Name: Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Poznaj mikroskopię korelacyjną do badania dynamicznych interakcji HIV-1 z komórkami HeLa. Ta metoda łączy fluorescencyjną mikroskopię świetlną z krio-elektronową tomografią dla analizy 3D zachowań wirusowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Travisowi Wheelerowi i warsztatowi mechanicznemu na Wydziale Biologii Komórki i Fizjologii Uniwersytetu w Pittsburghu za zbudowanie stolika na próbki kriofluorescencji, Changlu Tao i Cheng Xu z Uniwersytetu Nauki i Technologii w Chinach za pomoc techniczną, oraz dr Teresie Brosenitsch za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były wspierane przez Narodowe Instytuty Zdrowia (GM082251 i GM085043).

1. Hodowla komórek HeLa na pokrytych węglem, złotych siatkach EM Finder
<ol>
	<li>Wyładowanie jarzeniowe po stronie węglowej siatki szukacza EM R2/2 Quantifoil o oczkach 200 pod ciśnieniem 25 mA przez 25 sekund.</li>
	<li>Pokryj siatkę EM fibronektyną, unosząc ją stroną węglową do dołu na 40 μl kropli 50 μg/ml roztworu fibronektyny, a następnie zdezynfekuj ją w świetle UV przez 2 godziny w kapturze do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Umieścić komórki HeLa na siatce o gęstości 2 x 104 komórki/ml (łącznie 2 ml kultury) w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem i hodować komórki w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 , w DMEM uzupełnionym 4,5 g/l L-glutaminy i glukozą, 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu, 100 jednostek/ml penicyliny, i 100 μg/ml streptomycyny przez około 18 godzin. Komórki HeLa są zakażone po hodowli O/N.</li>
</ol>
2. Zakażenie HIV-1 i obrazowanie żywych komórek
<ol>
	<li>Dodać urządzenie do śledzenia komórek fluorescencyjnych (czerwony CMTPX, 1 μl/2 ml) do naczynia do hodowli ze szklanym dnem (od kroku 1.3) i inkubować szalkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby umożliwić pobranie barwnika fluorescencyjnego.</li>
	<li>Umyj komórki PBS i dodaj 50 μl wstępnie podgrzanej świeżej pożywki.</li>
	<li>Umieścić naczynie w komorze żywej komórki, w temperaturze 37 °C, mikroskopu ze skanerem konfokalnym w polu zamiatania. Wybierz wiele pól (10-15 pozycji), które zawierają 1-3 komórki/kwadrat, przy czym komórki znajdują się między dwiema fazami mitozy, gdy są najbardziej rozproszone i płaskie (patrz rysunki 2c i 2d), ponieważ krioEM wymaga stosunkowo cienkich obszarów próbki. Zapisz te pozycje do przyszłego obrazowania (krok 2.5).</li>
	<li>Zainfekuj komórki pseudotypowymi cząstkami HIV-1 VSV-G, które zawierają GFP-Vpr (używamy 40 μl próbki zawierającej 40 ng/ml p24). Podczas dodawania cząsteczek wirusa na dno naczynia należy uważać, aby nie naruszyć siatki EM, ponieważ pozycje do obrazowania zostały już wybrane i zapisane.</li>
	<li>Natychmiast po dodaniu wirionów zbieraj poklatkowe szybkie obrazy konfokalne 3D w wybranych wcześniej pozycjach (z kroku 2.3) przez 20-40 minut.</li>
	<li>Obrazy konfokalne uzyskano za pomocą MetaMorph i przeanalizowano za pomocą automatycznego śledzenia cząstek 3D pod kątem dynamiki pojedynczych cząstek za pomocą oprogramowania Imaris (patrz rysunek 1). Ponieważ korelujemy dynamiczne zachowanie cząstek HIV-1 o ograniczonej dyfrakcji z ultrastrukturą komórkową, obrazowanie poklatkowe żywych komórek i śledzenie cząstek 3D mają kluczowe znaczenie dla wyników. Jednak w przypadku dużej i statycznej struktury do analizy korelacyjnej wystarczyłby prosty obraz fluorescencyjny (bez żywej komórki).</li>
</ol>
3. Przygotowanie mrożonej i uwodnionej próbki EM
Aby zminimalizować opóźnienie czasowe między pobraniem ostatniego obrazu konfokalnego a kriofiksacją próbki, FEI Vitrobot (lub inne urządzenie do witryfikacji) powinno zostać zainicjowane i przygotowane do zamrażania wgłębnego podczas zbierania fluorescencyjnych obrazów konfokalnych żywych komórek.
<ol>
	<li>Włącz urządzenie do witryfikacji i ustaw jego temperaturę klimatyczną na 22 °C, wilgotność docelową na 100%, czas osuszania na 7 sekund, a czas oczekiwania i opróżniania na 1 sekundę.</li>
