5/6 nefrektomia w połączeniu z dietą bogatą w sól i hamowaniem syntazy tlenku azotu w celu wywołania przewlekłej choroby nerek u szczura Lewisa
3 lipca 2013
Opisano dwuetapową metodę leczenia przewlekłej choroby nerek (PChN) u szczura Lewisa poprzez chirurgiczne usunięcie 5/6 masy nerkowej. Połączenie zabiegu chirurgicznego, hamowania NOS i diety bogatej w sól prowadzi do powstania modelu przypominającego ludzką PChN, co pozwala na badanie mechanizmów przyczynowych i opracowywanie nowych interwencji terapeutycznych.
Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie przewlekłej choroby nerek u szczura linii Lewis. Jest to osiągane poprzez uprzednie podawanie blokera tlenku azotu, NG Nitro, L-argininy lub LNNA przez okres czterech tygodni. Następnie usuwa się całą prawą nerkę.
Następnie po tygodniu usuwa się dwie trzecie lewej nerki. Na koniec, podczas podawania LNNA i stosowania diety wysokosolnej, monitoruje się rozwój niewydolności nerek u szczura w czasie. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące utrwaloną przewlekłą chorobę nerek poprzez pobieranie moczu w celu pomiaru białka oraz oznaczanie hematokrytu i UIA we krwi, osoczu i/lub moczu, a także pomiar ciśnienia tętniczego skurczowego.
Funkcja nerek jest ostatecznie określana przez klirens inuliny oraz stosunek klirensu para-aminohiroksybenzoesanu, czyli klirens PAH. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nefrologii, takie jak lepsze zrozumienie patologii CKD, i może być wykorzystana do badania efektów interwencji terapeutycznych. Na cztery tygodnie przed początkowym zabiegiem nefrektomii należy rozpocząć podawanie 20 mg/L inhibitora syntazy tlenku azotu LNNA w wodzie pitnej szczurów.
Zgodnie z tym harmonogramem, przed rozpoczęciem procedury należy zdezynfekować stół za pomocą 70% alkoholu. W ramach przygotowania do operacji należy wysterylizować następujące instrumenty: jeden koc, jedną pęsetę tkankową Studenta 12 cm z jednym lub dwoma ząbkami, jedną pęsetę Studenta wzoru standardowego, dwie pęsety Simkina, jedne nożyczki Mayo, jedne nożyczki irydologiczne Studenta oraz jeden needle holder Olson-Heger z nożyczkami.
Następnie należy przygotować następujący zestaw materiałów: stół operacyjny z podgrzewaczem i lampą, tlen oraz izofluran, tkanki, shaver, sterylne narzędzia chirurgiczne, sterylne gazy w rozmiarach 5x5 i 10x10, 70% alkohol, 0,9% roztwór chlorku sodu, strzykawkę 1 ml, igły 25G, gąbki żelatynowe, nici Vicryl 4,0 i 5,0, buprenorfinę w dawce 0,03 mg/kg oraz czystą klatkę dla szczurów po operacji.
Po wprowadzeniu w stan anestezji w komorze indukcyjnej przy użyciu 4% izofluranu i podaniu leków przeciwbólowych, w razie potrzeby przenieś szczura na podkładkę grzewczą, kładąc go na lewym boku na stole, i wentyluj za pomocą maski nosowej mieszanką 2% izofluranu i jednego litra tlenu. Wygol bok szczura i odkaź miejsce operacyjne alkoholem.
Ponieważ zabieg odbywa się w warunkach półsterylnych, w celu zapewnienia większej sterylności przygotowania, skórę w miejscu nacięcia dezynfekujemy wyłącznie alkoholem. Można zastosować szorowanie Betadyną; należy założyć czepek i maseczkę, a następnie umyć i zdezynfekować ręce przed założeniem sterylnych rękawiczek chirurgicznych. Następnie, używając pęsety anatomicznej i nożyc tępych, wykonujemy nacięcie o długości od 1 do 1,5 cm równolegle do żeber.
Następnie, poprzez tępe rozczłonkowanie mięśni grzbietu, odsłoń prawą nerkę. Gdy dolny biegun nerki będzie widoczny, użyj małej pęsety tępej, aby ostrożnie chwycić tkankę tłuszczową okołonerkową. Następnie za pomocą pęsety delikatnie pociągnij za tłuszcz okołonerkowy, uważając, aby nie uszkodzić nadnerczy, i wysuń nerkę na zewnątrz, aby oddzielić ją od nadnerczy.
Umieść pęsetę w przyśrodkowej części tkanki tłuszczowej i delikatnie przesuń tkankę ku górze, rozdzielając nadnercze od nerki. Delikatnie połóż nerkę na gazie i oczyść ją z otaczającej tkanki tłuszczowej oraz tkanki łącznej. Zidentyfikuj tętnicę i żyłę nerkową i poluzuj je.
