Name: Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Poznaj technikę dynamicznego zacisku w komórkach zwojowych siatkówki myszy, umożliwiającą badanie wpływu pobudzających i hamujących wejść synaptycznych na aktywność neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych (ARC DP0988227) oraz Grant Inicjatywy Badawczej Nauk Biomedycznych z Dyscypliny Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w Sydney. Wzmacniacz Patch Clamp EPC 8 został sfinansowany przez Startup Fund z Dyscypliny Nauk Biomedycznych, Uniwersytetu w Sydney. Sprzęt InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System został zakupiony ze środków Fundacji Rebecci L. Cooper oraz Startup Fund z Dyscypliny Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w Sydney. Dziękujemy anonimowym recenzentom za wnikliwe sugestie i uwagi.

1. Ogólna konfiguracja i przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Trzymaj mysz w ciemności przez 30 minut (staraj się zmniejszyć jej poziom stresu). Czekając, przygotuj 1 l roztworu zewnątrzkomórkowego. Najpierw rozpuść 1,9 g wodorowęglanu sodu w pół litra wody Milli-Q. Jego pH utrzymuje się na poziomie 7,4 poprzez bulgotanie z 95%O2 i 5% CO2 . Pięć minut później rozpuść 8,8 g pożywki Amesa w 100 ml wody Milli-Q, dodaj do roztworu wodorowęglanu sodu, uzupełnij do 1 l wodą Milli-Q i dobrze wymieszaj. Utrzymuj ten roztwór w stanie karbotlenowym do końca eksperymentu.</li>
	<li>Weź 250 ml karbotlenionego podłoża Ames i ustaw system reperfuzji płynów w konfiguracji elektrofizjologicznej. Utrzymuj roztwór w stanie karbokoksygennym.</li>
	<li>Równomiernie rozsmaruj cienką warstwę smaru próżniowego na dnie komory perfuzyjnej. Uszczelnij go szkiełkiem nakrywkowym i upewnij się, że jest szczelny. Weź niewielką ilość smaru (o średnicy ~ 2 mm) i umieść go na górnym i dolnym końcu komory. Kulki te utrzymają siatkę (platynową ramkę nawleczoną na nić dentystyczną) na miejscu i zapobiegną zbyt mocnemu naciskaniu na siatkówkę. Zamocuj komorę na platformie i wyrównaj oba otwory.</li>
	<li>Zwierzę jest najpierw znieczulane izofluranem przez 2 minuty, a następnie uśmiercane przez zwichnięcie szyjki macicy. Szybko usuń oczy małymi nożyczkami (zakrzywionymi ostrzami), dokładnie umyj karbonowym płynem zewnątrzkomórkowym w małej zlewce, a następnie umieść na szalce Petriego wypełnionej karbotlenowym płynem zewnątrzkomórkowym.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj otwór wprowadzający w rogówce (~ 2 mm od krawędzi) za pomocą igły o rozmiarze 19. Powtórz dla drugiego oka. Ten ważny krok powinien być szybki, aby umożliwić dotlenienie obu siatkówk. Usuń jedną rogówkę za pomocą małych nożyczek do tęczówki, przecinając równolegle do jej krawędzi. Następnie usuń tęczówkę i obiektyw za pomocą cienkich kleszczyków. Powtórz dla drugiego oka. Przenieść jedną muszlę oczną do zlewki zawierającej karbotlenowy roztwór zewnątrzkomórkowy.</li>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela przeciąć jedną muszlę oczną na pół, aby móc spłaszczyć całe mocowanie i uzyskać dwie całe mocowania na siatkówkę. Ostrożnie oddziel siatkówkę od nabłonka barwnikowego za pomocą sondy preparacyjnej lub delikatnie ją ściągając. Po odłączeniu siatkówka jest dość przezroczysta. Zwróć uwagę, że wypukła powierzchnia to strona fotoreceptorów. Wklęsła powierzchnia jest stroną komórek zwojowych i może przyklejać się do siebie z powodu obecności lepkiego ciała szklistego.</li>
