego (opcjonalnie) Rysunek 1 (30 min przygotowania, 5 min na mysz)
Wszystkie operacje powinny być wykonywane przy użyciu ścisłej techniki aseptycznej, z autoklawowanym sterylnym sprzętem.
Jedna mysz dawcy odtworzy trzy myszy gospodarzy.
<ol>
	<li>Znieczulenie biorcy myszy NODscid i umieszczenie, z ołowiem osłaniającym głowę, wewnątrz środka promiennika "exactor" Gammacell 40.</li>
	<li>Napromienij myszy NODscid napromieniowaniem całkowitego ciała 2,5 Gy (TBI).</li>
</ol>
KRYTYCZNY KROK: Optymalizacja TBI może być potrzebna ze względu na różnice w dawce wymaganej do wystarczającego wyczerpania komórek odpornościowych gospodarza w różnych szczepach myszy.
Punkt pauzy: Myszy gospodarzy mogą być napromieniowane wcześniej, ale powinny być użyte w ciągu 24 godzin od napromieniowania.
<ol start="3">
	<li>Eutanazja myszy dawców zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami. Oczyść kończyny tylne i usuń kość piszczelową i udową z obu, usuwając nadmiar tkanki z kości (ryc. 1ai, 1aii).</li>
</ol>
KRYTYCZNY KROK: Kości strzałkowe nie nadają się do użytku ze względu na bardzo wąskie światło.
<ol start="4">
	<li>Usunąć płytki końcowe z obu końców czterech wyciętych kości i wypłukać je za pomocą igły 22 G i 1 ml sterylnego PBS, aż staną się białe (ryc. 1aiii). Tabela referencyjna 2.</li>
	<li>Dobrze wymieszać wyekstrahowaną zawiesinę szpiku kostnego (BM) i pobrać 300 μl do trzech igieł tuberkulinowych o sile 27 g. Wyekstrahowany BM powinien zawierać około 2 x 107 komórek i wystarczy do rekonstytucji 3 myszy gospodarza. Tabela referencyjna 2.</li>
	<li>Wstrzyknąć zawiesinę do bocznej żyły ogonowej trzech uprzednio napromieniowanych myszy NODscid z kroku 1.1 (Rysunek 1b). Tabela referencyjna 2.</li>
</ol>
UWAGA: Aby sprawdzić sterylność wstrzykniętego BM, zalecamy posiewanie pozostałego BM i hodowlę przez 24 godziny w celu sprawdzenia infekcji. Główną przyczyną śmierci w tym momencie jest infekcja u nowo odtworzonych myszy.
2. Generowanie okien wewnątrzczaszkowych - Rysunek 2 (30 minut na mysz)
Wszystkie operacje powinny być wykonywane przy użyciu ścisłej techniki aseptycznej, z autoklawowanym sterylnym sprzętem i pod lampą grzewczą, aby utrzymać zwierzęta w cieple (Rysunek 2A).
<ol>
	<li>Myszy biorcy NODscid należy znieczulić zatwierdzonym przez IACUC środkiem znieczulającym, wstrzyknięciem Avertin IP w dawce 0,5 mg/g i umieszczeniem, z ołowiem osłaniającym głowę, wewnątrz środka promiennika "exactor" Gammacell 40. Usuń włosy ze skóry głowy. Dodatkowo zastosuj żel łzowy, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.</li>
	<li>Oczyść skórę głowy najpierw roztworem Betadine, a następnie alkoholem, a następnie wykonaj nacięcie od środka uszu do tuż nad oczami. Usuń skórę głowy 3 mm po obu stronach pierwszego nacięcia, odsłaniając czaszkę i punkty orientacyjne na powierzchni czaszki (ryc. 2Bi).</li>
	<li>Podnieś okostną, wstrzykując 2% roztwór lidokainy: epinefryny i wypreparuj z powierzchni czaszki (ryc. 2Bii).</li>
	<li>Za pomocą wiertła trepanacyjnego 2,7 mm osłabij okrąg czaszki o średnicy 2,7 mm nad korą prawej półkuli między lambdą a bregmą. NIE WOLNO penetrować kości wiertłem (Rysunek 2Biii). Tabela referencyjna 2.</li>
</ol>
KRYTYCZNY KROK: jeśli wiertło przejdzie przez czaszkę, powierzchnia mózgu zostanie uszkodzona, co wpłynie na wyniki z dodatkowym urazem. Ponadto wystąpi nadmierne krwawienie, które uniemożliwi wygenerowanie przezroczystego okna.
<ol start="5">
	<li>Usuń osłabiony płat kostny za pomocą pęsety preparacyjnej i haczyka dentystycznego oraz celowej, ale kontrolowanej siły (ryc. 2Biii).</li>
	<li>(Opcjonalnie) Jeśli patrzysz na patologię guza, wstrzyknij wybrane linie komórek nowotworowych (z fluorescencyjnym genem reporterowym) do środka okna wygenerowanego w kroku 2.5.
	<ol>
		<li>Załaduj strzykawkę Hamiltona 10 μl 30 G z zawiesiną komórek i załaduj igłę do ramki stereotaktycznej. 
		KROK KRYTYCZNY: Liczba komórek będzie musiała zostać zoptymalizowana pod kątem używanych komórek nowotworowych i wymaganego czasu wzrostu. Do hodowli U87 używamy 2 x 105 komórek po 10 μl na mysz.</li>
		<li>Załaduj mysz na cyfrową ramkę stereotaktyczną, wyrównaj igłę do środkowego punktu wygenerowanego okna.</li>
		<li>Opuść igłę, aż dotknie powierzchni kory mózgowej i zresetuj współrzędne cyfrowe.</li>
		<li>Opuścić igłę na głębokość 3,2 mm w głąb tkanki korowej i wstrzyknąć na głębokość 3 mm.</li>
		<li>Powoli igłę, a następnie wyjmij mysz z ramki. 
		ETAP KRYTYCZNY: Wstrzykiwać roztwór przez 1 minutę i pozostawić igłę na miejscu po wstrzyknięciu, aby zapewnić zmniejszony przepływ wsteczny. 
		KROK KRYTYCZNY: W przypadku wystąpienia niewielkiego krwotoku należy przepłukać sterylną solą fizjologiczną przez 1-5 minut, aby zatrzymać powierzchowne krwawienie. Kontynuuj kolejne kroki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwilż powierzchnię mózgu kroplą sterylnego PBS, aby utrzymać nawodnienie tkanki mózgowej.</li>
	<li>Umieść 3 mm szkiełko nakrywkowe na powierzchni mózgu, aby całkowicie uszczelnić wokół wygenerowanego okienka 2,7 mm. Tabela referencyjna 2.</li>
	<li>Osusz otaczającą kość czaszki, a następnie nałóż vetbond na całą odsłoniętą czaszkę, aby ponownie uszczelnić tkankę skóry głowy do kości czaszki i szkiełka nakrywkowego na miejscu. NIE WOLNO nakładać nadmiaru, ponieważ będzie on przeciekał pod szkłem i zmniejszy potencjał obrazowania.</li>
	<li>Wymieszaj świeży proszek akrylowy i roztwór, około 30% (w/v) i nałóż na wierzch vetbond. Aby zapewnić szczelne uszczelnienie, lekko nałóż akryl na krawędź szkiełka nakrywkowego (Rysunek 2Biv). Tabela referencyjna 2.</li>
</ol>
UWAGA: Akryl dentystyczny jest niezwykle niebezpieczny, dlatego zalecamy używanie rękawiczek i maski podczas zabiegów.
KRYTYCZNY KROK: Akryl dentystyczny musi pozostać giętki podczas formowania, aby zapewnić dobre uszczelnienie i zredukować nadmiar. Nagromadzenie akrylu na oknie spowoduje rozmycie obrazów.
<ol start="11">
	<li>Pozwól myszom dojść do siebie w ciepłej klatce.</li>
</ol>
3. Promieniowanie stereotaktyczne (opcjonalnie) - Rysunek 3 (25 minut na mysz)
Różnice będą istniały w różnych używanych promiennikach i w związku z tym konieczna będzie optymalizacja. Użyliśmy specjalnie zaprojektowanego naświetlacza.
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy za pomocą izofluranu w dawce 4% do indukcji, a następnie 1,5-2% przez cały zabieg w ilości 0,5-1 litra O2 na minutę i umieszczenie na niestandardowym ograniczniku głowy wewnątrz promiennika stereotaktycznego (ryc. 3Ai).</li>
	<li>Uzyskaj skan CT wiązką stożkową 360° z lampą rentgenowską pracującą z napięciem 40 kVp i 0,05 mA przez filtr aluminiowy 2 mm. Użyj obrazu, aby pokierować ruchem sceny, kierując izocentrum promieniowania na prawą półkulę, upewniając się, że znajduje się ono centralnie w kierunku grzbietowo-brzusznym.</li>
	<li>Włóż kolimator półkulowy, blok 8 mm x 11 mm.</li>
</ol>
KRYTYCZNY KROK: Kolimatory mogą być zaprojektowane dla wielu różnych konfiguracji, a więc mogą być ulepszone tak, aby włączały i wykluczały różne części mózgu. 8 mm x 11 mm określa półkulowy obszar mózgu.
<ol start="4">
	<li>Uzyskaj pojedyncze ortogonalne obrazy CT zarówno od góry (AP), jak i od dołu (PA) przez kolimator, aby jeszcze bardziej poprawić umiejscowienie mózgu, anatomiczne struktury kostne mogą być wykorzystane do odtwarzalności.</li>
	<li>Wymień filtr aluminiowy na miedziany filtr zabiegowy o średnicy 0,93 mm i podaj połowę pożądanej dawki promieniowania za pomocą lampy rentgenowskiej pracującej z napięciem 225 kVp i 13 mA od góry w kierunku AP.</li>
	<li>Przywróć suwnicę do dolnego położenia i ponownie podaj drugą połowę dawki promieniowania za pomocą lampy rentgenowskiej pracującej pod napięciem 225 kVp i 13 mA od dna w kierunku PA.</li>
</ol>
KRYTYCZNY KROK: Konieczne jest naświetlanie zarówno z góry, jak i z dołu, aby zmniejszyć gradient RT przez tkankę mózgową, pomaga to również w wyrównaniu izocentrum do środka mózgu.
4. Mikroskopia laserowa in vivo z dwoma fotonami - Rysunek 3 (1-3 godziny na sesję)
Różnice będą istniały w różnych używanych mikroskopach i w związku z tym konieczna będzie optymalizacja. Użyliśmy laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Carl Zeiss LSM510 META.
<ol>
	<li>Znieczulić myszy środkiem znieczulającym zatwierdzonym przez IACUC, wstrzyknięciem Avertin IP w dawce 0,5 mg/g i oczyść okno za pomocą sprayu nasączonego alkoholem.</li>
	<li>
	<ol class="ualpha">
		<li>(Opcjonalnie) Wstrzyknąć oznakowany barwnik naczyniowy 5-10 minut przed obrazowaniem, do żyły ogonowej przed obrazowaniem. Alexa647-Dekstran stosowany w stężeniu 0,35 μg/g lub APC-CD31 stosowany w stężeniu 0,2 μg/g. Patrz tabela 2.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Wstrzyknąć fluoresceinę przez żyłę ogonową w dawce 7,7 mg/kg, 5 minut przed obrazowaniem, w celu nakreślenia guza. Tabela referencyjna 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw kanały w mikroskopie konfokalnym zgodnie z fluorochromem użytym w wygenerowanej myszy chimerycznej. Tabela 1 przedstawia kanały opisane w tym modelu.</li>
	<li>Odwróć mysz na ruchomym stoliku mikroskopu i ustabilizuj głowę w odpowiedniej pozycji za pomocą plasteliny, którą można formować. (Rysunek 3Aii) Tabela referencyjna 2.</li>
</ol>
KRYTYCZNY KROK: ICW musi być prostopadły do punktu lasera i jako taki musi być ustawiony poziomo, aby zapewnić optymalne obrazowanie.
<ol start="5">
	<li>Włącz laser pierwszego kanału i użyj do ustawienia w środku ICW.</li>
	<li>Użyj obiektywu 5x i zrób zdjęcie całego okna, aby użyć go jako mapy dla dalszych obrazów w wyższej rozdzielczości.</li>
	<li>Obrazowanie powinno być wykonywane przy użyciu obiektywów "dalekiego zasięgu" 10X i 20X, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu.</li>
</ol>
KRYTYCZNY KROK: Kanały i cele na 2PLM powinny być ustawione przy użyciu zmodyfikowanych komórek in vitro przed obrazowaniem modeli mysich, aby upewnić się, że wskazują one na prawidłowy fluorochrom.
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorochrom</td>
			<td>Wpryb</td>
			<td>GFP / Fluoresceina / FITC</td>
			<td>mCherry / Zapytanie ofertowe / DsRED</td>
			<td>APC / Alexa647</td>
			<td>Autofluorescencja SHG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser wzbudzający</td>
			<td>458 nm</td>
			<td>488 nm</td>
			<td>543 nm</td>
			<td>633 nm</td>
			<td>Laser kameleon 820 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtr kolekcji</td>
			<td>480-520 nm</td>
			<td>500-550 nm</td>
			<td>565-615 nm</td>
			<td>650-710 nm</td>
			<td>390-465 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Konfiguracja fluorochromu. Przewodniki dla użytkownika, aby zobaczyć laser wzbudzenia i kolektor widm emisyjnych zastosowany dla każdego z kanałów dostępnych w modelu.

