Analiza kokulturowa interakcji białek zewnątrzkomórkowych wpływających na wydzielanie insuliny przez komórki beta trzustki
15 czerwca 2013
Transkomórkowe interakcje białkowe są ważnymi determinantami funkcji komórek beta trzustki. Szczegółowo opisano tutaj metodę - zaadaptowaną z modelu synaptogenezy - do badania, w jaki sposób określone białka transbłonowe wpływają na wydzielanie insuliny. Transfekowane komórki HEK293 wyrażają białka będące przedmiotem zainteresowania; Komórki beta nie muszą być transfekowane ani w inny sposób bezpośrednio zaburzone.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie, w jaki sposób interakcje międzykomórkowe obejmujące zewnątrzkomórkowe domeny określonych białek transbłonowych wpływają na funkcję komórek beta, a dokładniej na wydzielanie insuliny. Osiąga się to poprzez pierwszą transektację, linię komórkową ssaków z plazmidem zawierającym białko będące przedmiotem zainteresowania w drugim etapie. Linia komórkowa beta jest hodowana wspólnie z komórkami ssaków.
W końcowym etapie kohodowla jest inkubowana w pożywkach o różnych stężeniach glukozy, aby umożliwić ocenę wydzielania insuliny stymulowanego glukozą. Ostatecznie radioimmunologiczne testy insuliny lub Eliza są wykorzystywane do oceny poziomów insuliny wydzielanej do pożywki przez hodowane komórki beta. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak nadekspresja genów i knockdown, jest to, że pozwala ona uniknąć zaburzeń ekspresji mRNA i białka, które potencjalnie wpływają na zdrowie i/lub funkcję komórek beta w sposób, który może zakłócić analizy specyficznej interakcji białka.
Zacznij od przeniesienia komórek HEC 2 93 na płytkę 24-dołkową w 0,5 mililitra pożywki HEC 2 93 na studzienkę, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone na dnie płytki. Potrząsaj płytką wzdłuż jednej osi na raz z prędkością zsynchronizowaną z falą powstałą w studni. Gdy komórki HEC 2 93 osiągną 100% płynności CO, transfekuj kultury 0,8 mikrograma plazmidu kodującego interesujące białko w dwóch mikrolitrach lipo 2000.
Zgodnie z protokołem lipo, ogólny schemat kokultury, która ma zostać zademonstrowana, jest tutaj przedstawiony przy użyciu nieenzymatycznego środka do usuwania komórek. Rozpocznij ten etap od pobrania jednej komórki INS z około 70-80% płynnością z dna kolby hodowlanej T 75. Po odwirowaniu komórek przez trzy minuty w temperaturze 150 G w temperaturze pokojowej, użyj pipety P 1000, aby ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze połowy INS na pół.
Następnie za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów dodaj dodatkowe 24 mililitry zmieszanej pożywki i ponownie zawiesić komórki, zassać pożywkę z dołków 24-dołkowej płytki zawierającej komórki HEC 2 9 3. Następnie za pomocą pipety P 1000 delikatnie dodaj 500 mikrolitrów zawiesiny INS z jedną komórką na warstwę komórek sześciokątnych wzdłuż boków studzienki. Po każdych sześciu dołkach użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby ponownie zawiesić jedną komórkę INS.
Ponownie, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Teraz inkubuj komórki przez 24 do 48 godzin, w zależności od protokołu eksperymentalnego. Po inkubacji komórek przez pożądany okres doświadczalny, pojedynczo, jedną ręką odsysać pożywkę do kohodowli i natychmiast zastąpić pożywkę 250 mikrolitrami 2,5 milimolowej glukozy w buforze wodorowęglanowym Ringera Krebsa.
