Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy
May 16th, 2013
Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie wpływu zmian w stosunku i względnym czasie pobudzających i hamujących wejść synaptycznych na aktywność impulsową neuronów wykorzystujących komórki zwojowe siatkówki jako neurony modelowe. Osiąga się to poprzez łatanie ciała komórki zwojowej w całej siatkówce, za pomocą szklanej pipety wypełnionej roztworem wewnątrzkomórkowym, który przypomina fizjologiczny skład jonowy i żółtym Lucyferem w celu morfologicznej identyfikacji typu komórki jako drugi krok za pomocą dynamicznego zacisku, zestaw pobudzających i hamujących form fal przewodnictwa jest wstrzykiwany do ciała komórki, które w odpowiedzi powodują zmianę potencjału błonowego. Następnie do ciała komórki wstrzykiwane są różne przebiegi przewodnictwa uzyskane z eksperymentów fizjologicznych w warunkach kontrolnych lub w obecności leków w celu uzyskania odpowiednich odpowiedzi neuronalnych.
Wyniki pokazują wpływ zmian stosunku pobudzenia i hamowania na aktywność impulsową komórek zwojowych siatkówki w oparciu o wstrzykiwanie prądów złożonych z przewodnictwa pobudzającego i hamującego za pomocą dynamicznych zapisów klamrowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cęgi prądowe lub cęgi napięciowe, jest to, że zapewnia interaktywne narzędzie, za pomocą którego stosunek i względny czas pobudzających i hamujących przewodnictwa synaptycznego można wstrzykiwać do neuronów w celu zbadania wpływu na odpowiedzi komórkowe. Metodologia ta może dostarczyć informacji na temat funkcji obwodów siatkówki, a także wszelkich innych sieci neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym.
Rozpocznij tę procedurę od ustawienia systemu reperfuzyjnego z 250 mililitrami karboksylowo natlenionego podłoża celowniczego w układzie elektrofizjologicznym. Następnie równomiernie rozsmaruj cienką warstwę smaru próżniowego na dnie komory perfuzyjnej. Uszczelnij go szkiełkiem nakrywkowym i upewnij się, że jest szczelny.
Następnie umieść niewielką ilość smaru na górnym i dolnym końcu komory. Smar utrzyma siatkę na miejscu i zapobiegnie zbyt mocnemu naciskaniu na siatkówkę. Teraz przymocuj komorę do platformy, a następnie wyrównaj oba otwory.
Złożyć zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy po znieczuleniu izofluorem. Szybko usuń jego oczy za pomocą małych zakrzywionych nożyczek. Umyj je dokładnie natlenionym płynem zewnątrzkomórkowym w małej zlewce i umieść na szalce Petriego wypełnionej natlenionym płynem zewnątrzkomórkowym w samochodzie.
Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj otwór wprowadzający za pomocą igły o rozmiarze 19 w rogówce około dwóch milimetrów od krawędzi obu oczu. Ten ważny krok powinien być szybki, aby umożliwić natlenienie obu wodzy. Następnie usuń jedną rogówkę za pomocą małych nożyczek do tęczówki, przecinając równolegle do jej krawędzi.
Następnie usuń tęczówkę i soczewkę za pomocą cienkich kleszczyków i powtórz procedury dla drugiego oka. Przenieść jedną muszlę oczną do zlewki zawierającej natleniony roztwór zewnątrzkomórkowy z kartonu. Za pomocą ostrza skalpela przeciąć jedną muszlę oczną na pół, delikatnie oddzielić siatkówkę od nabłonka barwnikowego za pomocą sondy preparacyjnej lub delikatnie ją ściągając.
Następnie przytrzymaj krawędź oderwanej tkanki siatkówki blisko aury Serta za pomocą pary cienkich kleszczy i chwyć aurę serta kolejną parą cienkich kleszczyków. Pociągnij go w kierunku środka siatkówki. Jest to delikatny proces i może wymagać kilku prób.
