Name: Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Poznaj mikroskopię korelacyjną do badania dynamicznych interakcji HIV-1 z komórkami HeLa. Ta metoda łączy fluorescencyjną mikroskopię świetlną z krio-elektronową tomografią dla analizy 3D zachowań wirusowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Travisowi Wheelerowi i warsztatowi mechanicznemu na Wydziale Biologii Komórki i Fizjologii Uniwersytetu w Pittsburghu za zbudowanie stolika na próbki kriofluorescencji, Changlu Tao i Cheng Xu z Uniwersytetu Nauki i Technologii w Chinach za pomoc techniczną, oraz dr Teresie Brosenitsch za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były wspierane przez Narodowe Instytuty Zdrowia (GM082251 i GM085043).

1. Hodowla komórek HeLa na pokrytych węglem, złotych siatkach EM Finder
<ol>
	<li>Wyładowanie jarzeniowe po stronie węglowej siatki szukacza EM R2/2 Quantifoil o oczkach 200 pod ciśnieniem 25 mA przez 25 sekund.</li>
	<li>Pokryj siatkę EM fibronektyną, unosząc ją stroną węglową do dołu na 40 μl kropli 50 μg/ml roztworu fibronektyny, a następnie zdezynfekuj ją w świetle UV przez 2 godziny w kapturze do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Umieścić komórki HeLa na siatce o gęstości 2 x 104 komórki/ml (łącznie 2 ml kultury) w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem i hodować komórki w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 , w DMEM uzupełnionym 4,5 g/l L-glutaminy i glukozą, 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu, 100 jednostek/ml penicyliny, i 100 μg/ml streptomycyny przez około 18 godzin. Komórki HeLa są zakażone po hodowli O/N.</li>
</ol>
2. Zakażenie HIV-1 i obrazowanie żywych komórek
<ol>
	<li>Dodać urządzenie do śledzenia komórek fluorescencyjnych (czerwony CMTPX, 1 μl/2 ml) do naczynia do hodowli ze szklanym dnem (od kroku 1.3) i inkubować szalkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby umożliwić pobranie barwnika fluorescencyjnego.</li>
	<li>Umyj komórki PBS i dodaj 50 μl wstępnie podgrzanej świeżej pożywki.</li>
	<li>Umieścić naczynie w komorze żywej komórki, w temperaturze 37 °C, mikroskopu ze skanerem konfokalnym w polu zamiatania. Wybierz wiele pól (10-15 pozycji), które zawierają 1-3 komórki/kwadrat, przy czym komórki znajdują się między dwiema fazami mitozy, gdy są najbardziej rozproszone i płaskie (patrz rysunki 2c i 2d), ponieważ krioEM wymaga stosunkowo cienkich obszarów próbki. Zapisz te pozycje do przyszłego obrazowania (krok 2.5).</li>
	<li>Zainfekuj komórki pseudotypowymi cząstkami HIV-1 VSV-G, które zawierają GFP-Vpr (używamy 40 μl próbki zawierającej 40 ng/ml p24). Podczas dodawania cząsteczek wirusa na dno naczynia należy uważać, aby nie naruszyć siatki EM, ponieważ pozycje do obrazowania zostały już wybrane i zapisane.</li>
	<li>Natychmiast po dodaniu wirionów zbieraj poklatkowe szybkie obrazy konfokalne 3D w wybranych wcześniej pozycjach (z kroku 2.3) przez 20-40 minut.</li>
	<li>Obrazy konfokalne uzyskano za pomocą MetaMorph i przeanalizowano za pomocą automatycznego śledzenia cząstek 3D pod kątem dynamiki pojedynczych cząstek za pomocą oprogramowania Imaris (patrz rysunek 1). Ponieważ korelujemy dynamiczne zachowanie cząstek HIV-1 o ograniczonej dyfrakcji z ultrastrukturą komórkową, obrazowanie poklatkowe żywych komórek i śledzenie cząstek 3D mają kluczowe znaczenie dla wyników. Jednak w przypadku dużej i statycznej struktury do analizy korelacyjnej wystarczyłby prosty obraz fluorescencyjny (bez żywej komórki).</li>
</ol>
3. Przygotowanie mrożonej i uwodnionej próbki EM
Aby zminimalizować opóźnienie czasowe między pobraniem ostatniego obrazu konfokalnego a kriofiksacją próbki, FEI Vitrobot (lub inne urządzenie do witryfikacji) powinno zostać zainicjowane i przygotowane do zamrażania wgłębnego podczas zbierania fluorescencyjnych obrazów konfokalnych żywych komórek.
<ol>
	<li>Włącz urządzenie do witryfikacji i ustaw jego temperaturę klimatyczną na 22 °C, wilgotność docelową na 100%, czas osuszania na 7 sekund, a czas oczekiwania i opróżniania na 1 sekundę.</li>
