Name: Analiza kokulturowa interakcji białek zewnątrzkomórkowych wpływających na wydzielanie insuliny przez komórki beta trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Poznaj metodę kokultury HEK293 z komórkami beta trzustki do badania wpływu białek transbłonowych na wydzielanie insuliny. Technika ta pozwala ocenić funkcję komórek beta bez zakłócania ich homeostazy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health R01DK080971 oraz granty Juvenile Diabetes Research Foundation 37-2009-44. Doceniamy również wsparcie otrzymane od UCSD Pediatric Diabetes Research Center (PDRC).

1. Transfekcja warstwy HEK293
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę komórkową HEK293, dodając do 500 ml butelek DMEM (z 4,5 g/ml glukozy i czerwieni fenolowej oraz bez glutaminy): 50 ml FBS, 5 ml 100X roztworu penicyliny/streptomycyny, 5 ml 100x roztworu L-glutaminy i 500 μl amfoterycyny B.</li>
	<li>Umieść komórki HEK293 na płytce 24-dołkowej, używając 0,5 ml pożywki HEK293 na dołek. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozłożone na dnie płytki.</li>
	<li>Gdy komórki HEK293 osiągną 100% zbieżności, transfekuj 0,8 μg plazmidu kodującego interesujące białko (wstawione do wektora ekspresyjnego ssaków) i 2 μl Lipofectaminy 2000 zgodnie z protokołem Lipofectamine. Zdecydowaliśmy się na użycie szkieletu pcDNA 3.3 przeznaczonego do ekspresji w komórkach ssaków.</li>
	<li>Opcjonalnie, po 6 godzinach inkubacji, wymienić pożywki do transfekcji opisane w protokole Lipofectamine na normalne podłoża HEK293.</li>
	<li>Aby ocenić ekspresję transfekowanego białka, podzbiór baseników z transfekowanej kultury tkankowej można wykorzystać do immunofluorescencyjnego wykrywania ekspresji białka lub do analizy ekspresji białka metodą western blot przy użyciu standardowych technik.</li>
</ol>
2. Opcjonalna fiksacja komórek HEK293 wyrażających transfekowane białko
Transfekowane komórki HEK293 mogą być delikatnie utrwalone w celu ułatwienia kokultury w podłożach, które mogą być szkodliwe dla żywych komórek HEK293 (np. krok 3.9 poniżej) lub w celu umożliwienia efektywnego przygotowania płytek do kilku eksperymentów naraz (zobacz też Dyskusja).
<ol>
	<li>Przeprowadzenie badań pilotażowych w celu określenia przebiegu czasowego ekspresji białka w komórkach HEK293.</li>
	<li>Po transfekcji warstwy komórkowej HEK293 należy odessać pożywkę z komórek w punkcie czasowym po transfekcji związanym z najwyższym poziomem ekspresji. Jeśli nastąpi to w ciągu pierwszych 24 godzin, nie odsysaj do 24 godzin po transfekcji.</li>
	<li>Delikatnie przemyj komórki HEK293 D-PBS, a następnie dodaj 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubuj w temperaturze RT przez 30 minut. (Aby uzyskać 4% roztwór PFA, zacznij od 16% roztworu w 1X PBS i rozcieńcz 1:4 1X PBS.)</li>
	<li>Używając sterylnego PBS, delikatnie umyć komórki 3 razy i inkubować w PBS O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć komórki 3 razy sterylnym PBS, następnie dodać PBS i pozostawić w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania potrzebnej (maksymalny czas przechowywania może się różnić w zależności od wyrażonego białka. Komórki HEK293 transfekowane w celu ekspresji izoform neuroliginy przechowujemy do 2 tygodni bez istotnych zmian w obserwowanym wpływie na wydzielanie insuliny).</li>
</ol>
3. Współhodowla komórek beta INS-1 z komórkami HEK293
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę INS-1, dodając do 500 ml RPMI 1640 (z glukozą i czerwienią fenolową oraz bez glutaminy): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicylina/streptomycyna, 5 ml 100X roztwór L-glutaminy, 5 ml pirogronianu sodu, 500 μl amfoterycyny B, 500 μl beta-merkaptoetanolu (jest to prawie identyczne z podłożem zwykle stosowanym do pierwotnej hodowli wysp trzustkowych, z wyjątkiem dodania beta-merkaptoetanolu).</li>