	<li>Umieść schowek siatkowy w tłoku Dewara i przygotuj zimny ciekły etan. Zamontuj dewara na urządzeniu do witryfikacji.</li>
	<li>Bezpośrednio po konfokalnym obrazowaniu żywych komórek (sekcja 2) należy umieścić naczynie hodowlane na chłodzonym lodem bloku miedzianym i przenieść go do pomieszczenia do przygotowywania próbek krioEM. Załaduj siatkę EM na specjalistyczną pęsetę i szybko usuń wszelkie media z siatki. Blotting odbywa się ręcznie, za pomocą bibuły filtracyjnej, po czym 4 μl roztworu złotych kulek o długości 15 nm zmieszanego z mikrosferami fluorescencyjnymi o wielkości 0,2 μm jest natychmiast umieszczane na siatce. Złote koraliki są używane jako znaczniki referencyjne wspomagające gromadzenie i wyrównywanie danych tomograficznych. Mikrosfery fluorescencyjne są wykorzystywane do wspomagania korelacji między obrazami fluorescencyjnymi i krioEM (patrz rysunki 2c-2f).</li>
	<li>Załaduj pęsetę na urządzenie do witryfikacji i poinstruuj urządzenie, aby osuszyło i zanurzyło zamrażanie w ciekłym tetanie16. Parametry blottingu zoptymalizowane pod kątem osiągnięcia najlepszego rezultatu to: czas osuszania, 7 sekund; przesunięcie kleksa, 0; czas odpływu, 1 sekunda; temperatura, 22 °C; i wilgotność, 100%.</li>
	<li>Przenieś zamrożoną uwodnioną siatkę do uchwytu krioEM w celu natychmiastowego obrazowania krioET lub do dewara do przechowywania ciekłego azotu w celu późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
4. Kriofluorescencyjna mikroskopia świetlna
Do wykonania kroków 4.1- 4.10 wymagana jest domowa komora na próbki kriofluorescencji i system etapów (Rysunek 3). Szczegółową specyfikację i opis etapu można znaleźć w Jun et al.Rozdział 15.
<ol>
	<li>Napełnij samociśnieniowy dewar ciekłym azotem ciekłym azotem co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem kriofluorescencji mikroskopii świetlnej (patrz rysunek 3a).</li>
	<li>Zamontuj domową próbkę kriofluorescencji stage15 (rysunek 3) na mikroskopie ze światłem odwróconym fluorescencyjnym, takim jak Olympus IX 71.</li>
	<li>Podłączyć wlot ciekłego azotu stolika do kriopróbki do samociśnieniowego dewara i umieścić wylot zabezpieczający przed przelaniem ciekłego azotu w odpowiednim pojemniku. Podłącz suchy przewód azotowy do tulei umieszczonej nad soczewką obiektywu, aby soczewka była ciepła i wolna od szronu.</li>
	<li>Umieść platformę z bloku miedzianego (strzałka na rysunku 3b) w komorze krioetapu, aby załadować zamrożoną siatkę na próbki. Ostudzić i napełnić miedzianą komorę krioetapu ciekłym azotem przez przewód wlotowy z samociśnieniowego napełniacza dewara.</li>
	<li>Gdy krioetap osiągnie temperaturę ciekłego azotu (w ciągu ~4-6 minut), przenieś skrzynkę magazynową sieci (z kroku 3.5) do krioetapu.</li>
	<li>Umieść zamrożoną uwodnioną siatkę próbki we wkładzie z próbką EM na bloku miedzianym i przypnij siatkę za pomocą pierścienia C (jeśli używasz wkładu mikroskopu Polara) lub umieść wstępnie schłodzony miedziany pierścień na górze (grot strzałki na rysunku 3d), aby utrzymać siatkę na miejscu, a także w celu łatwego wyjęcia siatki po obrazowaniu kriofluorescencyjnym (jeśli jest to mikroskop krioelektronowy bez Polara).</li>
	<li>Umieść wkład (od kroku 4.6) w wewnętrznej komorze kriostolika (biały grot strzałki na rysunku 3b).</li>
	<li>Wyszukaj i znajdź te same cząsteczki wirusa z danych obrazowania żywych komórek. Ponieważ siatka EM ma indeks, łatwo jest zlokalizować tę samą cząstkę na siatce zarówno na obrazach żywych komórek, jak i na obrazach krioflorescencji.</li>
