1.12: Wprowadzenie do mikroskopii fluorescencyjnej

Fluorescencja to zjawisko, które ma miejsce, gdy substancja pochłania światło o danej długości fali i emituje światło o innej długości fali. Fluorescencja zachodzi, gdy elektron, który został wzbudzony do wyższego i bardziej niestabilnego stanu energetycznego, rozluźnia się do stanu podstawowego i wydziela foton światła. Światło odpowiedzialne za wzbudzenie, czyli przeniesienie elektronu do wyższego stanu energetycznego, ma krótszą długość fali i wyższą energię niż emisja fluorescencji, która ma dłuższą długość fali, niższą energię i inny kolor.

Mikroskopia fluorescencyjna łączy w sobie właściwości powiększające mikroskopu świetlnego z technologią fluorescencyjną, która umożliwia wzbudzenie i wykrycie emisji z fluoroforów - fluorescencyjnych związków chemicznych. Dzięki mikroskopii fluorescencyjnej naukowcy mogą obserwować lokalizację określonych typów komórek w tkankach lub cząsteczek w komórkach.

Główne elementy mikroskopu fluorescencyjnego w dużym stopniu pokrywają się z tradycyjnym mikroskopem świetlnym. Jednak 2 główne różnice to rodzaj źródła światła i zastosowanie specjalistycznych elementów filtrujących.

Mikroskopia fluorescencyjna wymaga bardzo silnego źródła światła, takiego jak ksenonowa lub rtęciowa lampa łukowa, taka jak ta pokazana tutaj. Światło emitowane przez rtęciową lampę łukową jest 10-100 razy jaśniejsze niż większość żarówek i zapewnia światło w szerokim zakresie długości fal, od ultrafioletu po podczerwień. To źródło światła o dużej mocy jest najbardziej niebezpieczną częścią zestawu mikroskopu fluorescencyjnego, ponieważ patrzenie bezpośrednio w niefiltrowane światło może poważnie uszkodzić siatkówkę, a niewłaściwe obchodzenie się z żarówkami może spowodować ich eksplozję.

Zasada działania mikroskopii fluorescencyjnej jest prosta. Gdy światło opuszcza lampę łukową, jest kierowane przez filtr wzbudnicy, który wybiera długość fali wzbudzenia.

Światło to jest odbijane w kierunku próbki przez specjalne lustro zwane lustrem dichroicznym, które jest zaprojektowane tak, aby odbijać światło tylko na długości fali wzbudzenia. Odbite światło przechodzi przez obiektyw, gdzie jest skupiane na próbce fluorescencyjnej. Emisje z próbki są z kolei przekazywane z powrotem przez obiektyw – gdzie następuje powiększenie obrazu – a teraz przez zwierciadło dichroiczne.

Światło to jest filtrowane przez filtr barierowy, który dobiera długość fali emisji i odfiltrowuje zanieczyszczające światło z lampy łukowej lub innych źródeł, które odbijają się od elementów mikroskopu. Na koniec przefiltrowana emisja fluorescencyjna jest wysyłana do detektora, gdzie obraz może zostać zdigitalizowany lub przesłany do okularu w celu oglądania optycznego.

Filtr wzbudnicy, zwierciadło dichroiczne i filtr barierowy można zmontować razem w element znany jako kostka filtrująca. Podczas oglądania próbki można zmieniać różne kostki filtracyjne, aby zmienić długość fali wzbudzenia, a do modyfikacji intensywności wzbudzenia można użyć szeregu membran.

Jeśli chodzi o wykonywanie mikroskopii fluorescencyjnej, fluorofor może być tak samo ważny jak sam mikroskop, a rodzaj obrazowanego fluoroforu decyduje o używanej długości fali wzbudzenia i wykrywanej długości fali emisyjnej. Długości fal wzbudzenia zawierają niewielki zakres energii, które mogą zostać pochłonięte przez fluorofor i spowodować jego przejście w stan wzbudzony. Po wzbudzeniu możliwy jest szeroki zakres emisji lub przejścia z powrotem do niższego stanu energetycznego, co skutkuje widmem emisyjnym.

Różnica między szczytem krzywej absorpcji lub wzbudzenia a szczytem krzywej emisji jest znana jako przesunięcie Stoke'a. Im większa odległość w tym przesunięciu, tym łatwiej jest oddzielić dwie różne długości fal. Dodatkowo, wszelkie nakładające się widmo musi zostać usunięte przez komponenty kostki filtra, aby zmniejszyć tło i poprawić jakość obrazu.