Obwiąż naczynia ligaturą z pojedynczym węzłem, aby zapobiec jej ześlizgnięciu się. Po przecięciu ostrożnie przesuń luźny węzeł wzdłuż naczyń w kierunku aorty, na odległość około 0,5 centymetra, aby stworzyć przestrzeń między nerką a węzłem. Następnie zawiąż dwa podwójne węzły, nie odcinając końców ligatury.
Jeśli perfuzja zostanie pomyślnie zatrzymana, kolor nerki natychmiast zmieni się na brązowy. Następnie należy przeciąć naczynia nerkowe blisko nerki i ją usunąć. Delikatnie pociągnij za długie końce podwiązki, aby sprawdzić, czy nie występuje krwawienie z naczyń nerkowych.
Ligatura powinna pozostać na naczyniu. Odciąć długie końce ligatury. Pozostałe naczynia nerkowe cofaną się do jamy brzusznej.
Niezwłocznie zastosować szwy ciągłe Vicryl 5.0 w celu zamknięcia mięśni szkieletowych kończyny tylnej. Wstrzyknąć domięśniowo buprenorfinę w dawce 0,03 mg/kg. Następnie zastosować szwy podskórne Vicryl 4.0 w celu zamknięcia skóry.
Następnie osusz wyciętą nerkę za pomocą papierowego ręcznika i zważ ją. Pozostaw szczura do rekonwalescencji w czystej, osobnej klatce, umieszczonej w połowie na podkładce grzewczej i z dostępem do pokarmu oraz wody, a następnie monitoruj jego stan zgodnie z protokołem tekstowym. Siedem dni później.
W ramach przygotowania do drugiej operacji oblicz wagę około dwóch trzecich prawej nerki i przygotuj niewielkie fragmenty gąbki żelatynowej. Powtórz pokazaną procedurę, aby wyeksponować lewą nerkę i oddzielić od niej nadnercze. Umieść ostre nożyczki wokół bieguna górnego lewej nerki i zresekuj biegun górny jednym cięciem; natychmiast przykryj miejsce nacięcia fragmentem gąbki żelatynowej i wyryj lekki ucisk za pomocą sterylnej gazy.
Następnie wyciąć dolny biegun nerki i osłonić go w podobny sposób, aby zapobiec krzepnięciu krwi na skórze. Unieść nerkę i za pomocą sterylnej gazy wywierać umiarkowany nacisk na obie podkładki z gąbki żelowej, aż do zatrzymania krwawienia. Jeśli krwawienie nadal występuje przy drugiej podkładce z gąbki, umieścić pozostałą część nerki z przylegającymi podkładkami z gąbki żelowej wewnątrz jamy brzusznej, a następnie zamknąć mięśnie i skórę.
Postępuj zgodnie z opisaną wcześniej procedurą, aby monitorować rekonwalescencję i zapewnić opiekę szczurowi. Po subtotalnej nefrektomii pozostaje około jednej szóstej całkowitej masy nerek. Na tej rycinie przedstawiono obliczony procent usuniętej masy prawej nerki wraz ze średnią i odchyleniem standardowym.
W naszych poprzednich eksperymentach w tygodniu po jednostronnej nefrektomii dochodzi do przerostu lewej nerki, co skutkuje lekkim niedoszacowaniem preferowanej ilości tkanki nerkowej do usunięcia, która była oparta na obliczonej masie prawej nerki. Jednakże, ponieważ nie jest możliwe określenie masy lewej nerki, jest to najdokładniejszy sposób na usunięcie około pięć sześćsći masy nerkowej. Postęp niewydolności nerek jest monitorowany poprzez pobieranie moczu do pomiaru białka i kreatyniny, krwi do oznaczenia mocznika i kreatyniny w osoczu oraz pomiar ciśnienia tętniczego skurczowego.
Klirens kreatyniny można obliczyć, lecz ma on tendencję do niedoszacowania spadku GFR ze względu na intensywną kanalikową sekrecję kreatyniny u szczurów, co podkreśla znaczenie złotej metody określania funkcji nerek za pomocą klirensu inuliny i PAH, której pełną procedurę opisali Conners i wsp. Klirens inuliny i PAH oblicza się na podstawie ich stężenia w próbce moczu, szybkości przepływu moczu oraz ich stężenia w osoczu. Z czasem u szczurów z przewlekłą chorobą nerek (CKD) rozwija się nadciśnienie tętnicze, anemia, białkomocz oraz występuje znaczny spadek szybkości filtracji kłębuszkowej i efektywnego osoczowego przepływu nerkowego.
Po sześciu tygodniach rozwinęła się utrwalona przewlekła choroba nerek (CKD), co stanowi odpowiedni punkt czasowy do testowania interwencji ratunkowych; obserwuje się wówczas silną progresję nadciśnienia tętniczego i białkomoczu, podczas gdy hematokryt i funkcja nerek wykazują łagodne pogorszenie. Inne objawy, na których nie skupiono się w naszych doświadczeniach, obejmują zaburzenia metabolizmu fosforanu wapnia i lipidów oraz wiele innych, w zależności od szczepu szczurów. Rozwój CKD może znacząco różnić się w przypadku wykorzystanego tutaj szczepu szczurów Lewis.
