Name: Fotozakrzepowe niedokrwienie: minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmiany korowej do badań nad udarem u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj minimalnie inwazyjną metodę fotozakrzepowego niedokrwienia kory mózgowej u myszy z wykorzystaniem barwnika Rose Bengal i aktywacji światłem. Technika ta umożliwia precyzyjne indukowanie ogniskowych zmian niedokrwiennych bez konieczności kraniektomii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Annalisie Buffo za wnikliwe sugestie i komentarze, a Maurizio Grassano, Marinie Boido i Ermirze Pajaj za zdjęcia. Prace te zostały sfinansowane przez FP7-MC-214003-2 (Sieć Szkoleń Początkowych Marie Curie AXREGEN) oraz projekt Compagnia di San Paolo, gliarep.

1. Przed operacją 
<ol>
 <li> Zważ różę bengalską w probówce o pojemności 1,5 ml i rozpuść w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, aż do osiągnięcia końcowego stężenia 15 mg/ml. Filtruj sterylizuj przez filtr 0,2 μm i przechowuj w ciemności w temperaturze pokojowej do dwóch miesięcy. 
 </li>
 <li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przez autoklawowanie. Obszar operacyjny powinien zostać zdezynfekowany na mniej niż godzinę przed rozpoczęciem operacji.</li>
 <li>Zapisać masę ciała myszy, aby dostosować dawkę Rose Bengal do wstrzyknięcia. Wstrzyknęliśmy 10 μl / g masy zwierzęcia samicom myszy CD1 w wieku 12 tygodni w niniejszym protokole. Ilość róży bengalskiej potrzebna do wytworzenia pożądanej wielkości zmiany korowej może być łatwo określona w oddzielnym zestawie wstępnych eksperymentów, testując różne dawki (zwykle 2 μl/g, 5 μl/g lub 10 μl/g masy ciała). Należy pamiętać, że ilość Rose Bengal do wstrzyknięcia jest wysoce zależna od warunków eksperymentu, w szczególności od rodzaju użytego źródła światła i czasu ekspozycji na światło. W niniejszym badaniu stwierdzono, że dawka 10 μl/g (150 μg/g) jest niezbędna do wywołania fotozakrzepicy po ekspozycji na światło przez 15 minut, podczas gdy inne grupy zgłosiły, że wstrzyknięcie dootrzewnowe 50 μg/g 6,8 i 100 μg/g10 było wystarczające do wywołania zmiany fotozakrzepowej.</li>
</ol>
2. Procedura anestezjologiczna
<ol>
 <li>Znieczulenie myszy izofluranem w przezroczystej komorze indukcyjnej (3,5-4% do indukcji, 1,5-2% do utrzymania) w mieszaninie 50% (v/v) tlenu/50% (v/v) tlenku diazotu. Znieczulenie gazowe pozwala na szybkie obudzenie zwierząt, a poziom gazu znieczulającego można łatwo regulować. Alternatywnie, myszy można również znieczulić mieszaniną ketaminy i ksylazyny. </li>
 <li>Po osiągnięciu głębokiego znieczulenia należy wyjąć znieczulone zwierzę z komory indukcyjnej, umieścić je w ramce stereotaktycznej i utrzymać znieczulenie za pomocą maski na twarz. Dostosuj dawkę izofulranu, aby uzyskać odpowiedni poziom znieczulenia. Monitoruj częstość oddechów przez cały czas trwania zabiegu i upewnij się, że jest stała (40-60 oddechów na minutę). </li>
 <li>Użyj szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone. </li>
 <li>Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu. </li>
 <li>Delikatnie włóż sondę doodbytniczą, aby monitorować temperaturę podczas zabiegów chirurgicznych. Ustaw odpowiednią poduszkę grzewczą sterowaną sprzężeniem zwrotnym, aby utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 ± 0.5 °C. </li>
