Name: Zastosowanie testu ochrony DNA in vitro do wizualizacji właściwości białka DPS w zakresie mediacji stresu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Poznaj test ochrony DNA in vitro do badania aktywności białka Dps z E. coli. Ta metoda pozwala wizualizować redukcję uszkodzeń DNA wywołanych stresem oksydacyjnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Michela de Martino, Wilfred R. Hagen i Kourosh Honarmand Ebrahimi za użyteczne dyskusje. Prace te zostały wsparte przez fundusze na rozpoczęcie działalności z Uniwersytetu Technicznego w Delft.

1. Ekspresja i oczyszczanie DPS
Uzyskanie białka o wysokiej czystości jest niezbędnym pierwszym krokiem do testu ochrony DNA. Oczyszczanie białka Dps można przeprowadzić w ciągu 4 do 5 dni.
<ol>
	<li>Przekształć szczep E. coli z niedoborem proteazy (taki jak BL21(DE3) pLysS) w wektor pET (taki jak pET17), do którego sklonowano sekwencję kodującą białko Dps.</li>
	<li>Przenieść przekształcone komórki na płytki agarowe Luria Bulth (LB) zawierające odpowiednie antybiotyki (takie jak ampicylina i chloramfenikol, dla przykładów podanych w ppkt 1.1). Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki w 30 ml pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200-250 obr./min.</li>
	<li>Zaszczepić 2 x 1 l LB pożywki zawierającej odpowiednie antybiotyki po 10 ml każdej z nocnych kultur. Rosnąć w temperaturze 37 °C, wstrząsając, do średnicy zewnętrznej około 0,6. (Hodowla komórek do wyższej średnicy zewnętrznej zwiększa wydajność białka, bez zauważalnego pogorszenia czystości produktu końcowego). Wywołać ekspresję Dps przez dodanie IPTG do stężenia 0,3 mM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny podczas wstrząsania.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie przy 6 000 x g przez 15 minut. Ponownie zawiesić granulki komórek w 7,5 ml buforu DEAE A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) na L indukowanej hodowli komórkowej. W razie potrzeby próbki można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Procedura może być następnie kontynuowana przez rozmrażanie próbek w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać mieszaninę inhibitorów proteazy (takich jak inhibitory proteazy Calbiochem zestaw III, w stężeniu 0,167 μl na ml zawiesiny komórkowej) do zawiesiny komórkowej, aby zapobiec degradacji nadekspresji Dps.</li>
	<li>Przygotuj ekstrakt bezkomórkowy za pomocą prasy francuskiej. Zalać prasę francuską 20 ml buforu DEAE A (w przypadku stosowania modelu o ciągłym przepływie), a następnie dwukrotnie rozbić próbkę przy 20 kpsi. Odwirować lizat przy sile 30 000 x g przez 35 minut w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia nierozpuszczalnych cząstek i zachować supernatant. Supernatant można następnie zamrozić przy użyciu ciekłego azotu i w razie potrzeby przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zrównoważyć 30 ml kolumny DEAE Sepharose CL-6B z buforem DEAE A, używając FPLC. Przepuścić bufor przez kolumnę z prędkością 1-2 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu 0,2 MPa nad tłem. Załaduj ekstrakt bezkomórkowy na kolumnę i zacznij zbierać przepływ, gdy sygnał OD 280 zacznie rosnąć powyżej linii podstawowej. Przemyć kolumnę buforem DEAE A, aż wartość OD280 powróci do linii podstawowej, jednocześnie w sposób ciągły zbierając przepływ. Przepływ powinien zawierać większość białka Dps, wolnego od związanego DNA. Przepłukać kolumnę 100% buforem B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M NaCl, 0,1 mM EDTA). Ten eluat zawiera kompleksy Dps-DNA, a także inne białka i może być odrzucony.</li>