	<li>Za pomocą środka do usuwania komórek (lub innego nieenzymatycznego środka do usuwania komórek) zbierz komórki INS-1 z około 70-80% zbieżnością z dna kolby hodowlanej T75. Każda kolba dostarczy mniej więcej wystarczającą ilość komórek na 48 dołków.</li>
	<li>Po odwirowaniu komórek w wirówce przez 3 minuty przy 1 200 obr./min, ponownie zawiesić w mieszance 50/50 pożywek INS-1 i HEK. W przypadku 70-80% zlewającej się kolby komórek INS-1 należy ponownie zawiesić w około 25 ml zmieszanych pożywek.</li>
	<li>W przypadku używania komórek HEK293, które zostały utrwalone w paraformaldehydzie, a nie w żywych komórkach HEK293, ponownie zawieś komórki INS-1 w 100% pożywce INS-1, a nie w pożywce mieszanej.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 ml usunąć komórki z osadu, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.</li>
	<li>Odessać, aby usunąć pożywkę z komórek HEK293.</li>
	<li>Za pomocą pipety p1000 delikatnie dodaj 500 μl zawiesiny komórek INS-1 na warstwę komórek HEK wzdłuż boków studzienki. Po każdych 6 dołkach użyj pipety o pojemności 10 ml, aby ponownie zawiesić komórki INS-1, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Ogólny schemat konfiguracji kokultury przedstawiono na rysunku 1.</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 24-48 godzin, w zależności od protokołu eksperymentalnego.</li>
	<li>Jeśli wymagany jest okres kohodowli dłuższy niż 48 godzin, należy wykonać opcjonalne czynności opisane w sekcji 2 powyżej, aby utrwalić komórki HEK293.</li>
	<li>W przypadku stosowania pierwotnych zdysocjowanych wysepek gryzoni lub ludzkich wysepek [np. patrz wcześniejsze protokoły w JoVE11-15], należy upewnić się, że zamiast pożywki INS-1 stosuje się odpowiednie podłoża, takie jak RPMI z 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca, 5 ml L-Glut, 0,5 ml amfoterycyny-B. Chociaż można użyć zdysocjowanych komórek wysp trzustkowych na płytce 24-dołkowej, w praktyce, ze względu na dużą liczbę potencjalnie potrzebnych wysp trzustkowych, zaleca się rozważenie zmniejszenia do płytki 48-dołkowej (co wymaga mniejszej liczby komórek wysp trzustkowych na studzienkę). Na 48-dołkową płytkę dodaj około 100 wysepek zdysocjowanych komórek na płytkę, aby rozpocząć. W zależności od skuteczności dysocjacji i zastosowanej metody, może być wymagana mniejsza liczba wysepek.</li>
</ol>
4. Wydzielanie insuliny stymulowane glukozą
<ol>
	<li>Preinkubować komórki w 250 μl 2,5 mM glukozy w KRB (bufor wodorowęglanowy Krebsa-Ringera) przez minimum 1 godzinę. Aby przeprowadzić preinkubację, usuń pożywkę kokulturową i natychmiast zastąp ją KRB. Ta wymiana powinna być wykonywana pojedynczo, aby zminimalizować narażenie komórek INS-1 na tlen środowiskowy. Zasysać jedną ręką, a drugą pipetować KRB o niskiej (2,5 mM) glikemii.</li>
	<li>Wymieniać preinkubację KRB na 250 μl 2,5 mM lub 20 mM glukozy w buforze KRB po jednym dołku na raz.</li>
	<li>Jeśli jest to właściwe dla konkretnego eksperymentu, można dodać dodatkowe leki wydzielające, takie jak 100 μM IBMX, aby wytworzyć silniejszą stymulowaną odpowiedź wydzielania insuliny. W szczególności zdysocjowane pierwotne komórki beta wysp trzustkowych słabo reagują na samo zwiększone stężenie glukozy, dlatego w tym przypadku należy szczególnie rozważyć dodanie IBMX lub innych substancji wydzielających16,17 .</li>
	<li>Po 1 godzinie inkubacji przenieś pożywkę do probówek do mikrofuge i wiruj 1 500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć 200 μl supernatantu i użyć go do analizy za pomocą insuliny RIA lub ELISA.</li>
	<li>Aby przygotować lizat komórkowy, natychmiast po usunięciu pożywki dodać do płytki 100 μl buforu do lizy komórek RIPA (150 mM NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 lub Nonidet P-40, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) z inhibitorami proteazy do płytki i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 min.</li>
	<li>Wirować lizat przez 15 minut przy 10 000 x g i usunąć 50 μl supernatantu do analizy za pomocą insuliny RIA lub ELISA.</li>
</ol>