	<li>Umieść schowek siatkowy w tłoku Dewara i przygotuj zimny ciekły etan. Zamontuj dewara na urządzeniu do witryfikacji.</li>
	<li>Bezpośrednio po konfokalnym obrazowaniu żywych komórek (sekcja 2) należy umieścić naczynie hodowlane na chłodzonym lodem bloku miedzianym i przenieść go do pomieszczenia do przygotowywania próbek krioEM. Załaduj siatkę EM na specjalistyczną pęsetę i szybko usuń wszelkie media z siatki. Blotting odbywa się ręcznie, za pomocą bibuły filtracyjnej, po czym 4 μl roztworu złotych kulek o długości 15 nm zmieszanego z mikrosferami fluorescencyjnymi o wielkości 0,2 μm jest natychmiast umieszczane na siatce. Złote koraliki są używane jako znaczniki referencyjne wspomagające gromadzenie i wyrównywanie danych tomograficznych. Mikrosfery fluorescencyjne są wykorzystywane do wspomagania korelacji między obrazami fluorescencyjnymi i krioEM (patrz rysunki 2c-2f).</li>
	<li>Załaduj pęsetę na urządzenie do witryfikacji i poinstruuj urządzenie, aby osuszyło i zanurzyło zamrażanie w ciekłym tetanie16. Parametry blottingu zoptymalizowane pod kątem osiągnięcia najlepszego rezultatu to: czas osuszania, 7 sekund; przesunięcie kleksa, 0; czas odpływu, 1 sekunda; temperatura, 22 °C; i wilgotność, 100%.</li>
	<li>Przenieś zamrożoną uwodnioną siatkę do uchwytu krioEM w celu natychmiastowego obrazowania krioET lub do dewara do przechowywania ciekłego azotu w celu późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
4. Kriofluorescencyjna mikroskopia świetlna
Do wykonania kroków 4.1- 4.10 wymagana jest domowa komora na próbki kriofluorescencji i system etapów (Rysunek 3). Szczegółową specyfikację i opis etapu można znaleźć w Jun et al.Rozdział 15.
<ol>
	<li>Napełnij samociśnieniowy dewar ciekłym azotem ciekłym azotem co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem kriofluorescencji mikroskopii świetlnej (patrz rysunek 3a).</li>
	<li>Zamontuj domową próbkę kriofluorescencji stage15 (rysunek 3) na mikroskopie ze światłem odwróconym fluorescencyjnym, takim jak Olympus IX 71.</li>
	<li>Podłączyć wlot ciekłego azotu stolika do kriopróbki do samociśnieniowego dewara i umieścić wylot zabezpieczający przed przelaniem ciekłego azotu w odpowiednim pojemniku. Podłącz suchy przewód azotowy do tulei umieszczonej nad soczewką obiektywu, aby soczewka była ciepła i wolna od szronu.</li>
	<li>Umieść platformę z bloku miedzianego (strzałka na rysunku 3b) w komorze krioetapu, aby załadować zamrożoną siatkę na próbki. Ostudzić i napełnić miedzianą komorę krioetapu ciekłym azotem przez przewód wlotowy z samociśnieniowego napełniacza dewara.</li>
	<li>Gdy krioetap osiągnie temperaturę ciekłego azotu (w ciągu ~4-6 minut), przenieś skrzynkę magazynową sieci (z kroku 3.5) do krioetapu.</li>
	<li>Umieść zamrożoną uwodnioną siatkę próbki we wkładzie z próbką EM na bloku miedzianym i przypnij siatkę za pomocą pierścienia C (jeśli używasz wkładu mikroskopu Polara) lub umieść wstępnie schłodzony miedziany pierścień na górze (grot strzałki na rysunku 3d), aby utrzymać siatkę na miejscu, a także w celu łatwego wyjęcia siatki po obrazowaniu kriofluorescencyjnym (jeśli jest to mikroskop krioelektronowy bez Polara).</li>
	<li>Umieść wkład (od kroku 4.6) w wewnętrznej komorze kriostolika (biały grot strzałki na rysunku 3b).</li>
	<li>Wyszukaj i znajdź te same cząsteczki wirusa z danych obrazowania żywych komórek. Ponieważ siatka EM ma indeks, łatwo jest zlokalizować tę samą cząstkę na siatce zarówno na obrazach żywych komórek, jak i na obrazach krioflorescencji.</li>