	<li>Za pomocą pary cienkich kleszczy przytrzymaj krawędź oderwanej tkanki siatkówki blisko ora serrata i chwyć ora serrata kolejną parą cienkich kleszczy, pociągnij ją w kierunku środka siatkówki. Jest to delikatny proces i może wymagać kilku prób. Jeśli się powiedzie, ora serrata, ciało rzęskowe i ciało szkliste są usuwane w tym procesie, a krzywizna siatkówki zostaje zmniejszona (tj. bardziej płaska).</li>
	<li>Przytnij krawędzie, a następnie przenieś go do komory perfuzyjnej komórkami zwojowymi skierowanymi do góry. Przytrzymaj chusteczkę na miejscu, umieszczając siatkę na kulkach smarowych. Umieść pozostałą chusteczkę w drugiej muszli ocznej do późniejszego użycia. Podobne procedury rozwarstwiania siatkówki opisano w Middleton i Protti 16 oraz Pottek i wsp. Rozdział 17.</li>
	<li>Zamontuj komorę zapisu pod mikroskopem pionowym. Natychmiast ustawić ciągłą perfuzję siatkówki karpinianym roztworem zewnątrzkomórkowym (35,5 °C) z szybkością 3 - 5 ml/min. Upewnij się, że elektroda uziemiająca jest na swoim miejscu.</li>
	<li>Do mikroskopu dołączona jest kamera cyfrowa umożliwiająca wizualizację tkanki. Cała konfiguracja znajduje się nad stołem powietrznym (amortyzacja) i wewnątrz klatki Faradaya (blokuje zewnętrzne statyczne i niestatyczne pola elektryczne).</li>
	<li>Włącz źródło światła (podczerwień, > 850 nm) i za pomocą obiektywu 40X skieruj jego ostrość na ciała komórek zwojowych. Znajdź centralny obszar całego mocowania do nagrywania.</li>
	<li>Rozmrozić zamrożoną fiolkę z roztworem wewnątrzkomórkowym na bazie K+ (300 μl, pH = 7,4) zawierającym (w mM) K-glukonian: 140, kwas HEPES: 10, MgCl2: 4,6, ATP-Na+: 4, GTP-Na+: 0,4 i EGTA: 10. Wszystkie odczynniki zakupione w firmie Sigma-Aldrich.</li>
</ol>
2. Łatanie ciał komórkowych komórek zwojowych siatkówki
<ol>
	<li>Najpierw wypoleruj na gorąco końce rurki ze szkła kapilarnego borokrzemianowego, a następnie pociągnij je za pomocą szklanego ściągacza do mikroelektrod z dwoma stopniami podgrzewania (rezystancja: 5 - 8 MΩ).</li>
	<li>Dodać 3 μl Lucifer Yellow (końcowe stężenie 0,2%) do roztworu wewnątrzkomórkowego, dobrze wymieszać i odwirować. Następnie przenieść górne 85% roztworu do strzykawki o pojemności 1 ml, podłączyć ją do jednostki filtera0,22 μm, a następnie do igły podskórnej wielokrotnego użytku o sile 30 g. Lodówce.</li>
	<li>Zamocuj szklaną pipetę, o podobnym rozmiarze końcówki jak końcówki używane do nagrywania, w jej uchwycie i przesuń ją pod mikroskopem za pomocą mikromanipulatora. Pod obiektywem 40X powoli opuść pipetę, aż utworzy małe wgłębienie na powierzchni wewnętrznej membrany ograniczającej. Ostrożnie przesuń pipetę do przodu, aż złapie niewielką ilość tkanki, a następnie przesuń ją w górę i/lub na boki, aby wyrwać mały otwór i odsłonić ciała komórkowe komórek zwojowych. Im mniejsza, tym wyższy stopień integralności sieci siatkówki jest zachowany. W razie potrzeby sulforodamina 101 (SR101; 0,5 - 1 μM) może zostać dodana do podłoża zewnątrzkomórkowego w celu znakowania uszkodzonych neuronów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej 15.</li>
	<li>Napełnij czystą pipetę 8 - 10 μl roztworu wewnątrzkomórkowego. Włóż go do uchwytu przymocowanego do amplifier głowica stage i upewnij się, że elektroda chlorowanego chlorku srebra jest zanurzona. Wyrzuć, jeśli obecny jest/są brud i/lub pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Włącz cały sprzęt. Użyliśmy wzmacniacza patch clamp EPC 8 sterowanego przez PatchMaster, aby uzyskać nagrania całych komórek w konfiguracji cęgów napięciowych. Należy pamiętać, że można również użyć innych wzmacniaczy, które umożliwiają nagrywanie cęgów prądowych w trybie szybkim. Zastosuj i utrzymuj nadciśnienie w roztworze