<ol><li>Kienast, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Hansen-Algenstaedt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+observation+reveals+time-course-dependent+characteristics+of+tumour+vascularisation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation.</a> Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).</li>
<li>Kherlopian, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+imaging+techniques+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A review of imaging techniques for systems biology.</a> BMC Systems Biology. 2, 74(2008).</li>
<li>Kedrin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).</li>
<li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nature Methods. 6, 143-145 (2009).</li>
<li>Brown, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. -E., Lu, S. -M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Thin-skull+Window+Technique+for+Chronic+Two-photon+In+vivo+Imaging+of+Murine+Microglia+in+Models+of+Neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2059(2010).</li>
<li>Drew, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).</li>
<li>Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in-vivo+analysis+of+normal+brain+response+to+cranial+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation.</a> PLoS ONE. 7, e38366(2012).</li>
<li>Tate, M. C., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+angiogenesis+and+invasion+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22NURT%22%5BJournal%5D)">Biology of angiogenesis and invasion in glioma.</a> NURT. 6, 447-457 (2009).</li>
<li>Aghi, M., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+bone+marrow-derived+cells+to+blood+vessels+in+ischemic+tissues+and+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors.</a> Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).</li>
<li>Nussenbaum, F., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis%3A+insights+and+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis: insights and innovations.</a> J. Oncol. 2010, 132641(2010).</li>
<li>Zhang, H. -r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+endothelial+progenitor+cells+into+the+neovasculature+of+malignant+glioma+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroonco%22%5BJournal%5D)">Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft.</a> J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).</li>
<li>Blouw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypoxic+response+of+tumors+is+dependent+on+their+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment.</a> Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).</li>
<li>Du, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF1alpha+induces+the+recruitment+of+bone+marrow-derived+vascular+modulatory+cells+to+regulate+tumor+angiogenesis+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion.</a> Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).</li>
<li>Rajantie, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+bone+marrow-derived+cells+recruited+during+angiogenesis+comprise+precursors+for+periendothelial+vascular+mural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells.</a> Blood. 104, 2084-2086 (2004).</li>
<li>Shin de Patil, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+lin%28-%29c-kit%28%2B%29Sca-1%2B+stem+cells+do+not+contribute+to+vasculogenesis+in+Lewis+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma.</a> Neoplasia. 7, 234-240 (2005).</li>
<li>Purhonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+circulating+endothelial+precursors+do+not+contribute+to+vascular+endothelium+and+are+not+needed+for+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).</li>
<li>Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stromal-derived+factor-1+recruits+vascular+progenitors+to+mitotic+neovasculature%2C+where+microenvironment+influences+their+differentiated+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes.</a> Cancer Research. 66, 9054-9064 (2006).</li>
<li>Burrell, K., Zadeh, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurrell%2C+K+%22Molecular+Mechanisms+of+Tumor+Angiogenesis%22">Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis</a>. , InTech. (2012).</li>
<li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy%2C+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li>
<li>Tolentino, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiography+of+fluoresceinated+anti-vascular+endothelial+growth+factor+antibody+and+dextrans+in+experimental+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization.</a> Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).</li>
<li>Holash, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-Trap%3A+a+VEGF+blocker+with+potent+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).</li>
<li>Shinoda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-guided+resection+of+glioblastoma+multiforme+by+using+high-dose+fluorescein+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium.</a> , 1-7 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Trzy kanały opisane na wszystkich dotychczasowych obrazach są wymienne dla trzech markerów będących przedmiotem zainteresowania w innych modelach i pozostawiają badaczom nieoceniony zestaw narzędzi do badania wielu typów komórek i interakcji. Konieczne jest planowanie, aby upewnić się, że wszystkie markery i typy komórek z powodzeniem zintegrowały cząsteczkę fluorescencji reporterowej w odrębnym kanale.
Oprócz standardowych trzech zastosowanych tutaj kanałów, byliśmy również w stanie zintegrować czwarty kanał CFP (rysunek 4A) i kanał kolagenowy 7 oparty na SHG (rysunek 4B). Rozszerza to możliwość przyjrzenia się interakcjom komórkowym in vivo , a ponadto pozwala użytkownikowi na mieszanie populacji w celu zbadania określonych interakcji komórka-komórka, przy jednoczesnym zachowaniu dwóch kanałów dla innych markerów. Na przykład przyjrzeliśmy się komórkom nowotworowym (RFP) i rakowym komórkom macierzystym (CFP) w stosunku 1:3 z zainteresowaniem porównaniem ich interakcji wewnątrznowotworowych (ryc. 4A). Zaobserwowaliśmy, że 7 dni po implantacji populacji mieszanej stosunek ten został utrzymany i obie populacje komórek były nadal widoczne.
Kanał CFP stwarza problemy techniczne ze względu na nakładanie się na kanał GFP zarówno w widmach wzbudzenia, jak i emisji, i jako taki wymaga przetwarzania po obrazowaniu w celu zdefiniowania prawdziwych komórek CFP+ od tych, które faktycznie są GFP+. Przetwarzanie po obrazowaniu można przeprowadzić bezpośrednio na mikroskopach 2-fotonowych wbudowanych w oprogramowanie Zeiss LSM, dzięki czemu obraz GFP jest odejmowany od obrazu CFP, co powoduje, że prawdziwe komórki CFP pozostają w tyle (ryc. 4A). Przesłanka do odejmowania proporcji zależy od równie jasnych obrazów i wynika z tego, że laser CFP (458 nm) fluoryzuje zarówno komórki CFP, jak i GFP, podczas gdy laser GFP (488 nm) jest zbyt wysoki, aby fluoryzować komórki CFP. Oprócz CFP udało nam się również użyć wcześniej opublikowanych konfiguracji, aby przyjrzeć się poziomom SHG, a tym samym zobrazować włókna kolagenowe, które tworzą błonę podstawną otaczającą naczynia krwionośne (Figura 4B).
Inna adaptacja tego modelu wykorzystuje specjalnie zbudowany promiennik dla małych zwierząt, który ma możliwość wykorzystania stereotaktycznego promieniowania kierowanego do naświetlania odcinków tkanek o średnicy zaledwie 2 mm. Kierując okno z napromieniowaniem, można przyjrzeć się wpływowi, jaki promieniowanie wywiera na znajdującą się pod nim tkankę. Niedawno opublikowaliśmy badanie, w którym przyjrzeliśmy się wpływowi promieniowania na normalną tkankę mózgową w odniesieniu do rekrutacji BMDC do układu krwionośnego, patrząc w szczególności na ich rolę w zmianach w tkankach po promieniowaniu. Odkryliśmy, że rekrutacja BMDC była zależna zarówno od czasu, jak i dawki w normalnej tkance 11.
Możliwe jest zbadanie mechanizmów dostarczania i integracji środków terapeutycznych, pod warunkiem, że lek jest oznaczony markerem fluorescencyjnym. Podczas naszych badań udało nam się prześledzić produkcję VEGFTrap, leku antyangiogennego, który blokuje całą sygnalizację VEGF w lokalnym obszarze produkcji 25. Poprzez genetyczną modyfikację naszych komórek nowotworowych w celu ekspresji genu VEGFtrap sprzężonego z IRES do EGFP (ryc. 4Ci) i przy użyciu "dawcy" BM RFP, byliśmy w stanie zobrazować produkcję EGFP: VEGFtrap, interakcję BMDC i unaczynienie jednocześnie (ryc. 4Cii). Pokazało to wszechstronność modelu i dostępnych kanałów. Możliwe jest również przyjrzenie się kinetyce leku ze względu na obietnicę rozdzielczości pojedynczej komórki. Fluoresceina (GFP+) jest stosowana do wyznaczania guzów podczas operacji, aby zapewnić osiągnięcie maksymalnej resekcji 26. Poprzez wstrzykiwanie dożylne podczas obrazowania można wykazać, że rozgraniczenie następuje NIE poprzez aktywny wychwyt fluoresceiny do samych komórek nowotworowych, ale zamiast tego poprzez gromadzenie się leku w obszarze zrębu z czasem, co widać po braku kolokalizacji 10 minut po wstrzyknięciu fluoresceiny (ryc. 4D).
Ogólnie rzecz biorąc, nasza strategia łączy nowatorskie i istniejące techniki w celu uzyskania unikalnej platformy eksperymentalnej, która jest korzystna w badaniu dynamicznych interakcji komórkowych. Strategia ta okazała się nieocenionym podejściem do badania dynamicznej ewolucji pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości BMDC, guza i normalnego unaczynienia mózgu w odpowiedzi na terapię wewnątrzczaszkową. Obrazowanie przyżyciowe może zapewnić lepsze zrozumienie molekularnych regulatorów rekrutacji, migracji i różnicowania BMDC w wewnątrzczaszkowym unaczynieniu guza mózgu, a także wielu innych dynamicznych procesów, które można dostosować do innych dziedzin badań. Hamowanie przypuszczalnych czynników, które regulują BMDC w połączeniu z innymi strategiami terapeutycznymi, może pomóc w określeniu dokładnego czasu terapii skojarzonych. Co więcej, strategia ta może zostać zaadaptowana do wielu przyszłych projektów wykorzystujących nie tylko barwniki barwiące in vivo in vivo , ale także inhibitory małocząsteczkowe i nanocząstki, które są znakowane fluorescencyjnie, co pozwala naukowcom śledzić wzorce dystrybucji i migracji bardziej ukierunkowanych środków terapeutycznych, a także spojrzeć podłużnie na ich kinetykę.

