Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie wpływu zmian stosunku oraz względnego czasu wystąpienia pobudzających i hamujących sygnałów synaptycznych na aktywność impulsową neuronów, wykorzystując komórki zwojowe siatkówki jako neurony modelowe. Osiąga się to poprzez rejestrację potencjałów z ciała komórki zwojowej w preparacie całej siatkówki, przy użyciu szklanej pipety wypełnionej roztworem wewnątrzkomórkowym o składzie jonowym zbliżonym do fizjologicznego oraz barwnikiem Lucifer yellow w celu morfologicznej identyfikacji typu komórki. W drugim kroku, z wykorzystaniem metody dynamic clamp, do ciała komórki wstrzykuje się zestaw przebiegów fali przewodnictwa pobudzającego i hamującego, co wywołuje zmianę potencjału błonowego jako odpowiedź. Następnie do ciała komórki wstrzykuje się różne przebiegi przewodnictwa uzyskane w eksperymentach fizjologicznych w warunkach kontrolnych lub w obecności leków, aby uzyskać odpowiadające im odpowiedzi neuronalne.

Wyniki pokazują wpływ zmian stosunku pobudzenia i hamowania na aktywność impulsacyjną komórek zwojowych siatkówki, w oparciu o wstrzykiwanie prądów składających się z przewodnictw pobudzających i hamujących za pomocą rejestracji metodą dynamic clamp. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak current clamp czy voltage clamp, jest to, że stanowi ona interaktywne narzędzie, za pomocą którego stosunek i względny czas przewodnictw synaptycznych pobudzających i hamujących mogą być wstrzykiwane do neuronów w celu zbadania ich wpływu na odpowiedzi komórkowe. Metodologia ta może dostarczyć wiedzy na temat funkcji obwodów siatkówki, jak również dowolnych innych sieci neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania systemu reperfuzji z 250 ml medium Aims nasyconego tlenem i węglanem w układzie elektrofizjologicznym. Następnie równomiernie nanieś cienką warstwę smaru próżniowego na dno komory perfuzyjnej. Zamknij ją za pomocą szkiełka nakrywkowego i upewnij się, że jest ono szczelne.

Następnie nanieś niewielką ilość smaru na górną i dolną krawędź komory. Smar utrzyma siatkę na miejscu i zapobiegnie zbyt silnemu uciskowi na siatkówkę. Teraz zamocuj komorę na platformie, a następnie wyrównaj oba otwory.

Uśmierć zwierzę poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych po uprzednim znieczuleniu izofluranem. Szybko usuń oczy za pomocą małych zakrzywionych nożyczek. Przemyj je dokładnie w małym zlewku zawierającym natleniony płyn pozakomórkowy dla zwierząt, a następnie umieść w szalce Petriego wypełnionej natlenionym płynem pozakomórkowym dla zwierząt.

Pod mikroskopem dissectingowym wykonaj otwór w rogówce obu oczu za pomocą igły 19G, około dwóch milimetrów od krawędzi. Ten istotny krok powinien być przeprowadzony szybko, aby zapewnić utlenowanie obu rogówek. Następnie usuń jedną rogówkę za pomocą małych nożyczek do tęczówki, przecinając ją równolegle do jej krawędzi.

Następnie za pomocą precyzyjnej pęsety usuń tęczówkę i soczewkę, a następnie powtórz te czynności dla drugiego oka. Przenieś jedną czaszę oka do zlewki zawierającej natleniony roztwór pozakomórkowy z karboksem. Za pomocą ostrza skalpela przetnij jedną czaszę oka na pół, a następnie delikatnie oddziel siatkówkę od nabłonka pigmentowego, używając tępej sondy sekcyjnej lub delikatnie ją odciągając.

Następnie należy przytrzymać krawędź oddzielonej tkanki siatkówki blisko ora serrata za pomocą jednej pary precyzyjnych pincet, a następnie chwycić ora serrata drugą parą precyzyjnych pincet. Przeciągnij ją w kierunku środka siatkówki. Jest to proces delikatny i może wymagać kilku prób.

W przypadku sukcesu ciała rzęskowego oraz ciała szklistego zostaną usunięte, a krzywizna siatkówki zostanie zredukowana. Następnie należy przyciąć krawędzie, a potem przenieść siatkówkę do komory perfuzyjnej stroną z komórkami zwojowymi do góry. Tkankę należy unieruchomić, kładąc siatkę na kulkach smaru.

Pozostałą tkankę wraz z drugim uchwytem do oka należy przechowywać w natlenionym roztworze zewnątrzkomórkowym CARBOX do późniejszego użycia; zamontuj komorę rejestracyjną pod mikroskopem pionowym. Natychmiast ustaw ciągłą perfuzję siatkówki natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym CARBOX z prędkością od 3 do 5 ml/min w temperaturze 35,5 °C, upewniając się, że elektroda uziemiająca jest na swoim miejscu. Następnie włącz źródło światła mikroskopu i ustaw ostrość na ciałach komórek komórek zwojowych, korzystając z obiektywu 40x.

Zlokalizuj środek otworu montażowego do rejestracji. W tym kroku zamocuj w uchwycie szklaną pipetę o oporności od pięciu do ośmiu megaomów i przesuń ją pod mikroskop za pomocą mikromanipulatora, korzystając z obiektywu 40x. Powoli obniżaj pipetę, aż powstanie niewielkie wgłębienie na powierzchni wewnętrznej błony ograniczającej.