W celu wywołania nadciśnienia i dysfunkcji śródbłonka zastosowano dietę wysokosolną oraz bloker tlenku azotu. To niewielki krok. Technikę tę można przeprowadzić w ciągu około 20 do 50 minut, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak indukowanie przewlekłej choroby nerek u szczurów linii loose reds poprzez wykonywanie stopniowej nefrektomii podskórnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule opisano dwuetapową metodę indukcji przewlekłej choroby nerek (CKD) u szczurów szczepu Lewis. Podejście to łączy chirurgiczne usunięcie części masy nerek, hamowanie tlenku azotu oraz dietę wysokosolną w celu stworzenia modelu naśladującego ludzką CKD.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nefrologia
- Modele zwierzęce
- Badania nad przewlekłą chorobą nerek
Wstęp
- Przewlekła choroba nerek stanowi istotny problem zdrowotny.
- Modele zwierzęce są niezbędne do badania mechanizmów CKD.
- Szczur rasy Lewis jest odpowiednim modelem do tego typu badań.
- Indukowanie CKD może pomóc w testowaniu nowych interwencji terapeutycznych.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu CKD u szczura linii Lewis.
- Zbadanie mechanizmów przyczynowych CKD.
- Ułatwienie opracowania nowych strategii terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Podawanie blokera tlenku azotu (LNNA) przez cztery tygodnie.
- Chirurgiczne usunięcie całej prawej nerki.
- Następnie usunięcie dwóch trzecich lewej nerki tydzień później.
- Monitorowanie niewydolności nerek poprzez analizę moczu i krwi.
Główne wyniki
- Skuteczna indukcja CKD w modelu szczura rasy Lewis.
- Pomiar poziomu białka i hematokrytu w moczu.
- Ocena obecności UIA w osoczu krwi i moczu.
- Monitorowanie zmian ciśnienia skurczowego krwi w czasie.
Wnioski
- Model ten skutecznie symuluje ludzką CKD.
- Pozwala on na lepsze zrozumienie mechanizmów niewydolności nerek.
- Istnieje potencjał do testowania nowych interwencji terapeutycznych w leczeniu CKD.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie przemysłowe
Model nefrektomii 5/6 u szczurów linii Lewis, w połączeniu z dietą wysokosolną i inhibicją syntazy tlenku azotu, stanowi solidny system przedkliniczny do badania progresji przewlekłej choroby nerek (CKD) oraz interwencji terapeutycznych. Ten zintegrowany model umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka i zwiększa wiarygodność prognostyczną badań translacyjnych ukierunkowanych na CKD. Jego wyniki ilościowe oraz cechy istotne dla przebiegu choroby wspierają decyzje dotyczące portfela projektów z uwzględnieniem ryzyka we wczesnych etapach odkrywania leków i w rurociągach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie patofizjologii CKD oraz walidację hipotez mechanistycznych w kontrolowanych warunkach in vivo.
- Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez modelowanie postępującego uszkodzenia kłębuszkowego i cewkowo-śródmiąższowego, odpowiadającego przebiegowi choroby u ludzi.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celów terapeutycznych oraz selekcji szlaków związanych z CKD.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany model zwierzęcy do oceny potencjalnych interwencji oraz ich wpływu na funkcję nerek.
- Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych wyników, takich jak klirens inuliny i PAH, białkomocz oraz ciśnienie tętnicze.
- Umożliwia powtarzalną ocenę skuteczności związków w kontekście istotnym dla danej jednostki chorobowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z cechami ludzkiej CKD, co wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów oraz walidację przedkliniczną.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po testy przedkliniczne poprzez modelowanie postępującej dysfunkcji nerek i nadciśnienia.
- Stanowi podstawę do podejmowania decyzji o rozwoju programów terapeutycznych w CKD z uwzględnieniem oceny ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten jest przeznaczony do zastosowań na etapach od wczesnego odkrywania, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po walidację przedkliniczną w badaniach nad CKD.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów CKD oraz zaangażowania poszczególnych szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe i powtarzalne wyniki do oceny związków oraz weryfikacji gotowości testu.
- Analityka: Umożliwia pomiar GFR, ERPF, białkomoczu oraz ciśnienia tętniczego w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkrywczą z fazą przedkliniczną dzięki zastosowaniu punktów końcowych istotnych dla choroby oraz dopasowaniu biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do iteracyjnego testowania interwencji w CKD oraz badań mechanistycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad CKD.
- Wartość operacyjna: standaryzuje procedury i wyniki ilościowe w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez modelowanie progresji CKD istotnej dla ludzi.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na terapie CKD.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgicznej nefrektomii oraz prowadzenia modeli zwierzęcych.
- Wymaga dostępu do infrastruktury analitycznej do pomiaru klirensu inuliny i PAH.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów chirurgicznych i analitycznych pomiędzy zespołami.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla różnych szczepów szczurów lub podtypów CKD.
- W projekcie badania należy uwzględnić zmienność modelu oraz odpowiedzi specyficzne dla danego szczepu.