<ol><li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li>
<li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li>
<li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. Metab. 11, Suppl 4. 159-167 (2009).</li>
<li>Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-secreting+cell+lines%3A+classification%2C+characteristics+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications.</a> Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).</li>
<li>Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+central+synapse%3A+clues+from+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">How to build a central synapse: clues from cell culture.</a> Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).</li>
<li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li>
<li>Abderrahmani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+traits+are+required+for+glucose-induced+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion.</a> FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).</li>
<li>Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li>
<li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neurexin%2C+neuroligin%2C+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li>
<li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li>
<li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+I%3A+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+II%3A+purification+and+culture+of+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343(2009).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).</li>
<li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli%3A+enhanced+Ca2%2B+and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li>
<li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+gene+expression+in+HEK293+cells%3A+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9(2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda kokultury zapewnia skuteczny sposób określania fizjologicznego znaczenia określonych białek transbłonowych na powierzchni komórki beta, a w szczególności ich domen zewnątrzkomórkowych. Poprzez hodowlę komórek beta lub komórek insulinoma (takich jak zastosowane tutaj komórki INS-1) w kontakcie z komórkami HEK293 wyświetlającymi interesujące białko na powierzchni komórki, można zaprojektować eksperymenty w celu określenia skutków zewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko bez bezpośredniego zakłócani...