Ostrożnie przesuwaj pipetę do przodu, aż pobierze niewielką ilość tkanki, a następnie przesuń ją w górę i/lub na boki, aby rozedrzeć mały otwór i odsłonić ciała komórek zwojowych. Teraz napełnij czystą pipetę od 8 do 10 µL wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie potasu z Lucifer yellow. Włóż ją do uchwytu przymocowanego do głowicy wzmacniacza i upewnij się, że elektroda srebrowo-chlorkowa jest zanurzona.

Wybierz komórkę o dużym ciele komórkowym. Powoli obniż końcówkę pipety, stosując dodatnie ciśnienie, aby utworzyć niewielkie wgłębienie na powierzchni błony. Następnie przerwij i zwolnij ciśnienie, aby uzyskać giga-uszczelnienie (giga seal).

Po uzyskaniu giga-uszczelnienia (giga seal), należy delikatnie przyłożyć podciśnienie, aby przerwać błonę i uzyskać konfigurację patch-clamp w trybie całej komórki (whole cell). Procedura ta jest etapem wymagającym dużej precyzji. Zastosowanie zbyt dużego podciśnienia może spowodować nieszczelność połączenia.

Jeśli ilość będzie zbyt mała, błona pozostanie nienaruszona. Z czasem Lucifer yellow wypełni komórkę, co pozwoli na wizualizację morfologii komórki, o ile ta pozostanie stabilna. Taka konfiguracja powinna być utrzymana przez 30 minut lub dłużej.

Następnie przeprowadź test prądowo-napięciowy od -75 mV do +35 mV w krokach co 10 mV przy użyciu programu Patch Master i przejdź do dalszych testów, pod warunkiem wystąpienia prądu sodowego większego niż 1 nA. Następnie otwórz program LabVIEW i uruchom dedykowany program Neuro Acuma.

Ustaw liczbę powtórzeń na osiem. Następnie ustaw potencjały odwrócenia dla przewodnictw pobudzających i hamujących odpowiednio na 0 i -75 mV. Wybierz jedną pasującą parę przewodnictw pobudzających i hamujących do testu, wówczas w dolnym panelu pojawi się zielony ślad przewodnictwa pobudzającego oraz czerwony ślad przewodnictwa hamującego.

Następnie powróć do patch master i wybierz tryb clamp prądowy. Bezzwłocznie przełącz wzmacniacz w tryb clamp prądowy w programie neuro acuma. Naciśnij przycisk nagrywania.

Odpowiedź komórkowa z afazycznym wyładowaniem potencjałów czynnościowych pojawi się w górnym panelu. Następnie należy wstrzyknąć prąd do komórki o niskiej przewodności. Jeśli początkowo zaobserwuje się słabą odpowiedź lub jej brak, należy zwiększać prąd w małych przyrostach, aż do uzyskania silnej odpowiedzi.

Nadmierny wtrysk prądu może doprowadzić do śmierci komórki. Po zakończeniu testów należy wybrać nową parę przebiegów przewodnictwa i powtórzyć procedury dla wszystkich par przewodnictw fizjologicznych i sztucznych.

Po zakończeniu rejestracji ostrożnie wycofaj pipetę, aby nie uszkodzić ciała komórki. Następnie niezwłocznie utrwal tkankę w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut, a potem trzykrotnie przemyj przez 10 minut buforem fosforanowym 0,1 M; schłodź próbkę i przeprowadź barwienie przeciwciałami następnego dnia lub w ciągu tygodnia, gdy będą gotowe. Barwienie komórek zwojowych wypełnionych Lucifer yellow przeprowadź w temperaturze pokojowej, stosując pierwotne przeciwciało królicze anty-Lucifer yellow IgG w rozcieńczeniu 1:10 000 przez pięć dni.

Następnie w szóstym dniu, po inkubacji przez noc z wtórnym przeciwciałem kozim anty-króliczym IgG, dodać rozcieńczenie 1:500. Na koniec przygotować preparat świeży siatkówki w medium konserwującym fluorescencję. Nałożyć szkiełko nakrywkę i uszczelnić lakierem do paznokci. Wykonać obrazy konfokalne morfologii komórek przy użyciu konfokalnego mikroskopu Leica SPECT two.

Oto odpowiedzi komórki zwojowej na wstrzyknięcie pobudzających i hamujących przebiegów przewodnictwa; przebiegi uzyskane w eksperymentach kontrolnych zaznaczono odpowiednio na kolor zielony i czerwony. A tutaj przedstawiono odpowiedzi na wstrzyknięcie przebiegów przewodnictwa zarejestrowanych po aplikacji tetrodotoksyny do kąpieli. Oto odpowiedzi innej komórki zwojowej na różne pary przebiegów przewodnictwa.

Stosunki między przewodnictwem pobudzającym a hamującym zmieniano w zakresie od 1:0 do 1:2. Wraz ze wzrostem stopnia hamowania odpowiedź komórki ulegała zmniejszeniu; poniżej przedstawiono odpowiedzi komórki zwojowej na ten sam poziom pobudzenia przy zmiennym czasie rozpoczęcia hamowania. Delta T oznacza różnicę czasu między rozpoczęciem przewodnictwa hamującego a pobudzającego.

Wraz ze zmniejszaniem się opóźnienia inhibicji, odpowiedź komórki stawała się słabsza. Procedura ta jest potężną techniką, która pomaga ujawnić oddziaływania między pobudzającymi a hamującymi wejściami synaptycznymi, które generują odpowiedź neuronalną.