	<li>Rejestruj obrazy cryo-DIC i GFP w zidentyfikowanych pozycjach w warunkach kriogenicznych za pomocą mikroskopu świetlnego z długą roboczą (2,7-4 mm) soczewką obiektywową. Podczas obrazowania kriofluorescencyjnego należy okresowo sprawdzać poziom ciekłego azotu w krioetapie i w razie potrzeby uzupełniać go, aby utrzymać stolik próbki poniżej -170 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania kriofluorescencyjnego ostrożnie umieść wkład z próbką na platformie z blokiem miedzianym i przechowuj wkład w ciekłym azocie Dewara do przyszłej analizy krioET za pomocą systemu Polara. Jeśli używasz mikroskopu krioelektronowego bez Polara, zdejmij miedziany pierścień, wyjmij siatkę próbki, umieść ją w pudełku do przechowywania siatki i przechowuj próbkę w ciekłym azocie Dewara, dopóki próbka nie zostanie zbadana przez krioET.</li>
	<li>W celu analizy danych należy nałożyć na siebie uzyskane obrazy cryo-DIC i GFP (z kroku 4.9, patrz rysunek 4b) i skorelować pozycje sygnałów GFP w obrazie kriofluorescencji z tymi uzyskanymi w serii obrazowania żywych komórek.</li>
</ol>
5. Tomografia krioelektronowa
<ol>
	<li>Załaduj wkład z próbką do stacji kriotransferowej mikroskopu elektronowego wyposażonego w pistolet do emisji w terenie, takiego jak mikroskop Polara G2.</li>
	<li>W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce przy powiększeniu 140X zidentyfikuj i zapisz skojarzone kwadraty siatki (z kroku 4.11) w pliku stołu montażowego.</li>
	<li>W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce przy powiększeniu 3500X włóż aperturę obiektywu 100 μm, wyszukaj i zapisz wszystkie pozycje skorelowane z sygnałami GFP w pliku drugiego stopnia.</li>
	<li>W trybie ekspozycji na niską dawkę znajdź pusty obszar, aby dostosować intensywność wiązki do dawki 1 lub 2 e-/2 i udoskonalić oś nachylenia, korzystając z funkcji etapu y, wypalając lód w nieistotnym obszarze węgla za pomocą kilku złotych kulek.</li>
	<li>W trybie ustawiania ostrości o niskiej dawce ustaw odległość ostrości na ~3 μm i wyreguluj kąt, aby wyrównać kierunek ostrości tak, aby był równoległy do osi pochylenia.</li>
	<li>W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce przywołaj zapisane pozycje (z kroku 5.3), dostosuj wysokość eucentryczną próbki i sprawdź zakres nachylenia dla obszaru zainteresowania. Uzyskaj obraz projekcyjny z bardzo niską dawką elektronów (~1 e-/Å2) przy rozogniskowaniu od 8 do 10 μm, w trybie ekspozycji, aby potwierdzić skorelowane cząstki wirusa do tomografii krioelektronowej.</li>
	<li>Przełącz się na tryb ostrości przy niskiej dawce. W menu funkcji automatycznych TEM należy poprzedzić automatyczne funkcje wysokości eucentrycznej i ostrości na obszarze ostrości.</li>
	<li>Skonfiguruj parametry uzyskiwania serii pochylenia. Na rysunku 4 w tym artykule zastosowano kąty nachylenia w zakresie ±70°, poniżej i powyżej 45°, odpowiednio w krokach co 3° i 2°, z rozogniskowaniem 6 μm i około 70 μm dawki całkowitej.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.7 i 5.8 dla wszystkich zapisanych pozycji. Oprogramowanie do tomografii wsadowej może być używane do automatycznego gromadzenia danych w wielu pozycjach w celu zwiększenia przepustowości.</li>
</ol>
6. Rekonstrukcja trójwymiarowa za pomocą IMOD17
<ol>
	<li>Sprawdź serię pochylenia RAW w celu dostosowania minimalnych i maksymalnych wartości gęstości oraz określenia, czy istnieje widok, który należy wykluczyć z powodu dużego przesunięcia obrazu.</li>
	<li>Uruchom eTomo i skonfiguruj panel tomogramu, używając typu osi, rozmiaru piksela, średnicy odniesienia itp. Następnie utwórz skrypty com.</li>
	<li>Skonfiguruj okno główne w taki sposób, aby można było jednocześnie dostosować/śledzić kilka etapów obliczeń tomogramu. Zmodyfikuj niezbędne parametry i wykonaj określone programy, które są wymagane na każdym etapie przetwarzania (patrz samouczek eTomo, <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a>).</li>
	<li>Na ostatnim etapie utwórz w pełni wyrównany stos (ze średnim błędem resztkowym mniejszym niż 0,6) i zrekonstruuj tomogramy za pomocą algorytmu ważonej projekcji wstecznej w IMOD.</li>
	<li>Odszumianie potencjalnych obszarów zainteresowania za pomocą nieliniowego anizotropowego programu wzmacniającego krawędzie dyfuzji 3D zaimplementowanego w IMOD z odpowiednimi parametrami w celu zwiększenia kontrastu i klarowności.</li>
</ol>