</ol>
3. Chirurgia oświetlenia obszaru docelowego
<ol>
 <li>Ogol skórę głowy myszy elektryczną maszynką do golenia. </li>
 <li>Mocno zabezpiecz głowę i włóż nauszniki do zewnętrznego przewodu pokarmowego. Uważaj, aby nie uszkodzić błony bębenkowej. </li>
 <li>Zdezynfekuj skórę na powierzchni za pomocą naprzemiennych machnięć 70% etanolu i betadyny za pomocą bawełnianych wacików. </li>
 <li>Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej od poziomu oczu do szyi. Zastosuj zwijacze skóry, aby czaszka była odsłonięta. </li>
 <li>Delikatnie cofnij okostną do krawędzi czaszki za pomocą skalpela i pozostaw powierzchnię czaszki do wyschnięcia za pomocą sterylnych wacików. Zidentyfikuj bregmę i lambdę. Umieść szklaną mikropipetę na bregmie jako punkt odniesienia, a następnie przesuń ją do współrzędnych interesującego Cię regionu. Obszar zainteresowania wybrany do tego artykułu ma z grubsza okrągły kształt, wyśrodkowany około 2 mm bocznie w stosunku do bregmy i obejmuje obszar około 30 mm2, który obejmuje dużą część kory sensomotorycznej zgodnie z atlasem mózgu myszy autorstwa Franklina i Paxinosa11. </li>
 <li>Zaznacz interesujące Cię miejsce punktami odniesienia i umieść światłowód w bliskim kontakcie z powierzchnią czaszki, aby uniknąć rozpraszania światła, ale zwróć uwagę, aby nie wywierać na nie nacisku. Oświetlany obszar można ograniczyć, nakładając na czaszkę maskę o małym otworze lub nasadkę na końcu światłowodu. </li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie i aktywacja róży bengalskiej
<ol>
 <li>Umieścić roztwór róży bengalskiej w strzykawce o pojemności 1 ml i obliczyć ilość do wstrzyknięcia w zależności od dawki 10 μl/g masy ciała.</li>
 <li>Kontynuuj powolne wstrzyknięcie dootrzewnowe.</li>
 <li>Pozwól barwnikowi dyfundować i dostać się do krwiobiegu. Po 5 minutach włącz oświetlacz zimnego światła. Unikaj oświetlania zwierzęcia przez jakiekolwiek inne źródło światła. Zastosowaliśmy oświetlacz światłowodowy o natężeniu 150 W. </li>
 <li>Po 15 minutach oświetlenia przerwij ekspozycję na światło i zszyj ranę.
 Pięć minut oświetlenia powoduje już zawał, a 10 minut prawdopodobnie wystarczy do uzyskania maksymalnego efektu12. W celu zminimalizowania zmienności decydujemy się na oświetlenie przez 15 minut. </li>
</ol>
5. Szew
<ol>
 <li>Usuń retraktory skóry i nałóż sterylny roztwór soli fizjologicznej, aby uniknąć odwodnienia. </li>
 <li>Zamknij ranę za pomocą igły do odwrotnego cięcia i nici do szwów jedwabnych lub nylonowych.</li>
 <li>Przerwij podawanie znieczulenia, ostrożnie wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego i umieść ją na wstępnie podgrzanej poduszce grzewczej, aż całkowicie się obudzi, a następnie włóż ją z powrotem do klatki. Temperatura ciała powinna być dokładnie monitorowana przez cały czas trwania zabiegów, aby ograniczyć zmienność rozszerzenia zawału. W zależności od stężenia i drogi podania, Rose Bengal można nadal wykryć w krwiobiegu przez kilka godzin po wstrzyknięciu13. Preferuj koc grzewczy od lampy grzewczej, aby uniknąć potencjalnych wtórnych uszkodzeń (długość fali absorpcji Rose Bengal mieści się w zielonym spektrum).</li>
</ol>