pipety. Wybierz komórkę o dużym ciele komórki, więc najprawdopodobniej jest to komórka zwojowa, a nie przemieszczona komórka amakrynowa lub komórka glejowa. Powoli opuść końcówkę pipety tak, aby zrobiła małe wgłębienie na powierzchni membrany, zatrzymaj się i zwolnij ciśnienie. Natychmiast obniżyć potencjał podtrzymania do - 60 mV. Po uzyskaniu gigasealu (GΩ) między nimi, delikatnie zassaj, aby przerwać membranę, aby uzyskać konfigurację zacisku krosowego dla całej komórki. Ta procedura jest delikatnym krokiem, jeśli zostanie przyłożone zbyt duże podciśnienie, połączenie staje się nieszczelne; Jeśli jest za mało, membrana pozostaje nienaruszona.</li>
	<li>Z biegiem czasu Lucyfer Żółty wypełni komórkę, umożliwiając wizualizację morfologii komórki. Jeśli jest stabilny, ta konfiguracja powinna trwać 30 minut lub dłużej.</li>
</ol>
3. Zapisy komórek zwojowych za pomocą dynamicznego zacisku
<ol>
	<li>Najpierw wykonywany jest test prądowo-napięciowy (od - 75 do + 35 mV co 10 mV) za pomocą PatchMaster. Przejdź do późniejszych testów tylko wtedy, gdy występuje duży prąd Na+ (> 1 nA). Należy zauważyć, że w rzadkich przypadkach, gdy przemieszczona komórka amakrynowa zostanie załatana, w takim przypadku nie zareaguje ciągami potencjałów czynnościowych na kolejne wstrzyknięcia prądu.</li>
	<li>Otwórz LabVIEW i uruchom niestandardowy program Neuroakuma, a następnie załaduj różne przebiegi przewodności. Ustaw liczbę powtórzeń na 8 (6 - 8 do celów statystycznych). Ustawić potencjały odwrócenia przewodnictwa pobudzającego i hamującego odpowiednio na poziomie 0 i - 75 mV. Wybierz jedną pasującą parę przewodnictwa pobudzającego i hamującego do testów. Ślad przewodnictwa pobudzającego (na zielono) i ślad przewodnictwa hamującego (na czerwono) pojawi się w dolnym panelu.</li>
	<li>Wróć do PatchMaster, wybierz bieżący tryb clampowy i natychmiast przełącz wzmacniacz w tryb cęgów prądowych "CC + Comm FAST". Ten tryb pozwala na dokładne śledzenie szybkich zmian potencjału błony. Jeśli zachowane jest dobre uszczelnienie między membraną a pipetą, kompensacja jest niewielka lub żadna; W przeciwnym razie nagranie nie potrwa długo. W Neuroakumie naciśnij przycisk "nagraj". Odpowiedź komórkowa (zwykle z fazowym wybuchem potencjałów czynnościowych, ryc. 1A) pojawi się na górnym panelu. Najpierw wstrzyknij prąd do ogniwa z niskim skalowaniem przewodności, jeśli obserwuje się niewielką odpowiedź lub nie obserwuj jej wcale, zwiększaj małymi krokami, aż wytworzy silną odpowiedź. Nadmierny wtrysk prądu może zabić ogniwo. Po zakończeniu testów wybierz nową parę przebiegów przewodności, powtórz powyższe dla wszystkich par przewodności fizjologicznych i sztucznych. Prądy fizjologiczne (I) wstrzykiwane w czasie rzeczywistym opierają się na: 
	I(t) = Gexc(t) x (Vm(t) - Vexc) + Ginh(t) x (Vm(t) - Vinh)</li>
</ol>
Konduktancja (G w nS) może być synaptyczna lub sztuczna. Pobudzające i hamujące przebiegi przewodnictwa synaptycznego zebrano z wcześniejszych eksperymentów przeprowadzonych przez Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen i Solomon (wyniki niepublikowane) w odpowiedzi na różne bodźce wzrokowe w warunkach kontrolnych i w obecności tetrodotoksyny (TTX, 1 μM). Przebiegi sztucznego przewodnictwa zostały zamodelowane za pomocą funkcji alfa. Vm (w mV) jest zarejestrowanym potencjałem błony. Gexc i Ginh reprezentują odpowiednio przewodnictwo pobudzające i hamujące, podczas gdy Vexc i Vinh reprezentują potencjały odwrócenia odpowiednio przewodnictwa pobudzającego i hamującego. Czas wynosi t w ms. Częstotliwość próbkowania: 40 kHz. 