	<li>Usunąć dodatkowe białka zanieczyszczające poprzez wytrącanie siarczanu amonu. Określ objętość przepływu w puli. Powoli (przez 10-20 minut) dodawać suchy drobnoziarnisty siarczan amonu do 62% nasycenia (390 mg na ml roztworu) w temperaturze 4 °C, dobrze mieszając. Mieszaj mieszaninę przez dodatkowe 20-30 minut po dodaniu ostatniej porcji siarczanu amonu, aby zapewnić pełną równowagę. Dps pozostanie rozpuszczalny, podczas gdy zanieczyszczające białka wytrącą się z roztworu.</li>
	<li>Usunąć wytrącone białka przez odwirowanie w temperaturze 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i zachować supernatant.</li>
	<li>Powoli dodawać dodatkowe 227 mg siarczanu amonu na ml supernatantu, aby osiągnąć 94% nasycenia i mieszać przez 20-30 minut, aby zapewnić pełną równowagę. Dps wytrąca się przy tym wysokim stężeniu soli i może być zbierany przez odwirowanie w temperaturze 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Dps będzie w granulce; Supernatant można odrzucić. W razie potrzeby pellet można przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad zawierający Dps w buforze do ponownego zawieszania (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Dostosować objętość próbki do 2,5 ml.</li>
	<li>Wymiana buforu w celu usunięcia siarczanu amonu za pomocą żelowej kolumny filtracyjnej PD-10. Zrównoważyć złoże żelowe za pomocą 25 ml buforu do ponownego spożycia. Nanieść 2,5 ml próbki Dps na górną część kolumny PD-10 i pozostawić do wchłonięcia. Odrzuć przepływ. Zebrać Dps przez elucję za pomocą 3,5 ml buforu do respodencji.</li>
	<li>Odwirować próbkę wymienioną buforem o masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich nierozpuszczalnych składników i rozcieńczyć ją 6-10 ml buforu rozcieńczającego (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), aby upewnić się, że stężenie soli jest wystarczająco niskie, aby Dps mógł związać się z kolumną SP Sepharose. Szczególnie skoncentrowane próbki Dps mogą stać się mniej rozpuszczalne po rozcieńczeniu do buforu o niższej zawartości soli, o czym świadczy zmętnienie cieczy, ale mogą być całkowicie rozpuszczalne przez dodanie niewielkiej ilości 5 M roztworu NaCl (dodatkowe 10-20 mM).</li>
	<li>Zrównoważyć 30 ml SP Sepharose Fast Flow z buforem SP A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Przepuścić bufor przez kolumnę z prędkością 1,5-2 ml/min przy ciśnieniu granicznym 0,3 MPa na tle. Załaduj próbkę do kolumny. Przemyć buforem SP A, aż ślad OD.280 powróci do linii wyjściowej i odrzucić przepływ. Uruchom gradient liniowy o pojemności 150 ml od 0 do 100% buforu B, zbierając frakcje o objętości 2 ml. Dps wymywa się w ostrym szczycie przy około 50% B, chociaż możliwa jest zmiana o 10%.</li>
	<li>Uruchom frakcje elucyjne na 15% żelu SDS-PAGE i sprawdź, czy nie ma zanieczyszczenia DNA, mierząc stosunek O.D.260 / O.D.280 za pomocą spektrofotometru. Żel powinien pokazywać tylko jedno pasmo około 19 kDa, a OD.260/ OD.280 wynosi zwykle około 0,7. Zbierz najczystsze frakcje Dps. Użyj odśrodkowego urządzenia filtrującego (takiego jak jednostka filtracyjna Amicon Ultra) z odcięciem masy cząsteczkowej 10K, aby skoncentrować Dps i wymienić go na bufor magazynowy (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl). Podwielokrotnić oczyszczony Dps i zamrozić w ciekłym azocie w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Test ochrony DNA
