Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie obecności cząsteczek mRNA z rozdzielczością pojedynczych cząsteczek w pojedynczych komórkach drożdży. W pierwszej kolejności należy utrwalić komórki drożdży i formaldehyd, używając buforu zawierającego liazę. Następnie należy przeprowadzić permeabilizację komórek, aż większość z nich przestanie być widoczna w kontraście fazowym.

Następnie inkubuj permeabilizowane komórki z cząsteczkami jednoniciowego DNA znakowanymi fluorescencyjnie, a potem osadź komórki na oczyszczonym plazmowo szkiełku podstawnym. Ostatecznie wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej mogą szczegółowo wykazać obecność i lokalizację cząsteczek mRNA w pojedynczych komórkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza ekspresji genów, mikromacierze i northern blot, jest możliwość wizualizacji pojedynczych mRNA w pojedynczych komórkach.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie transkrypcji. Obejmuje to kwantyfikację liczby cząsteczek arm RNA na komórkę w populacji, co może dostarczyć danych do modeli regulacji na poziomie promotora. Może być ona również wykorzystana do określenia lokalizacji oraz okresów półtrwania transkryptów w trakcie cyklu komórkowego.

W komorze próżniowej do wstępnego oczyszczania plazmowego umieść szkiełka nakrywkowe na slajdach. Następnie włóż komorę próżniową do kuchenki mikrofalowej i upewnij się, że jest szczelna. Włącz pompę, a gdy ta zostanie uruchomiona, rozpocznij proces.

Włącz pompę próżniową, następnie uruchom kuchenkę mikrofalową i wyłącz ją pięć sekund po pojawieniu się plazmy. Następnie wyłącz system próżniowy, a potem pompę. Wysuń komorę próżniową.

Następnie przenieś szkiełka podstawowe oczyszczoną stroną do góry do płytek 12-dołkowych i hoduj drożdże do A 600 wynoszącej około 0,1 do 0,2. W pożywce minimalnej 10 mils komórek wystarcza na około 10 hybrydyzacji.

Dodaj 1/10 objętości 37% formaldehydu bezpośrednio do pożywki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Wirowarkuj komórki przy 3000 Gs przez pięć minut. Resuspenduj osad w 1 ml buforu B i przenieś do probówki do mikrocentryfugi.

Przemyć dwukrotnie jedną mililitrem lodowatego buforu B w probówce do mikrocentryfugi. Centryfugować przy 13, 000 RPM przez jedną minutę. Następnie dodać jeden mililitr buforu do wysiewu sferoidów i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.

Monitorować komórki pod mikroskopem co kilka minut, aż większość z nich stanie się czarna. Następnie przemyć dwa razy lodowatym buforem. Wirować z niską prędkością 3 500 RPM.

Dodaj 1 mL 70% etanolu. Delikatnie zresuspenduj osad i pozostaw przez noc w temperaturze 4°C lub przechowuj bezterminowo w temperaturze -20°C. Aby przygotować roztwór do hybrydyzacji, dodaj od 1 do 3 µL sondy do 100 µL buforu do hybrydyzacji.

Następnie wymieszaj w wirówce typu vortex i odwiruj. Wyobraziliśmy trzy różne geny jednocześnie, używając trzech różnych zestawów sond. Teraz odwiruj utrwaloną próbkę drożdży i odessaj bufor płuczący.

Dodać roztwór hybrydyzacyjny i inkubować w ciemności przy łagodnym wstrząsaniu przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia czyste szkiełka nakrywki potraktować 150 µl 0,01% polilizyny przez pięć minut. Następnie odessać roztwór i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.

Preparaty myje się trzykrotnie wodą destylowaną i suszy na powietrzu po jednym płukaniu w 1X SSC. Komórki zawiesza się w 150 µL świeżo przygotowanego barwnika DAPI o stężeniu 0,1 µg/mL. Alikwot zawiesiny komórkowej nanosi się na szkiełka nakrywkowe traktowane poli-L-lizyną i inkubuje przez 30 minut. Następnie medium montażowe z cząsteczkami złota rozmraża się do temperatury pokojowej.

Nanieś 3 µL na szkiełko przedmiotowe. Następnie dodaj około 0,5 mL etanolu na szkiełko nakrywkowe. W płytce 12-dołkowej zdejmij szkiełko nakrywkowe, trzymając je pęsetą, i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

Połóż szkiełko nakrywkowe stroną z komórkami do dołu na medium montażowym i pozostaw do utwardzenia przez kilka godzin lub przez noc w ciemności. Uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci i przystąp do obrazowania. Wykonaj stos zdjęć wokół punktu odniesienia, gdzie całkowita odległość wynosi 5 µm przy wielkości kroku 0,2 µm.

Powtórz obrazowanie dla każdego kanału barwnika odpowiadającego każdemu zestawowi sond. Następnie postępuj zgodnie z opisem zawartym w towarzyszącym tekście. Aby zidentyfikować komórki za pomocą segmentacji watershed, zidentyfikuj punkty przy użyciu gradientu radialnego i zmierz punkty, stosując dopasowanie Gaussa.

Zazwyczaj histogramy są obliczane na podstawie obrazów FISH i wykorzystywane do określenia liczby cząsteczek mRNA obecnych w pojedynczych komórkach. Istotną zaletą ilościowego oznaczania RNA w oparciu o mikroskopię jest możliwość uzyskania informacji o lokalizacji transkryptów. Na przykład, w tej metodzie FISH wykorzystuje się pojedyncze sondy do identyfikacji mRNA w pojedynczych komórkach z indukowalnym allelem CCB CBF one.

Ponieważ w miejscu transkrypcji obecnych jest wiele cząsteczek mRNA, łatwo jest zidentyfikować obecność i lokalizację miejsc transkrypcji w obrębie jądra komórkowego. Wykorzystanie różnych barwników do znakowania mRNA różnych genów ułatwia kwantyfikację wielu gatunków mRNA w tych samych komórkach. W tym eksperymencie komórki drożdży inkubowano w obecności czynnika alfa oraz sorbitolu. Przy użyciu sond FISH, dane pokazują jedną komórkę reagującą wyłącznie na feromon, co wskazuje czerwony pojedynczy punkt startu FUS.

Jednocześnie inna komórka reaguje głównie na sorbitol, w której miejsce startu S TL one jest znakowane na zielono. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak znakować i wizualizować pojedyncze cząsteczki mRNA w drożdżach. Po opanowaniu tej techniki można ją prawidłowo przeprowadzić w ciągu dwóch dni.

Należy pamiętać o zapewnieniu odpowiednio wysokiego zagęszczenia komórek. Próbki o niskim stężeniu wymagają obrazowania i zapisywania większej liczby pól widzenia.