	<li>Rejestruj obrazy cryo-DIC i GFP w zidentyfikowanych pozycjach w warunkach kriogenicznych za pomocą mikroskopu świetlnego z długą roboczą (2,7-4 mm) soczewką obiektywową. Podczas obrazowania kriofluorescencyjnego należy okresowo sprawdzać poziom ciekłego azotu w krioetapie i w razie potrzeby uzupełniać go, aby utrzymać stolik próbki poniżej -170 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania kriofluorescencyjnego ostrożnie umieść wkład z próbką na platformie z blokiem miedzianym i przechowuj wkład w ciekłym azocie Dewara do przyszłej analizy krioET za pomocą systemu Polara. Jeśli używasz mikroskopu krioelektronowego bez Polara, zdejmij miedziany pierścień, wyjmij siatkę próbki, umieść ją w pudełku do przechowywania siatki i przechowuj próbkę w ciekłym azocie Dewara, dopóki próbka nie zostanie zbadana przez krioET.</li>
	<li>W celu analizy danych należy nałożyć na siebie uzyskane obrazy cryo-DIC i GFP (z kroku 4.9, patrz rysunek 4b) i skorelować pozycje sygnałów GFP w obrazie kriofluorescencji z tymi uzyskanymi w serii obrazowania żywych komórek.</li>
</ol>
5. Tomografia krioelektronowa
<ol>
	<li>Załaduj wkład z próbką do stacji kriotransferowej mikroskopu elektronowego wyposażonego w pistolet do emisji w terenie, takiego jak mikroskop Polara G2.</li>
	<li>W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce przy powiększeniu 140X zidentyfikuj i zapisz skojarzone kwadraty siatki (z kroku 4.11) w pliku stołu montażowego.</li>
	<li>W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce przy powiększeniu 3500X włóż aperturę obiektywu 100 μm, wyszukaj i zapisz wszystkie pozycje skorelowane z sygnałami GFP w pliku drugiego stopnia.</li>
	<li>W trybie ekspozycji na niską dawkę znajdź pusty obszar, aby dostosować intensywność wiązki do dawki 1 lub 2 e-/2 i udoskonalić oś nachylenia, korzystając z funkcji etapu y, wypalając lód w nieistotnym obszarze węgla za pomocą kilku złotych kulek.</li>
	<li>W trybie ustawiania ostrości o niskiej dawce ustaw odległość ostrości na ~3 μm i wyreguluj kąt, aby wyrównać kierunek ostrości tak, aby był równoległy do osi pochylenia.</li>
	<li>W trybie wyszukiwania przy niskiej dawce przywołaj zapisane pozycje (z kroku 5.3), dostosuj wysokość eucentryczną próbki i sprawdź zakres nachylenia dla obszaru zainteresowania. Uzyskaj obraz projekcyjny z bardzo niską dawką elektronów (~1 e-/Å2) przy rozogniskowaniu od 8 do 10 μm, w trybie ekspozycji, aby potwierdzić skorelowane cząstki wirusa do tomografii krioelektronowej.</li>
	<li>Przełącz się na tryb ostrości przy niskiej dawce. W menu funkcji automatycznych TEM należy poprzedzić automatyczne funkcje wysokości eucentrycznej i ostrości na obszarze ostrości.</li>
	<li>Skonfiguruj parametry uzyskiwania serii pochylenia. Na rysunku 4 w tym artykule zastosowano kąty nachylenia w zakresie ±70°, poniżej i powyżej 45°, odpowiednio w krokach co 3° i 2°, z rozogniskowaniem 6 μm i około 70 μm dawki całkowitej.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.7 i 5.8 dla wszystkich zapisanych pozycji. Oprogramowanie do tomografii wsadowej może być używane do automatycznego gromadzenia danych w wielu pozycjach w celu zwiększenia przepustowości.</li>
</ol>
6. Rekonstrukcja trójwymiarowa za pomocą IMOD17
<ol>
	<li>Sprawdź serię pochylenia RAW w celu dostosowania minimalnych i maksymalnych wartości gęstości oraz określenia, czy istnieje widok, który należy wykluczyć z powodu dużego przesunięcia obrazu.</li>
	<li>Uruchom eTomo i skonfiguruj panel tomogramu, używając typu osi, rozmiaru piksela, średnicy odniesienia itp. Następnie utwórz skrypty com.</li>
	<li>Skonfiguruj okno główne w taki sposób, aby można było jednocześnie dostosować/śledzić kilka etapów obliczeń tomogramu. Zmodyfikuj niezbędne parametry i wykonaj określone programy, które są wymagane na każdym etapie przetwarzania (patrz samouczek eTomo, <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a>).</li>
	<li>Na ostatnim etapie utwórz w pełni wyrównany stos (ze średnim błędem resztkowym mniejszym niż 0,6) i zrekonstruuj tomogramy za pomocą algorytmu ważonej projekcji wstecznej w IMOD.</li>
	<li>Odszumianie potencjalnych obszarów zainteresowania za pomocą nieliniowego anizotropowego programu wzmacniającego krawędzie dyfuzji 3D zaimplementowanego w IMOD z odpowiednimi parametrami w celu zwiększenia kontrastu i klarowności.</li>
</ol>