Test składa się z wielu etapów, w których liczy się czas, i powinien być przemierzony co do sekundy, aby uzyskać powtarzalne wyniki. W grę wchodzi wiele składników i etapów pipetowania, dlatego zaleca się korzystanie z tabeli pipetowania (patrz Tabela 1) w celu śledzenia kroków i objętości. Całkowity czas potrzebny na wykonanie testu wynosi nie więcej niż 3 godziny.
<ol>
	<li>Odmierzyć 30 ml wody do hermetycznej fiolki; płukać wodę zN2 przez 10 minut (używając dwóch igieł strzykawkowych, jednej w płynie, drugiej nad nim) w celu usunięcia tlenu z roztworu. Dodać 0,0168 g FeSO4•7H2O do wody, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 2 mM. Zamknąć fiolkę i płukać azotem jeszcze przez 5 minut, a następnie wymieszać. Rozwiązanie musi być jasne; Jeśli wyczuwalna jest jakakolwiek żółta nuta, przygotuj nowy roztwór żelaza.</li>
	<li>Przygotować roztwór 100 mMH 2O2 (10,87 μl 9,2 MH 2O2 w 1 ml wody); przechowywać na lodzie i chronić przed światłem, zawijając w folię aluminiową. Stosować tylko przez około 1-2 godziny po przygotowaniu z powodu samoistnego próchnicy. Zapas nadtlenku wodoru jest również podatny na rozkład, który może być częściowo złagodzony przez odpowiednie przechowywanie (w ciemności, w temperaturze 4 °C). Zaleca się regularne kontrole stężenia zapasów poprzez pomiar średnicy zewnętrznej 240.</li>
	<li>Szybko rozmrozić porcję oczyszczonego Dps w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej i trzymać na lodzie. Wirować przez 10 sekund przy 4 000 x g w pikocentrycznym stole w celu wytrącenia agregatów. Zmierzyć stężenie po odwirowaniu za pomocą spektrofotometru (OD 280 = 1,547 wskazuje stężenie monomeru 100 μM Dps).</li>
	<li>Rozcieńczyć liniowe DNA z materiału wyjściowego o wysokim stężeniu za pomocą 12-krotnego buforu reakcyjnego (1 M MOPS-KOH pH 7,0, 1 M NaCl) do stężenia 100 ng / μl. Aby ułatwić kwantyfikację, stosuje się liniowe DNA, ale można również użyć plazmidowego DNA.</li>
	<li>Odpipetować 1 μl mieszaniny DNA z buforem do probówki PCR. Dodać tyle wody do reakcji, aby końcowa objętość reakcji (minus SDS) wynosiła 12 μl. Ilość tę należy obliczyć z wyprzedzeniem, korzystając z tabeli pipetowania. Dodać Dps do końcowego stężenia dodekameru wynoszącego 3 μM. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić Dps związanie się z DNA.</li>
	<li>Dodaj tyle 2 mM roztworuFeSO4, aby osiągnąć pożądane stężenie. W typowym eksperymencie wykorzystuje się zakres stężeń od 0 do 1 mMFeSO4. Wyższe stężenia spowodują bardziej rozległą degradację DNA, ale mogą również prowadzić do powstania osadów żelaza w mieszaninie reakcyjnej. Szybko dodać 1 μl roztworu 100 mMH 2O2 (do 10 mM stężenia końcowego) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić zajście reakcji degradacji za pośrednictwem Fentona.</li>
	<li>Dodać 0,8 μl 20% SDS (dodecylosiarczan sodu). Mieszać i inkubować w temperaturze 85 °C przez 5 minut w celu rozbicia kompleksów Dps-DNA. SDS destabilizuje kompleks Dps-DNA i zapobiega niepożądanym przesunięciom żelu dla DNA, co poprawia łatwość kwantyfikacji. Opcjonalnym krokiem jest zatrzymanie reakcji poprzez katalityczny rozkład nadtlenku wodoru do nietoksycznych produktów. W przypadku warunków opisanych w tym protokole krok ten nie jest konieczny do uzyskania szerokiego zakresu degradacji DNA.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 1 minutę, dodać barwnik ładujący i naładować żel agarozowy. Uruchom żel i wybarwić DNA za pomocą bromku etydyny. Żel powinien być barwiony po elektroforezie, a nie przed elektroforezą, aby zapobiec zakłóceniom SDS w dystrybucji bromku etydyny w żelu.</li>
</ol>