<ol><li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cells+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li>
<li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li>
<li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li>
<li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015(2008).</li>
<li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li>
<li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84(2009).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li>
<li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li>
<li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li>
<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li>
<li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li>
<li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li>
<li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li>
<li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Przedstawiliśmy prosty zestaw protokołów, aby zapewnić zaawansowane podejście korelacyjne do analizy dynamicznych zdarzeń komórkowych przy użyciu poklatkowego, konfokalnego, fluorescencyjnego obrazowania fluorescencji żywych komórek, a następnie cryoET. Nasz rozwój metodologiczny w celu skorelowania obrazowania 3D żywych komórek z krioET o wysokiej rozdzielczości ma kluczowe znaczenie dla zbadania wielu trudnych problemów biologicznych, takich jak wizualizacja rzadkich, dynamicznych (nie statycznych, jak wcześniej zgłasz...

Tomografia krioelektronowa (cryoET) to potężna technika obrazowania, która umożliwia trójwymiarową (3D) wizualizację komórek i tkanek oraz zapewnia wgląd w organizację natywnych organelli i struktur komórkowych w rozdzielczości molekularnej w stanie zbliżonym do fizjologicznego1. Jednak z natury niski kontrast niebarwionej zamrożonej i uwodnionej próbki, w połączeniu z ich czułością na promieniowanie, utrudnia zlokalizowanie obszarów zainteresowania wewnątrz komórki, a następnie pomyślne wykonanie serii przechyłu bez uszkodzenia obszaru docelowego. Aby przezwyciężyć te problemy, konieczne jest podejście korelacyjne, które łączy mikroskopię świetlną i elektronową. Specyficzne cechy uwydatnione przez znakowanie fluorescencyjne są identyfikowane i lokalizowane za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu świetlnego, a następnie ich współrzędne są przenoszone do mikroskopu elektronowego w celu uzyskania danych strukturalnych 3D o wysokiej rozdzielczości. Ta metoda korelacyjna pomaga zlokalizować docelowe obszary zainteresowania, którymi należy się zająć. Ze względu na ograniczenie grubości próbki za pomocą cryoEM (<300 nm), obecnie tylko peryferyjne obszary ogniwa nadają się do analizy strukturalnej 3D za pomocą CryoET. Dalsze zmniejszenie grubości próbek uwodnionych w wyniku zamrożonego cięcia przez sekcjonowanie ciała szklistego8 lub mielenie wiązką jonów w skupieniu kriogenicznym (FIB)9 rozszerzyłoby możliwości obrazowania korelacyjnego.
Poprzednio, metody korelacyjne były głównie używane do ułatwienia pozyskiwania danych cryoET dla dużych i statycznych struktur10-13. W tych badaniach zaimplementowano krioetapy, które akceptują siatki krioelektromagnetyczne i pasują do mikroskopu pionowego lub odwróconego10,11,14. Chociaż przełączanie sieci wydaje się dość proste w swoich projektach, w przypadku sieci EM występują dodatkowe etapy przesyłania, co zwiększa prawdopodobieństwo, że sieć może zostać zdeformowana, uszkodzona i zanieczyszczona. Niedawno zademonstrowaliśmy postęp techniczny w mikroskopii korelacyjnej, który pozwala nam bezpośrednio wizualizować dynamiczne zdarzenia, które są z natury trudne do uchwycenia, takie jak interakcje HIV-1 i komórek gospodarza we wczesnych stadiach infekcji15. Osiągnęliśmy to, projektując i wdrażając stolik na próbki do mikroskopii krioświetlnej, który dostosowuje system wkładów w celu zminimalizowania uszkodzeń próbki spowodowanych obsługą siatki, ułatwiając w ten sposób korelację. Nasza konstrukcja obejmuje zintegrowany uchwyt na wkłady z próbkami, co pozwala na sekwencyjne wykonywanie zarówno mikroskopii krioświetlnej, jak i krioelektronowej na tym samym uchwycie próbki, bez przenoszenia próbki, co usprawnia proces korelacji. Ponadto wdrożyliśmy również dokładną i wiarygodną procedurę korelacji przy użyciu fluorescencyjnych kulek lateksowych jako znaczników odniesienia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L glukozy z L-glutaminą</td><td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>F1141-1MG</td><td>Hodowla komórek HeLa na siatkach EM</td></tr><tr><td>Cell tracker</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>C34552</td><td>Czerwone CMTPX</td></tr><tr><td>Białko A koniugaty</td> <td>złotaTed Pella, Inc., Redding, CA</td><td>15822-1</td><td>15 nm średnica</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Mikrosfery fluorescencyjne</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>F8811</td><td>Żółto-zielona fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca cielęca</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Złoty wyszukiwarka quantifoil siatki EM</td><td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Niemcy</td><td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Urządzenie do rozrzezzenia 100X</td><td>EMS, Hatfield, mikroskop</td> elektronowy PA <td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Polara G2 z pistoletem do emisji pola</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus IX 71</td><td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td><td></td><td>LUCPlanFLN 40X/0,6 NA (odległość robocza 2,7-4 mm)</td></tr><tr><td>obiektyw Mikroskop Nikon TiE</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY</td><td></td><td>przy użyciu soczewki obiektywowej olejowej 60X/1,35 NA</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Sweptfield</td><td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tokai Hit komora na żywo Tokio</td><td>, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etap próbki kriofluorescencji</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Zbudowany w domu przez warsztat mechaniczny, patrz odniesienie 15 dla projektu.</td></tr></tbody></table>

mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3d oddziaływań dynamicznych

