Przygotowanie próbki histologicznej do mikroskopii świetlnej
Histologia to termin odnoszący się do badania mikroskopowej anatomii tkanek i komórek. Właściwe przygotowanie próbki histologicznej do mikroskopii świetlnej ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości wyników z próbek tkanek.
Istnieją 3 główne etapy wspólne dla prawie wszystkich procedur histologicznych. Najpierw próbka jest utrwalana w celu zachowania tkanki i spowolnienia jej degradacji. Następnie próbka jest zanurzana w materiale lub medium do zatapiania, które ma podobne właściwości mechaniczne do siebie. Po osadzeniu próbka jest dzielona lub cięta na cienkie plasterki za pomocą precyzyjnego narzędzia tnącego znanego jako mikrotom. W tym filmie wideo opisano te ogólne kroki i niektóre pojęcia, które się z nimi wiążą.
Utrwalenie tkanek jest krytycznym krokiem, który zachowuje składniki komórek i tkanek oraz utrzymuje ich strukturę. Po śmierci komórki naturalnie występujące enzymy są uwalniane z organelli komórkowych i zaczynają rozkładać białka w całej komórce i macierzy zewnątrzkomórkowej, niszcząc w ten sposób strukturę komórki. Utrwalanie zapobiega takiej degradacji poprzez bezpośrednie hamowanie zdolności tych enzymów do trawienia białka i sprawianie, że miejsca rozszczepienia enzymu stają się nierozpoznawalne.
Dwa główne mechanizmy utrwalania to sieciowanie i koagulacja. Sieciowanie polega na tworzeniu wiązań kowalencyjnych zarówno w białkach, jak i między nimi, co powoduje usztywnienie tkanki, a tym samym jest odporne na degradację. Koagulacja jest spowodowana odwodnieniem białek poprzez użycie alkoholi lub acetonu, które deformują trzeciorzędową strukturę białka, tak że hydrofobowe lub bojące się wody regiony poruszają powierzchnię białka. Utrwalanie koagulacyjne może pomóc w penetracji tkanek mediów osadzających, takich jak wosk parafinowy.
Jednym z najczęściej stosowanych utrwalaczy jest formalina, czyli formaldehyd rozpuszczony w wodzie. Podczas utrwalania formaldehyd przyłącza się do amin pierwszorzędowych, takich jak te znajdujące się w łańcuchach bocznych aminokwasów lizyny i glutaminy, tworząc stabilne wiązanie krzyżowe zwane mostkiem metelenowym. Proces ten jest z natury powolny i może potrwać do 1-2 dni.
Przed utrwaleniem należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Po pierwsze, należy wziąć pod uwagę dyfuzyjność próbki. Utrwalacze będą dyfundować na odległość przez tkanki z szybkością związaną ze współczynnikiem dyfuzji dla utrwalacza pomnożonym przez pierwiastek kwadratowy z czasu. Utrwalacz, który potrzebuje 1 godziny, aby wniknąć 1 mm w próbkę, potrzebuje 25 godzin, aby wniknąć w 5 mm. Gdy formalina dotrze do środka tkanki, musi nastąpić reakcja sieciowania. W związku z tym wielkość próbki powinna być ograniczona do 4 mm grubości w celu dokładnego utrwalenia w rozsądnym czasie.
Po drugie, weź pod uwagę objętość i pH utrwalacza. Stosunek utrwalacza do objętości próbki powinien wynosić co najmniej 40:1, aby odczynnik nie wyczerpywał się łatwo z upływem czasu. Podczas gdy niektóre utrwalacze są zaprojektowane do pracy w kwaśnym pH, formalina działa najlepiej, gdy jest buforowana fosforanem w celu utrzymania neutralnego pH, dzięki czemu nie dochodzi do nadmiaru kwasu, który powoduje artefakty w tkankach.