<ol><li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li>
<li>Mathers, C. D., Boerma, T., Ma Fat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+causes+of+death%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Global and regional causes of death.</a> Br. Med. Bull. 92, 7-32 (2009).</li>
<li>Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+in+the+cerebral+microcirculation%3A+effect+of+aspirin+and+other+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents.</a> Circ. Res. 40, 320-328 (1977).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).</li>
<li>Bergeron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+photochemical+cortical+lesions+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inducing photochemical cortical lesions in rat brain.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9, Unit 9 16(2003).</li>
<li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+ischemia+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model.</a> Surg. Neurol. 67, 620-625 (2007).</li>
<li>Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+infarction.+I.+Early+microvascular+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations.</a> Acta Neuropathol. 72, 315-325 (1987).</li>
<li>Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+induction+of+focal+cerebral+ischemia+in+mice+by+photothrombosis+of+cortical+microvessels%3A+characterization+of+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses.</a> J. Neurosci. Methods. 117, 43-49 (2002).</li>
<li>Kitagawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+ischemia+after+bilateral+carotid+artery+occlusion+and+intraluminal+suture+occlusion+in+mice%3A+evaluation+of+the+patency+of+the+posterior+communicating+artery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 570-579 (1998).</li>
<li>Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hardware+and+methodology+for+targeting+single+brain+arterioles+for+photothrombotic+stroke+on+an+upright+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope.</a> J. Neurosci. Methods. 170, 35-44 (2008).</li>
<li>Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 1st, Academic Press. New York. (1997).</li>
<li>Piao, M. S., Lee, J. K., Jang, J. W., Kim, S. H., Kim, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+photochemically+induced+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Korean+Neurosurg.+Soc%22%5BJournal%5D)">A mouse model of photochemically induced spinal cord injury.</a> J. Korean Neurosurg. Soc. 46, 479-483 (2009).</li>
<li>Silva, V. M., Corson, N., Elder, A., Oberdorster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rat+ear+vein+model+for+investigating+in+vivo+thrombogenicity+of+ultrafine+particles+%28UFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The rat ear vein model for investigating in vivo thrombogenicity of ultrafine particles (UFP).</a> Toxicol. Sci. 85, 983-989 (2005).</li>
<li>Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+spinal+cord+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced spinal cord injury in the rat.</a> Brain Res. 367, 296-300 (1986).</li>
<li>Van Reempts, J., Van Deuren, B., Van de Ven, M., Cornelissen, F., Borgers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flunarizine+reduces+cerebral+infarct+size+after+photochemically+induced+thrombosis+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Flunarizine reduces cerebral infarct size after photochemically induced thrombosis in spontaneously hypertensive rats.</a> Stroke. 18, 1113-1119 (1987).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx. 2, 396-409 (2005).</li>
<li>Kleinschnitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+of+platelets+or+intrinsic+coagulation+pathway-driven+thrombosis+does+not+prevent+cerebral+infarctions+induced+by+photothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Blocking of platelets or intrinsic coagulation pathway-driven thrombosis does not prevent cerebral infarctions induced by photothrombosis.</a> Stroke. 39, 1262-1268 (2008).</li>
<li>Porritt, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothrombosis-induced+infarction+of+the+mouse+cerebral+cortex+is+not+affected+by+the+Nrf2-activator+sulforaphane%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Photothrombosis-induced infarction of the mouse cerebral cortex is not affected by the Nrf2-activator sulforaphane.</a> PLoS One. 7, e41090(2012).</li>
<li>Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+effective+behavioral+tasks+for+evaluating+sensorimotor+dysfunction+following+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice.</a> J. Neurosci Methods. 129, 87-93 (2003).</li>
<li>Markgraf, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+histopathologic+consequences+of+photothrombotic+occlusion+of+the+distal+middle+cerebral+artery+in+Sprague-Dawley+and+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Comparative histopathologic consequences of photothrombotic occlusion of the distal middle cerebral artery in Sprague-Dawley and Wistar rats.</a> Stroke. 24, 286-292 (1993).</li>
<li>Wester, P., Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photothrombotic+%27ring%27+model+of+rat+stroke-in-evolution+displaying+putative+penumbral+inversion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A photothrombotic 'ring' model of rat stroke-in-evolution displaying putative penumbral inversion.</a> Stroke. 26, 444-450 (1995).</li>
<li>Hu, X., Wester, P., Brannstrom, T., Watson, B. D., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+and+reproducible+focal+cortical+ischemia+with+or+without+late+spontaneous+reperfusion+generated+by+a+ring-shaped%2C+laser-driven+photothrombotic+lesion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Progressive and reproducible focal cortical ischemia with or without late spontaneous reperfusion generated by a ring-shaped, laser-driven photothrombotic lesion in rats.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 7, 76-85 (2001).</li>
<li>Maxwell, K. A., Dyck, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+focal+ischemic+lesions+in+neonatal+mice+by+photothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible focal ischemic lesions in neonatal mice by photothrombosis.</a> Dev. Neurosci. 27, 121-126 (2005).</li>
<li>Kuroiwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rat+model+of+photothrombotic+ischemia+and+infarction+within+the+caudoputamen%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen.</a> Stroke. 40, 248-253 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Modyfikacje i zastępstwa
Ze względu na szczyt absorpcji przy długości fali 562 nm, do naświetlania światłoczułej róży bengalskiej wybrano pierwotnie laser światła zielonego z przefiltrowanej lampy ksenonowej. Chociaż wzbudzenie za pośrednictwem lasera było nadal stosowane niedawno5, można je zastąpić lampą o zimnym świetle, która również zapewnia wzbudzenie barwnika10,15. Światłowody ze światłem zimnym są łatwiejsze w obsłudze i tańsze niż źródła laserowe. Należy jednak zauważyć, że la...