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Krioelektronowa tomografia (cryoET) umożliwia wizualizację 3D struktur komórkowych w rozdzielczości molekularnej w stanie zbliżonym do fizjologicznego1. Jednak bezpośrednia wizualizacja poszczególnych kompleksów wirusowych w środowisku komórkowym gospodarza za pomocą cryoET jest wyzwaniem2 ze względu na rzadki i dynamiczny charakter wnikania wirusa, szczególnie w przypadku HIV-1. Podczas gdy obrazowanie poklatkowe żywych komórek dostarczyło wielu informacji na temat wielu aspektów cyklu życia HIV-13-7, rozdzielczość zapewniana przez mikroskopię żywych komórek jest ograniczona (~ 200 nm). Nasze prace miały na celu opracowanie metody korelacji, która pozwala na bezpośrednią wizualizację wczesnych zdarzeń zakażenia HIV-1 poprzez połączenie mikroskopii świetlnej fluorescencyjnej żywych komórek, mikroskopii kriofluorescencyjnej i krioET. W ten sposób sygnały z żywych komórek i kriofluorescencji mogą być wykorzystywane do dokładnego kierowania próbkowaniem w cryoET. Co więcej, informacje strukturalne uzyskane z cryoET mogą być uzupełnione dynamicznymi danymi funkcjonalnymi uzyskanymi dzięki obrazowaniu żywych komórek celu znakowanego fluorescencyjnie.
W tym artykule wideo przedstawiamy szczegółowe metody i protokoły do badań strukturalnych HIV-1 i interakcji między komórkami gospodarza za pomocą korelacyjnego 3D szybkiego obrazowania żywych komórek i analizy strukturalnej krioET o wysokiej rozdzielczości. Komórki HeLa zakażone cząstkami HIV-1 scharakteryzowano najpierw za pomocą konfokalnej mikroskopii żywych komórek, a następnie region zawierający tę samą cząstkę wirusa przeanalizowano za pomocą tomografii krioelektronowej pod kątem szczegółów strukturalnych 3D. Korelacja między dwoma zestawami danych obrazowych, obrazowaniem optycznym i obrazowaniem elektronowym, została osiągnięta przy użyciu zbudowanego w domu stopnia mikroskopii kriofluorescencyjnej. Opisane tutaj podejście będzie cenne nie tylko dla badania interakcji między komórkami wirusa-gospodarza, ale także dla szerszych zastosowań w biologii komórki, takich jak sygnalizacja komórkowa, transport receptorów błonowych i wiele innych dynamicznych procesów komórkowych.

Aby scharakteryzować dynamiczne zachowanie cząsteczek wirusa, zainfekowane HIV-1 komórki HeLa obrazowano za pomocą szybkomiejsceowej konfokalnej mikroskopii żywych komórek, a ruchy cząsteczek analizowano automatycznym śledzeniem cząsteczek w 3D (Rycina 1). Aby uniknąć kilkuminutowego odstępu czasu, który może wystąpić między pozyskaniem ostatniego konfokalnego obrazu żywej komórki a mrożeniem szokowym (co może być wystarczająco długim okresem, by utracić skorelowane cząsteczki HIV-1), zaprojektowano i zb...