Kolejnym krokiem w przygotowaniu histologicznym jest zatapianie, które polega na podparciu próbek w pożywce o podobnej sztywności mechanicznej jak sama próbka. Wybór odpowiedniego podłoża do zatapiania ma kluczowe znaczenie, ponieważ jeśli jest ono zbyt sztywne lub zbyt słabe, podczas cięcia mogą wystąpić defekty. Zdecydowanie najczęstszym medium używanym do zatapiania jest wosk parafinowy.
Przed zatopieniem w parafinie próbki należy odwodnić poprzez zastąpienie wody w tkance etanolem, najpierw ksylenami, a na końcu podgrzanym woskiem parafinowym. Gdy wosk przeniknie do próbki, jest ona ostrożnie umieszczana i otoczona dodatkowym woskiem za pomocą formy w celu uformowania bloku. Następnie próbki są umieszczane w kasecie na tkanki w celu przekrojenia.
Cięcie to proces wycinania cienkich plasterków próbki z bloku do zatapiania. Skrawki mają zwykle grubość rzędu 4-10 μm do stosowania w mikroskopii świetlnej.
Aby wyciąć sekcje, najpierw mocuje się metalową, szklaną lub diamentową tarczę na mikrotomie. Próbkę umieszcza się następnie w uchwycie na próbki. Następnie próbka jest przesuwana na powierzchnię cięcia i przeciągana w poprzek ostrza, aby utworzyć plaster o pożądanej grubości. Sekcje będą gromadzić się w postaci cienkich wstążek, które można umieścić na szkiełkach.
Po podziale na sekcje próbki umieszcza się na szkiełkach. W przypadku próbek zatopionych w parafinie, plastry są najpierw umieszczane w podgrzanej łaźni wodnej, a następnie wyjmowane z wody na szkiełko i pozostawiane do wyschnięcia.
Tkanka biologiczna ma bardzo mały naturalny kontrast, więc po histologii szkiełka są zwykle barwione barwnikami lub przeciwciałami, które podkreślają morfologię lub określone białka. Najczęściej wykonywanym barwieniem jest hematoksylina i eozyna, czyli H&E. Ponieważ jest to tak powszechne, wiele zautomatyzowanych maszyn zostało stworzonych do powtarzalnego barwienia wielu odcinków H&E. Hematoksylina barwi jądra komórek na niebiesko, a eozyna barwi cytoplazmę na różowo, ujawniając morfologię komórkową tkanek.
Jedną z wad fiksacji jest to, że sieciowanie białek może sprawić, że przeciwciała znakujące będą bardziej podatne na znalezienie miejsc wiązania. Zamiast używać utrwalania do konserwacji próbek, można zastosować szybkie zamrażanie tkanek lub zamrażanie błyskawiczne, po którym następuje technika cięcia zwana kriosekcją
Próbki tkanek są osadzane i orientowane w specjalnym medium do zamrażania zwanym OCT, czyli medium o optymalnej temperaturze cięcia, a następnie szybko zamrażane. Podobnie jak inne media do zatapiania, OCT dopasowuje się do sztywności próbki.
Kriomikrotom lub kriostat służy do cięcia zamrożonych odcinków, a przyrząd ten utrzymuje temperaturę wewnętrzną -20°C, aby utrzymać ostrze tnące i próbki w chłodzie. W przeciwieństwie do sekcji zatopionych w parafinie, zamrożone sekcje mogą być bezpośrednio podnoszone na dodatnio naładowane szkiełko natychmiast po przekrojeniu.
Innym sposobem uniknięcia utrwalenia jest zatapianie w agarze, w którym próbki są pokryte świeżo przygotowaną płynną agarozą. Gdy agaroza stygnie, blokuje tkankę na miejscu, a nadmiar agarozy można odciąć.
Wibrotomy, inna alternatywa dla mikrotomu, mają ostrze, które wibruje i porusza się po próbce zanurzonej w agarozie. Wibrotomy służą do tworzenia grubych przekrojów rzędu 50-1000 μm z próbek zatopionych w agarozie.