Lepsze zrozumienie zmian strukturalnych i biologicznych, które zachodzą w mózgu w odpowiedzi na różne patologie i interwencje terapeutyczne, jest kluczowe dla poprawy strategii leczenia. Jednak jednym z obecnych wyzwań w badaniu tych zmian strukturalnych i biologicznych, szczególnie w odniesieniu do patologii wewnątrzczaszkowych, jest niedostępność tkanki i niemożność badania ewolucji czasowej i dynamicznego postępu zmian w warunkach in vivo. Opracowanie technologii "okienkowej" okazało się wcześniej skuteczne w badaniu zmian w tkankach miękkich w procesie rozwoju guza 5-7. Opracowanie modeli ICW okazuje się być trudniejsze technicznie ze względu na konieczność usunięcia kości czaszki bez uszkodzenia w wyniku wywołania infekcji w leżącej poniżej tkance mózgowej. W poprzednich pracach próbowano rozrzedzić czaszkę w celu uwidocznienia tkanki 8-10, jednak aby uzyskać wyraźne obrazy o wysokiej rozdzielczości, wymagane jest pełne usunięcie kości czaszki 11. Powtarzanie obrazowania długoterminowego (30 dni+) dopiero niedawno stało się wykonalną opcją poprzez obrazowanie 1,11, wcześniej badano krótsze ramy czasowe 5.
W ciągu ostatniej dekady głównym celem było wyjaśnienie pochodzenia neo-waskulacji po bodźcach patologicznych, w szczególności w odpowiedzi na powstawanie i progresję guza, aby dostarczyć nowych celów terapeutycznych do leczenia nowotworów. Wiele kontrowersji pozostaje wokół źródła nowego unaczynienia w mózgu podczas rozwoju guza lub po promieniowaniu. Tradycyjnie uważa się, że unaczynienie zachodzi poprzez angiogenezę, proces, w którym nowe naczynia tworzą się z kiełkowania wcześniej istniejących naczyń 12. Nowsze badania sugerują jednak, że wcześniej zakładany embrionalny proces waskulogenezy może odgrywać bardziej znaczącą rolę w tworzeniu patologicznej naczyniowości. Waskulogeneza polega na rekrutacji dorosłych odpowiedników angioblastów ze szpiku kostnego, które z kolei są następnie bezpośrednio zaangażowane w tworzenie nowego śródbłonka naczynia 12-14. Coraz więcej dowodów wskazuje, że śródbłonkowe komórki prekursorowe są mobilizowane ze szpiku kostnego w celu zainicjowania tworzenia naczyń de novo w odpowiedzi na mediatory onkogenne 15-17. Jednak badania te dostarczają sprzecznych dowodów na bezpośredni udział tych komórek pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC) w śródbłonku naczynia, przy czym procentowy udział różni się w zależności od rodzaju bodźca patologicznego i odpowiedzi na leczenie 18-21.
Dlatego nieocenione jest ustanowienie powtarzalnych metod eksperymentalnych, które pozwalają na obrazowanie przyżyciowe w wysokiej rozdzielczości dla powtarzających się długoterminowych badań procesu integracji BMDC z naczyniami krwionośnymi guza i w odpowiedzi na terapię. Standardowe techniki histologiczne nie dostarczają dynamicznych informacji wymaganych do określenia długoterminowego przeżycia, różnicowania i integracji komórek, które powodują neowaskulatura, a zatem nie mogą ostatecznie wykazać mechanizmów interakcji komórkowych.
Wykazaliśmy za pomocą naszego eksperymentalnego podejścia, że istnieje różny stopień rekrutacji BMDC zarówno po wewnątrzczaszkowym promieniowaniu jonizującym, jak i po wzroście guza, rekrutacja, która jest jednak specyficzna dla miejsca patologii, a nie inwazja całej tkanki wewnątrzczaszkowej 11,22. Wykazaliśmy, że rekrutacja przebiega zgodnie z wrażliwym na czas wzorcem, co wykazano w wielokrotnym obrazowaniu pojedynczego zwierzęcia 11,22. Podobnie, obrazowanie in vivo może również dostarczyć nieocenionych informacji na temat mimikry komórek nowotworowych, dzięki której fluorescencyjnie znakowane komórki nowotworowe mogą być obrazowane i śledzone za pomocą przeciwciała CD31 dożylnego dla komórek śródbłonka, aby podkreślić możliwość transdyferencjacji komórek nowotworowych w celu bezpośredniego utworzenia własnego śródbłonka.
Wszechstronność modelu jest zwiększona dzięki możliwości obrazowania 4 kanałów fluorescencyjnych, co zapewnia wyczerpującą liczbę kombinacji do badania różnych procesów komórkowych i biologicznych. Jesteśmy w stanie obrazować dożywotnie CFP (niebieski), GFP (zielony), Cherry/RFP (czerwony) i Alexa647/APC (dalekiej czerwieni), jednocześnie w jednym polu wielokrotnie w czasie. Naukowcy mogą genetycznie modyfikować komórki w celu ekspresji fluorochromów dla każdego z kanałów, a także kupować barwniki i przeciwciała, aby podkreślić zmiany strukturalne o szczególnym znaczeniu. Do tej pory barwniki i przeciwciała powszechnie stosowane w badaniach obejmują CD31 i dekstran, które podkreślają mikrokrążenie i jego zmiany w tkance 1,11,23,24, chociaż wykorzystaliśmy w tym celu kanał dalekiej czerwieni, oba są dostępne do stosowania w innych wymienionych kanałach. Podobnie inne barwniki, w tym Sytox Orange, który podkreśli obszary apoptozy, oraz markery, takie jak te firmy Visen, zostały specjalnie zaprojektowane do stosowania in vivo. Oprócz wymienionych czterech powszechnie stosowanych kanałów fluorescencyjnych, można dodać kanał generacji drugiej harmonicznej (SHG) i zoptymalizować go w celu zobrazowania endogennych włókien kolagenowych modelu 7, wizualizując błonę podstawną otaczającą naczynia krwionośne.
Aby zademonstrować zdolność adaptacyjną naszego modelu, jak również wspomniane wyżej interakcje komórka-komórka, udało nam się zbadać interakcje lek-komórka. Przyjrzeliśmy się inhibitorom leków, takim jak AMD3100, inhibitor SDF-1, i jego roli w sieciach sygnalizacyjnych zaangażowanych w rekrutację BMDC 11. W podobny sposób przeprowadziliśmy genetycznie modyfikowane komórki ksenoprzeszczepów glejaka U87 w celu ekspresji VEGFTrap, inhibitora VEGF 25, w połączeniu przez IRES z cząsteczką GFP. Korzystając z RFP+ BM, jesteśmy w stanie zbadać rolę, jaką VEGF odgrywa w rekrutacji BMDC do układu krwionośnego. Ostatnio wykorzystaliśmy ten model do badania kinetyki leków, przyglądając się mechanizmowi stojącemu za lekiem Fluoresceina 26 na poziomie komórkowym, który wyznacza nowotwór. Dzięki zastosowaniu specjalnie zbudowanego w domu promiennika dla małych zwierząt byliśmy w stanie zintegrować stereotaktyczne promieniowanie dostarczane w celu oceny odpowiedzi zarówno guza, jak i BMDC na leczenie.
Dzięki zastosowaniu naszej nowatorskiej metody obrazowania przyżyciowego, badacze uzyskają wgląd w zmiany zachodzące w czasie rzeczywistym w pojedynczych komórkach, które zachodzą w różnych patologiach i systemach, pomagając w wyjaśnieniu wielu funkcjonalnych i biologicznych cech zmian w tkankach.