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie zastosowania metody korelacyjnej fluorescencyjnej i krioelektronowej mikroskopii poprzez obrazowanie dynamicznych małych cząsteczek HIV-1 wchodzących w interakcje z komórkami HeLa gospodarza. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez uprzednie wysianie i hodowlę komórek HeLa na złotej siatce EM w naczyniu hodowlanym z szklanym dnem oraz zainfekowanie komórek HeLa cząsteczkami HIV-1 znakowanymi GFP. Drugim krokiem jest wykonanie wysokofrekwencyjnych trójwymiarowych obrazów konfokalnych żywych komórek zainfekowanych HIV-1 w trybie time-lapse oraz analiza tych obrazów za pomocą zautomatyzowanego śledzenia cząsteczek 3D w celu badania dynamiki pojedynczych cząsteczek po witryfikacji.Próbka, zawierająca te same cząstki wirusowe co w danych z obrazowania żywych komórek, zostaje umieszczona na obrazach kriofluorescencyjnych w celu dalszej analizy wysokorozdzielczej trójwymiarowej kriotomografii elektronowej. Ostatnim krokiem jest zebranie serii projekcji cryo EM pod różnymi kątami dla wszystkich zidentyfikowanych pozycji zawierających cząstki HIV-1 oraz rekonstrukcja tomogramów 3D za pomocą algorytmu ważonej projekcji wstecznej przy użyciu oprogramowania imad. W końcowym etapie zaawansowana korelacyjna mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek 3D oraz wysokorozdzielcza kriotomografia elektronowa są wykorzystywane do bezpośredniej wizualizacji dynamicznych cząstek wirusowych ograniczonych dyfrakcyjnie oraz ich oddziaływań z komórkami gospodarza.Nasza praca ma na celu opracowanie metody korelacyjnej, która umożliwia bezpośrednią wizualizację wyłącznie zdarzeń związanych z infekcją HIV-1. Poprzez połączenie mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek, krio-mikroskopii fluorescencyjnej oraz krio-tomografii elektronowej w ten sposób, sygnały fluorescencyjne z żywych komórek i próbek kriogenicznych mogą służyć jako precyzyjny przewodnik podczas próbkowania w krio-tomografii elektronowej. Ponadto informacje strukturalne uzyskane z krio-tomografii elektronowej mogą zostać uzupełnione o dynamiczne dane funkcjonalne dostępne dzięki obrazowaniu na żywo celów znakowanych fluorescencyjnie. Główną zaletą tej techniki lub istniejącej metody jest zastosowanie zaawansowanego, korelacyjnego, szybkiego obrazowania 3D na żywo wraz z wysokorozdzielczą krio-tomografią elektronową 3D do badania zdarzeń dynamicznych, które z natury są trudne do uchwycenia, takich jak interakcje HIV typu 1 z komórką gospodarza we wczesnym stadium infekcji.Aby przygotować siatkę do hodowli komórkowej, poddaj węglową stronę siatki Quantifoil R 2/2 o oczkowaniu 200 z EM finderem złoconym procesowi wyładowań żarowych przy natężeniu poniżej 25 mA przez 25 s. Pokryj siatkę EM fibronektyną, kładąc ją stroną węglową w dół na kropelce 40 µL roztworu fibronektyny o stężeniu 50 µg/mL. Pozostaw siatkę w komorze do hodowli tkanek pod światłem UV na dwie godziny w celu dezynfekcji, a następnie wysiej komórki HeLa na siatkę w gęstości 2 × 10⁴ komórek/mL w naczyniu hodowlanym z szklanym dnem.W medium DMEM z odpowiednimi suplementami inkubować komórki w temperaturze 37°C przy 5% dwutlenku węgla przez około 18 godzin przed zakażeniem HIV-1. Przed zakażeniem HIV do komórek HeLa w naczyniu hodowlanym z szklanym dnem dodać fluorescencyjny tracker komórkowy i inkubować naczynie w temperaturze 37°C przez 10 minut, aby umożliwić pobranie barwnika fluorescencyjnego. Przemyć komórki PBS i dodać 50 µL podgrzanego świeżego medium. Umieścić naczynie w komorze do żywych komórek w temperaturze 37°C mikroskopu konfokalnego z systemem skanowania typu swept-field. Ponieważ krio-EM wymaga stosunkowo cienkich obszarów próbki.Wybierz kilka pól zawierających od jednej do trzech komórek na kwadrat, w których komórki znajdują się pomiędzy dwiema fazami mitozy, gdy są najbardziej rozciągnięte i płaskie; zapisz te pozycje za pomocą oprogramowania NIS Elements w celu późniejszego obrazowania. Następnie zainfekuj komórki pseudotypowanymi białkiem VSVG cząsteczkami HIV-1 zawierającymi GFP-VPR, wprowadzając cząsteczki wirusa do dolnej studzienki naczynia, uważając, aby nie naruszyć siatki EM. Ponieważ pozycje do obrazowania zostały wcześniej wybrane i zapisane, niezwłocznie po dodaniu wirusów wykonaj serię szybkich obrazów konfokalnych 3D w trybie time-lapse w wybranych wcześniej pozycjach przez okres od 20 do 40 minut.Bezpośrednio po obrazowaniu żywych komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego, należy umieścić naczynie hodowlane na miedzianym bloku chłodzonym lodem i przenieść je do pomieszczenia przygotowania próbek do krio-EM. Załaduj siatkę EM do specjalistycznej pęsety, szybko odsącz pozostałości pożywki hodowlanej za pomocą papieru filtracyjnego, a następnie natychmiast nanieś na siatkę kilka mikrolitrów roztworu kulek złota o średnicy 15 nm zmieszanego z fluorescencyjnymi mikrosferami o średnicy 0,2 µm. Fluorescencyjne mikrosfery służą do ułatwienia korelacji między obrazowaniem fluorescencyjnym a krio-EM.Załaduj pęsetę do urządzenia do witryfikacji w celu szybkiego mrożenia, stosując zoptymalizowane parametry osuszania w celu uzyskania najlepszych rezultatów. Aby rozpocząć procedurę krio fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej, podłącz linię suchego azotu do osłony umieszczonej nad obiektywem, aby utrzymać soczewkę w cieple i zapobiec osadzaniu się szronu; zamontuj własnej konstrukcji krio fluorescencyjny stół preparatowy na odwróconym fluorescencyjnym mikroskopie świetlnym. Podłącz wlot ciekłego azotu w krio stole do samociśnieniowego dozownika i umieść wylot zabezpieczenia przed przepełnieniem ciekłego azotu w odpowiednim pojemniku.Umieść zamrożoną siatkę z uwodnioną próbką w kasecie do preparatów EM