Próbki są zwykle usuwane z agarozy przed barwieniem, a następnie umieszczane na szkiełku otoczonym substancją, taką jak smar próżniowy, który zapobiega zgniecaniu próbki przez szkiełko nakrywkowe. Najlepiej oglądać je za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości każdego grubego przekroju.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat przygotowania próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej.
Powinieneś teraz zrozumieć kroki związane z przygotowaniem próbki, aby przejść od kawałka tkanki do plamistego fragmentu. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Histologia to badanie komórek i tkanek, które zwykle jest wspomagane przez użycie mikroskopu świetlnego. Przygotowanie próbek histologicznych może się…
Histologia to termin odnoszący się do badania mikroskopowej anatomii tkanek i komórek. Właściwe przygotowanie próbki histologicznej do mikroskopii świetlnej ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości wyników z próbek tkanek.
Istnieją 3 główne etapy wspólne dla prawie wszystkich procedur histologicznych. Najpierw próbka jest utrwalana w celu zachowania tkanki i spowolnienia jej degradacji. Następnie próbka jest zanurzana w materiale lub medium do zatapiania, które ma podobne właściwości mechaniczne do siebie. Po osadzeniu próbka jest dzielona lub cięta na cienkie plasterki za pomocą precyzyjnego narzędzia tnącego znanego jako mikrotom. W tym filmie wideo opisano te ogólne kroki i niektóre pojęcia, które się z nimi wiążą.
Utrwalenie tkanek jest krytycznym krokiem, który zachowuje składniki komórek i tkanek oraz utrzymuje ich strukturę. Po śmierci komórki naturalnie występujące enzymy są uwalniane z organelli komórkowych i zaczynają rozkładać białka w całej komórce i macierzy zewnątrzkomórkowej, niszcząc w ten sposób strukturę komórki. Utrwalanie zapobiega takiej degradacji poprzez bezpośrednie hamowanie zdolności tych enzymów do trawienia białka i sprawianie, że miejsca rozszczepienia enzymu stają się nierozpoznawalne.
Dwa główne mechanizmy utrwalania to sieciowanie i koagulacja. Sieciowanie polega na tworzeniu wiązań kowalencyjnych zarówno w białkach, jak i między nimi, co powoduje usztywnienie tkanki, a tym samym jest odporne na degradację. Koagulacja jest spowodowana odwodnieniem białek poprzez użycie alkoholi lub acetonu, które deformują trzeciorzędową strukturę białka, tak że hydrofobowe lub bojące się wody regiony poruszają powierzchnię białka. Utrwalanie koagulacyjne może pomóc w penetracji tkanek mediów osadzających, takich jak wosk parafinowy.
Jednym z najczęściej stosowanych utrwalaczy jest formalina, czyli formaldehyd rozpuszczony w wodzie. Podczas utrwalania formaldehyd przyłącza się do amin pierwszorzędowych, takich jak te znajdujące się w łańcuchach bocznych aminokwasów lizyny i glutaminy, tworząc stabilne wiązanie krzyżowe zwane mostkiem metelenowym. Proces ten jest z natury powolny i może potrwać do 1-2 dni.
Przed utrwaleniem należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Po pierwsze, należy wziąć pod uwagę dyfuzyjność próbki. Utrwalacze będą dyfundować na odległość przez tkanki z szybkością związaną ze współczynnikiem dyfuzji dla utrwalacza pomnożonym przez pierwiastek kwadratowy z czasu. Utrwalacz, który potrzebuje 1 godziny, aby wniknąć 1 mm w próbkę, potrzebuje 25 godzin, aby wniknąć w 5 mm. Gdy formalina dotrze do środka tkanki, musi nastąpić reakcja sieciowania. W związku z tym wielkość próbki powinna być ograniczona do 4 mm grubości w celu dokładnego utrwalenia w rozsądnym czasie.
Po drugie, weź pod uwagę objętość i pH utrwalacza. Stosunek utrwalacza do objętości próbki powinien wynosić co najmniej 40:1, aby odczynnik nie wyczerpywał się łatwo z upływem czasu. Podczas gdy niektóre utrwalacze są zaprojektowane do pracy w kwaśnym pH, formalina działa najlepiej, gdy jest buforowana fosforanem w celu utrzymania neutralnego pH, dzięki czemu nie dochodzi do nadmiaru kwasu, który powoduje artefakty w tkankach.
