Przygotowanie próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej

Histologia to termin odnoszący się do badania mikroskopowej anatomii tkanek i komórek. Prawidłowe przygotowanie próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej jest niezbędne do uzyskania wysokiej jakości wyników z próbek tkankowych.

Istnieją 3 główne etapy wspólne dla niemal wszystkich procedur histologicznych. Po pierwsze, próbkę utrwala się, aby zachować strukturę tkanki i spowolnić jej degradację. Następnie próbkę zanurza się w materiale, czyli medium zatopowym, który posiada podobne właściwości mechaniczne do badanej tkanki. Po zatopieniu próbkę poddaje się sekcjonowaniu, czyli cięciu na cienkie plastry, przy użyciu precyzyjnego narzędzia tnącego zwanego mikrotomem. Niniejszy film opisuje te ogólne etapy oraz niektóre powiązane z nimi pojęcia.

Fiksacja tkanek jest krytycznym etapem, który pozwala na zachowanie składników komórek i tkanek oraz utrzymanie ich struktury. Po śmierci komórki z organelli komórkowych uwalniane są naturalnie występujące enzymy, które zaczynają degradować białka w całej komórce i macierzy zewnątrzkomórkowej, niszcząc tym samym strukturę komórki. Fiksacja zapobiega takiej degradacji poprzez bezpośrednie hamowanie zdolności tych enzymów do trawienia białek oraz sprawienie, że miejsca cięcia enzymatycznego stają się nierozpoznawalne.

Dwa główne mechanizmy fiksacji to sieciowanie i koagulacja. Sieciowanie polega na tworzeniu wiązań kowalencyjnych zarówno w obrębie białek, jak i między nimi, co powoduje usztywnienie tkanki i tym samym jej odporność na degradację. Koagulacja jest spowodowana odwodnieniem białek poprzez zastosowanie alkoholi lub acetonu, co deformuje strukturę trzeciorzędową białek, w wyniku czego regiony hydrofobowe, czyli „bojące się wody”, przemieszczają się na powierzchnię białka. Fiksacja koagulacyjna może pomóc mediom zatapiającym, takim jak parafina, w penetracji tkanki.

Jednym z najczęściej stosowanych utrwalaczy jest formalina, która jest formaldehydem rozpuszczonym w wodzie. Podczas fiksacji formaldehyd przyłącza się do amin pierwszorzędowych, takich jak te występujące w łańcuchach bocznych aminokwasów lizyny i glutaminy, tworząc trwałe wiązanie sieciujące zwane mostkiem metylenowym. Proces ten jest z natury powolny i może trwać od 1 do 2 dni.

Przed przystąpieniem do fiksacji należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Po pierwsze, należy rozważyć dyfuzyjność próbki. Utrwalacze dyfundują przez tkanki na odległość zależną od współczynnika dyfuzji utrwalacza pomnożonego przez pierwiastek kwadratowy z czasu. Utrwalacz, który potrzebuje 1 godziny, aby wniknąć na 1 mm w głąb próbki, będzie potrzebował 25 godzin, aby wniknąć na 5 mm. Gdy formalina dotrze do centrum tkanki, wciąż musi zajść reakcja sieciowania. Zatem w celu zapewnienia dokładnej fiksacji w rozsądnym czasie, grubość próbki powinna być ograniczona do 4 mm.

Po drugie, należy rozważyć objętość i pH utrwalacza. Stosunek objętości utrwalacza do objętości próbki powinien wynosić co najmniej 40:1, aby odczynnik nie został szybko zużyty w czasie. Podczas gdy niektóre utrwalacze są zaprojektowane do pracy w pH kwasowym, formalina działa najlepiej, gdy jest buforowana fosforanem w celu utrzymania neutralnego pH, aby nie powstawał nadmiar kwasu, który powoduje artefakty w tkance.

Kolejnym krokiem w przygotowaniu histologicznym jest zatapianie, które polega na unieruchomieniu preparatów w medium o sztywności mechanicznej zbliżonej do sztywności samego preparatu. Wybór odpowiedniego medium do zatapiania jest krytyczny, ponieważ zbyt duża lub zbyt mała sztywność może prowadzić do wystąpienia defektów podczas skrawania. Najpowszechniejszym medium stosowanym do zatapiania jest parafina.

