Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie zastosowania metody korelacyjnego światła fluorescencyjnego i mikroskopii krioelektronowej poprzez obrazowanie dynamicznych małych cząstek HIV one oddziałujących z komórkami hela gospodarza. Osiąga się to poprzez najpierw posiew i hodowlę komórek heela na siatce EM złotego szukacza w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem i zakażenie komórek heela cząstkami oznaczonymi GFP jako HIV one. Drugim krokiem jest zebranie poklatkowych, szybkich obrazów konfokalnych 3D żywych komórek zakażonych wirusem HIV i przeanalizowanie obrazów za pomocą automatycznego śledzenia cząstek 3D pod kątem dynamiki pojedynczych cząstek po witryfikacji.

Próbka, te same cząstki wirusa z danych obrazowania żywych komórek, znajdują się na obrazach kriofluorescencyjnych w celu dalszej analizy krioelektronowej tomografii 3D o wysokiej rozdzielczości. Ostatnim krokiem jest zebranie serii projekcji kriogenicznych EM pod kątem dla wszystkich zidentyfikowanych pozycji zawierających cząstki HIV one i zrekonstruowanie tomów 3D za pomocą algorytmu projekcji zwrotnej z obciążeniem przy użyciu oprogramowania imad. Ostatecznie zaawansowana korelująca 3D mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek i tomografia krioelektronowa o wysokiej rozdzielczości są wykorzystywane do bezpośredniej wizualizacji dynamicznych cząstek wirusa ograniczonych dyfrakcją i ich interakcji z komórkami gospodarza.

Nasza praca ma na celu opracowanie metody korelacji, która pozwala na bezpośrednią wizualizację tylko zdarzeń związanych z zakażeniem wirusem HIV Łącząc w ten sposób fluorescencyjne żywe komórki, takie jak mikroskopia, mikroskopia kriofluorescencyjna i tomografia krioelektronowa, można wykorzystać sygnały żywych komórek i kriofluorescencyjnych do znacznego kierowania próbkowaniem w tomografii krioelektronowej. Co więcej, informacje strukturalne uzyskane z krioelektronowej tomografii mogą być uzupełnione dynamicznymi danymi funkcjonalnymi dostępnymi dzięki obrazowaniu stylu życia celów znakowanych fluorescencyjnie. Główną zaletą tej techniki lub istniejącej metody jest to, że zaawansowane korelacyjne, szybkie obrazowanie stylu życia 3D z podejściem do tomografii elektronowej koralowców 3D o wysokiej rozdzielczości jest stosowane do badania dynamicznych zdarzeń, które są z natury trudne do wychwycenia, takich jak HIV typu pierwszego i interakcje komórek gospodarza na wczesnym etapie infekcji.

Aby przygotować siatkę do hodowli komórkowych, rozładuj stronę węglową 200 mesh R dwa na dwóch foliach quanti, złotej siatce szukacza EM poniżej 25 miliamperów przez 25 sekund. Pokryj siatkę EM włóknem nin, unosząc ją stroną węglową w dół na 40-mikrolitrowej kropli 50 mikrogramów na mililitr roztworu nin włókna. Pozostaw go w kapturze do hodowli tkankowej pod wpływem światła UV na dwie godziny w celu dezynfekcji, płytkę hela komórki na siatce o gęstości dwa razy 10 do czwartej komórki na mililitr w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem.

W DMEM z odpowiednimi suplementami, inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez około 18 godzin przed zakażeniem HIV na jeden dzień przed zakażeniem HIV, dodać fluorescencyjny tracker komórek do komórek hela w naczyniu do hodowli ze szklanym dnem i inkubować szalkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby umożliwić wychwyt barwnika fluorescencyjnego, umyj komórki PBS i dodaj 50 mikrolitrów wstępnie podgrzanej świeżej pożywki. Umieść naczynie w komorze żywej komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza mikroskopu ze skanerem konfokalnym w polu zamiatania. Ponieważ krioenzym EM wymaga stosunkowo cienkich obszarów próbki.