Kolejnym krokiem w przygotowaniu histologicznym jest zatapianie, które polega na podparciu próbek w pożywce o podobnej sztywności mechanicznej jak sama próbka. Wybór odpowiedniego podłoża do zatapiania ma kluczowe znaczenie, ponieważ jeśli jest ono zbyt sztywne lub zbyt słabe, podczas cięcia mogą wystąpić defekty. Zdecydowanie najczęstszym medium używanym do zatapiania jest wosk parafinowy.
Przed zatopieniem w parafinie próbki należy odwodnić poprzez zastąpienie wody w tkance etanolem, najpierw ksylenami, a na końcu podgrzanym woskiem parafinowym. Gdy wosk przeniknie do próbki, jest ona ostrożnie umieszczana i otoczona dodatkowym woskiem za pomocą formy w celu uformowania bloku. Następnie próbki są umieszczane w kasecie na tkanki w celu przekrojenia.
Cięcie to proces wycinania cienkich plasterków próbki z bloku do zatapiania. Skrawki mają zwykle grubość rzędu 4-10 μm do stosowania w mikroskopii świetlnej.
Aby wyciąć sekcje, najpierw mocuje się metalową, szklaną lub diamentową tarczę na mikrotomie. Próbkę umieszcza się następnie w uchwycie na próbki. Następnie próbka jest przesuwana na powierzchnię cięcia i przeciągana w poprzek ostrza, aby utworzyć plaster o pożądanej grubości. Sekcje będą gromadzić się w postaci cienkich wstążek, które można umieścić na szkiełkach.
Po podziale na sekcje próbki umieszcza się na szkiełkach. W przypadku próbek zatopionych w parafinie, plastry są najpierw umieszczane w podgrzanej łaźni wodnej, a następnie wyjmowane z wody na szkiełko i pozostawiane do wyschnięcia.
Tkanka biologiczna ma bardzo mały naturalny kontrast, więc po histologii szkiełka są zwykle barwione barwnikami lub przeciwciałami, które podkreślają morfologię lub określone białka. Najczęściej wykonywanym barwieniem jest hematoksylina i eozyna, czyli H&E. Ponieważ jest to tak powszechne, wiele zautomatyzowanych maszyn zostało stworzonych do powtarzalnego barwienia wielu odcinków H&E. Hematoksylina barwi jądra komórek na niebiesko, a eozyna barwi cytoplazmę na różowo, ujawniając morfologię komórkową tkanek.
Jedną z wad fiksacji jest to, że sieciowanie białek może sprawić, że przeciwciała znakujące będą bardziej podatne na znalezienie miejsc wiązania. Zamiast używać utrwalania do konserwacji próbek, można zastosować szybkie zamrażanie tkanek lub zamrażanie błyskawiczne, po którym następuje technika cięcia zwana kriosekcją
Próbki tkanek są osadzane i orientowane w specjalnym medium do zamrażania zwanym OCT, czyli medium o optymalnej temperaturze cięcia, a następnie szybko zamrażane. Podobnie jak inne media do zatapiania, OCT dopasowuje się do sztywności próbki.
Kriomikrotom lub kriostat służy do cięcia zamrożonych odcinków, a przyrząd ten utrzymuje temperaturę wewnętrzną -20°C, aby utrzymać ostrze tnące i próbki w chłodzie. W przeciwieństwie do sekcji zatopionych w parafinie, zamrożone sekcje mogą być bezpośrednio podnoszone na dodatnio naładowane szkiełko natychmiast po przekrojeniu.
Innym sposobem uniknięcia utrwalenia jest zatapianie w agarze, w którym próbki są pokryte świeżo przygotowaną płynną agarozą. Gdy agaroza stygnie, blokuje tkankę na miejscu, a nadmiar agarozy można odciąć.