Na początku XXI wieku, udar niedokrwienny jest wyniszczającym zaburzeniem, które stanowi drugą przyczynę długotrwałej niepełnosprawności1 i drugą przyczynę śmiertelności na całym świecie, w której udar stanowił około 5,7 miliona zgonów w 2004 roku2. Pomimo wielu wysiłków, które zostały włożone, nadal nie ma skutecznego leczenia, które poprawiłoby powrót do sprawności po udarze. Zwierzęce modele udaru mózgu są szeroko stosowane w badaniach nad udarem, ponieważ umożliwiają modelowanie patofizjologii uszkodzeń niedokrwiennych i testują skuteczność różnych strategii neuroprotekcyjnych in vivo. Większość z tych modeli ma na celu wywołanie rozległych zawałów poprzez przerwanie (tymczasowo lub na stałe) przepływu krwi w tętnicy środkowej mózgu, podczas gdy inne modele zostały opracowane do badania zmian o niewielkich rozmiarach w określonych obszarach, zwykle w korze ruchowej i somatosensorycznej. Jednak kilka czynników może przyczynić się do wygenerowania pewnego stopnia zmienności w eksperymentalnych badaniach nad udarem, w tym zastosowany szczep myszy, wiek i płeć zwierząt objętych badaniem, a przede wszystkim technika zastosowana do wywołania uszkodzenia niedokrwiennego. W odniesieniu do tego ostatniego punktu, czas trwania i inwazyjność operacji (tj. konieczność wykonania kraniotomii), a także umiejętności chirurgiczne wymagane od operatora do wiarygodnego wywołania zmiany niedokrwiennej są krytycznymi determinantami udanego i bezstronnego badania udaru mózgu in vivo. 
Koncepcja fotozakrzepicy została początkowo zaproponowana przez Rosenbluma i El-Sabbana w 1977 roku3 i stała się sławna dzięki zastosowaniu w mózgu szczura przez Watsona i in. w 1985 roku4, w której technika ta została znacznie ulepszona i stworzyła podstawy obecnego modelu3-6. Podejście fotozakrzepowe ma na celu wywołanie zawału kory mózgowej poprzez fotoaktywację światłoczułego barwnika wcześniej dostarczonego do układu krwionośnego, co powoduje miejscową zakrzepicę naczyń w miejscach narażonych na działanie światła. Kiedy krążący barwnik jest oświetlany odpowiednią długością fali przez zimne źródło światła, uwalnia energię do cząsteczek tlenu, które z kolei generują dużą ilość wysoce reaktywnych produktów tlenu singletowego. Te produkty pośrednie tlenu indukują peroksydację błony komórkowej śródbłonka, prowadząc do adhezji i agregacji płytek krwi, a ostatecznie do powstania skrzeplin, które determinują lokalne przerwanie przepływu mózgowego7.
Fotozakrzepica to niekanoniczny model niedokrwienny, który nie zamyka ani nie przerywa tylko jednej tętnicy, jak to zwykle ma miejsce w ludzkim udarze, ale wywołuje zmiany w bardziej powierzchownych naczyniach, co powoduje selektywne przerwanie przepływu krwi w miejscach narażonych na światło. Z tego powodu podejście to może być odpowiednie do komórkowych i molekularnych badań plastyczności kory mózgowej. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota wykonania. Co więcej, fotozakrzepicę można łatwo przeprowadzić w ciągu około czterdziestu minut na zwierzę, w tym dwudziestominutowego oczekiwania (3 minuty na znieczulenie; 1 minuta na golenie skóry głowy; 3 do 5 minut na umieszczenie zwierzęcia na aparacie stereotaktycznym; 2 minuty na wyszorowanie skóry głowy roztworem antyseptycznym, wykonanie nacięcia i oczyszczenie czaszki; 2 do 4 minut na umieszczenie zimnego włókna świetlnego; 1 minuta na wstrzyknięcie roztworu róży bengalskiej; 5 minut oczekiwania na dootrzewnową dyfuzja; 15 min oświetlenia; i 5 minut na oczyszczenie rany i zszycie zwierzęcia). Co więcej, do wykonania tej techniki nie jest potrzebna żadna wiedza chirurgiczna, ponieważ zmiana jest wywoływana przez proste oświetlenie nienaruszonej czaszki. W przeciwieństwie do klasycznej niedrożności tętnic, metoda ta określa selektywną okluzję mikronaczyń pialnych i śródmiąższowych w strefie napromienianej i zmniejsza zmienność między zmianami, ponieważ nie pozostaje żadne naczynie boczne, które dostarczałoby tlen w obszarze docelowym.
Pomimo swojej szczególnej natury, uszkodzenie fotozakrzepowe dzieli podstawowe mechanizmy występujące w udarze mózgu. Podobnie jak w przypadku niedrożności tętnic w udarze mózgu, agregacja płytek krwi i tworzenie się skrzepów determinują przerwanie przepływu krwi w napromienianym obszarze7. Podobnie, model ten ma również podstawowe reakcje zapalne, jak w przypadku niedrożności tętnicy środkowej mózgu8. Jednak ze względu na dobrze wyznaczone granice, strefa półcieniowa, która odpowiada obszarowi częściowo zachowanego metabolizmu, jest bardzo zmniejszona lub nie istnieje po zmianie fotozakrzepowej. Ta wyraźna granica może ułatwić badanie odpowiedzi komórkowych w niedokrwiennym lub nienaruszonym obszarze kory mózgowej. Mysi model fotozakrzepicy jest szczególnie odpowiedni do badań nad udarem mózgu u różnych zwierząt transgenicznych. Rzeczywiście, klasyczne modele nie mogą pasować do wszystkich szczepów, a długoterminowe badania na szczepie myszy C57BL/6 wykazały wysoki współczynnik śmiertelności, który może powodować błąd9.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Roztwory i chemikalia</td></tr><tr><td>Rose Bengal </td><td>Sigma, Włochy</td><td>330000</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Vet </td><td>Merial</td><td>103120022</td><td></td></tr><tr><td>Betadine </td><td>Asta Medica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiały i sprzęt chirurgiczny</td></tr><tr><td>Fluosorber Filter </td><td>Aparat Havarda</td><td>340415</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz światłowodowy 150W</td> Regulator temperatury <td>Photonic</td><td>PL3000</td><td></td></tr><tr><td>do płyty TCAT-2DF </td><td>Aparatura Havarda</td><td>727561</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd stereotaktyczny </td><td>Stoelting</td><td>51950</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop operacyjny </td><td>Takagi</td><td>OM8</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka </td><td></td><td></td><td></td>grzewcza</tr> <tr><td>Tlen i azot gazowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne Światowy</td><td>instrument</td><td></td> precyzyjny <td>Krany światłowodowe i maska są wykonywane na zamówienie </td></tr></tbody></table>

