Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie wysokiej rozdzielczości obrazów pojedynczych komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku kostnego, zgodnie z ich wzorcami rekrutacji do normalnego układu naczyniowego mózgu i guza mózgu w czasie. Osiąga się to poprzez usunięcie kości piszczelowej i udowej od myszy dawcy w celu uzyskania fluorescencyjnych komórek progenitorowych szpiku kostnego, a następnie wstrzyknięcie tych komórek napromieniowanym myszom biorcy. Drugim krokiem jest wygenerowanie wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów GB M u chimerycznych myszy w komorze z oknem czaszkowym.

Następnie myszy poddawane są różnym schematom leczenia, w tym stereotaktycznemu promieniowaniu sterowanemu. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie myszy na dwufotonowym mikroskopie konfokalnym. Ostatecznie metodologia ta może być wykorzystana do dynamicznego badania mechanizmów unaczynienia wewnątrzczaszkowego w różnych modelach.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak histopatologia tkanek ex vivo, jest to, że możemy badać krytyczne dynamiczne informacje związane z tworzeniem się naczyń w mózgu. W ten sposób możemy odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mechanizmów neowaskularyzacji międzyczaszkowej. Chociaż metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w neowaskularyzację wewnątrzczaszkową, może być również stosowana do innych układów i procesów chorobowych w mózgu, takich jak niedokrwienie wewnątrzczaszkowe lub choroba neurodegeneracyjna po udarze mózgu i mechanizmy przerzutów komórek nowotworowych do mózgu.

Na potrzeby tego filmu nie byliśmy w stanie przestrzegać ścisłej techniki aseptycznej. W związku z tym kaptur bezpieczeństwa biologicznego ma nadmierny otwór o średnicy 12 cali, a zwierzęta nie są udrapowane, co pozwala widzowi na wyraźniejszy obraz i lepszy dostęp do zorientowania się w procedurach pracy eksperymentalnej. Należy ściśle przestrzegać techniki aseptycznej.

Rozpocznij tę procedurę od potwierdzenia ekspresji fluorescencji myszy dawcy GFP i poddaj ją eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami. Następnie oczyść obie kończyny tylne i usuń kość piszczelową i udową podczas pracy w warunkach aseptycznych. Usuń nadmiar tkanki z kości.

Następnie usuń płytki końcowe z obu końców czterech wyciętych kości. Przepłucz je igłą o rozmiarze 22 i jednym mililitrem sterylnego PBS. Staną się czyste, gdy cały szpik kostny zostanie wypłukany.

Następnie wymieszać wyekstrahowaną zawiesinę szpiku kostnego. Cóż, powinien zawierać około 20 milionów komórek, co wystarczy do rekonstytucji trzech myszy gospodarza. Następnie przygotuj 3 igły tuberkulinowe o rozmiarze 27 i wciągnij 300 mikrolitrów zawiesiny szpiku kostnego do każdej z nich.

Podczas gdy mysz jest umieszczona w ograniczniku. Zaznacz powierzchnię ogona grzbietowego, aby się zorientować. Następnie wstrzyknąć zawiesinę do bocznej żyły ogonowej trzech uprzednio napromieniowanych.

myszami ślizgowymi w tej procedurze pracującej w warunkach aseptycznych. Znieczulij chimeryczny szpik kostny myszy ślizgowe i podaj zatwierdzone przez iacuc prewencyjne znieczulenie. Zastosuj żel łzowy, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.

Oczyść głowę najpierw roztworem Betadyne, a następnie alkoholem i usuń nadmiar włosów. Następnie dodatkowo oczyść skórę głowy leżącą pod spodem alkoholem. Wykonaj nacięcie od środka uszu do tuż nad oczami.

Usuń skórę głowy po obu stronach pierwszego nacięcia, aby odsłonić około pięciu milimetrów leżącej pod spodem czaszki. Następnie zidentyfikuj anatomiczne punkty orientacyjne na powierzchni czaszki. Następnie zidentyfikuj i podnieś okostną, wstrzykując 2% lidokainę z roztworem epinefryny.

Następnie wypreparuj okostną z dala od powierzchni czaszki za pomocą ostrego narzędzia. Następnie użyj wiertła uszlachetniającego TR o średnicy 2,7 milimetra, aby osłabić okrągły płat kostny o średnicy 2,7 milimetra na prawej półkuli czaszki w równej odległości od Lambda i bgma. Nie należy penetrować kości wiertłem w celu ochrony leżącej pod spodem opony twardej i tkanki.

Teraz usuń osłabiony płat kostny za pomocą preparacji, pęsety i haczyka dentystycznego z celową, ale kontrolowaną siłą. Następnie załaduj strzykawkę Hamiltona o rozmiarze 30 z 10 mikrolitrami zawiesiny komórek i umieść igłę na ramie stereotaktycznej. Następnie umieść mysz na ramce stereotaktycznej.

Dopasuj igłę do środkowego punktu okienka wygenerowanego po tym, opuść igłę, aż dotknie powierzchni kory. Następnie zresetuj współrzędne cyfrowe. Teraz opuść igłę o 3,2 milimetra w głąb tkanki korowej.

Następnie cofnąć 0,2 milimetra i wstrzyknąć na trzy milimetry. Wstrzyknięcie na głębokość należy przeprowadzać z szybkością 10 mikrolitrów na minutę. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę na miejscu na minutę, a następnie powoli ją schować.

Następnie wyjmij mysz z ramki. Następnie utrzymuj nawodnienie powierzchni mózgu. Za pomocą kropli sterylnego PBS.

Umieść trzymilimetrowe szkiełko nakrywkowe na powierzchni mózgu, aby uszczelnić okienko o średnicy 2,7 milimetra. Następnie osusz otaczającą kość czaszki. Następnie nałóż spoiwo weterynaryjne, aby przykleić tkankę skóry głowy do kości czaszki i utrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu.