Wibrotomy, inna alternatywa dla mikrotomu, mają ostrze, które wibruje i porusza się po próbce zanurzonej w agarozie. Wibrotomy służą do tworzenia grubych przekrojów rzędu 50-1000 μm z próbek zatopionych w agarozie.
Próbki są zwykle usuwane z agarozy przed barwieniem, a następnie umieszczane na szkiełku otoczonym substancją, taką jak smar próżniowy, który zapobiega zgniecaniu próbki przez szkiełko nakrywkowe. Najlepiej oglądać je za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości każdego grubego przekroju.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat przygotowania próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej.
Powinieneś teraz zrozumieć kroki związane z przygotowaniem próbki, aby przejść od kawałka tkanki do plamistego fragmentu. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Histologia to termin odnoszący się do badania mikroskopowej anatomii tkanek i komórek. Właściwe przygotowanie próbki histologicznej do mikroskopii świetlnej ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości wyników z próbek tkanek.
Istnieją 3 główne etapy wspólne dla prawie wszystkich procedur histologicznych. Najpierw próbka jest utrwalana w celu zachowania tkanki i spowolnienia jej degradacji. Następnie próbka jest zanurzana w materiale lub medium do zatapiania, które ma podobne właściwości mechaniczne do siebie. Po osadzeniu próbka jest dzielona lub cięta na cienkie plasterki za pomocą precyzyjnego narzędzia tnącego znanego jako mikrotom. W tym filmie wideo opisano te ogólne kroki i niektóre pojęcia, które się z nimi wiążą.
Utrwalenie tkanek jest krytycznym krokiem, który zachowuje składniki komórek i tkanek oraz utrzymuje ich strukturę. Po śmierci komórki naturalnie występujące enzymy są uwalniane z organelli komórkowych i zaczynają rozkładać białka w całej komórce i macierzy zewnątrzkomórkowej, niszcząc w ten sposób strukturę komórki. Utrwalanie zapobiega takiej degradacji poprzez bezpośrednie hamowanie zdolności tych enzymów do trawienia białka i sprawianie, że miejsca rozszczepienia enzymu stają się nierozpoznawalne.
Dwa główne mechanizmy utrwalania to sieciowanie i koagulacja. Sieciowanie polega na tworzeniu wiązań kowalencyjnych zarówno w białkach, jak i między nimi, co powoduje usztywnienie tkanki, a tym samym jest odporne na degradację. Koagulacja jest spowodowana odwodnieniem białek poprzez użycie alkoholi lub acetonu, które deformują trzeciorzędową strukturę białka, tak że hydrofobowe lub bojące się wody regiony poruszają powierzchnię białka. Utrwalanie koagulacyjne może pomóc w penetracji tkanek mediów osadzających, takich jak wosk parafinowy.
Jednym z najczęściej stosowanych utrwalaczy jest formalina, czyli formaldehyd rozpuszczony w wodzie. Podczas utrwalania formaldehyd przyłącza się do amin pierwszorzędowych, takich jak te znajdujące się w łańcuchach bocznych aminokwasów lizyny i glutaminy, tworząc stabilne wiązanie krzyżowe zwane mostkiem metelenowym. Proces ten jest z natury powolny i może potrwać do 1-2 dni.
Przed utrwaleniem należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Po pierwsze, należy wziąć pod uwagę dyfuzyjność próbki. Utrwalacze będą dyfundować na odległość przez tkanki z szybkością związaną ze współczynnikiem dyfuzji dla utrwalacza pomnożonym przez pierwiastek kwadratowy z czasu. Utrwalacz, który potrzebuje 1 godziny, aby wniknąć 1 mm w próbkę, potrzebuje 25 godzin, aby wniknąć w 5 mm. Gdy formalina dotrze do środka tkanki, musi nastąpić reakcja sieciowania. W związku z tym wielkość próbki powinna być ograniczona do 4 mm grubości w celu dokładnego utrwalenia w rozsądnym czasie.