Jeśli aura się powiedzie, ciało rzęskowe Serta i ciało szkliste zostaną usunięte, a krzywizna siatkówki zostanie zmniejszona. Następnie przytnij krawędzie, a następnie przenieś siatkówkę do komory perfuzyjnej Z komórkami zwojowymi skierowanymi do góry. Przytrzymaj chusteczkę na miejscu, umieszczając siatkę na kulkach smarowych.
Zachowaj pozostałą tkankę z drugą muszlą oczną w pudełku z natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym do późniejszego wykorzystania, zamontuj komorę rejestracyjną pod pionowym mikroskopem. Natychmiast wyreguluj ciągłą perfuzję siatkówki za pomocą natlenionego roztworu zewnątrzkomórkowego z karboksem W tempie od trzech do pięciu mililitrów na minutę w temperaturze 35,5 stopni Celsjusza upewnij się, że elektroda uziemiająca jest na swoim miejscu. Teraz włącz źródło światła mikroskopu i skieruj jego ostrość na ciała komórek zwojowych przez 40-krotny obiektyw.
Zlokalizuj środek uchwytu otworu do nagrywania. Na tym etapie zamocuj szklaną pipetę o sile od pięciu do ośmiu megaomów w uchwycie i przesuń ją pod mikroskopem za pomocą manipulatora mikrom pod obiektywem 40x. Powoli opuść pipetę, aż utworzy małe wgłębienie na powierzchni wewnętrznej membrany ograniczającej.
Ostrożnie przesuń pipetę do przodu, aż złapie niewielką ilość tkanki, a następnie przesuń ją w górę i/lub na boki, aby wyrwać mały otwór i odsłonić ciała komórek zwojowych. Teraz napełnij czystą pipetę ośmioma do 10 mikrolitrami, wewnątrzkomórkowym roztworem na bazie potasu z żółtym Lucyferem. Włóż go do uchwytu, przymocowanego do amplifier głowica stage i upewnij się, że elektroda chlorowanego chlorku srebra jest zanurzona.
Zaznacz komórkę z dużą treścią komórki. Powoli opuść końcówkę pipety z nadciśnieniem, aby zrobić małe wgłębienie na powierzchni membrany. Następnie zatrzymaj się i zwolnij ciśnienie, aby uzyskać giga uszczelnienie.
Po uzyskaniu giga uszczelnienia delikatnie zastosuj podciśnienie, aby przerwać membranę, aby uzyskać konfigurację zacisku krosowego całego ogniwa. Ta procedura jest delikatnym krokiem. Jeśli zostanie przyłożone zbyt duże podciśnienie, połączenie staje się nieszczelne.
Jeśli jest za mało, membrana pozostaje nienaruszona. Z biegiem czasu żółty Lucyfer wypełni komórkę, umożliwiając wizualizację morfologii komórki, jeśli jest stabilna. Ta konfiguracja powinna trwać 30 minut lub dłużej.
Teraz przeprowadź test napięcia prądu od minus 75 miliwoltów do dodatnich 35 miliwoltów co 10 miliwoltów za pomocą patch mastera i przejdź do późniejszych testów. Tylko wtedy, gdy obecny jest prąd sodowy większy niż jeden nanoamper. Następnie otwórz widok laboratorium i wykonaj niestandardowy napisany program neuro acuma.
Ustaw liczbę powtórzeń na osiem. Następnie ustaw potencjały odwrócenia przewodnictwa pobudzającego i hamującego odpowiednio na zero i minus 75 miliwoltów. Wybierz jedną pasującą parę przewodnictwa pobudzającego i hamującego do testowania, a zielony ślad przewodnictwa pobudzającego i czerwony ślad przewodnictwa hamującego pojawią się w dolnym panelu.
Następnie wróć do patch mastera i wybierz bieżący tryb zacisku. Natychmiast przełącz wzmacniacz w tryb cęgów prądowych w neuro acuma. Naciśnij przycisk nagrywania.