<table><tbody><tr><td colspan="4">odczynnik</td></tr><tr><td>NODSCID myszy</td><td>Jackson Lab</td><td>001303</td><td>8-tygodniowe</td></tr><tr><td>myszy B5/EGFP</td><td>Jackson Lab</td><td>003516</td><td></td></tr><tr><td>myszy ACTB/DsRED</td> Jackson <td>Lab</td><td>005441</td><td></td></tr><tr><td>Żel przeciwłzowy</td><td>Novartis</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>2% lidokaina-epinefryna</td><td>Bimeda MTC</td><td>25SP</td><td>Zastosowanie schludny</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Samoutwardzalny zestaw akrylowy</td><td>Bosworth</td><td>166260</td><td>Użyj ~30% (w/v)</td></tr><tr><td>10K MW Dextran-Alexa647</td><td>Invitrogen</td><td>D22914</td> Użyj <td>@ 0,6 mg / kg w soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>CD31-APC</td><td>BDPharmingen</td><td>551262</td><td>Użyj @ 0,3 mg / kg w soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>AK-fluor (Fluoresceina) 10%</td> <td>AKORN inc.</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>Użyj @ 7,7 mg/kg w roztworze soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Produkty Purdue</td><td>NDC 67618-150</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>fine Pęseta</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do precyzyjnego rozwarstwiania</td><td>VWR</td><td>25870-002</td><td></td></tr><tr><td>Igła 22G</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>27G 0,5 ml strzykawka TB</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Ręczne wiertło Micro-Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło Trephine 2,7 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>18004-27</td><td></td></tr><tr><td>10 &#956; l Strzykawka 30G Hamilton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>20909-U</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 3 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720 CS-3R</td><td></td></tr><tr><td>Gogle fluorescencyjne</td><td>BLS</td><td>FHS/T01</td><td>Podstawowa rama na głowę</td></tr><tr><td>Rama stereotaktyczna</td><td>stoelting</td><td>51950</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik myszy do wstrzykiwań dożylnych</td><td>Brain Tree Lifescience</td><td>MTI</td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