Po drugie, weź pod uwagę objętość i pH utrwalacza. Stosunek utrwalacza do objętości próbki powinien wynosić co najmniej 40:1, aby odczynnik nie wyczerpywał się łatwo z upływem czasu. Podczas gdy niektóre utrwalacze są zaprojektowane do pracy w kwaśnym pH, formalina działa najlepiej, gdy jest buforowana fosforanem w celu utrzymania neutralnego pH, dzięki czemu nie dochodzi do nadmiaru kwasu, który powoduje artefakty w tkankach.
Kolejnym krokiem w przygotowaniu histologicznym jest zatapianie, które polega na podparciu próbek w pożywce o podobnej sztywności mechanicznej jak sama próbka. Wybór odpowiedniego podłoża do zatapiania ma kluczowe znaczenie, ponieważ jeśli jest ono zbyt sztywne lub zbyt słabe, podczas cięcia mogą wystąpić defekty. Zdecydowanie najczęstszym medium używanym do zatapiania jest wosk parafinowy.
Przed zatopieniem w parafinie próbki należy odwodnić poprzez zastąpienie wody w tkance etanolem, najpierw ksylenami, a na końcu podgrzanym woskiem parafinowym. Gdy wosk przeniknie do próbki, jest ona ostrożnie umieszczana i otoczona dodatkowym woskiem za pomocą formy w celu uformowania bloku. Następnie próbki są umieszczane w kasecie na tkanki w celu przekrojenia.
Cięcie to proces wycinania cienkich plasterków próbki z bloku do zatapiania. Skrawki mają zwykle grubość rzędu 4-10 μm do stosowania w mikroskopii świetlnej.
Aby wyciąć sekcje, najpierw mocuje się metalową, szklaną lub diamentową tarczę na mikrotomie. Próbkę umieszcza się następnie w uchwycie na próbki. Następnie próbka jest przesuwana na powierzchnię cięcia i przeciągana w poprzek ostrza, aby utworzyć plaster o pożądanej grubości. Sekcje będą gromadzić się w postaci cienkich wstążek, które można umieścić na szkiełkach.
Po podziale na sekcje próbki umieszcza się na szkiełkach. W przypadku próbek zatopionych w parafinie, plastry są najpierw umieszczane w podgrzanej łaźni wodnej, a następnie wyjmowane z wody na szkiełko i pozostawiane do wyschnięcia.
Tkanka biologiczna ma bardzo mały naturalny kontrast, więc po histologii szkiełka są zwykle barwione barwnikami lub przeciwciałami, które podkreślają morfologię lub określone białka. Najczęściej wykonywanym barwieniem jest hematoksylina i eozyna, czyli H&E. Ponieważ jest to tak powszechne, wiele zautomatyzowanych maszyn zostało stworzonych do powtarzalnego barwienia wielu odcinków H&E. Hematoksylina barwi jądra komórek na niebiesko, a eozyna barwi cytoplazmę na różowo, ujawniając morfologię komórkową tkanek.
Jedną z wad fiksacji jest to, że sieciowanie białek może sprawić, że przeciwciała znakujące będą bardziej podatne na znalezienie miejsc wiązania. Zamiast używać utrwalania do konserwacji próbek, można zastosować szybkie zamrażanie tkanek lub zamrażanie błyskawiczne, po którym następuje technika cięcia zwana kriosekcją
Próbki tkanek są osadzane i orientowane w specjalnym medium do zamrażania zwanym OCT, czyli medium o optymalnej temperaturze cięcia, a następnie szybko zamrażane. Podobnie jak inne media do zatapiania, OCT dopasowuje się do sztywności próbki.
Kriomikrotom lub kriostat służy do cięcia zamrożonych odcinków, a przyrząd ten utrzymuje temperaturę wewnętrzną -20°C, aby utrzymać ostrze tnące i próbki w chłodzie. W przeciwieństwie do sekcji zatopionych w parafinie, zamrożone sekcje mogą być bezpośrednio podnoszone na dodatnio naładowane szkiełko natychmiast po przekrojeniu.