fotozakrzepowe niedokrwienie: minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmiany korowej do badań nad udarem u myszy

Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies

Model udaru fotozakrzepowego ma na celu wywołanie uszkodzenia niedokrwiennego w danym obszarze kory mózgowej za pomocą fotoaktywacji wcześniej wstrzykniętego barwnika światłoczułego. Po oświetleniu barwnik jest aktywowany i wytwarza tlen singletowy, który uszkadza składniki błon komórkowych śródbłonka, a następnie agregację płytek krwi i tworzenie skrzeplin, co ostatecznie decyduje o przerwaniu lokalnego przepływu krwi. Podejście to, początkowo zaproponowane przez Rosenbluma i El-Sabbana w 1977 roku, zostało później ulepszone przez Watsona w 1985 roku w mózgu szczura i stworzyło podstawy obecnego modelu. Również zwiększona dostępność transgenicznych linii myszy dodatkowo przyczyniła się do wzrostu zainteresowania modelem fotozakrzepicy. Krótko mówiąc, barwnik światłoczuły (Rose Bengal) jest wstrzykiwany dootrzewnowo i dostaje się do krwiobiegu. Po oświetleniu zimnym źródłem światła barwnik aktywuje się i indukuje uszkodzenie śródbłonka z aktywacją płytek krwi i zakrzepicą, co powoduje miejscowe przerwanie przepływu krwi. Źródło światła można zastosować na nienaruszonej czaszce bez konieczności kraniotomii, co pozwala na celowanie w dowolny obszar kory mózgowej w powtarzalny i nieinwazyjny sposób. Mysz jest następnie zszywana i pozwala jej się obudzić. Ocenę uszkodzeń niedokrwiennych można szybko przeprowadzić za pomocą barwienia chlorkiem trifenylotetrazolu lub fioletem krezylowym. Technika ta powoduje zawał o niewielkich rozmiarach i dobrze odgraniczonych granicach, co jest bardzo korzystne dla precyzyjnej charakterystyki komórek lub badań funkcjonalnych. Ponadto jest szczególnie przydatny do badania odpowiedzi komórkowych i molekularnych leżących u podstaw plastyczności mózgu u myszy transgenicznych.

Niniejszy protokół pozwala na wywołanie uszkodzenia kory mózgowej, które jest widoczne gołym okiem już podczas sekcji kory (Ryciny 1A-1C). Uszkodzenie fototrombotyczne rozwija się w powierzchownych i głębokich warstwach kory, w których tkanka jest wystarczająco przezroczysta, aby umożliwić fotoaktywację błękitu różowego (Rose Bengal). Pomiar zakresu zawału mózgu można przeprowadzić szybko za pomocą barwienia histologicznego chlorkiem trifenylo-tetrazolium (TTC) na świeżej tkance lub fioletem krezylowym p...

Fotozakrzepica to szybka, minimalnie inwazyjna technika wywoływania małego i dobrze zdefiniowanego zawału w obszarach zainteresowania w wysoce powtarzalny sposób. Jest szczególnie przydatny do badania odpowiedzi komórkowych i molekularnych leżących u podstaw plastyczności mózgu u myszy transgenicznych.

Fotozakrzepowe niedokrwienie: minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmiany korowej do badań nad udarem u myszy

The photothrombotic stroke model aims to induce an ischemic damage within a given cortical area by means of photo-activation of a previously injected ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie zakrzepicy naczyniowej i uszkodzenia niedokrwiennego w określonym obszarze kory mózgowej poprzez fotoaktywację wcześniej wstrzykniętego barwnika światłoczułego. Osiąga się to najpierw poprzez wykonanie nacięcia skóry w celu odsłonięcia czaszki. Następnie wewnątrzbrzusznie wstrzykuje się barwnik światłoczuły – błękit różowy (rose bengal).Pięć minut później docelowy obszar kory jest wystawiony na działanie zimnego źródła światła przez 15 minut. Rose Bengal krąży w naczyniach krwionośnych. Po naświetleniu Rose Bengal ulega aktywacji i wytwarza tlen singletowy.Uszkodzeniu ulegają elementy błon komórek śródbłonka, co z kolei prowadzi do powstania zakrzepów na całej naświetlonej powierzchni, skutkując miejscowym przerwaniem przepływu krwi w tętnicy udowej. Na koniec procedury skórę zszywa się w celu zamknięcia rany. Identyfikację obszarów niedokrwiennych można szybciej przeprowadzić za pomocą barwienia TTC lub kryształkiem fioletowym.Cześć, jestem v Abes. Cześć, nazywam się Mon Maze. Fototrombござ jest szybką i nieinwazyjną techniką indukowania powtarzalnych ognisk niedokrwiennych kory mózgu u myszy.Jest on odpowiedni dla szeregu eksperymen

photothrombotic-ischemia-minimally-invasive-reproducible

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ischemia fototrombotyczna: Minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmian korowych dla badań nad udarem u myszy