<ol><li>Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+DNA-binding+protein+with+regulatory+and+protective+roles+in+starved+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli.</a> Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).</li>
<li>Chiancone, E., Ceci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+capacity+of+Dps+proteins+to+combat+bacterial+stress+conditions%3A+Detoxification+of+iron+and+hydrogen+peroxide+and+DNA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding.</a> Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).</li>
<li>Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase-dependent+variation+in+protein+composition+of+the+Escherichia+coli+nucleoid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid.</a> J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).</li>
<li>Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+repression+by+Fis+and+H-NS+at+the+Escherichia+coli+dps+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter.</a> Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).</li>
<li>Martinez, A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+DNA+during+oxidative+stress+by+the+nonspecific+DNA-binding+protein+Dps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps.</a> J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).</li>
<li>Nair, S., Finkel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dps+protects+cells+against+multiple+stresses+during+stationary+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase.</a> J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).</li>
<li>Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+Dps%2C+a+ferritin+homolog+that+binds+and+protects+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA.</a> Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).</li>
<li>Zhao, G., Ceci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+hydrogen+peroxide+detoxification+properties+of+DNA-binding+protein+from+starved+cells.+A+ferritin-like+DNA-binding+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).</li>
<li>Ceci, P., Cellai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+condensation+and+self-aggregation+of+Escherichia+coli+Dps+are+coupled+phenomena+related+to+the+properties+of+the+N-terminus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus.</a> Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).</li>
<li>Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+incorporation+into+Escherichia+coli+Dps+gives+rise+to+a+ferritin-like+microcrystalline+core%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core.</a> J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).</li>
<li>Swift, J., Wehbi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+functional+ferritin-like+proteins+with+hydrophobic+cavities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).</li>
<li>Ceci, P., Chiancone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+iron+oxide+nanoparticles+in+Listeria+innocua+Dps+%28DNA-binding+protein+from+starved+cells%29%3A+a+study+with+the+wild-type+protein+and+a+catalytic+centre+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant.</a> Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).</li>
<li>Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dps+protein+of+Agrobacterium+tumefaciens+does+not+bind+to+DNA+but+protects+it+toward+oxidative+cleavage%3A+x-ray+crystal+structure%2C+iron+binding%2C+and+hydroxyl-radical+scavenging+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).</li>
<li>Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+so-called+Listeria+innocua+ferritin+is+a+Dps+protein.+Iron+incorporation%2C+detoxification%2C+and+DNA+protection+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties.</a> Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).</li>
<li>Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+Koelreuteria+paniculata+Laxm.+on+oxidative+stress+and+hydrogen+peroxide-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopharmacology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage.</a> Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).</li>
<li>Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radical+scavenging%2C+DNA+protection%2C+and+inhibition+of+lipid+peroxidation+mediated+by+uric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).</li>
<li>Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+role+of+Fur+proteins%3A+FurB+%28All2473%29+from+Anabaena+protects+DNA+and+increases+cell+survival+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress.</a> The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).</li>
<li>Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+stimulation+of+formation+of+the+ferroxidase+center+and+the+iron+core+in+Pyrococcus+furiosus+ferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).</li>
<li>Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+iron+determination+using+ferene+triazine%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Serum iron determination using ferene triazine.</a> Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Proces oczyszczania Dps, jak opisano w tym artykule, jest bardzo solidny. Czystość utrzymuje się na wysokim poziomie (> 99%); żadne inne białka nie pojawiają się na żelach SDS-PAGE jako widoczne prążki. Mimo to niektóre partie oczyszczonych Dps wydają się mieć aktywność nukleazy, o czym świadczy częściowa degradacja DNA podczas inkubacji z bardzo wysokimi stężeniami Dps. Może to wskazywać na obecność wysoce aktywnych DNaz w niskim stężeniu, których nie byliśmy w stanie usunąć poprzez oczyszczanie. Jednak ta degradacja DN...