na miedzianym bloku, a następnie nałóż wcześniej schłodzony pierścień C-clip, aby utrzymać siatkę na miejscu. Umieść kasetę w komorze wewnętrznej etapu kriogenicznego i odszukaj te same cząstki wirusów, które zidentyfikowano w danych z obrazowania żywych komórek. Ponieważ siatka EM posiada indeks, lokalizacja tej samej cząstki na siatce zarówno w obrazach żywych komórek, jak i w obrazach krio-fluorescencyjnych jest prosta.Należy wykonać obrazy DIC i fluorescencyjne w warunkach kriogenicznych w wyznaczonych pozycjach, używając mikroskopu świetlnego z obiektywem o długiej odległości roboczej. Podczas obrazowania fluorescencyjnego w niskiej temperaturze należy okresowo sprawdzać poziom ciekłego azotu w stoliku kriogenicznym i w razie potrzeby uzupełniać go za pomocą dozownika z nadciśnieniem, aby utrzymać temperaturę stolika z próbką poniżej -170 °C na potrzeby krioelektronowej tomografii. Siatkę z próbką należy wprowadzić do stacji transferu kriogenicznego mikroskopu elektronowego wyposażonego w działo emisyjne polowego w trybie poszukiwania przy niskiej dawce przy powiększeniu 140 x.Zidentyfikuj obszary lub pola siatki, z których pozyskano obrazy kriofluorescencyjne. Wykonaj obraz cryo EM o niskim powiększeniu dla skorelowanego obszaru i zapisz jego pozycję w pliku sprzętowym w trybie wyszukiwania z niską dawką przy powiększeniu 3 500 x. Wstaw przysłonę obiektywu o średnicy 100 micron i zapisz wszystkie pozycje skorelowane z sygnałami GFP w drugim pliku sprzętowym.Skonfiguruj parametry tomografii do pozyskania serii pochyleń, w tym zakres kąta pochylenia, dawkę elektronów, wartość defokusu oraz schematy pochylenia. Aby rozpocząć tę procedurę, wykonaj serię pochyleń dla wszystkich zapisanych pozycji. Skonfiguruj główne okno w taki sposób, aby kilka etapów obliczeń Tomo Graham mogło być dostosowywanych lub śledzonych jednocześnie; zmień niezbędne parametry i uruchom konkretne programy wymagane dla każdego kroku przetwarzania.W końcowym etapie należy utworzyć pełny wyrównany stos z głównym błędem resztkowym mniejszym niż 0,6 i zrekonstruować TOMy za pomocą algorytmu ważonej projekcji wstecznej. W trybie obrazowania Im w celu charakterystyki dynamicznego zachowania cząsteczek wirusa, wykonano obrazowanie komórek HeLa zainfekowanych HIV-1 za pomocą szybkomiernej konfokalnej mikroskopii żywych komórek, a ruchy cząsteczek przeanalizowano za pomocą zautomatyzowanego śledzenia cząsteczek 3D.Na tej reprezentatywnej rycinie śledzono w 3D stosach konfokalnych pojedynczą zieloną fluorescencyjną cząstkę wirusa, wskazaną żółtą grotą strzałki, z trzy minutowym odstępem czasu między klatkami, aby uniknąć kilkuminutowej przerwy czasowej. Może ona wystąpić pomiędzy pozyskaniem ostatniego konfokalnego obrazu żywej komórki a zamrażaniem w ciekłym etanie (plunge freezing). Zaprojektowano i zbudowano stoły do kriofluorescencyjnej mikroskopii świetlnej, przeznaczone do obrazowania zamrożonych uwodnionych próbek w kasetach do kriomikroskopii elektronowej (cryo EM).Na mikroskopach świetlnych panel A przedstawia samociśnieniowy zbiornik wypełniony ciekłym azotem, który służy do chłodzenia miedzianego stolika próbek cryos. Panel B pokazuje widok z góry do wnętrza stolika próbek cryos, gdzie biała strzałka wskazuje komorę wewnętrzną. Siatka z próbką jest umieszczana w kasecie na preparaty E EM, która znajduje się w centrum platformy z bloku miedzi wskazanej czarną strzałką.Platformę tę dodano do użytku z niepolarnymi mikroskopami elektronowymi. Po załadowaniu siatki z próbką, wkłady przeniesiono do komory wewnętrznej w celu przeprowadzenia kriofluorescencji. Panele mikroskopowe C i D przedstawiają odpowiednio wkład z próbką przed i po umieszczeniu miedzianego pierścienia, który stabilizuje siatkę podczas pracy z niepolarnym kriomikroskopem elektronowym.Użyteczność procedury zaawansowanej korelatywnej mikroskopii żywych komórek i kriotomografii elektronowej wykazano poprzez bezpośrednią wizualizację fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek HIV V1 oddziałujących z komórką gospodarza HeLa. Obraz DIC zarejestrowany za pomocą kriomikroskopu świetlnego, przedstawiony na panelu A, został nałożony na obraz kriofluorescencyjny cząsteczek znakowanych GFP, przedstawiony na panelu B. Znakowane cząsteczki są zaznaczone kolorem czerwonym. Panele C, D i E to obrazy z kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) wykonane przy niskiej dawce dla obszaru zawierającego cząsteczkę fluorescencyjną zakreśloną okręgiem na panelach B i C, odpowiednio przy powiększeniach 140x, 3 500x i 27 500x.Wstawka na panelu E stanowi powiększony widok zarejestrowany po pozyskaniu tomograficznych serii nachyleń; panele F, G i H przedstawiają trzy tomograficzne przekroje o grubości 4 nm, oddzielone od siebie odległością 21 nm w kierunku Z. Połączenia między cząsteczką a błoną komórkową są wskazane strzałkami zarówno na obrazie projekcyjnym we wstawce i panelu E, jak i na przekrojach tomograficznych. Na panelach F i G.Przedstawiliśmy prosty zestaw protokołów zapewniających zaawansowane podejście korelacyjne do analizy dynamicznych interakcji wirusów z komórkami w warunkach sterylnych, z wykorzystaniem obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym za pomocą konfokalnego mikroskopu lipo cell, a następnie kriotomografii elektronowej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że precyzyjna i niezawodna korelacja między obrazem fluorescencyjnym a obrazem z mikroskopii elektronowej jest kluczowa dla pomyślnego przeprowadzenia kriotomografii elektronowej. Dane uzyskane dzięki opisanej procedurze będą przydatne w wielu zastosowaniach dotyczących dynamicznych procesów komórkowych w biologii komórki, takich jak sygnalizacja komórkowa czy internalizacja receptorów powierzchniowych.