Odpowiedź komórkowa z afazyjnym wybuchem potencjałów czynnościowych pojawi się na górnym panelu. Następnie wstrzyknij prąd do ogniwa o niskiej przewodności. Po pierwsze, jeśli zaobserwuje się niewielką reakcję lub nie zaobserwujesz jej wcale, zwiększaj prąd małymi krokami, aż uzyska silną odpowiedź.
Nadmierny wtrysk prądu może zabić ogniwo. Po zakończeniu testów. Wybierz nową parę przebiegów przewodności i powtórz procedury dla wszystkich par przewodności fizjologicznych i sztucznych.
Po nagraniu ostrożnie wsuń pipetę, aby korpus komórki pozostał nienaruszony. Następnie natychmiast utrwal tkankę i 4% para formaldehyd przez 30 minut, a następnie trzy 10-minutowe płukanie 0,1-molowym buforem fosforanowym, wstaw do lodówki i wykonaj barwienie przeciwciał następnego dnia lub w ciągu tygodnia, gdy są gotowe. Zabarwienie przeciwko żółtym komórkom zwojowym Lucyfera w temperaturze pokojowej pierwszorzędową żółtą igG królika anty Lucyfera w rozcieńczeniu od jednego do 10 000 przez pięć dni.
Następnie szóstego dnia, pozostając na noc z wtórnym kozim przeciwciałem anty króliczym IgG, dodaj rozcieńczenie od jednego do 500 Na koniec na mokro zamontuj siatkówkę w fluorescencyjnym podłożu konserwującym. Umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelnij lakierem do paznokci. Wykonaj konfokalne obrazy morfologii komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica SPECT.
Oto reakcje komórki zwojowej na wstrzyknięcie przewodnictwa pobudzającego i hamującego Formy fal uzyskane z eksperymentów kontrolnych oznaczone odpowiednio na zielono i czerwono. A oto reakcje na wstrzyknięcie przebiegów konduktancji zarejestrowanych po zastosowaniu tetrodatoksyny w kąpieli. Oto reakcje innej komórki zwojowej na różne pary ramion przebiegów przewodnictwa.
Stosunki między przewodnictwem pobudzającym a przewodnictwem hamującym zostały zmienione z jednego do zera na jeden do dwóch. Wraz ze wzrostem stopnia zahamowania zmniejszała się odpowiedź komórki, a oto reakcje komórki zwojowej na ten sam poziom wzbudzenia, w którym początek hamowania był zróżnicowany. Delta T reprezentuje różnicę czasu między początkiem przewodnictwa hamującego i pobudzającego.
W miarę zmniejszania się opóźnienia hamowania, odpowiedź komórki stawała się słabsza. Ta procedura jest potężną techniką, która pomaga ujawnić interakcje między exci three a hamującymi danymi wejściowymi synap, które generują wyjście neuronalne.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł wideo demonstruje procedury łatania ciał komórkowych i wdrażania nagrań z zaciskami dynamicznymi z komórek zwojowych w całoście siatkówki mysich oczu. Ta technika pozwala na badanie pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich wpływu na wyładowania neuronalne.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Elektrofizjologia
- Fizjologia siatkówki
Tło
- Komórki zwojowe siatkówki są kluczowe dla przekazywania informacji wzrokowych.
- Zrozumienie proporcji wejść synaptycznych jest niezbędne do wyjaśnienia zachowania neuronów.
- Techniki zacisków dynamicznych ulepszają tradycyjne metody elektrofizjologiczne.
- To badanie koncentruje się na interakcji między pobudzającymi i hamującymi wejściami.
Cel badania
- Zbadanie, jak zmiany w proporcjach wejść synaptycznych wpływają na wyładowania neuronalne.
- Wykorzystanie zacisków dynamicznych do manipulacji przewodności synaptycznych w czasie rzeczywistym.
- Dostarczenie wnikliwych informacji na temat funkcji obwodów siatkówki.