Przed zatopieniem w parafinie próbki muszą zostać odwodnione poprzez zastąpienie wody w tkance najpierw etanolem, następnie ksylenami, a na koniec podgrzaną parafiną. Po nasyceniu próbki woskiem, zostaje ona ostrożnie ustawiona i otoczona dodatkową ilością parafiny w formie, aby utworzyć bloczek. Następnie próbki są mocowane do kasety histologicznej w celu ich skrawania.

Skrawanie jest procesem wycinania cienkich plastrów próbki z bloczka z zatopioną tkanką. Skrawane sekcje mają zazwyczaj grubość rzędu 4-10 µm, co umożliwia ich wykorzystanie w mikroskopii świetlnej.

Aby wykonać skrawanie, w mikrotomie mocuje się najpierw metalowe, szklane lub diamentowe ostrze. Następnie próbkę umieszcza się w uchwycie na próbkę. W kolejnym kroku próbka jest przesuwana w stronę powierzchni tnącej i prowadzona wzdłuż ostrza, aby uzyskać plaster o pożądanej grubości. Sekcje gromadzą się w postaci cienkich wstążek, które można przenieść na szkiełka podstawowe.

Po skrawaniu próbki są umieszczane na szkiełkach. W przypadku próbek zatopionych w parafinie, plastry nanosi się najpierw do podgrzanej kąpieli wodnej, a następnie wyjmuje z wody bezpośrednio na szkiełko i pozostawia do wyschnięcia.

Tkanka biologiczna charakteryzuje się bardzo niskim naturalnym kontrastem, dlatego po przeprowadzeniu badań histologicznych preparaty są zazwyczaj barwione barwnikami lub przeciwciałami, które uwydatniają morfologię lub specyficzne białka. Najczęściej stosowanym barwieniem jest barwienie hematoksyliną i eozyną, czyli H&E. Ze względu na jego powszechność stworzono wiele zautomatyzowanych urządzeń pozwalających na powtarzalne barwienie licznych skrawków metodą H&E. Hematoksylina barwi jądra komórkowe na niebiesko, a eozyna barwi cytoplazmę na różowo, co pozwala uwidocznić morfologię komórkową tkanek.

Jedną z wad fiksacji jest to, że sieciowanie białek może utrudnić przeciwciałom znakującym dotarcie do ich miejsc wiązania. Zamiast stosowania fiksacji w celu utrwalenia próbek, można zastosować szybkie mrożenie tkanki, tzw. snap freezing, po którym następuje technika cięcia zwana kriosekcjonowaniem.

Próbki tkanek są zatapiane i orientowane w specjalnym medium mrożącym zwanym OCT (optimal cutting temperature medium), a następnie szybko mrożone. Podobnie jak inne media do zatapiania, OCT dopasowuje się do sztywności próbki.

Do wycinania skrawków mrożonych używa się kriomikrotomu lub kriotomatu; urządzenie to utrzymuje temperaturę wewnętrzną na poziomie -20°C, aby ostrze tnące i próbki pozostały schłodzone. W przeciwieństwie do skrawków zatopionych w parafinie, skrawki mrożone można przenieść bezpośrednio na dodatnio naładowane szkiełko przedmiotowe natychmiast po sekcjonowaniu.

Innym sposobem uniknięcia fiksacji jest zatapianie w agarze, w którym próbki pokrywa się świeżo przygotowaną płynną agarozą. W miarę stygnięcia agaroza unieruchamia tkankę, a nadmiar agarozy można odciąć.

Wibrotomy, będące kolejną alternatywą dla mikrotomu, posiadają ostrze, które wibruje i przesuwa się przez próbkę zatopioną w agarozie. Wibrotomy są wykorzystywane do tworzenia grubych skrawków o grubości rzędu 50-1000 µm z próbek zatopionych w agarozie.

Próbki są zazwyczaj usuwane z agarozy przed barwieniem, a następnie umieszczane na szkiełku w otoczeniu substancji takiej jak smar próżniowy, który zapobiega zgniataniu próbki przez szkiełko nakrywkowe. Najlepiej obserwować je przy użyciu mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości dla każdego grubego skrawka.

Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat przygotowania próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej.

Powinni Państwo teraz rozumieć etapy przygotowania próbek, które prowadzą od fragmentu tkanki do możliwości uzyskania barwionego skrawka. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!