Po wstępnej inkubacji kultur CO przez jedną godzinę należy wymienić bufor KRB o niskiej zawartości glukozy na 250 mikrolitrów 2,5 milimolowej lub 20-milimolowej glukozy. Po kolejnej godzinie inkubacji przenieś bufor KRB do mikroprobówek do fuge i wiruj bufor przez pięć minut w temperaturze 1500 g i czterech stopniach Celsjusza, podczas gdy probówki znajdują się w wirówce. Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy komórek rippa z inhibitorami proteazy do płytki i inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Gdy probówki zakończą wirowanie, usuń 200 mikrolitrów supernatantu do późniejszej analizy za pomocą radiotestu immunologicznego insuliny lub Elizy. Na koniec odwiruj to, co jest teraz lizatem komórkowym przez 15 minut przy 10 000 g, a następnie usuń 50 mikrolitrów SNAT do analizy za pomocą insulinowego testu radioimmunologicznego lub Elizy. Tutaj pokazano wyniki uzyskane z kohodowli komórek beta INS one z komórkami HC 2 93 transfekowanymi w celu ekspresji izoformy neuroliggenu określanej tutaj jako NLX.
Ekspresja NLX zwiększała podstawowe i stymulowane wydzielanie insuliny przez współhodowane komórki I NS one. Domena zewnątrzkomórkowa NX musi wchodzić w interakcje z innym białkiem lub cząsteczką na powierzchni jednej komórki I NS, aby spowodować, że komórki INS one wydzielają więcej insuliny. Wyniki innych rodzajów analiz z wykorzystaniem systemu kokultur przedstawiono na dwóch kolejnych wykresach.
Na pierwszym wykresie pokazano wzrost zawartości insuliny w komórkach INS z hodowli INS przez NLY. Natomiast w tym eksperymencie RNA zostało pobrane z warstwy komórkowej i przeanalizowane przez R-T-Q-P-C-R. Jednoczesna hodowla z NLY zwiększyła poziom mRNA insuliny i PDX one.
Po tej procedurze można wykonać dodatkowe metody, takie jak QPCR lub immunohistochemia ilościowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy interakcje zewnątrzkomórkowe transfekowanego białka mogą powodować zmiany w strukturze komórki lub ekspresji genów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje rolę transcelularnych oddziaływań białkowych w funkcji komórek beta trzustki, ze szczególnym uwzględnieniem sekrecji insuliny. Metoda polega na kokultywowaniu transfekowanych komórek HEK293 z komórkami beta w celu oceny wpływu specyficznych białek transbłonowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Endokrynologia
Wstęp
- Interakcje transkomórkowe mają kluczowe znaczenie dla funkcjonowania komórek beta.
- Wydzielanie insuliny jest kluczowym procesem pod wpływem tych interakcji.
- Istniejące metody mogą zaburzać kondycję komórek beta, co utrudnia analizy.
- Celem niniejszej pracy jest przedstawienie bardziej dopracowanego podejścia.
Cel badania
- Zbadanie, w jaki sposób konkretne białka transbłonowe wpływają na wydzielanie insuliny.
- Wykorzystanie modelu kokultury w celu zminimalizowania bezpośredniej perturbacji komórek beta.
- Ocena wpływu stężeń glukozy na uwalnianie insuliny.
Zastosowane metody
- Transfekcja komórek HEK293 plazmidami zawierającymi białka zainteresowania.
- Współhodowla transfektowanych komórek HEK293 z komórkami beta.
- Inkubacja współhodowli w mediach o różnych stężeniach glukozy.
- Wykorzystanie radioimmunologicznych testów insuliny lub testów ELISA do pomiaru sekrecji insuliny.
Główne wyniki
- Wykazano wpływ konkretnych białek błonowych na wydzielanie insuliny.
- Udowodniono, że stężenie glukozy wpływa na uwalnianie insuliny w komórkach w hodowli współdzielonej.
- Potwierdzono skuteczność metody w porównaniu z tradycyjnymi technikami perturbacji.
- Uzyskano nową wiedzę na temat mechanizmów funkcjonowania komórek beta.
Wnioski
- Metoda kokultury umożliwia badanie oddziaływań białek bez naruszania kondycji komórek beta.
- Zdobyta wiedza może stanowić podstawę do przyszłych badań nad cukrzycą i funkcją komórek beta.