Organizmy tlenowe muszą nieustannie zmagać się z reaktywnymi formami tlenu, które mogą uszkadzać ich DNA, jak również inne kluczowe makrocząsteczki biologiczne. Jednym z potężnych narzędzi do przeciwdziałania toksycznym skutkom uszkodzeń oksydacyjnych jest białko wiążące DNA z wygłodzonych komórek (Dps). Od czasu odkrycia w 1992 r. w zagłodzonej kulturze E. coli 1, Dps został zidentyfikowany u ponad 300 gatunków bakterii i archebakterii 2. Masywna regulacja w górę Dps w fazie stacjonarnej sprawia, że jest to białko E. coli o najwyższej ekspresji związane z nukleoidami w warunkach głodu 3, 4. Ponadto wykazano, że Dps zachowuje zarówno żywotność bakterii, jak i integralność DNA podczas wielu różnych stresów, w tym głodu, wysokiego stężenia żelaza, ekspozycji na światło UV, szoku cieplnego i stresu oksydacyjnego 5, 6.
Strukturalnie, Dps sam się asocjuje w stabilny homo-oligomeryczny kompleks 12 monomerów, które łączą się w sferyczną, pustą powłokę. Wewnętrzna wnęka o szerokości ~ 4,5 nm jest dostępna dla zewnętrznego rozpuszczalnika przez pory, które umożliwiają przejście małych cząsteczek 7 i może sekwestrować zmineralizowane metale, takie jak żelazo 8. Ochronne działanie Dps wynika z jego kilku aktywności biochemicznych, które obejmują niespecyficzne wiązanie DNA 1, aktywność ferroksydazy i magazynowanie żelaza 8.
Szczegółowe badanie korzystnych biochemicznych działań Dps wymaga najpierw jego oczyszczenia. Oczyszczanie Dps jest skomplikowaną procedurą, ponieważ Dps musi zostać oddzielony nie tylko od innych białek, ale także od wszelkich związanych DNA 7. Nasz zoptymalizowany proces oczyszczania wykorzystuje wiele popularnych technik, składających się z dwóch kolumn jonowymiennych i etapu wytrącania siarczanu amonu. Potrzebnych jest kilka wymian buforowych, ponieważ wysoce skoncentrowany Dps może wytrącać się z roztworu w warunkach niskiej zawartości soli. Po oczyszczeniu białka Dps można je zastosować do testów, które bezpośrednio mierzą jego aktywność ferroksydazy 8, stechiometrię wiążącą DNA 9 i mechanizmy wiązania żelaza 10. Oczyszczony Dps ma również inne potencjalne zastosowania. Stabilna, pusta sferyczna struktura Dps została wykorzystana jako rusztowanie do przechowywania cząstek hydrofobowych wewnątrz jamy białkowej 11, a nawet jako komora reakcyjna do syntezy nowych nanocząstek magnetycznych 12.
Zdolność ochronna Dps do pośredniczenia w uszkodzeniach spowodowanych przez reaktywne formy tlenu może być jasno i bezpośrednio wykazana za pomocą testu ochrony DNA 13, 14. W tej procedurze in vitro rodniki powstają, gdy żelazo katalizuje degradacjęH2O2poprzez chemię Fentona. Rodniki te bezpośrednio uszkadzają DNA obecne w reakcji i mogą je całkowicie zdegradować w wysokich stężeniach. Dwa kluczowe działania DPS mogą bezpośrednio przeciwdziałać skutkom produkcji rodników, w której pośredniczy Fenton. Dps obniża stężenie katalitycznego żelaza poprzez mineralizację, zużywając w tym procesie dostępny nadtlenek wodoru. Dodatkowo, wiązanie Dps z DNA może potencjalnie chronić go fizycznie przed radykalnym uszkodzeniem i kondensować go do mniejszej objętości o mniejszej reaktywnej powierzchni. Połączenie tych dwóch właściwości sprawia, że test ochrony DNA dobrze nadaje się do pomiaru ochronnej aktywności Dps.
Test ochrony DNA jest dość wszechstronny i może być używany do różnych zastosowań poza charakterystyką Dps. Radykalne uszkodzenia są powszechną formą stresu w komórkach, a do przeciwdziałania im stosuje się wiele różnych białek i substancji chemicznych. Ogólna zasada testu, wykorzystująca integralność DNA jako marker uszkodzenia rodnikowego, może być stosowana w połączeniu z prawie każdą reakcją wytwarzającą rodniki lub środkiem przeciwdziałającym. Test został z powodzeniem wykorzystany między innymi do określenia właściwości przeciwutleniających ekstraktu z K. paniculata do stosowania w przemyśle spożywczym 15, do scharakteryzowania wpływu kwasu moczowego na mediację uszkodzeń hydroksylowych 16 oraz do uzyskania nowych informacji na temat funkcji białek regulatora transkrypcji Fur 17.
Pomimo licznych zastosowań testu w opublikowanych artykułach, stwierdziliśmy, że wymagane było wiele kroków optymalizacyjnych i rozwiązywania problemów, co sprawia, że konfiguracja testu po raz pierwszy jest niepotrzebnie pracochłonnym procesem dla wielu badaczy. Protokół, który przedstawiamy w tym artykule, ma na celu usunięcie tej bariery wejścia.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3)pLysS kompetentne komórki</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>pET-17b DNA</td><td>EMD-Millipore</td><td>69663-3</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Merck</td><td>105033</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR</td><td>443824T</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw koktajlowy inhibitorów proteazy III</td><td>EMD-Millipore</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DFF100</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Kolumny odsalające</td><td>GE Healthcare LS</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>SP-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1799</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centr. Filtr (10K MWCO)</td><td>Milipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>siarczanu żelazawego siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8048</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Calbiochem</td><td>475898</td><td></td></tr><tr><td>roztwór SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator statyczny</td><td>Hettich</td><td>INE500</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem </td><td>Nowy Brunszwik Sc.</td><td>Inova 44</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Rozbijacz komórek</td><td>Constant Systems Ltd.</td><td>TS2/40/AA/AA</td><td></td></tr><tr><td>FPLC Purifier</td><td>General Electric</td><td>AKTA</td><td></td></tr><tr><td>Hermetyczne fiolki</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-08918-85</td><td></td></tr><tr><td>Igły strzykawkowe</td><td>Pipety BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie testu ochrony dna in vitro do wizualizacji właściwości białka dps w zakresie mediacji stresu