Opisujemy tutaj metodę ułatwiającą badanie, jak zewnątrzkomórkowe domeny określonych białek transbłonowych wpływają na wydzielanie insuliny. Metoda bada wpływ interakcji białka będącego przedmiotem zainteresowania z białkami (lub ewentualnie innymi cząsteczkami) na powierzchni komórek beta trzustki. Metoda pozwala na zbadanie, w jaki sposób białka powierzchniowe komórek ulegające ekspresji przez komórki beta lub przez inne sąsiednie komórki (np. komórki śródbłonka, neurony, komórki alfa trzustki) wpływają na funkcję komórek beta poprzez interakcje międzykomórkowe (tj. poprzez interakcje z partnerami interakcji na powierzchni sąsiednich komórek beta).
Komórkowa błona plazmatyczna zawiera złożony zestaw strukturalnych i funkcjonalnych białek służących jako pomosty do środowiska zewnątrzkomórkowego. Poprzez tworzenie połączeń międzykomórkowych lub inicjację zdarzeń sygnalizacyjnych z tworzywa sztucznego, interakcje między białkami na powierzchni komórki mogą pomóc w koordynowaniu funkcji sąsiednich komórek. Komórki beta trzustki są zgrupowane razem w wyspach trzustkowych i działają w skoordynowany sposób w celu utrzymania homeostazy glukozy1. Jak wykazano na przykład na przykładzie znaczenia zewnątrzkomórkowych interakcji EphA-ephrinA i neuroliginy-2 w regulacji wydzielania insuliny stymulowanego przez glukozę, staje się coraz bardziej jasne, że zwiększona wiedza na temat interakcji zewnątrzkomórkowych zachodzących między białkami na powierzchni sąsiednich komórek beta będzie miała ogromne znaczenie dla uzyskania pełnego zrozumienia wydzielania insuliny. Dojrzewanie funkcjonalne komórek beta i utrzymanie homeostazy glukozy1-3. Celem opisanej tutaj metody jest umożliwienie zbadania wpływu na funkcję komórek beta interakcji transkomórkowych obejmujących określone białka transbłonowe lub w inny sposób związane z powierzchnią komórki. Poprzez wspólną hodowlę komórek beta z komórkami HEK293 transfekowanymi różnymi konstruktami ekspresyjnymi, można skutecznie badać wpływ różnych białek powierzchniowych komórek lub ich zmutowanych wariantów na funkcję komórek beta. Odbywa się to bez konieczności transfekcji samych komórek beta.
Wyjaśnienie ról poszczególnych interakcji międzykomórkowych poprzez badania knockdown, knockout lub nadekspresji w hodowanych komórkach beta lub in vivo wymaga bezpośrednich zakłóceń ekspresji mRNA i białek komórek beta, potencjalnie wpływając na zdrowie i/lub funkcjonowanie komórek beta w sposób, który mógłby zakłócić analizy efektów określonych interakcji zewnątrzkomórkowych. Podejścia te zmieniają również poziomy domen wewnątrzkomórkowych docelowych białek, a ponadto nie pozwalają na odróżnienie skutków wynikających z interakcji między białkami na tej samej komórce lub w tej samej komórce od skutków interakcji międzykomórkowych. W tym miejscu opisano metodę określania wpływu określonych interakcji międzykomórkowych na zdolność wydzielania insuliny i reaktywność komórek beta. Metoda ta ma zastosowanie do linii komórek beta wydzielających insulinę, takich jak komórki INS-14, oraz do zdysocjowanych pierwotnych komórek beta gryzoni lub ludzkich. Opiera się na modelach kokultury opracowanych przez neurobiologów, którzy odkryli, że narażenie hodowanych neuronów na określone białka neuronalne wyrażane na warstwach komórkowych HEK293 (lub COS) może zidentyfikować białka, które napędzają tworzenie synaps5,6. Biorąc pod uwagę podobieństwa między maszynerią wydzielniczą synaps neuronalnych i komórek beta, doszliśmy do wniosku, że funkcja komórek beta i dojrzewanie funkcjonalne mogą być napędzane przez podobne interakcje międzykomórkowe7-9. Aby zbadać te interakcje, opracowaliśmy opisany tutaj system, w którym komórki beta są hodowane na warstwie komórek HEK293 wyrażających interesujące białko10. System ten pozwala cytoplazmie komórek beta pozostać nietkniętą, podczas gdy zewnątrzkomórkowe interakcje białko-białko są manipulowane.

<table><tbody><tr><td>pcDNA 3.3 wektor/szkielet</td><td>Invitrogen</td><td>K830001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>18324012</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech</td><td>45001-312</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dla wstrzykiwaczy/paciorkowców</td><td>Mediatech</td><td>45001-652-1</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Mediatech</td><td>45001-808-1/30</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Mediatech</td><td>45001-404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Mediatech</td><td>45001-434</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Mediatech</td><td>45001-710-1</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211; thanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Stripper</td><td>komórkowy Mediatech</td><td>45000-668</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolba</td><td>BD</td><td>1368065</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>50980487</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Mediatech</td><td>45001-130</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma</td><td>I5879-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RIPA</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza kokulturowa interakcji białek zewnątrzkomórkowych wpływających na wydzielanie insuliny przez komórki beta trzustki