Stosowane metody
- Łatania ciał komórek zwojowych w całoście siatkówki.
- Wstrzyknięcie fal przewodności za pomocą zacisków dynamicznych.
- Oceny reakcji neuronów na różne pobudzające i hamujące wejścia.
- Porównanie wyników w warunkach kontrolnych i pod wpływem leków.
Główne wyniki
- Wykazane wpływy proporcji wejść synaptycznych na aktywność wyładowań.
- Podkreślenie zalet zacisków dynamicznych w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Dostarczenie danych na temat wpływu czasowania i wielkości wejść na reakcje neuronalne.
- Wykazanie potencjalnych zastosowań do zrozumienia innych sieci neuronowych.
Wnioski
- Zaciskami dynamicznymi jest potężnym narzędziem do badania zachowania neuronów.
- Uzyskane wnioski mogą wpłynąć na badania obwodów siatkówkowych i ośrodkowego układu nerwowego.
- Wymaga dalszego badania interakcji synaptycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding the precise balance of excitatory and inhibitory synaptic inputs is critical for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. Dynamic clamp enables real-time manipulation of conductance waveforms to probe how input ratios influence neuronal output, providing predictive confidence in mechanistic hypotheses. This approach supports early discovery by clarifying pathway function and reducing ambiguity in target engagement models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by testing how changes in excitation-inhibition ratios affect spiking output in disease-relevant neuronal models.
- Operational Value: Isolate independent variables (conductance waveforms) to clarify causal relationships between synaptic inputs and neuronal responses.
- Scientific Value: Enable mechanistic de-risking by quantifying how inhibitory delay or magnitude modulates cellular excitability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare validated neuronal systems for downstream compound screening by establishing baseline input-output relationships under controlled conductance conditions.
- Operational Value: Generate quantitative, reproducible measurements of spiking activity as a dependent variable for assay standardization.
- Operational Value: Support platform reuse by applying artificial conductance waveforms (e.g., alpha functions) to screen modulatory compounds across multiple neuronal types.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Assess disease relevance by comparing conductance waveforms from control versus drug-treated conditions to identify pathophysiological shifts in synaptic balance.
- Operational Value: Enable translational continuity from discovery through preclinical validation by using consistent dynamic clamp protocols across model systems.
- Scientific Value: Inform risk-adjusted advancement decisions by linking synaptic input dynamics to neuronal output phenotypes predictive of circuit function.
Pipeline & Workflow Integration
Dynamic clamp fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to assay readiness for lead identification, particularly when supported by quantitative electrophysiological readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing precise injection of excitatory and inhibitory conductances to isolate their individual and combined effects on spiking.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible neuronal responses to standardized conductance waveforms, enabling reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (e.g., spike frequency, burst patterns) that allow teams to compare conditions and assess compound effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using disease-relevant conductance waveforms derived from physiological or pharmacologically altered states.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for probing synaptic interactions across diverse neuronal models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct manipulation of synaptic conductances and observation of neuronal output.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via real-time feedback-controlled current injection based on membrane potential and predefined conductance parameters.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in how synaptic balance influences network function.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative assessment of how input ratio changes alter spiking phenotypes in model systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in patch clamp electrophysiology and real-time dynamic clamp software integration.
- Dependent on stable whole-cell configuration and accurate measurement of instantaneous membrane potential for conductance calculation.
- Necessitates cross-team standardization of conductance waveform parameters (amplitude, timing, reversal potentials) for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different neuronal types or disease models with varying baseline excitability.
- Limited by the need for precise temporal control and fidelity of conductance waveform injection to accurately simulate synaptic dynamics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:05
General Set Up and Tissue Preparation
5:32
Patching Cell Bodies of Retinal Ganglion Cells
7:20
Recordings of Ganglion Cells Using Dynamic Clamp
9:12
Antibody Staining Against Lucifer Yellow Filled Retinal Ganglion Cells
10:14
Results: Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells
11:27
Conclusion