- Podejście to może prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów sekrecji insuliny.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie transkomórkowych oddziaływań białek jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka związanego z walidacją celów terapeutycznych w komórkach beta podczas poszukiwania leków na cukrzycę. Ta metoda kokultury umożliwia badanie mechanistyczne wpływu białek zewnątrzkomórkowych na wydzielanie insuliny bez naruszania kondycji komórek beta, co zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu. Rozwiązuje ona kluczowy problem na etapie odkrywania leków: odróżnienie rzeczywistej sygnalizacji transkomórkowej od wewnątrzkomórkowych czynników zakłócających w analizie szlaków sygnałowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia ocenę funkcjonalną oddziaływań białek transbłonowych w kontekście wydzielania insuliny przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórek beta.
- Wartość operacyjna: Pozwala uniknąć artefaktów związanych z wyciszaniem (knockdown) lub nadekspresją mRNA/białek, które mogą zakłócać badania walidacji celu.
- Wartość strategiczna: Wspiera ukierunkowany na hipotezy screening interaktorów zewnątrzkomórkowych w celu minimalizacji ryzyka w badaniach szlaków sygnalizacyjnych komórek beta.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie ilościowych odczytów wydzielania insuliny w warunkach kontrolowanej stymulacji glukozą w celu standaryzacji testu.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje komórki HEK293 jako regulowaną platformę prezentacji białek zewnątrzkomórkowych dla powtarzalnych testów kokultury.
- Wartość strategiczna: Pozwala na skalowalną ocenę białek kandydackich wpływających na funkcję komórek beta w formacie istotnym fizjologicznie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Powiązana interakcje białek pozakomórkowych z funkcjonalnym dojrzewaniem komórek beta oraz insulinowym uwalnianiem zależnym od poziomu glukozy.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z pierwotnymi dysocjowanymi komórkami beta oraz liniami komórkowymi komórek beta w celu walidacji między modelami.
- Wartość strategiczna: Zapewnia system istotny dla jednostek chorobowych, umożliwiający priorytetyzację celów z potencjałem dopasowania do biomarkerów translacyjnych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od angażowania celu po walidację funkcjonalną, wspierając w szczególności identyfikację wiodących związków poprzez mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do szlaków komórek beta.
- Biologia odkrywcza: Badanie, w jaki sposób domeny zewnątrzkomórkowe specyficznych białek błonowych modulują wydzielanie insuliny przez komórki beta w kontrolowanym systemie kokultury.
- Przesiewanie: Umożliwia ustandaryzowaną, powtarzalną ocenę wydzielania insuliny w różnych stężeniach glukozy przy użyciu radioimmunometrii lub testu ELISA.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennej zależnej (poziomy insuliny), co pozwala na porównanie efektów oddziaływań białkowych w określonych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy oddziaływań zewnątrzkomórkowych ze zmianami w zawartości insuliny i ekspresji genów (np. mRNA insuliny, PDX1) w celu zapewnienia ciągłości przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę kokultury wielokrotnego użytku do badania wielu białek błonowych bez konieczności zmiany podstawowych procedur postępowania z komórkami beta.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w sygnalizacji komórek beta poprzez oddzielenie efektów transkomórkowych od zaburzeń wewnątrzkomórkowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje proces kokultury poprzez zdefiniowanie etapów transfekcji, inkubacji oraz analizy sekrecji, zapewniając spójność działań między zespołami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go w walidacji celów terapeutycznych, dostarczając funkcjonalnych danych o sekrecji insuliny, które nie są obciążone artefaktami wynikającymi ze stanu zdrowia komórek beta.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane efekty wpływające na stymulowaną glukozą sekrecję insuliny.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w transfekcji komórek ssaków, technikach kokultury oraz testach wydzielania insuliny stymulowanego glukozą.
- Zależność od kontroli wydajności transfekcji oraz prawidłowego tworzenia warstwy komórek HEK293 w celu zapewnienia spójnej prezentacji białka.
- Konieczność standaryzacji protokołów próby z glukozą oraz metod oznaczania insuliny (radioimmunologicznej lub ELISA) we wszystkich eksperymentach.
- Wymaga rozważenia adaptacji metod przy rozszerzeniu badań na pierwotne komórki beta lub alternatywne linie komórek beta poza INS-1.
- Ograniczenie do analizy oddziaływań białek pozakomórkowych; brak możliwości bezpośredniego badania wewnątrzkomórkowych domen sygnałowych bez zastosowania metod komplementarnych.