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interakcje między białkami na powierzchni komórki pomagają koordynować funkcje sąsiednich komórek. Komórki beta trzustki są skupione razem w wyspach trzustkowych i działają w skoordynowany sposób w celu utrzymania homeostazy glukozy. Staje się coraz bardziej oczywiste, że interakcje między białkami transbłonowymi na powierzchni sąsiednich komórek beta są ważnymi determinantami funkcji komórek beta.
Wyjaśnienie ról poszczególnych interakcji międzykomórkowych poprzez badania knockdown, knockout lub nadekspresji w hodowanych komórkach beta lub in vivo wymaga bezpośrednich zakłóceń ekspresji mRNA i białek, potencjalnie wpływając na zdrowie i/lub funkcjonowanie komórek beta w sposób, który mógłby zakłócić analizy efektów określonych interakcji. Podejścia te zmieniają również poziomy domen wewnątrzkomórkowych docelowych białek i mogą zapobiegać skutkom interakcji między białkami w tej samej błonie komórkowej, aby można je było odróżnić od skutków interakcji międzykomórkowych.
Tutaj przedstawiono metodę określania wpływu określonych interakcji międzykomórkowych na zdolność wydzielania insuliny i responsywność komórek beta. Metoda ta ma zastosowanie do linii komórek beta, takich jak komórki INS-1, oraz do zdysocjowanych pierwotnych komórek beta. Opiera się na modelach kokultury opracowanych przez neurobiologów, którzy odkryli, że ekspozycja hodowanych neuronów na określone białka neuronalne ulegające ekspresji na warstwach komórkowych HEK293 (lub COS) zidentyfikowała białka ważne dla tworzenia synaps. Biorąc pod uwagę podobieństwa między maszynerią wydzielniczą synaps neuronalnych i komórek beta, doszliśmy do wniosku, że dojrzewanie funkcjonalne komórek beta może być napędzane przez podobne interakcje międzykomórkowe. Opracowaliśmy system, w którym komórki beta są hodowane na warstwie komórek HEK293 wykazujących ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania. W tym modelu cytoplazma komórki beta pozostaje nietknięta, podczas gdy zewnątrzkomórkowe interakcje białko-białko są manipulowane. Chociaż skupiamy się tutaj przede wszystkim na badaniach nad wydzielaniem insuliny stymulowanym przez glukozę, można analizować inne procesy; na przykład zmiany w ekspresji genów określone za pomocą immunoblottingu lub qPCR.

Stosując opisaną tutaj metodę, przebadaliśmy wpływ różnych wariantów białka neuroliginy na wydzielanie insuliny. Stanowi to uzupełnienie naszych opublikowanych prac badających wpływ neuroliginy-2 na funkcję komórek beta10. Rysunek 2 przedstawia na przykład wyniki uzyskane z kokultury komórek beta INS-1 z komórkami HEK293 przetransfekowanymi w celu ekspresji izoformy neuroliginy, określanej tutaj jako NL-X. Eksperyment ten został zaprojektowany, aby sprawdzić hipotezę, według której NL-X bierze...

Transkomórkowe interakcje białkowe są ważnymi determinantami funkcji komórek beta trzustki. Szczegółowo opisano tutaj metodę - zaadaptowaną z modelu synaptogenezy - do badania, w jaki sposób określone białka transbłonowe wpływają na wydzielanie insuliny. Transfekowane komórki HEK293 wyrażają białka będące przedmiotem zainteresowania; Komórki beta nie muszą być transfekowane ani w inny sposób bezpośrednio zaburzone.

Analiza kokulturowa interakcji białek zewnątrzkomórkowych wpływających na wydzielanie insuliny przez komórki beta trzustki

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie, w jaki sposób interakcje transkomórkowe obejmujące domeny zewnątrzkomórkowe specyficznych białek transbłonowych wpływają na funkcję komórek beta, a w szczególności na wydzielanie insuliny. Jest to realizowane poprzez najpierw transfekcję linii komórek ssaczych plazmidem zawierającym badane białko, a w drugim kroku współhodowlę linii komórek beta z komórkami ssaczymi.W ostatnim kroku kokulturę inkubuje się w pożywkach o różnych stężeniach glukozy, aby umożliwić ocenę stymulowanego glukozą wydzielania insuliny. Ostatecznie do oceny poziomu insuliny wydzielonej do pożywki przez hodowane komórki beta stosuje się radiochemiczne testy immunoenzymatyczne lub testy ELISA. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak nadoekspresja i knockdown genów, jest uniknięcie zaburzeń ekspresji mRNA i białek, co potencjalnie mogłoby wpłynąć na zdrowie i/lub funkcję komórek beta w sposób mogący zakłócić analizy specyficznych oddziaływań białka.Zacznij od przeniesienia komórek HEC 2 93 do płytki 24-dołkowej w ilości 0,5 ml pożywki HEC 2 93 na dołek, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek na dnie płytki. Potrząsaj płytką wzdłuż jednej osi naraz z prędkością zsynchronizowaną z falą tworzącą się w dołku. Gdy komórki HEC 2 93 osiągną 100% konfluencji, przeprowadź transfekcję kultur za pomocą 0,8 µg plazmidu kodującego interesujące białko w 2 µl lipo 2000.Zgodnie z protokołem lipo, ogólny schemat współhodowli, który zostanie teraz zaprezentowany, został przedstawiony tutaj z wykorzystaniem nieenzymatycznego usuwacza komórek. Krok ten należy rozpocząć od zebrania komórek INS one przy konfluencji wynoszącej około 70 do 80% z dna kolby hodowlanej T 75. Po wirowaniu komórek przez trzy minuty przy 150 Gs w temperaturze pokojowej, należy użyć pipety P 1000, aby zawiesić osad w 1 mL pożywki składającej się w połowie z INS one i w połowie z.Następnie za pomocą pipety 10 ml należy dodać kolejne 24 ml mieszaniny pożywek i ponownie zawiesić komórki. Odessać pożywkę z dołków płytki 24-dołkowej zawierającej komórki HEC 2 9 3. Następnie, używając pipety P 1000, ostrożnie nanieść 500 µl zawiesiny komórek INS 1 na warstwę komórek HEC, prowadząc pipetę wzdłuż ścianek dołka. Po każdym sześciu dołkach należy użyć pipety 10 ml, aby ponownie zawiesić komórki INS 1.Ponownie wymieszaj, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Następnie inkubuj komórki przez 24 do 48 godzin, w zależności od protokołu eksperymentalnego. Po inkubacji komórek przez wymagany okres eksperymentalny, aspiruj po kolei z każdego dołka pożywkę kokultury jedną ręką, a drugą natychmiast zastąp ją 250 µL 2.5 mM glukozy w buforze Krebs-Ringera z wodorowęglanami.Po godzinnej preinkubacji kokultur należy zastąpić bufor KRB o niskiej zawartości glukozy 250 µL roztworu glukozy o stężeniu 2,5 mM lub 20 mM. Po kolejnej godzinie inkubacji przenieść bufor KRB do probówek do wirówki i wirować przez pięć minut przy 1500 ×g i 4 °C. Natychmiast dodać do płytki 100 µL buforu do lizy komórek RIPA z inhibitorami proteaz i inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze 4 °C.Po zakończeniu wirowania probówek, należy pobrać 200 µL supernatantu do późniejszej analizy za pomocą radioimmunologicznego testu insuliny lub testu ELISA. Następnie, uzyskaną lizat komórkowy należy wirować przez 15 minut przy 10 000 ×g, a następnie pobrać 50 µL SNAT do analizy za pomocą radioimmunologicznego testu insuliny lub testu ELISA. Przedstawiono tutaj wyniki uzyskane z kokultury komórek INS-1 beta z komórkami HC-293 przetransfekowanymi w celu ekspresji izoformy neuroliginy, określanej tutaj jako NLX.Ekspresja NLX zwiększyła bazową i stymulowaną sekrecję insuliny przez współhodowane komórki INS-1. Domena zewnątrzkomórkowa NX musi wchodzić w interakcje z innym białkiem lub cząsteczką na powierzchni komórek INS-1, aby spowodować zwiększenie wydzielania insuliny przez te komórki. Wyniki innych rodzajów analiz z wykorzystaniem systemu współhodowli przedstawiono na dwóch następnych wykresach.Na tym pierwszym wykresie przedstawiono wzrost zawartości insuliny w komórkach INS1 współhodowanych z NLY. W tym eksperymencie RNA zostało wyizolowane z warstwy komórek i poddane analizie metodą RT-qPCR. Współhodowla z NLY zwiększyła poziomy mRNA insuliny oraz PDX1.Po wykonaniu tej procedury można zastosować dodatkowe metody, takie jak qPCR lub ilościowa immunohistochemia, aby odpowiedzieć na kolejne pytania, na przykład czy zewnątrzkomórkowe oddziaływania przetransfekowanego białka mogą powodować zmiany w strukturze komórek lub ekspresji genów.