Innym sposobem uniknięcia utrwalenia jest zatapianie w agarze, w którym próbki są pokryte świeżo przygotowaną płynną agarozą. Gdy agaroza stygnie, blokuje tkankę na miejscu, a nadmiar agarozy można odciąć.
Wibrotomy, inna alternatywa dla mikrotomu, mają ostrze, które wibruje i porusza się po próbce zanurzonej w agarozie. Wibrotomy służą do tworzenia grubych przekrojów rzędu 50-1000 μm z próbek zatopionych w agarozie.
Próbki są zwykle usuwane z agarozy przed barwieniem, a następnie umieszczane na szkiełku otoczonym substancją, taką jak smar próżniowy, który zapobiega zgniecaniu próbki przez szkiełko nakrywkowe. Najlepiej oglądać je za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości każdego grubego przekroju.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat przygotowania próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej.
Powinieneś teraz zrozumieć kroki związane z przygotowaniem próbki, aby przejść od kawałka tkanki do plamistego fragmentu. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is tissue fixation necessary in histological sample preparation?
Tissue fixation preserves cell and tissue structure by preventing degradation caused by naturally occurring enzymes released after cell death. Fixation inhibits enzyme activity and makes protein cleavage sites unrecognizable. The two main mechanisms are cross-linking, which forms covalent bonds to stiffen tissue, and coagulation, which dehydrates proteins using alcohols or acetone to deform their structure.
Q2: What are the two main mechanisms of tissue fixation?
Cross-linking involves covalent bond formation within and between proteins, causing tissue to stiffen and resist degradation. Coagulation dehydrates proteins through alcohols or acetone, deforming their tertiary structure so hydrophobic regions move to the protein surface. Coagulative fixation helps embedding media like paraffin wax penetrate tissue more effectively.
Q3: How does formalin work as a fixative in tissue preparation?
Formalin, formaldehyde dissolved in water, attaches to primary amines on amino acid side chains like lysine and glutamine, forming stable crosslinks called methylene bridges. This cross-linking process is inherently slow, requiring 1-2 days for completion. Formalin works best when buffered with phosphate to maintain neutral pH and prevent tissue artifacts.
Q4: What factors should be considered before tissue fixation begins?
Consider sample diffusivity: fixatives penetrate tissue at rates related to diffusion coefficient and time, so samples should be limited to 4 mm thickness for thorough fixation. Also consider fixative volume and pH. The fixative-to-sample ratio should be at least 40:1 to prevent reagent depletion. Formalin should be buffered with phosphate to maintain neutral pH and avoid tissue artifacts.
Q5: What is the purpose of embedding media in histological preparation?
Embedding media supports specimens with mechanical rigidity similar to the tissue itself. Paraffin wax is the most common embedding medium. Choosing appropriate embedding media is critical because media that is too stiff or too weak causes sectioning defects. Prior to paraffin embedding, samples must be dehydrated by replacing water with ethanol, then xylenes, and finally warmed paraffin wax.
Q6: How does cryosectioning differ from traditional paraffin-embedded sectioning?
Cryosectioning avoids fixation by rapidly freezing tissue in OCT (optimal cutting temperature) medium, then sectioning with a cryomicrotome maintained at -20°C. Unlike paraffin sections that require water bath treatment, frozen sections are directly lifted onto positively charged glass slides immediately after sectioning. This method preserves protein structure better for antibody labeling since cross-linking does not occur.
Q7: What are alternative embedding methods to paraffin wax?
Agar embedding covers samples with freshly prepared liquid agarose that locks tissue in place as it cools. Vibrotomes with vibrating blades cut thick sections of 50-1000 µm from agarose-embedded samples. Samples are typically removed from agarose before staining and mounted on slides with vacuum grease. Thick agarose sections are best viewed using light microscopy principle instrumentation and applications for high-resolution imaging.
Chapters in this video
0:00
Overview
1:05
Fixation of Tissue Samples
4:19
Embedding and Sectioning
6:12
Applications
9:01
Summary
Videos from this collection: