1.11: Przygotowanie próbki histologicznej do mikroskopii świetlnej

Histologia to termin odnoszący się do badania mikroskopowej anatomii tkanek i komórek. Właściwe przygotowanie próbki histologicznej do mikroskopii świetlnej ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości wyników z próbek tkanek.

Istnieją 3 główne etapy wspólne dla prawie wszystkich procedur histologicznych. Najpierw próbka jest utrwalana w celu zachowania tkanki i spowolnienia jej degradacji. Następnie próbka jest zanurzana w materiale lub medium do zatapiania, które ma podobne właściwości mechaniczne do siebie. Po osadzeniu próbka jest dzielona lub cięta na cienkie plasterki za pomocą precyzyjnego narzędzia tnącego znanego jako mikrotom. W tym filmie wideo opisano te ogólne kroki i niektóre pojęcia, które się z nimi wiążą.

Utrwalenie tkanek jest krytycznym krokiem, który zachowuje składniki komórek i tkanek oraz utrzymuje ich strukturę. Po śmierci komórki naturalnie występujące enzymy są uwalniane z organelli komórkowych i zaczynają rozkładać białka w całej komórce i macierzy zewnątrzkomórkowej, niszcząc w ten sposób strukturę komórki. Utrwalanie zapobiega takiej degradacji poprzez bezpośrednie hamowanie zdolności tych enzymów do trawienia białka i sprawianie, że miejsca rozszczepienia enzymu stają się nierozpoznawalne.

Dwa główne mechanizmy utrwalania to sieciowanie i koagulacja. Sieciowanie polega na tworzeniu wiązań kowalencyjnych zarówno w białkach, jak i między nimi, co powoduje usztywnienie tkanki, a tym samym jest odporne na degradację. Koagulacja jest spowodowana odwodnieniem białek poprzez użycie alkoholi lub acetonu, które deformują trzeciorzędową strukturę białka, tak że hydrofobowe lub bojące się wody regiony poruszają powierzchnię białka. Utrwalanie koagulacyjne może pomóc w penetracji tkanek mediów osadzających, takich jak wosk parafinowy.

Jednym z najczęściej stosowanych utrwalaczy jest formalina, czyli formaldehyd rozpuszczony w wodzie. Podczas utrwalania formaldehyd przyłącza się do amin pierwszorzędowych, takich jak te znajdujące się w łańcuchach bocznych aminokwasów lizyny i glutaminy, tworząc stabilne wiązanie krzyżowe zwane mostkiem metelenowym. Proces ten jest z natury powolny i może potrwać do 1-2 dni.

Przed utrwaleniem należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Po pierwsze, należy wziąć pod uwagę dyfuzyjność próbki. Utrwalacze będą dyfundować na odległość przez tkanki z szybkością związaną ze współczynnikiem dyfuzji dla utrwalacza pomnożonym przez pierwiastek kwadratowy z czasu. Utrwalacz, który potrzebuje 1 godziny, aby wniknąć 1 mm w próbkę, potrzebuje 25 godzin, aby wniknąć w 5 mm. Gdy formalina dotrze do środka tkanki, musi nastąpić reakcja sieciowania. W związku z tym wielkość próbki powinna być ograniczona do 4 mm grubości w celu dokładnego utrwalenia w rozsądnym czasie.

Po drugie, weź pod uwagę objętość i pH utrwalacza. Stosunek utrwalacza do objętości próbki powinien wynosić co najmniej 40:1, aby odczynnik nie wyczerpywał się łatwo z upływem czasu. Podczas gdy niektóre utrwalacze są zaprojektowane do pracy w kwaśnym pH, formalina działa najlepiej, gdy jest buforowana fosforanem w celu utrzymania neutralnego pH, dzięki czemu nie dochodzi do nadmiaru kwasu, który powoduje artefakty w tkankach.

Kolejnym krokiem w przygotowaniu histologicznym jest zatapianie, które polega na podparciu próbek w pożywce o podobnej sztywności mechanicznej jak sama próbka. Wybór odpowiedniego podłoża do zatapiania ma kluczowe znaczenie, ponieważ jeśli jest ono zbyt sztywne lub zbyt słabe, podczas cięcia mogą wystąpić defekty. Zdecydowanie najczęstszym medium używanym do zatapiania jest wosk parafinowy.

Przed zatopieniem w parafinie próbki należy odwodnić poprzez zastąpienie wody w tkance etanolem, najpierw ksylenami, a na końcu podgrzanym woskiem parafinowym. Gdy wosk przeniknie do próbki, jest ona ostrożnie umieszczana i otoczona dodatkowym woskiem za pomocą formy w celu uformowania bloku. Następnie próbki są umieszczane w kasecie na tkanki w celu przekrojenia.

Cięcie to proces wycinania cienkich plasterków próbki z bloku do zatapiania. Skrawki mają zwykle grubość rzędu 4-10 μm do stosowania w mikroskopii świetlnej.

Aby wyciąć sekcje, najpierw mocuje się metalową, szklaną lub diamentową tarczę na mikrotomie. Próbkę umieszcza się następnie w uchwycie na próbki. Następnie próbka jest przesuwana na powierzchnię cięcia i przeciągana w poprzek ostrza, aby utworzyć plaster o pożądanej grubości. Sekcje będą gromadzić się w postaci cienkich wstążek, które można umieścić na szkiełkach.

Po podziale na sekcje próbki umieszcza się na szkiełkach. W przypadku próbek zatopionych w parafinie, plastry są najpierw umieszczane w podgrzanej łaźni wodnej, a następnie wyjmowane z wody na szkiełko i pozostawiane do wyschnięcia.

Tkanka biologiczna ma bardzo mały naturalny kontrast, więc po histologii szkiełka są zwykle barwione barwnikami lub przeciwciałami, które podkreślają morfologię lub określone białka. Najczęściej wykonywanym barwieniem jest hematoksylina i eozyna, czyli H&E. Ponieważ jest to tak powszechne, wiele zautomatyzowanych maszyn zostało stworzonych do powtarzalnego barwienia wielu odcinków H&E. Hematoksylina barwi jądra komórek na niebiesko, a eozyna barwi cytoplazmę na różowo, ujawniając morfologię komórkową tkanek.

Jedną z wad fiksacji jest to, że sieciowanie białek może sprawić, że przeciwciała znakujące będą bardziej podatne na znalezienie miejsc wiązania. Zamiast używać utrwalania do konserwacji próbek, można zastosować szybkie zamrażanie tkanek lub zamrażanie błyskawiczne, po którym następuje technika cięcia zwana kriosekcją

Próbki tkanek są osadzane i orientowane w specjalnym medium do zamrażania zwanym OCT, czyli medium o optymalnej temperaturze cięcia, a następnie szybko zamrażane. Podobnie jak inne media do zatapiania, OCT dopasowuje się do sztywności próbki.

Kriomikrotom lub kriostat służy do cięcia zamrożonych odcinków, a przyrząd ten utrzymuje temperaturę wewnętrzną -20°C, aby utrzymać ostrze tnące i próbki w chłodzie. W przeciwieństwie do sekcji zatopionych w parafinie, zamrożone sekcje mogą być bezpośrednio podnoszone na dodatnio naładowane szkiełko natychmiast po przekrojeniu.

Innym sposobem uniknięcia utrwalenia jest zatapianie w agarze, w którym próbki są pokryte świeżo przygotowaną płynną agarozą. Gdy agaroza stygnie, blokuje tkankę na miejscu, a nadmiar agarozy można odciąć.

Wibrotomy, inna alternatywa dla mikrotomu, mają ostrze, które wibruje i porusza się po próbce zanurzonej w agarozie. Wibrotomy służą do tworzenia grubych przekrojów rzędu 50-1000 μm z próbek zatopionych w agarozie.

Próbki są zwykle usuwane z agarozy przed barwieniem, a następnie umieszczane na szkiełku otoczonym substancją, taką jak smar próżniowy, który zapobiega zgniecaniu próbki przez szkiełko nakrywkowe. Najlepiej oglądać je za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości każdego grubego przekroju.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat przygotowania próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej.

Powinieneś teraz zrozumieć kroki związane z przygotowaniem próbki, aby przejść od kawałka tkanki do plamistego fragmentu. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!