Nie nakładaj zbyt dużo, ponieważ przecieknie pod szkłem i zmniejszy potencjał obrazowania. Następnie wymieszaj świeży proszek akrylowy z roztworem dentystycznym w kapturze i nałóż mieszaninę na spoiwo weterynarza za pomocą igły o rozmiarze 22. Aby zapewnić szczelne uszczelnienie, nałóż akryl tak, aby lekko zachodził na krawędź szkiełka nakrywkowego, ale nie zakrywał szkiełka nakrywkowego.

W tym kroku umieść znieczuloną mysz w niestandardowym ograniczniku głowy wewnątrz zaprojektowanego w domu stereotaktycznego promiennika XAD 2 25. Uzyskaj skan CT wiązką stożkową 360 stopni z lampą rentgenowską działającą przy napięciu szczytowym 40 kilo i 0,05 miliampera przez dwumilimetrowy filtr aluminiowy. Użyj obrazu, aby ustawić stolik w taki sposób, aby środek promieniowania ISO był skierowany na prawą półkulę i znajdował się centralnie w kierunku grzbietowo-brzusznym.

Dostępna jest szeroka gama kolimatorów do celowania w promieniowanie, co świadczy o zdolności adaptacyjnych modelu. W tym przypadku używamy ośmiu milimetrów na 11 milimetrów do napromieniania półkuli. Włóż kolimator półsferyczny do stereotaktycznego promiennika X RAD 2 25.

Uzyskaj pojedyncze ortogonalne obrazy CT zarówno od góry, jak i od dołu przez kolimator, aby zapewnić prawidłowe ustawienie głowy poprzez zlokalizowanie anatomicznych struktur kostnych i ręczne dostrojenie pozycji sceny na monitorze. Wymień aluminiowy filtr podczerwieni XAD 2 25 na miedziany filtr uzdatniający o średnicy 0,93 milimetra. Następnie uruchom program lampy rentgenowskiej przy szczytowym napięciu 225 illa i 13 miliamperach i podaj połowę dawki promieniowania od góry w kierunku AP.

Ustawić suwnicę w dolnym położeniu i podać drugą połowę dawki promieniowania od dołu w kierunku PA. W tej procedurze należy znieczulić wcześniej wygenerowaną mysz z oknem wewnątrzczaszkowym i oczyścić okno za pomocą sprayu nasączonego alkoholem. Ustaw kanały w mikroskopie konfokalnym zgodnie z fluorochromami zintegrowanymi z wygenerowaną chimeryczną myszą.

Alternatywnie można ponownie użyć poprzednich ustawień, aby zmniejszyć zmienność między sesjami obrazowania. Wstrzyknąć wszelkie znaczniki wymagane do obrazowania do bocznej żyły ogonowej, w tym przypadku dekstran do naczyń krwionośnych. Odwróć mysz na specjalnie skonstruowany ogranicznik głowy, podpierając się formowaną plasteliną, upewniając się, że głowa jest prostopadła do lasera i płasko załaduj ogranicznik na ruchomą stolik mikroskopu.

Włącz laser pierwszego kanału i ustaw go na środku okna wewnątrzczaszkowego, patrząc bezpośrednio na punkt przecięcia wiązki laserowej na oknie komory. Wykonaj zdjęcie każdego kanału dla całego okna za pomocą obiektywu o powiększeniu pięciokrotności i użyj go jako mapy dla innych obrazów o wyższej rozdzielczości z obiektywami dalekiego zasięgu 10x i 20x. Schemat ten podkreśla błędy techniczne związane z procesem chirurgicznym i pokazuje wpływ, jaki każdy z nich będzie miał na wytworzone obrazy.

Powietrze uwięzione pod oknem będzie widoczne na obrazach jako bąbelki. Akryl nagromadzony na szkle jest autofluorescencyjny w odległym kanale czerwonym i blokuje część pola widzenia. Podobnie, brud na szybie podczas obrazowania objawia się na obrazach jako wygięcie autofluorescencyjne.

Nawet idealne okienko wewnątrzczaszkowe może napotkać problemy, gdy znajdzie się pod mikroskopem. Artefakty oddychania skutkują powstawaniem obrazów w linie, podczas gdy niewłaściwe położenie myszy na ramce powoduje segmentację obrazu. Ponieważ laser przechodzi tylko przez część tkanki po przetworzeniu obrazu, możliwe jest dodanie dodatkowego kanału dla komórek oznaczonych CFP, dzięki czemu obrazy GFP można odjąć od obrazów CFP, aby ujawnić prawdziwy sygnał CFP.

Dodatkowo, wykorzystując autofluorescencję drugiej generacji harmonicznej charakterystyczną dla czterech włókien kolagenu, jesteśmy w stanie zobrazować błonę podstawną układu krwionośnego. Dostępność pięciu kanałów fluorescencyjnych pozwala użytkownikowi na dużą elastyczność i zdolność adaptacji nowatorskiego modelu lustrzanego opisanego w tym artykule. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o niebezpiecznych produktach używanych podczas zabiegów chirurgicznych.

Ważne jest również, aby być skrupulatnym i zwracać szczególną uwagę na szczegóły, aby zapewnić, że tkanka mózgowa pozostaje nieuszkodzona przez cały długotrwały okres obrazowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć chimeryczną mysz z fluorescencyjnymi komórkami progenitorowymi, a co za tym idzie, być w stanie uchwycić obrazy w czasie rzeczywistym naczyń wewnątrzczaszkowych w czasie rzeczywistym po implantacji komórek nowotworowych z interwencją terapeutyczną lub bez niej.