Udało nam się zintegrować wcześniej opracowaną technologię okna wewnątrzczaszkowego (ICW) 1-4 z przyżyciowym 2-fotonowym mikroskopem konfokalnym, aby opracować nową platformę, która pozwala na bezpośrednią, długoterminową wizualizację zmian struktury tkanki wewnątrzczaszkowej. Obrazowanie w rozdzielczości pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym dostarcza dodatkowych informacji dynamicznych wykraczających poza standardowe analizy histologiczne punktu końcowego, które dotyczą wyłącznie przekrojów poprzecznych tkanki typu "snap-shot".
Ustanawiając tę technikę obrazowania przyżyciowego u fluorescencyjnych myszy chimerycznych, jesteśmy w stanie obrazować jednocześnie cztery kanały fluorescencyjne. Poprzez włączenie komórek znakowanych fluorescencyjnie, takich jak szpik kostny GFP+, możliwe jest śledzenie losów tych komórek, badając ich długoterminową migrację, integrację i różnicowanie w tkance. Dalsza integracja wtórnej komórki reporterowej, takiej jak linia nowotworowa glejaka mCherry, pozwala na scharakteryzowanie interakcji komórka-komórka. Zmiany strukturalne w mikrośrodowisku tkanek można uwypuklić poprzez dodanie barwników i przeciwciał przyżyciowych, na przykład przeciwciał znakowanych CD31 i cząsteczek dekstranu.
Ponadto, opisujemy połączenie naszego modelu obrazowania ICW z małym mikro-promiennikiem zwierzęcym, który zapewnia stereotaktyczne napromieniowanie, tworząc platformę, za pomocą której można ocenić dynamiczne zmiany tkankowe, które zachodzą po podaniu promieniowania jonizującego.
Obecne ograniczenia naszego modelu obejmują penetrację mikroskopu, która jest ograniczona do głębokości do 900 μm od powierzchni podkorowej, ograniczając obrazowanie do grzbietowej osi mózgu. Obecność kości czaszki sprawia, że ICW jest bardziej wymagającą procedurą techniczną w porównaniu z bardziej uznanymi i wykorzystywanymi modelami komorowymi stosowanymi obecnie do badania tkanki sutkowej i poduszek tłuszczowych 5-7. Ponadto ICW stwarza wiele wyzwań związanych z optymalizacją obrazowania.

Opcjonalny etap rekonstytucji szpiku kostnego (BM) myszy NODscid powinien skutkować 80% pobraniem fluorescencyjnego szpiku „dawcy” u 100% myszy „gospodarzy” NODscid, jednak w przypadku innych szczepów niebędących immunokompromitowanymi konieczna będzie optymalizacja całkowitego naświetlania organizmu (TBI) w celu poprawy rekonstytucji. W przypadku nieudanej rekonstytucji myszy zachorują i szybko padną po zabiegu; osłabione myszy mogą wymagać dodatkowych źródeł pożywienia i wody.
Gotowe okno ICW powinno wyglądać jak to przedstawione na Rysunku 2Biv. Idealnie jest, aby wokół szklanego szkiełka nakrywki znajdował się wałek z akrylu, ponieważ zapewnia on wytrzymałość połączenia z czaszką. Doskonałe okna są powtarzalne i umożliwiają wielokrotne obrazowanie przez okres do 8 tygodni po ich wykonaniu (Rysunek 2C). Obrazy uzyskane przez te optymalne okna będą wyglądać jak te widoczne na Rysunku 3Bi. Niedoskonałości podczas tworzenia okna spowodują uzyskanie obrazów słabej jakości; na przykład pęcherzyki powietrza pod oknem uniemożliwią obrazowanie całych pól widzenia, a niektóre obszary będą wydawać się ciemne, ponieważ powietrze blokuje obrazowanie laserowe (Rysunek 3Bii). W przypadku nadmiaru kleju i akrylu na szkiełku nakrywce wystąpi wysoki poziom fluorescencji tła oraz obszary zamazane w polu widzenia, jak pokazano na Rysunku 3Biii; podobnie, jeśli na oknie znajduje się zanieczyszczenie, w polu widzenia widoczne będą małe kropki fluorescencji tła (Rysunek 3Biv).
Sukces obrazowania ICW jest zdeterminowany przez poprawność techniki chirurgicznej, jednak nawet optymalne ICW mogą napotkać problemy podczas sesji obrazowania. W związku z tym obrazy generowane charakteryzują się różnym zakresem i stopniem przejrzystości, co przedstawiono na Rysunku 3. Obraz o jakości publikacyjnej pokazany na Rysunku 3C powstaje, gdy wszystkie parametry są optymalne. Chociaż nie jest to możliwe w przypadku wszystkich myszy, można oczekiwać, że 80% generowanych obrazów będzie wyglądać w ten sposób. Jedną z głównych wad obecnej konfiguracji mikroskopowej jest zastosowanie laserów odwróconych. Myszy muszą być ustawione na grzbietach, co skutkuje nadmiernym stresem i dyskomfortem, które mogą prowadzić do trudności w oddychaniu podczas obrazowania. Powoduje to powstanie obrazu „paskowanego”, ponieważ oddychanie zakłóca proces uśredniania zachodzący podczas obrazowania, w którym każdy wiersz pikseli jest obrazowany czterokrotnie, a w końcowym obrazie wyświetlana jest średnia z tych czterech prób. Każdy ruch podczas uśredniania, taki jak ten spowodowany trudnościami w oddychaniu, stworzy artefakt pojawiający się jako linia na obrazie, co widać na Rysunku 3D. Problem ten mogą napotkać również myszy, które nie zostały dostatecznie znieczulone podczas obrazowania. Efekt „paskowania” można zmniejszyć, ograniczając uśrednianie obrazu do jednej próby, jednak zredukuje to jakość obrazu i może nie rozwiązać problemu. Alternatywnie myszy można ponownie ustawić lub powtórzyć próbę, gdy oddychanie wróci do normy. Zastosowanie pionowego 2PLM wyeliminowałoby ten problem, ponieważ myszy mogłyby być obrazowane „w pozycji brzusznej”. Dodatkowym problemem przy obrazowaniu na odwróconym 2PLM jest ograniczona dostępność przy pozycjonowaniu ICW po umieszczeniu myszy na mikroskopie, co prowadzi do powstawania obrazów „segmentowanych”, takich jak te widoczne na Rysunku 3E. W tym przypadku laser i szkiełko nakrywowe nie są ustawione prostopadle względem siebie, w związku z czym obrazowanie odbywa się pod kątem. Skutkuje to generowaniem obrazu „segmentowanego”, w którym boki pola widzenia nie są obrazowane. Problem ten można łatwo rozwiązać poprzez ponowne ustawienie myszy tak, aby upewnić się, że szkiełko nakrywowe jest całkowicie poziome po umieszczeniu na uchwycie głowy, jak pokazano na Rysunku 3Aii.
Model przedstawiony w niniejszej pracy został wykorzystany specjalnie do zbadania roli BMDC w unaczynieniu tkanki nowotworowej i wykazuje możliwość jednoczesnego użycia trzech różnych kanałów (Cherry, GFP, daleka czerwień - Alexa647 oraz APC), co sprawiło, że CFP i SHG stały się zbędne w tym konkretnym przypadku. Byliśmy w stanie obrazować myszy podłużnie przez maksymalnie 8 tygodni, badając rekrutację i integrację komórek BM z układem naczyniowym na poziomie pojedynczych komórek, bez negatywnych skutków wywołanych przez okno. Model ten demonstruje łatwość gromadzenia dynamicznych informacji o pochodzeniu i formowaniu się naczyń krwionośnych oraz interakcjach między różnymi typami komórek, co wcześniej było niemożliwe do osiągnięcia poprzez końcową analizę histologiczną.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Krok</td >
			<td >Problem</td >
			<td >Przyczyna</td >
			<td >Rozwiązanie</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1.4</td >
			<td >Rozdrobnienie kości</td >
			<td >Tępe narzędzia</td >
			<td >Pobrać szpik kostny od świeżej myszy, używając zaostrzonych nożyczek lub nowej ostrza skalpela; fragmenty kości będą utrudniać wstrzyknięcie do żyły ogonowej</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1.5</td >
			<td >Niska wydajność ekstrakcji (niska lepkość)</td >
			<td >Blaszki końcowe kości przecięte zbyt dystalnie; niewłaściwa metoda pobierania</td >
			<td >Kości należy przecinać jak najbliżej proksymalnie i pobierać bezpośrednio do probówki, aby zapobiec rozpryskiwaniu 
			Należy poświęcić odpowiednią ilość czasu, aby zmaksymalizować i starannie przeprowadzić ekstrakcję BM 
			W razie potrzeby połączyć materiał od więcej niż jednej myszy w 1 ml</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >Wysoka wydajność ekstrakcji (wysoka lepkość)</td >
			<td >Zbyt mała ilość buforu do pobierania</td >
			<td >Rozcieńczyć roztwór dodatkowym 0,1% BSA i podzielić na trzy myszy biorcze, maksymalnie do 500 μl na mysz</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1.6</td >
			<td >Niepowodzenie wstrzyknięcia dożylnego</td >
			<td >Słaba wazodylatacja i słaba widoczność naczynia</td >
			<td >Zwiększyć rozszerzenie naczyń za pomocą lampy grzewczej. Umieścić mysz w stabilizatorze do żyły ogonowej z wbudowanym źródłem światła, aby ułatwić dostęp</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1</td >
			<td >Chore myszy</td >
			<td >Infekcja</td >
			<td >Uśmiercić myszy zgodnie z zasadami instytucji. Upewnić się, że ogony są oczyszczone przed wstrzyknięciem i sprawdzić sterylność wyektrahowanego BM w hodowli</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >Śmiertelność myszy</td >
			<td >Słabe przyjęcie BM</td >
			<td >Sprawdzić % fluorescencyjnego przyjęcia BM przez martwą mysz. 
			Zoptymalizować TBI dla używanej linii myszy 
			Zwiększyć ilość wstrzykiwanego BM (np. użyć jednej myszy dawcy dla dwóch biorców)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2.4</td >
			<td >Niewielkie krwawienie</td >
			<td >Przerwanie opony twardej podczas wiercenia</td >