<ol><li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cells+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li>
<li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li>
<li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li>
<li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015(2008).</li>
<li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li>
<li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84(2009).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li>
<li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li>
<li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li>
<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li>
<li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li>
<li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li>
<li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li>
<li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Przedstawiliśmy prosty zestaw protokołów, aby zapewnić zaawansowane podejście korelacyjne do analizy dynamicznych zdarzeń komórkowych przy użyciu poklatkowego, konfokalnego, fluorescencyjnego obrazowania fluorescencji żywych komórek, a następnie cryoET. Nasz rozwój metodologiczny w celu skorelowania obrazowania 3D żywych komórek z krioET o wysokiej rozdzielczości ma kluczowe znaczenie dla zbadania wielu trudnych problemów biologicznych, takich jak wizualizacja rzadkich, dynamicznych (nie statycznych, jak wcześniej zgłasz...

Tomografia krioelektronowa (cryoET) to potężna technika obrazowania, która umożliwia trójwymiarową (3D) wizualizację komórek i tkanek oraz zapewnia wgląd w organizację natywnych organelli i struktur komórkowych w rozdzielczości molekularnej w stanie zbliżonym do fizjologicznego1. Jednak z natury niski kontrast niebarwionej zamrożonej i uwodnionej próbki, w połączeniu z ich czułością na promieniowanie, utrudnia zlokalizowanie obszarów zainteresowania wewnątrz komórki, a następnie pomyślne wykonanie serii przechyłu bez uszkodzenia obszaru docelowego. Aby przezwyciężyć te problemy, konieczne jest podejście korelacyjne, które łączy mikroskopię świetlną i elektronową. Specyficzne cechy uwydatnione przez znakowanie fluorescencyjne są identyfikowane i lokalizowane za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu świetlnego, a następnie ich współrzędne są przenoszone do mikroskopu elektronowego w celu uzyskania danych strukturalnych 3D o wysokiej rozdzielczości. Ta metoda korelacyjna pomaga zlokalizować docelowe obszary zainteresowania, którymi należy się zająć. Ze względu na ograniczenie grubości próbki za pomocą cryoEM (<300 nm), obecnie tylko peryferyjne obszary ogniwa nadają się do analizy strukturalnej 3D za pomocą CryoET. Dalsze zmniejszenie grubości próbek uwodnionych w wyniku zamrożonego cięcia przez sekcjonowanie ciała szklistego8 lub mielenie wiązką jonów w skupieniu kriogenicznym (FIB)9 rozszerzyłoby możliwości obrazowania korelacyjnego.
Poprzednio, metody korelacyjne były głównie używane do ułatwienia pozyskiwania danych cryoET dla dużych i statycznych struktur10-13. W tych badaniach zaimplementowano krioetapy, które akceptują siatki krioelektromagnetyczne i pasują do mikroskopu pionowego lub odwróconego10,11,14. Chociaż przełączanie sieci wydaje się dość proste w swoich projektach, w przypadku sieci EM występują dodatkowe etapy przesyłania, co zwiększa prawdopodobieństwo, że sieć może zostać zdeformowana, uszkodzona i zanieczyszczona. Niedawno zademonstrowaliśmy postęp techniczny w mikroskopii korelacyjnej, który pozwala nam bezpośrednio wizualizować dynamiczne zdarzenia, które są z natury trudne do uchwycenia, takie jak interakcje HIV-1 i komórek gospodarza we wczesnych stadiach infekcji15. Osiągnęliśmy to, projektując i wdrażając stolik na próbki do mikroskopii krioświetlnej, który dostosowuje system wkładów w celu zminimalizowania uszkodzeń próbki spowodowanych obsługą siatki, ułatwiając w ten sposób korelację. Nasza konstrukcja obejmuje zintegrowany uchwyt na wkłady z próbkami, co pozwala na sekwencyjne wykonywanie zarówno mikroskopii krioświetlnej, jak i krioelektronowej na tym samym uchwycie próbki, bez przenoszenia próbki, co usprawnia proces korelacji. Ponadto wdrożyliśmy również dokładną i wiarygodną procedurę korelacji przy użyciu fluorescencyjnych kulek lateksowych jako znaczników odniesienia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L glukozy z L-glutaminą</td><td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>F1141-1MG</td><td>Hodowla komórek HeLa na siatkach EM</td></tr><tr><td>Cell tracker</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>C34552</td><td>Czerwone CMTPX</td></tr><tr><td>Białko A koniugaty</td> <td>złotaTed Pella, Inc., Redding, CA</td><td>15822-1</td><td>15 nm średnica</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Mikrosfery fluorescencyjne</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>F8811</td><td>Żółto-zielona fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca cielęca</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Złoty wyszukiwarka quantifoil siatki EM</td><td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Niemcy</td><td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Urządzenie do rozrzezzenia 100X</td><td>EMS, Hatfield, mikroskop</td> elektronowy PA <td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Polara G2 z pistoletem do emisji pola</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus IX 71</td><td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td><td></td><td>LUCPlanFLN 40X/0,6 NA (odległość robocza 2,7-4 mm)</td></tr><tr><td>obiektyw Mikroskop Nikon TiE</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY</td><td></td><td>przy użyciu soczewki obiektywowej olejowej 60X/1,35 NA</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Sweptfield</td><td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tokai Hit komora na żywo Tokio</td><td>, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etap próbki kriofluorescencji</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Zbudowany w domu przez warsztat mechaniczny, patrz odniesienie 15 dla projektu.</td></tr></tbody></table>

mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3d oddziaływań dynamicznych

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Krioelektronowa tomografia (cryoET) umożliwia wizualizację 3D struktur komórkowych w rozdzielczości molekularnej w stanie zbliżonym do fizjologicznego1. Jednak bezpośrednia wizualizacja poszczególnych kompleksów wirusowych w środowisku komórkowym gospodarza za pomocą cryoET jest wyzwaniem2 ze względu na rzadki i dynamiczny charakter wnikania wirusa, szczególnie w przypadku HIV-1. Podczas gdy obrazowanie poklatkowe żywych komórek dostarczyło wielu informacji na temat wielu aspektów cyklu życia HIV-13-7, rozdzielczość zapewniana przez mikroskopię żywych komórek jest ograniczona (~ 200 nm). Nasze prace miały na celu opracowanie metody korelacji, która pozwala na bezpośrednią wizualizację wczesnych zdarzeń zakażenia HIV-1 poprzez połączenie mikroskopii świetlnej fluorescencyjnej żywych komórek, mikroskopii kriofluorescencyjnej i krioET. W ten sposób sygnały z żywych komórek i kriofluorescencji mogą być wykorzystywane do dokładnego kierowania próbkowaniem w cryoET. Co więcej, informacje strukturalne uzyskane z cryoET mogą być uzupełnione dynamicznymi danymi funkcjonalnymi uzyskanymi dzięki obrazowaniu żywych komórek celu znakowanego fluorescencyjnie.
W tym artykule wideo przedstawiamy szczegółowe metody i protokoły do badań strukturalnych HIV-1 i interakcji między komórkami gospodarza za pomocą korelacyjnego 3D szybkiego obrazowania żywych komórek i analizy strukturalnej krioET o wysokiej rozdzielczości. Komórki HeLa zakażone cząstkami HIV-1 scharakteryzowano najpierw za pomocą konfokalnej mikroskopii żywych komórek, a następnie region zawierający tę samą cząstkę wirusa przeanalizowano za pomocą tomografii krioelektronowej pod kątem szczegółów strukturalnych 3D. Korelacja między dwoma zestawami danych obrazowych, obrazowaniem optycznym i obrazowaniem elektronowym, została osiągnięta przy użyciu zbudowanego w domu stopnia mikroskopii kriofluorescencyjnej. Opisane tutaj podejście będzie cenne nie tylko dla badania interakcji między komórkami wirusa-gospodarza, ale także dla szerszych zastosowań w biologii komórki, takich jak sygnalizacja komórkowa, transport receptorów błonowych i wiele innych dynamicznych procesów komórkowych.