Wystawienie fluoroforu na długotrwałe wzbudzenie spowoduje jego fotowybielanie, czyli osłabienie lub utratę fluorescencji. Aby ograniczyć fotowybielanie, możesz dodać do szkiełka środek montażowy zapobiegający blaknięciu i uszczelnić krawędzie lakierem do paznokci. Slajd powinien być również przechowywany w ciemności, gdy nie jest obrazowany.

Aby rozpocząć obrazowanie fluorescencyjne, włącz ksenonowe lub rtęciowe źródło światła i pozwól mu się rozgrzać nawet przez 15 minut, aby osiągnęło stałe oświetlenie.

Następnie umieść próbkę na stoliku i zabezpiecz ją na miejscu. Następnie włącz źródło białego światła w mikroskopie. Skoncentruj się na próbce za pomocą obiektywu o najniższej mocy, regulując pokrętła ostrości zgrubnej i precyzyjnej. Następnie użyj pokręteł regulacji stage, aby znaleźć obszar zainteresowania.

Następnie wyłącz źródło białego światła, a także wszelkie niepotrzebne światła w pomieszczeniu, aby zmniejszyć tło.

Wybierz odpowiednią kostkę filtra dla barwnika, który obrazujesz, i otwórz migawkę, aby oświetlić próbkę.

Na koniec dokonaj precyzyjnej regulacji ostrości i skieruj światło wyjściowe na kamerę do przetwarzania obrazu. Prawdopodobnie będziesz musiał dostosować czas ekspozycji dla każdego użytego fluoroforu lub barwnika fluorescencyjnego. Jednak ważne jest, aby utrzymać stały czas ekspozycji podczas porównywania cech z tym samym barwnikiem na różnych próbkach.

Aby zobrazować wiele barwników na tej samej próbce, zmień kostkę filtrującą tak, aby pasowała do każdego fluoroforu i zapisz nowy obraz.

Po zobrazowaniu każdego barwnika w próbce, poszczególne obrazy mogą być nakładane i łączone.

Wiele różnych rodzajów eksperymentów może wykorzystywać mikroskopię fluorescencyjną i obejmować różne rodzaje fluoroforów Jednym z najczęstszych zastosowań mikroskopii fluorescencyjnej jest obrazowanie białek, które zostały znakowane przeciwciałami, które są przyłączone lub "sprzężone" ze związkami fluorescencyjnymi. W tym przypadku wykryto przeciwciało przeciwko białkom powierzchniowym leptospirali przy użyciu przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z aleksandrem-488, które fluoryzuje na zielono po wzbudzeniu.

Innym sposobem na podkreślenie określonej cechy fluorescencji jest zintegrowanie kodu białka fluorescencyjnego, takiego jak białko zielonej fluorescencji lub GFP, z DNA organizmu. Gen GFP został pierwotnie wyizolowany z meduzy i może być wyrażany lub wytwarzany przez hodowane komórki w odpowiedzi na określone wyzwalacze lub jako część określonego typu komórek, takich jak komórki nowotworowe pokazane na tym obrazie

Innym zastosowaniem obrazowania fluorescencyjnego jest fluorescencyjna mikroskopia plamkowa, która jest technologią wykorzystującą znakowane fluorescencyjnie zespoły makromolekularne, takie jak sieć F-aktyny widoczna tutaj, do badania kinetyki ruchu i obrotu tego ważnego białka cytoszkieletu.

Zaawansowana technika znana jako odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu lub FRAP polega na celowym fotowybielaniu małego obszaru próbki w celu monitorowania szybkości dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek z powrotem do fotobielonego obszaru.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do mikroskopii fluorescencyjnej.

W tym filmie dowiedzieliśmy się o koncepcji fluorescencji, o tym, czym mikroskopia fluorescencyjna różni się od mikroskopii świetlnej i jak wykonać obraz fluorescencyjny przez lunetę. Dowiedzieliśmy się również o niektórych podstawowych i zaawansowanych aplikacjach, które wykorzystują fluorescencję. Dziękujemy za oglądanie i nie zapominaj, że chociaż fotowybielanie wygląda świetnie na twoich zębach, nie jest tak dobre dla twoich próbek.