correlative-microscopy-for-3d-structural-analysis-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskopia korelacyjna do 3D analizy strukturalnej dynamicznych interakcji

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Tutaj wprowadzamy metodę, cocem3D, która pozwala na odkrycie ultrastruktury konkretnej komórki w jej natywnej tkance poprzez połączenie konfokalnej i seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna, konfokalna i trójwymiarowa mikroskopia elektronowa określonej komórki czuciowej

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Obecny protokół opisuje metodę wizualizacji i pomiaru pierścieni aktynowych i innych składników okresowego szkieletu błony początkowego segmentu aksonu przy użyciu hodowanych neuronów hipokampa szczura i mikroskopii iluminacyjnej o strukturze 3D (3D-SIM).

Pomiar właściwości okresowego szkieletu błonowego początkowego segmentu aksonu przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (3D-SIM)

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Dynamiczna mikroskopia różnicowa (DDM) łączy w sobie cechy dynamicznego rozpraszania światła i mikroskopii. W tym artykule przedstawiono proces wykorzystania DDM do scharakteryzowania odtworzonych sieci cytoszkieletów poprzez ilościowe określenie subdyfuzyjnej i zamkniętej w klatce dynamiki cząstek w sieciach wimentynowych oraz ruchu balistycznego aktywnych kompozytów aktynowo-mikrotubulowych napędzanych miozyną.

Kwantyfikacja dynamiki cytoszkieletu za pomocą dynamicznej mikroskopii różnicowej

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak zbudować jednoobiektywowy, światło-arkuszowy mikroskop fluorescencyjny i jego zastosowanie do wizualizacji sieci cytoszkieletów.

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

Poznaj mikroskopię korelacyjną do badania dynamicznych interakcji HIV-1 z komórkami HeLa. Ta metoda łączy fluorescencyjną mikroskopię świetlną z krio-elektronową tomografią dla analizy 3D zachowań wirusowych w czasie rzeczywistym.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Przeglądaj więcej filmów