Aby scharakteryzować dynamiczne zachowanie cząsteczek wirusa, zainfekowane HIV-1 komórki HeLa obrazowano za pomocą szybkomiejsceowej konfokalnej mikroskopii żywych komórek, a ruchy cząsteczek analizowano automatycznym śledzeniem cząsteczek w 3D (Rycina 1). Aby uniknąć kilkuminutowego odstępu czasu, który może wystąpić między pozyskaniem ostatniego konfokalnego obrazu żywej komórki a mrożeniem szokowym (co może być wystarczająco długim okresem, by utracić skorelowane cząsteczki HIV-1), zaprojektowano i zb...

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie zastosowania metody korelacyjnej fluorescencyjnej i krioelektronowej mikroskopii poprzez obrazowanie dynamicznych małych cząsteczek HIV-1 wchodzących w interakcje z komórkami HeLa gospodarza. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez uprzednie wysianie i hodowlę komórek HeLa na złotej siatce EM w naczyniu hodowlanym z szklanym dnem oraz zainfekowanie komórek HeLa cząsteczkami HIV-1 znakowanymi GFP. Drugim krokiem jest wykonanie wysokofrekwencyjnych trójwymiarowych obrazów konfokalnych żywych komórek zainfekowanych HIV-1 w trybie time-lapse oraz analiza tych obrazów za pomocą zautomatyzowanego śledzenia cząsteczek 3D w celu badania dynamiki pojedynczych cząsteczek po witryfikacji.Próbka, zawierająca te same cząstki wirusowe co w danych z obrazowania żywych komórek, zostaje umieszczona na obrazach kriofluorescencyjnych w celu dalszej analizy wysokorozdzielczej trójwymiarowej kriotomografii elektronowej. Ostatnim krokiem jest zebranie serii projekcji cryo EM pod różnymi kątami dla wszystkich zidentyfikowanych pozycji zawierających cząstki HIV-1 oraz rekonstrukcja tomogramów 3D za pomocą algorytmu ważonej projekcji wstecznej przy użyciu

correlative-microscopy-for-3d-structural-analysis-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskopia korelacyjna do 3D analizy strukturalnej dynamicznych interakcji

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Tutaj wprowadzamy metodę, cocem3D, która pozwala na odkrycie ultrastruktury konkretnej komórki w jej natywnej tkance poprzez połączenie konfokalnej i seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna, konfokalna i trójwymiarowa mikroskopia elektronowa określonej komórki czuciowej

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Obecny protokół opisuje metodę wizualizacji i pomiaru pierścieni aktynowych i innych składników okresowego szkieletu błony początkowego segmentu aksonu przy użyciu hodowanych neuronów hipokampa szczura i mikroskopii iluminacyjnej o strukturze 3D (3D-SIM).

Pomiar właściwości okresowego szkieletu błonowego początkowego segmentu aksonu przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (3D-SIM)

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Dynamiczna mikroskopia różnicowa (DDM) łączy w sobie cechy dynamicznego rozpraszania światła i mikroskopii. W tym artykule przedstawiono proces wykorzystania DDM do scharakteryzowania odtworzonych sieci cytoszkieletów poprzez ilościowe określenie subdyfuzyjnej i zamkniętej w klatce dynamiki cząstek w sieciach wimentynowych oraz ruchu balistycznego aktywnych kompozytów aktynowo-mikrotubulowych napędzanych miozyną.

Kwantyfikacja dynamiki cytoszkieletu za pomocą dynamicznej mikroskopii różnicowej

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak zbudować jednoobiektywowy, światło-arkuszowy mikroskop fluorescencyjny i jego zastosowanie do wizualizacji sieci cytoszkieletów.

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

Poznaj mikroskopię korelacyjną do badania dynamicznych interakcji HIV-1 z komórkami HeLa. Ta metoda łączy fluorescencyjną mikroskopię świetlną z krio-elektronową tomografią dla analizy 3D zachowań wirusowych w czasie rzeczywistym.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Przeglądaj więcej filmów