Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie obecności cząsteczek mRNA o swoistości jednocząsteczkowej w pojedynczych komórkach drożdży. Najpierw utrwal komórki drożdży i formaldehyd za pomocą buforu zawierającego liazę. Przepuszczalność komórek, dopóki większość komórek nie będzie jasna.

Następnie inkubuj komórki perme z fluorescencyjnie znakowanymi jednoniciowymi cząsteczkami DNA, a następnie zamontuj komórki na oczyszczonym plazmowo szkiełku nakrywkowym. Ostatecznie wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej mogą szczegółowo określić obecność i lokalizację cząsteczek mRNA w pojedynczych komórkach. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ekspresja genów, mikromacierze i plamy północne, jest to, że poszczególne mRNA mogą być wizualizowane w pojedynczych komórkach.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transkrypcji. Obejmuje to ilościowe określenie liczby RNA ramienia na komórkę w populacji, które może stanowić podstawę do tworzenia modeli regulacji na poziomie promotora. Może być również używany do określania lokalizacji i okresów półtrwania transkryptów podczas cyklu komórkowego.

W komorze próżniowej do przygotowania plazmy pokrywa nasuwa się na szkiełka. Następnie umieść komorę próżniową w kuchence mikrofalowej i upewnij się, że jest szczelna. Włączyć pompę po uruchomieniu pompy.

Włącz teraz odkurzacz, włącz kuchenkę mikrofalową i zatrzymaj się pięć sekund po tym, jak plazma będzie widoczna. Następnie wyłącz próżnię, a następnie pompę. Wyciągnij komorę próżniową.

Następnie przenieś szkiełka nakrywkowe oczyszczoną stroną do góry do 12. Na dobrze ułożonych płytkach drożdże rosną do A 600 wynoszącego około 0,1 do 0,2. W minimalnej pożywce 10 mililitrów komórek wystarcza na około 10 hybrydyzacji.

Dodaj jedną dziesiątą objętość 37% formaldehydu bezpośrednio do pożywki wzrostowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Odwirować komórki w temperaturze 3000 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu B i przenieść do mikroprobówki wirówkowej.

Przemyć dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego buforu B w mikroprobówce wirówkowej. Wirować z prędkością 13 000 obr./min przez jedną minutę. Następnie dodaj jeden mililitr posiewu sfero, buforuj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Monitoruj komórki pod mikroskopem co kilka minut, aż większość komórek stanie się. Następnie umyj dwukrotnie lodowatym buforem. B. Wirowanie z niską prędkością 3 500 obr./min.

Dodaj jeden mililitr 70% etanolu resus. Delikatnie zawiesić granulkę i umieścić na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przechowywać na czas nieokreślony w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować roztwór hybrydyzacyjny, dodaj od jednego do trzech mikrolitrów sondy do 100 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego.

Następnie wirować i odwirować. Zobrazowaliśmy trzy różne geny jednocześnie za pomocą trzech różnych zestawów sond. Teraz odwirować utrwaloną próbkę drożdży i odessać z buforu do mycia.

Dodaj roztwór hybrydyzacyjny i inkubuj w ciemności, delikatnie wstrząsając przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia. Czysta pokrywa usta 150 mikrolitrami 0,01% polilizyny przez pięć minut. Następnie zaaspiruj i wysusz na powietrzu.

Szkiełka myć trzykrotnie wodą destylowaną i suszyć na powietrzu po jednym myciu jednym XSSC Resus, zawiesić komórki w 150 mikrolitrach po 0,1 mikrograma na mililitr. Świeżo przygotowaną, wilgotną plamę i podwielokrotność zawiesiny komórkowej na szkiełkach nakrywkowych poddanych działaniu polilizyny i inkubować przez 30 minut. Następnie rozmrozić przedłużone złote medium mocujące do temperatury pokojowej.

Umieść trzy mikrolitry na szkiełku. Następnie dodaj około 0,5 mililitra etanolu do szkiełka nakrywkowego. Na płytce 12-dołkowej usuń szkiełko nakrywkowe i wysusz na powietrzu, trzymając pęsetą.

Umieść szkiełko nakrywkowe stroną do dołu na podłożu montażowym i pozwól mu stwardnieć przez kilka godzin lub na noc w ciemności. Uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci i przystąp do obrazowania. Zrób Zack kilka zdjęć wokół punktu odniesienia, w którym całkowita odległość wynosi pięć mikrometrów przy rozmiarze 0,2 mikrometra.

Powtórz obrazowanie dla każdego kanału barwnika odpowiadającego każdemu zestawowi sond. Następnie postępuj zgodnie z opisem w dołączonym tekście. Aby zidentyfikować komórki za pomocą segmentacji działu wodnego, zidentyfikuj plamki za pomocą gradientu radialnego i zmierz plamki za pomocą dopasowania Gaussa.

Zazwyczaj histogramy są obliczane na podstawie obrazów ryb i wykorzystywane do określenia liczby mRNA obecnych w pojedynczych komórkach. Ważną zaletą kwantyfikacji RNA na podstawie mikroskopii jest to, że można uzyskać informacje na temat lokalizacji transkryptów. Na przykład ryba ta wykorzystuje pojedyncze sondy do identyfikacji mRNA w pojedynczych komórkach z indukowalnym allelem CCB CBF one.

Ponieważ w miejscu transkrypcji znajduje się wiele cząsteczek mRNA, łatwo jest zidentyfikować obecność i lokalizację miejsc transkrypcji w jądrze. Wykorzystanie różnych barwników do znakowania mRNA różnych genów ułatwia kwantyfikację wielu gatunków mRNA w tych samych komórkach. W tym eksperymencie komórki drożdży inkubowano w obecności czynnika alfa i sorbitolu Używając ryb z sondami Stelara, dane pokazują, że jedna komórka reaguje tylko na feromon wskazywany przez czerwone miejsce startowe FUS.

W tym samym czasie inna komórka reaguje głównie na sorbitol, gdzie miejsce startowe S TL jest oznaczone na zielono. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak znakować i wizualizować pojedyncze cząsteczki mRNA w drożdżach po opanowaniu. Tę technikę można wykonać poprawnie w ciągu dwóch dni.

Pamiętaj o odpowiednio gęstym zagęszczeniu komórek. Rozcieńczone próbki wymagają większej liczby pól do zobrazowania i przechowywania.