Wybierz wiele pól, które zawierają od jednej do trzech komórek na kwadrat, z komórkami między dwiema fazami mitozy, gdy są najbardziej rozproszone, i przechowuj te pozycje za pomocą oprogramowania elementu NIS do przyszłego obrazowania. Następnie zainfekuj komórki VSVG, pseudotypowymi cząstkami HIV one, które zawierają G-F-P-V-P-R i cząsteczki wirusa do dolnej studzienki naczynia, uważając, aby nie naruszyć siatki EM. Ponieważ pozycje do obrazowania zostały już wybrane i zapisane natychmiast po dodaniu varianów, zbieraj poklatkowe, szybkie obrazy konfokalne 3D w wcześniej wybranych pozycjach przez 20 do 40 minut.

Natychmiast po konfokalnym obrazowaniu żywych komórek umieść naczynie hodowlane na chłodzonym lodem bloku miedzianym i przenieś go do pomieszczenia do przygotowywania próbek kriogenicznych. Załaduj siatkę EM na specjalistyczną pęsetę, szybko usuń resztki pożywki hodowlanej bibułą filtracyjną, natychmiast umieść na siatce na mikrolitry 15-nanometrowego roztworu złotych kulek zmieszanego z mikrosferami fluorescencyjnymi o grubości 0,2 mikrona. Mikrosfery fluorescencyjne są wykorzystywane do wspomagania korelacji między fluorescencją a krio-em.

Załaduj pęsetę do urządzenia do witryfikacji w celu zamrożenia wgłębnego z parametrami blottingu zoptymalizowanymi w celu osiągnięcia najlepszych rezultatów. Aby rozpocząć procedurę kriofluorescencji mikroskopii świetlnej, podłącz przewód suchego azotu gazowego do tulei umieszczonej nad soczewką obiektywu, aby soczewka była ciepła i wolna od szronu, zamontuj domowy stolik na próbkę kriofluorescencji na odwróconym mikroskopie fluorescencji światła. Podłącz wlot ciekłego azotu do stolika na próbki kriozy do samociśnieniowego doera i umieść wylot zabezpieczający przed przepełnieniem ciekłego azotu w odpowiednim pojemniku.

Umieść zamrożoną uwodnioną siatkę na próbkę w kasecie z próbką EM na miedzianym bloku i umieść wstępnie schłodzony pierścień zaciskowy C na górze, aby utrzymać siatkę na miejscu. Umieść wkład w wewnętrznej komorze kriogenicznej i znajdź te same cząsteczki wirusa z danych obrazowania żywych komórek. Ponieważ siatka EM ma indeks, łatwo jest zlokalizować tę samą cząstkę na siatce zarówno na obrazach żywych komórek, jak i na obrazach kriofluorescencji.

Pozyskiwanie obrazów kriogenicznych DIC i fluorescencyjnych w zidentyfikowanych pozycjach w warunkach kriogenicznych za pomocą mikroskopu świetlnego z długą roboczą soczewką obiektywową. Podczas obrazowania kriofluorescencji należy okresowo sprawdzać poziom ciekłego azotu w stopniu kriogenicznym i w razie potrzeby napełniać go samociśnieniowym urządzeniem, aby utrzymać stolik próbki poniżej minus 170 stopni Celsjusza do kriotomografii elektronowej. Załadować siatkę próbek do stacji kriotransferowej mikroskopu elektronowego wyposażonego w pistolet do emisji pola w trybie wyszukiwania przy niskiej dawce przy powiększeniu 140 x.

Zidentyfikuj obszary lub kwadraty siatki, w których uzyskano obrazy kriofluorescencji. Nagraj obraz kriogeniczny EM skorelowanego obszaru w małym powiększeniu i zapisz pozycję w pliku stolika w trybie wyszukiwania o niskiej dawce przy powiększeniu 3 500 x. Wstaw wyszukiwanie apertury obiektywu 100 mikronów i zapisz wszystkie pozycje skorelowane z sygnałami GFP w pliku drugiego stopnia.

Skonfiguruj parametry tomografii w celu uzyskania serii nachylenia, w tym zakres kąta pochylenia, dawkę elektronów, wartość rozogniskowania i schematy przechyłu. Uzyskaj serię przechyłu dla wszystkich zapisanych pozycji, aby rozpocząć tę procedurę. Skonfiguruj okno główne w taki sposób, aby można było dostosować lub śledzić jednocześnie kilka etapów obliczeń Tomo Grahama, zmodyfikuj niezbędne parametry i wykonaj określone programy, które są wymagane przez każdy krok przetwarzania.