Ten film demonstruje procedurę generowania udaru fotozakrzepowego w modelu mysim poprzez laserowe oświetlenie nienaruszonej czaszki po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru fotozakrzepowego w modelu mysim: technika oświetlenia laserowego przez czaszkę myszy po podaniu barwnika światłoczułego w celu wywołania fotozakrzepicy

Różne mysie modele zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) są szeroko stosowane w eksperymentalnych badaniach mózgu. W tym miejscu demonstrujemy model przezczaszkowego stałego dystalnego MCAO, który powoduje konsekwentny zawał kory mózgowej o wielkości odpowiadającej uszkodzeniom spowodowanym przez większość udarów niedokrwiennych u ludzi.

Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Tutaj opisujemy półinwazyjną metodę mikroskopii optycznej do indukcji skrzepu fotozakrzepowego Rose Bengal w korze somatosensorycznej myszy in vivo.  Opisano techniczne aspekty procedury obrazowania, począwszy od indukcji zdarzenia fotozakrzepowego, a skończywszy na zastosowaniu i gromadzeniu danych.

Fotozakrzepica różana bengalska za pomocą konfokalnego obrazowania optycznego in vivo: model udaru pojedynczego naczynia

Fotozakrzepica jest minimalnie inwazyjną i wysoce powtarzalną procedurą wywoływania ogniskowego niedokrwienia rdzenia kręgowego i służy jako model uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy.

Ogniskowe niedokrwienie wywołane fotozakrzepicą jako model uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy

Opisujemy mysi model udaru wywołanego przez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej za pomocą szwu pokrytego silikonem. Protokół może być stosowany w celu wywołania trwałej okluzji lub tymczasowego niedokrwienia, a następnie reperfuzji.

Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Tradycyjne modele udaru fotozakrzepowego (PTS) głównie indukują gęste agregaty płytek krwi o wysokiej odporności na tkankowe leczenie aktywatorem plazminogenu (tPA)-litycznym. Tutaj zmodyfikowany mysi model PTS jest wprowadzany przez jednoczesne wstrzykiwanie trombiny i barwnika światłoczułego w celu fotoaktywacji. Model PTS wzmocniony trombiną wytwarza mieszane skrzepy płytkowo-fibrynowe i jest bardzo wrażliwy na trombolizę tPA.

Wzbogacony fibryną i wrażliwy na tPA model udaru fototrombotycznego

Tutaj opisany jest model udaru fotozakrzepowego, w którym udar jest wytwarzany przez nienaruszoną czaszkę poprzez wywołanie trwałej okluzji mikronaczyniowej za pomocą oświetlenia laserowego po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru u myszy: ogniskowe zmiany korowe spowodowane fotozakrzepicą

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia modelu dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) poprzez przezczaszkową elektrokoagulację u myszy C57BL/6J i oceny późniejszego zachowania neurologicznego i cech histopatologicznych.

Indukcja ostrego udaru niedokrwiennego u myszy przy użyciu techniki niedrożności dystalnej tętnicy środkowej

Stosując całkowicie optyczne podejście, udar niedokrwienny jest indukowany, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów Ca2+ za pomocą fluorescencyjnego biosensora w wyłaniającym się rdzeniu udaru czujnej, zachowującej się myszy.

Jednoczesna fotozakrzemia i fotometria włókien w celu wywołania i monitorowania udaru niedokrwiennego u zachowujących się myszy

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Poznaj minimalnie inwazyjną metodę fotozakrzepowego niedokrwienia kory mózgowej u myszy z wykorzystaniem barwnika Rose Bengal i aktywacji światłem. Technika ta umożliwia precyzyjne indukowanie ogniskowych zmian niedokrwiennych bez konieczności kraniektomii.

Fotozakrzepowe niedokrwienie: minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmiany korowej do badań nad udarem u myszy

Przeglądaj więcej filmów