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Stres oksydacyjny jest nieuniknionym produktem ubocznym życia tlenowego. Tlen cząsteczkowy jest niezbędny do metabolizmu ziemskiego, ale bierze również udział w wielu szkodliwych reakcjach w organizmach żywych. Połączenie metabolizmu tlenowego i żelaza, które jest kolejnym związkiem niezbędnym do życia, wystarcza do wytworzenia rodników w procesie chemicznym Fentona i degradacji składników komórkowych. Degradacja DNA jest prawdopodobnie najbardziej szkodliwym procesem z udziałem rodników wewnątrzkomórkowych, ponieważ naprawa DNA jest daleka od trywialnej. Test przedstawiony w tym artykule oferuje ilościową technikę pomiaru i wizualizacji wpływu cząsteczek i enzymów na uszkodzenia DNA za pośrednictwem rodników.
Test ochrony DNA jest prostym, szybkim i solidnym narzędziem do charakteryzowania in vitro właściwości ochronnych białek lub substancji chemicznych. Polega ona na wystawieniu DNA na szkodliwą reakcję oksydacyjną i dodaniu różnych stężeń interesującego związku. Zmniejszenie lub zwiększenie uszkodzeń DNA w funkcji stężenia związku jest następnie wizualizowane za pomocą elektroforezy żelowej. W tym artykule demonstrujemy technikę oznaczania ochrony DNA poprzez pomiar właściwości ochronnych białka wiążącego DNA z zagłodzonych komórek (Dps). Dps to mini-ferrytyna, która jest wykorzystywana przez ponad 300 gatunków bakterii do silnego zwalczania stresorów środowiskowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania Dps oraz zoptymalizowane warunki testowe do oceny ochrony DNA przez Dps.