			<td >Uciskać podkładkami żelowymi i stale płukać sterylnym roztworem soli fizjologicznej</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >Silne krwawienie</td >
			<td >Uszkodzenie mózgu podczas wiercenia</td >
			<td >Uśmiercić mysz zgodnie z wytycznymi instytucji</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2.8</td >
			<td >Pęcherzyki powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym</td >
			<td >Słaby kontakt z powierzchnią kory uniemożliwia prawidłowe ułożenie</td >
			<td >Zdjąć szkiełko nakrywkowe i dodać więcej PBS, aby szkiełko „płynęło” na okno, co pozwoli usunąć pęcherzyki</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2.10</td >
			<td >Przesunięcie szkiełka nakrywkowego podczas klejenia</td >
			<td >Masa akrylowa jest ciężka, wywiera nacisk na szkiełko nakrywkowe i przesuwa je</td >
			<td >Należy używać pęsety do przytrzymania szkiełka nakrywkowego podczas nakładania vetbondu i akrylu</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >4.2</td >
			<td >Niepowodzenie wstrzyknięcia dożylnego</td >
			<td >Słaba wazodylatacja i słaba widoczność naczynia</td >
			<td >Zwiększyć rozszerzenie naczyń za pomocą lampy grzewczej. Umieścić mysz w stabilizatorze do żyły ogonowej z wbudowanym źródłem światła, aby ułatwić dostęp</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >4.4 
			Rycina 3C</td >
			<td >Obrazy „pasiaste”</td >
			<td >Utrudniony lub nieregularny oddech</td >
			<td >Wyjąć mysz z ramy i pozwolić jej dojść do siebie 
			Zwiększyć dawkę podawanego środka znieczulającego i skorygować pozycję, aby upewnić się, że szyja nie jest nadmiernie zgięta ani wyprostowana, co mogłoby utrudniać oddychanie</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Rycina 3C</td >
			<td >Obraz „segmentowany”</td >
			<td >Mózg nie jest równoległy do obiektywów</td >
			<td >Skorygować pozycję szkiełka nakrywkowego, aby upewnić się, że jest ono płaskie</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >Naczynie niewidoczne</td >
			<td >Wstrzyknięcie nie jest widoczne wewnątrz naczynia</td >
			<td >Powtórzyć wstrzyknięcie do drugiej żyły ogonowej, ogrzać ogon, aby zapewnić dobrą wazodylatację</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >Wysokie tło</td >
			<td >Zabrudzone szkiełko nakrywkowe, 
			Pęcherzyki powietrza, Akryl</td >
			<td >Przetrzeć szkiełko nakrywkowe wilgotną ściereczką z 70% etanolem; nie moczyć, ponieważ płyn może przeniknąć pod akryl i uszkodzić tkankę mózgu</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2. Rozwiązywanie problemów. Wytyczne dotyczące kroków naprawczych wymaganych w przypadku problematycznych obszarów procedur.
<img alt="Schemat tworzenia okna śródczaszkowego; modele mysie, wstrzykiwanie glejaka, harmonogram leczenia." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Schemat 1"> 
Schemat 1. Diagram przebiegu eksperymentu. Przedstawiono w nim harmonogram zdarzeń w krokach eksperymentalnych 1-4. Modele mysie są przygotowywane w ciągu tygodnia, aby zapewnić prawidłową rekonstytucję BM, i nie są leczone lekiem aż do 7. dnia od powstania guza, aby zapewnić przyjęcie się przeszczepu nowotworowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363schemata1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą figurę</a>.
<img alt="Mouse leg dissection process, steps i-iii; anatomy diagram; vein, artery, IV injection sites." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Rycina 1. Rekonstytucja szpiku kostnego.(A) Procedura ekstrakcji szpiku kostnego i. Disekcja kości kończyny tylnej. ii. Wypreparowane kości udowe i piszczelowe z kończyn tylnych, oczyszczone i przygotowane do ekstrakcji. iii. Kości z usuniętą płytką końcową i przepłukane, wykazujące biały kolor pustych kości. (B) Schematy obrazujące rozmieszczenie żył bocznych w ogonie, wykorzystywanych do iniekcji.
<img alt="Proces operacji czaszki u gryzoni; narzędzia chirurgiczne i etapy; ustawienie eksperymentu neuronaukowego." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Tworzenie ICW. (A) Zalecane ustawienie aseptyczne (B) i. Odsłonięta powierzchnia czaszki ukazuje punkty orientacyjne niezbędne do operacji; ICW powinno być rozmieszczone na prawej półkuli w równej odległości od bregmy i lambdy. ii. Okostna uniesiona roztworem lidokainy, przygotowana do usunięcia. iii. Haczyk stomatologiczny niezbędny do usunięcia fragmentu kości wywierconego wiertłem. iv. Gotowe ICW wykonane z akrylu stomatologicznego. (C) Trzy przykładowe okna demonstrują powtarzalność metody.
<img alt="Mouse cranial window imaging setup; diagrams show perfect and flawed imaging due to artifacts." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3. Przewidywane wyniki 2PLM. Wszystkie obrazy przedstawiają zieloną macierz pozakomórkową (BM), czerwony nowotwór oraz niebieskie (pseudokolor daleka czerwień) naczynia krwionośne. (A) i. Prezentacja ramy głowicy, która utrzymuje przepływ izofluranu wewnątrz irradiatora dla małych zwierząt. Widoczny jest również kolimator 8 x 11 mm poruszający się w obrębie gantry. ii. Mysz w pozycji odwróconej w ramce stabilizującej głowę wymaganej do obrazowania; plastyczna plastelina zapewnia odpowiednie dopasowanie wszystkich okien. (B) Zdjęcia obrazujące wyniki problemów z generowaniem okna z i. optymalnego okna, ii. okno z uwięzionymi pod spodem pęcherzykami powietrza, iii rozlanie akrylu na szkiełko nakrywkowe i iv. zanieczyszczenia na samym oknie. (C) Wskazuje problemy występujące podczas obrazowania po pomyślnym wygenerowaniu ICW i. optymalne obrazowanie ii. artefakty oddechowe powodują powstanie obrazu „prążkowanego” iii. osłonka nieprostopadła do wiązki lasera powoduje powstanie obrazu „segmentowego”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną grafikę</a>.
<img alt="Wielokanałowa mikroskopia fluorescencyjna, analiza guza, kolagen SHG, wizualizacja VEGFTrap, in vitro/in vivo." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Funkcjonalne zastosowania i adaptacje modelu. (A) Przetwarzanie obrazów CFP po obrazowaniu, w którym obraz GFP jest odejmowany od obrazu CFP, aby uzyskać rzeczywisty obraz CFP, który może zostać nałożony na pozostałe trzy kanały w kolorze białym. Zielony BM, czerwony guz, białe CSC, niebieskie (pseudokolor daleka czerwień) naczynia krwionośne (B) Demonstracja włókien kolagenowych, które mogą być obrazowane za pomocą SHG. Zielony dekstran, czerwony BM, cyjan kolagen (C) i. Komórki VEGFTrap in vitro wykazują sygnał GFP generowany przez VEGFtrap. ii. Obrazowanie in vivo wyraźnie pokazuje komórki VEGFtrap, a dodatkowo podkreśla łatwość przełączania kanałów w celu zademonstrowania analizowanego układu. Zielony VEGFTRap + guz, czerwony BM, niebieskie (pseudokolor daleka czerwień) naczynia krwionośne. (D) Demonstracja gromadzenia się fluoresceiny w zrębie guza, a nie bezpośrednio w komórkach, co potwierdza brak nałożenia zielonego sygnału na czerwony guz. Zielona fluoresceina, czerwony guz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

Opisujemy nowatorską technikę obrazowania in vivo, która łączy fluorescencyjne chimeryczne myszy z oknami wewnątrzczaszkowymi i mikroskopią 2-fotonową o wysokiej rozdzielczości. Ta platforma obrazowania wspomaga badania dynamicznych zmian w tkance mózgowej i mikrokrążeniu na poziomie pojedynczej komórki, po patologicznych urazach i jest przystosowana do oceny wewnątrzczaszkowego dostarczania i dystrybucji leków.

Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie obrazów pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości w przypadku komórek progenitorowych pochodzących z szpiku kostnego, po prześledzeniu wzorców ich rekrutacji do naczyń krwionośnych normalnego mózgu oraz naczyń związanych z guzem mózgu w czasie. Cel ten osiąga się poprzez usunięcie piszczeli i kości udowej u myszy donora w celu pozyskania fluorescencyjnych komórek progenitorowych szpiku kostnego, a następnie wstrzyknięcie tych komórek napromieniowanym myszom biorcy. Drugim krokiem jest wygenerowanie wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów GBM u myszy chimerycznych wewnątrz komory okna czaszkowego.Następnie myszy zostają poddane różnym reżimom terapeutycznym, w tym radioterapii stereotaktycznej. Ostatnim krokiem jest obrazowanie myszy za pomocą dwufotonowego mikroskopu konfokalnego. Ostatecznie metodologia ta może być wykorzystana do dynamicznego badania mechanizmów unaczynienia wewnątrzczaszkowego w wielu modelach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak histopatologia tkanek ex vivo, jest możliwość badania krytycznych informacji dynamicznych związanych z formowaniem naczyń w mózgu. Dzięki temu możemy odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mechanizmów wewnątrzczaszkowej neowaskularyzacji. Choć metoda ta może służyć do pogłębienia wiedzy na temat neowaskularyzacji wewnątrzczaszkowej, może być ona również stosowana w badaniach nad innymi układami i procesami chorobowymi w mózgu, takimi jak niedokrwienie wewnątrzczaszkowe, udar, choroby neurodegeneracyjne oraz mechanizmy przerzutowania komórek nowotworowych do mózgu.Na potrzeby tego filmu nie byliśmy w stanie zastosować rygorystycznych zasad aseptyki. W związku z tym komora z laminarnym przepływem powietrza została otwarta szerzej niż 12 cali, a zwierzęta nie zostały przykryte sterylnymi ściereczkami, aby widz mógł uzyskać wyraźniejszy obraz i lepszy wgląd w orientację procedur podczas pracy eksperymentalnej. W rzeczywistych warunkach należy ściśle przestrzegać zasad aseptyki.Rozpocznij tę procedurę od potwierdzenia ekspresji fluorescencji u myszy donora GFP, a następnie przeprowadź eutanazję zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami. Następnie, pracując w warunkach aseptycznych, oczyść obie kończyny tylne i wyizoluj kość piszczelową oraz kość udową. Usuń wszystkie nadmiarowe tkanki z kości.Następnie należy usunąć płytki końcowe z obu końców czterech wyekstrahowanych kości. Przepłucz je za pomocą igły 22G i 1 ml sterylnego PBS. Staną się przezroczyste, gdy cały szpik kostny zostanie wypłukany.Następnie wymieszaj zawiesinę wyekstrahowanego szpiku kostnego. Powinna ona zawierać około 20 milionów komórek, co wystarczy do rekonstytucji u trzech myszy biorców. Następnie przygotuj 3 igły tuberkulinowe o rozmiarze 27G i pobierz do każdej z nich 300 µL zawiesiny szpiku kostnego.Podczas gdy mysz znajduje się w ograniczniku, zaznacz grzbietową powierzchnię ogona, aby ułatwić orientację. Następnie wstrzyknij zawiesinę do bocznej żyły ogonowej trzech wcześniej napromieniowanych osobników.W tej procedurze należy pracować z myszami nod skid w warunkach aseptycznych. Zanestezjuj chimeryczne myszy nod skid z przeszczepionym szpikiem kostnym i podaj przeciwbólowe leki profilaktyczne zatwierdzone przez IACUC. Nałóż żel do oczu, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.Najpierw oczyść głowę roztworem Betadine, a następnie alkoholem i usuń nadmiar włosów. Następnie dodatkowo oczyść skórę głowy alkoholem. Wykonaj nacięcie od punktu środkowego między uszami do miejsca tuż nad oczami.Usuń skórę i powięź z obu stron pierwszego nacięcia, aby odsłonić około pięciu milimetrów podległej im czaszki. Następnie zidentyfikuj punkty orientacyjne na powierzchni czaszki. W kolejnym kroku zidentyfikuj i odwarstw okostną, wstrzykując 2% roztwór lidokainy z epinefryną.Następnie odwarstw okostną od powierzchni czaszki za pomocą ostrego narzędzia. Użyj wiertła precyzyjnego TR 2,7 mm, aby osłabić okrągły fragment kości o średnicy 2,7 mm na prawej półkuli czaszki, w odległości ekwidystansowej od punktów Lambda i bgma. Nie przebijaj kości wiertłem, aby chronić leżącą pod nią oponę twardą oraz tkankę.Następnie, usuń osłabiony płat kostny, używając narzędzi do dyssekcji, pęsety i haczyka stomatologicznego, przykładając przemyślaną, lecz kontrolowaną siłę. Następnie pobierz do strzykawki Hamiltona o rozmiarze 30 G 10 µL zawiesiny komórkowej i zamocuj igłę w ramie stereotaktycznej. Następnie umieść mysz w ramie stereotaktycznej.Ustaw igłę w punkcie centralnym powstałego okna, a następnie obniż ją, aż dotknie powierzchni kory. Następnie zresetuj współrzędne cyfrowe. Teraz wprowadź igłę na głębokość 3.2 millimeters w tkankę kory.Następnie cofnij igłę o 0,2 mm i wykonaj wtryskiwanie na głębokości 3 mm. Iniekcja wgłębna powinna być przeprowadzana z prędkością 10 µL/min. Po zakończeniu wtryskiwania pozostaw igłę w miejscu przez jedną minutę, a następnie powoli ją wycofaj.Następnie wyjmij mysz z ramy. Po tym czasie utrzymuj powierzchnię mózgu w stanie nawilżonym, stosując krople sterylnego PBS.Na powierzchni mózgu, w celu zamknięcia okna o średnicy 2,7 mm, należy umieścić szkiełko okrywne o grubości 3 mm. Następnie należy osuszyć otaczającą kość czaszki. W kolejnym kroku należy nanieść klej wet bond, aby przykleić tkankę skóry głowy do kości czaszki i utrwalić szkiełko okrywne w miejscu.Nie należy nakładać zbyt dużej ilości, ponieważ substancja może wycieknąć spod szkiełka, co obniży jakość obrazowania. Następnie w dygestorium należy wymieszać świeży proszek akrylu dentystycznego z roztworem i nanieść mieszaninę na vet bond za pomocą igły o rozmiarze 22 G. Aby zapewnić szczelność, należy nałożyć akryl tak, aby lekko nachodził na krawędź szkiełka nakrywkowe, lecz nie zakrywał samego szkiełka.Na tym etapie umieść znieczurzoną mysz w specjalnie dopasowanym uchwycie głowy wewnątrz irradiationera stereotaktycznego XAD 2 25 opracowanego wewnętrznie. Wykonaj 360-stopniowy skan CT w technice cone beam, przy napięciu szczytowym lampy rentgenowskiej 40 kV i prądzie 0,05 mA, stosując filtr aluminiowy o grubości 2 mm. Wykorzystaj uzyskany obraz do ustawienia stołu w taki sposób, aby izocentrum promieniowania było skierowane na prawą półkulę i znajdowało się w centrum w kierunku grzbietowo-brzusznym.Dostępna jest szeroka gama kolimatorów umożliwiających kierowanie promieniowania, co świadczy o adaptacyjności modelu. W tym przypadku do naświetlania hemisferycznego wykorzystujemy kolimator o wymiarach 8 mm na 11 mm. Włóż kolimator hemisferyczny do irradiatora stereotaktycznego X RAD 2 25.Wykonaj pojedyncze ortogonalne obrazy TK z góry i z dołu przez kolimator, aby zapewnić prawidłowe ustawienie głowy poprzez zlokalizowanie anatomicznych struktur kostnych i ręczne dostrojenie pozycji stołu na monitorze. Zmień filtr aluminiowy naświetlacza XAD 2 25 IRRADIATOR na filtr miedziany o grubości 0,93 mm. Następnie uruchom program lampy rentgenowskiej przy napięciu szczytowym 225 kV i natężeniu 13 mA i podaj połowę dawki promieniowania z góry w kierunku AP.Zwróć gantry do dolnej pozycji i podaj drugą połowę dawki promieniowania od dołu w kierunku PA. W tej procedurze znieczul mysz z wcześniej wykonanym oknem wewnątrzczaszkowym i oczyść okno za pomocą sprayu alkoholowego. Skonfiguruj kanały w mikroskopie konfokalnym zgodnie z fluorochromami zintegrowanymi w wygenerowanej myszy chimerycznej.Alternatywnie można zastosować poprzednie ustawienia, aby zmniejszyć zmienność między sesjami obrazowania. W takim przypadku wstrzyknij do bocznej żyły ogonowej wszelkie znaczniki wymagane do obrazowania, np. dekstran do wizualizacji naczyń krwionośnych. Umieść mysz w specjalnie skonstruowanym uchwycie do głowy, stabilizując ją za pomocą plastycznej plasteliny, upewniając się, że głowa jest prostopadła do wiązki lasera, a następnie zamocuj uchwyt na ruchomym stoliku mikroskopu.Włącz laser pierwszego kanału i ustaw go w centrum okna wewnątrzczaszkowego, patrząc bezpośrednio na punkt przecięcia wiązki lasera na oknie komory. Wykonaj obraz każdego kanału dla całego okna przy użyciu obiektywu 5x i wykorzystaj go jako mapę dla pozostałych obrazów o wyższej rozdzielczości wykonanych obiektywami dalekiego zasięgu 10x i 20x. Ten schemat podkreśla błędy techniczne związane z procesem chirurgicznym i demonstruje wpływ, jaki każdy z nich będzie miał na otrzymane obrazy.Powietrze uwięzione pod okienkiem będzie widoczne na obrazach w postaci pęcherzyków. Osady akrylu na szkle wykazują autofluorescencję w kanale dalekiej czerwieni i będą blokować część pola widzenia. Podobnie, zanieczyszczenia na okienku podczas obrazowania objawiają się na zdjęciach jako autofluorescencyjne smugi.Nawet idealne okno wewnątrzczaszkowe może sprawiać problemy po umieszczeniu preparatu pod mikroskopem. Artefakty oddechowe powodują powstawanie prążkowanych obrazów, natomiast niewłaściwe ułożenie myszy w ramie skutkuje obrazem segmentowym. Ponieważ laser przecina tylko część tkanki, dzięki późniejszej obróbce obrazu możliwe jest dodanie dodatkowego kanału dla komórek znakowanych CFP, co pozwala na odjęcie obrazów GFP od obrazów CFP w celu wyodrębnienia rzeczywistego sygnału CFP.Ponadto, wykorzystując charakterystykę autofluorescencji generacji drugiej harmonicznej włókien kolagenu typu IV, jesteśmy w stanie obrazować błonę podstawną naczyń krwionośnych. Dostępność pięciu kanałów fluorescencyjnych zapewnia użytkownikowi dużą elastyczność i możliwość adaptacji nowatorskiego modelu lustrzanego opisanego w niniejszej pracy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o niebezpiecznych produktach stosowanych w trakcie zabiegów chirurgicznych.Niezbędna jest również skrupulatność i szczególna dbałość o szczegóły, aby zapewnić, że tkanka mózgowa pozostanie nieuszkodzona podczas długoterminowego obrazowania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak stworzyć mysz chimeryczną z fluorescencyjnymi komórkami progenitorowymi, a w konsekwencji być w stanie zarejestrować obrazy w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości z naczyń krwionośnych wewnątrzczaszkowych po implantacji komórek nowotworowych, z zastosowaniem interwencji terapeutycznej lub bez niej.

a-novel-high-resolution-vivo-imaging-technique-to-study-dynamic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Nowa, wysokiej rozdzielczości technika in vivo do badania dynamicznej odpowiedzi struktur czaszkowych na wzrost guza i terapię

Przedstawiamy nowatorskie podejście do ilościowego określania lokalizacji nanocząsteczek w naczyniach krwionośnych ludzkich guzów ksenoprzeszczepionych z wykorzystaniem dynamicznego obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym w modelu zarodka ptaka.

Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

W tym filmie wykonujemy obrazowanie dożylne wstępnie wstrzykniętych komórek rakowych w modelu mysim przez wszczepione okienko czaszkowe. Ta technika obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości umożliwia badanie dynamicznego zachowania komórek nowotworowych u żywej myszy.

Obrazowanie przyżyciowe oparte na oknie czaszkowym w modelu mysim: technika obrazowania służąca do badania zachowania wstępnie wstrzykniętych komórek rakowych w mózgu modelu mysiego

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Tutaj opisujemy metodę wielofotonowego obrazowania poklatkowego komórek mózgu w wysokiej rozdzielczości przed i po inwazyjnej interwencji chirurgicznej (np. biopsji) u tego samego żywego zwierzęcia. Metoda ta pozwala na badanie wpływu tych inwazyjnych zabiegów chirurgicznych na zachowanie migracyjne, inwazyjne i proliferacyjne komórek nowotworowych na poziomie pojedynczej komórki.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe zachowania komórek guza mózgu w odpowiedzi na inwazyjną biopsję chirurgiczną

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Poznaj nową technikę obrazowania in vivo z użyciem mikroskopii dwufotonowej do badania dynamicznej neowaskularyzacji w mózgu. Metoda umożliwia obserwację rekrutacji komórek progenitorowych do naczyń krwionośnych guza.

Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie (Wideo) | JoVE Journal

Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

Przeglądaj więcej filmów