Na ostatnim etapie utwórz w pełni wyrównany stos z głównym błędem resztkowym mniejszym niż 0,6 i zrekonstruuj Tomy za pomocą algorytmu ważonej projekcji wstecznej. In Im mod do scharakteryzowania dynamicznego zachowania cząsteczek wirusa. Komórki Hela zakażone wirusem HIV zostały zobrazowane za pomocą szybkiej konfokalnej mikroskopii żywych komórek, a ruchy cząstek przeanalizowano za pomocą automatycznego śledzenia cząstek 3D.

Na tym reprezentatywnym rysunku pojedyncza zielona fluorescencyjna cząstka wirusa oznaczona żółtym grotem strzałki była śledzona w konfokalnych stosach 3D z trzyminutowym odstępem czasu między klatkami, aby uniknąć upływu czasu o kilka minut. Może się to zdarzyć między pobraniem ostatniego konfokalnego obrazu żywej komórki a zamrożeniem wgłębnym. Zaprojektowano i skonstruowano stolik do mikroskopii kriofluorescencyjnej do obrazowania zamrożonych uwodnionych próbek we wkładach krio-elektromagnetycznych.

Na mikroskopach świetlnych panel A przedstawia samociśnieniowy doer wypełniony ciekłym azotem, który służy do schładzania miedzianego stolika na próbki krio. Panel B pokazuje widok z góry od wewnątrz stolika na próbki kriogeniczne z wewnętrzną komorą wskazywaną przez biały grot strzałki. Siatkę próbki umieszcza się na kartridżu z próbką E EM, który znajduje się pośrodku platformy z bloku miedzianego oznaczonej czarną strzałką.

Platforma ta została dodana do użytku z niepolarnymi mikroskopami elektronowymi. Po załadowaniu siatką na próbki, wkłady przeniesiono do wewnętrznej komory w celu uzyskania światła fluorescencyjnego cry. Panele mikroskopowe C i D pokazują odpowiednio wkład z próbką przed i po umieszczeniu miedzianego pierścienia, aby utrzymać siatkę na miejscu do użytku z niepolarnym mikroskopem krioelektronowym.

Użyteczność procedury zaawansowanej korelacyjnej mikroskopii komórek życia i tomografii krioelektronowej wykazano dzięki bezpośredniej wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie cząstek HIV V one oddziałujących z komórką heela gospodarza. Obraz DIC zarejestrowany za pomocą stolika mikroskopii krioświetlnej pokazanego na panelu A jest pokryty obrazem kriofluorescencji cząstek oznaczonych GFP pokazanym na panelu B. Oznaczone cząstki są kolorowe. Czerwone panele C, D i E to niskodawkowe obrazy krio-EM obszaru zawierającego cząstkę fluorescencyjną zakreśloną w panelach B i C odpowiednio o wymiarach 140 x 3, 500 x i 27 500 x.

Wstawka w panelu E to powiększony widok zarejestrowany po akwizycji paneli z serii tomograficznego pochylenia, FG i H pokazują trzy wycinki tomograficzne o grubości czterech nanometrów oddzielone odległością 21 nanometrów w kierunku Z. Połączenia między cząstką a błoną komórkową helo są oznaczone strzałkami zarówno na obrazie projekcyjnym we wstawce i panelu E, jak i na wycinkach tomograficznych. W panelach F i g.

Przedstawiliśmy prosty zestaw protokołów, aby zapewnić zaawansowane podejście korelacyjne do analizy dynamicznych interakcji wirusa i sterylnych przy użyciu poklatkowego konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego komórek lipo, a następnie tomografii krioelektronowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że precyzyjna i niezawodna korelacja między obrazem fluorescencyjnym a obrazem z mikroskopii elektronowej ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego uzyskania tomografii elektronowej wrony. Dane opisane w tej procedurze będą przydatne w wielu zastosowaniach obejmujących dynamiczne procesy komórkowe w biologii komórki, takie jak sygnalizacja komórkowa, internalizacja receptorów powierzchniowych.