coculture-analysis-extracellular-protein-interactions-affecting

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza kokultury interakcji białek pozakomórkowych wpływających na wydzielanie insuliny przez komórki beta trzustki

Niniejsze badanie opisuje metodę ukierunkowanego różnicowania w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych zarodkowych człowieka w kierunku trzustkowym. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kokultura z komórkami śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Funkcjonalność komórek beta jest ważna dla homeostazy glukozy we krwi, która jest oceniana w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą genetycznie zakodowanego reportera dla napływu wapnia.

Analiza funkcji komórek beta za pomocą obrazowania wapnia w rozdzielczości pojedynczej komórki na wysepkach danio pręgowanego

Badania ex vivo wysp trzustkowych są ważne dla badań nad cukrzycą. Istniejące techniki badania hodowanych wysepek w ich natywnej architekturze trójwymiarowej są czasochłonne, nieefektywne i rzadko stosowane. W pracy opisano nową, prostą i wydajną metodę generowania wysokiej jakości skrawków parafinowych całych hodowanych wysepek.

Osadzanie wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić szybkie, tanie testy lucyferazy przy średniej przepustowości przy użyciu lucyferazy Gaussia połączonej z insuliną jako wskaźnika wydzielania insuliny z komórek beta. Test można wykonać za pomocą większości czytników płytek luminescencyjnych i pipet wielokanałowych.

Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy

Ten protokół opisuje metodę synchronicznego pozyskiwania i korejestracji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych oraz wydzielania insuliny i glukagonu przez pierwotne ludzkie pseudowyspy za pomocą adenowirusowego dostarczania cyklicznego biosensora monofosforanu adenozyny (cAMP), detektora różnic cAMP in situ (cADDis) oraz systemu mikroperyfuzji.

Ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów

To badanie wykorzystuje wielobarwne markery fluorescencji śmierci komórki i apoptozy w połączeniu z mikroskopią konfokalną do oceny apoptozy wywołanej cytokinami i śmierci specyficznej dla komórek β w wyspach trzustkowych. Ujawnia przestrzenne i czasowe zmiany w śmierci komórki i apoptozie w odpowiedzi na bodźce zewnątrzkomórkowe.

Leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Poznaj metodę kokultury HEK293 z komórkami beta trzustki do badania wpływu białek transbłonowych na wydzielanie insuliny. Technika ta pozwala ocenić funkcję komórek beta bez zakłócania ich homeostazy.

Analiza kokulturowa interakcji białek zewnątrzkomórkowych wpływających na wydzielanie insuliny przez komórki beta trzustki

Przeglądaj więcej filmów