Proces oczyszczania białka Dps opisany w niniejszej procedurze jest bardzo powtarzalny. Oczyszczanie Dps zgodnie z opisanym protokołem, z wykorzystaniem 2 L kultury E. coli jako materiału wyjściowego, zazwyczaj pozwala uzyskać 2,5 ml białka zawierającego Dps12 w stężeniach od 5 do 12 μM. Dłuższy czas indukcji (4 h) wydaje się ograniczać tę zmienność. Czystość białka stale przekracza 99%, co potwierdzają żele SDS-PAGE (Rysunek 1). Poziom zanieczyszczenia DNA jest konsekwentnie pomijaln...

Białko wiążące DNA z wygłodzonych komórek (Dps) odgrywa kluczową rolę w zwalczaniu stresu bakteryjnego. W artykule omówiono oczyszczanie z E. coli Dps oraz protokół testu in vitro wykazujący ochronę DNA przed degradacją przez reaktywne formy tlenu za pośrednictwem Dps.

Zastosowanie testu ochrony DNA in vitro do wizualizacji właściwości białka DPS w zakresie mediacji stresu

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena in vitro efektu ochronnego białka DPS poprzez wizualizację redukcji uszkodzeń DNA indukowanych przez rodniki w wyniku aktywności DPS. Jest to realizowane poprzez wstępne oczyszczenie DPS z komórek e coli z wykorzystaniem kilku kolumn do wymiany jonowej oraz wytrącania siarczanem amonu. W drugim kroku oczyszczony DPS jest dodawany do DNA, co umożliwia utworzenie kompleksu A-D-P-S-D-N-A dzięki nieswoistym właściwościom wiązania DNA przez to białko. Następnie do reakcji dodaje się roztwory żelaza na II stopniu utlenienia oraz nadtlenku wodoru w celu wytworzenia rodników hydroksylowych poprzez chemię Fentona i w ten sposób uszkodzenia DNA.Uzyskane wyniki wykazują redukcję uszkodzeń DNA dzięki obecności DPS, na podstawie ilościowego oznaczenia prążków nieuszkodzonego DNA na żelach agarozowych po elektroforezie. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności podczas przygotowywania odczynników. Prowadzi to do niepożądanych reakcji towarzyszących, takich jak tworzenie się osadów żelaza żelazowego lub spontaniczny rozkład nadtlenku wodoru.Choć metoda ta pozwala na wgląd w aktywność ochronną DPS przeciwko stresowi oksydacyjn

application-an-vitro-dna-protection-assay-to-visualize-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie in vitro testu ochrony DNA do wizualizowania właściwości pośredniczenia stresu białka Dps

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnałowego pęknięć dwuniciowych DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, a także jego lokalizacji podczas mitozy.

Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

Odporność na stres jest jedną z cech charakterystycznych długowieczności i jest znana z tego, że jest genetycznie uwarunkowana. W tym miejscu opracowaliśmy bezstronną, wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych w poszukiwaniu mutacji, które nadają odporność na stres w komórkach ES, za pomocą której opracowaliśmy modele mysie do badań nad długowiecznością.

Zaawansowane podejście genetyczne do odkrycia genów odporności na stres u myszy — wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w komórkach ES

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Msh2-Msh6 odpowiada za inicjację naprawy błędów replikacyjnych w DNA. Przedstawiamy tutaj podejście oparte na kinetyce przejściowej, mające na celu zrozumienie mechanizmu działania tego kluczowego białka. Raport ilustruje eksperymenty z zastosowaniem techniki przepływu zatrzymanego (stopped-flow) w celu pomiaru sprzężonej kinetyki wiązania DNA oraz aktywności ATPase, które leżą u podstaw mechanizmu działania Msh2-Msh6 w procesie naprawy DNA.

Zastosowanie metod kinetyki stop-flow w celu zbadania mechanizmu działania białka naprawczego DNA

Poznaj test ochrony DNA in vitro do badania aktywności białka Dps z E. coli. Ta metoda pozwala wizualizować redukcję uszkodzeń DNA wywołanych stresem oksydacyjnym.

Zastosowanie testu ochrony DNA in vitro do wizualizacji właściwości białka DPS w zakresie mediacji stresu

Przeglądaj więcej filmów