Is = I0(t/α)e-αt
Powyższe równanie jest funkcją alfa (I0 = maksymalny prąd; 1/α = czas do szczytu (sec-1) prądu). Czas narastania i zaniku prądu synaptycznego jest podyktowany przez α 4. Przewodność pobudzająca pozostała niezmieniona, podczas gdy opóźnienie przewodnictwa hamującego uległo modyfikacji, zmniejszając jej opóźnienie w stosunku do początku wzbudzenia (ryc. 2D).
<ol start="4">
	<li>Po nagraniu ostrożnie wsuń pipetę, aby korpus komórki pozostał nienaruszony. Natychmiast utrwalić tkankę w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut, a następnie trzy 10-minutowe płukanie 0,1 M buforu fosforanowego. Wstaw do lodówki i wykonaj barwienie przeciwciałami następnego dnia lub w ciągu tygodnia.</li>
</ol>
4. Barwienie przeciwciał przeciwko żółto wypełnionym komórkom zwojowym siatkówki Lucyfera
<ol>
	<li>Barwienie przeciwciałami przeciwko żółtym komórkom zwojowym Lucyfera w temperaturze pokojowej (pierwszorzędowe przeciwciało anty-Lucyfer Żółte królicze IgG (rozcieńczenie = 1:10 000) przez pięć dni; szóstego dnia barwienie przez noc wtórnym kozim anty-króliczym IgG (rozcieńczenie = 1:500)). Zamontuj siatkówkę na mokro w fluorescencyjnym podłożu konserwującym. Szkiełko nakrywkowe i uszczelnić lakierem do paznokci.</li>
	<li>Wykonaj konfokalne zdjęcia morfologii komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica Spec-II (Rysunek 1B). Obecność aksonu pozwala na potwierdzenie istnienia komórek zwojowych.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, H. P. C., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Johnson, D., Wu, S. M. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+D+%22Foundations+of+cellular+neurophysiology%22">Foundations of cellular neurophysiology</a>. , The MIT Press. London. (1995).</li>
<li>Taylor, W. R., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+mechanisms+generate+direction+selectivity+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina.</a> Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).</li>
<li>Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique+in+ion+channel+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique in ion channel research.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Williams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+and+functional+impact+of+conductance+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).</li>
<li>Perkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-attached+voltage-clamp+and+current-clamp+recording+and+stimulation+techniques+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).</li>
<li>Feng, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+SK+calcium-dependent+potassium+currents+in+regulating+the+activity+of+deep+cerebellar+nucleus+neurons%3A+a+dynamic+clamp+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study.</a> Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).</li>
<li>Butera, R., Lin, R. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButera%2C+R+%22Dynamic-Clamp+From+Principles+to+Applications+Series%3A+Springer+Series+in+Computational+Neuroscience%22">Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience</a>. Destexhe, A., Bal, T. 1, Springer. (2009).</li>
<li>Marco, S. D. i, Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+functional+reorganization+of+retinal+circuits+induced+by+early+long-term+visual+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+technique%3A+review+of+the+current+state+of+the+art+and+potential+contributions+from+nanoengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+N%3A+Journal+of+Nanoengineering+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+NMDA+receptor+conductance+in+rat+midbrain+dopaminergic+neurons+using+the+dynamic+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique.</a> J. Vis. Exp. (46), e2275(2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li>
<li>Middleton, T. P., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+modulate+spontaneous+synaptic+activity+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells.</a> Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).</li>
<li>Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457(2011).</li>
</ol>

Wszystkie procedury zostały najpierw zatwierdzone przez Komisję Etyki Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Sydney, a następnie przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Australijskiego Kodeksu Postępowania w zakresie Opieki i Wykorzystywania Zwierząt do Celów Naukowych (National Health and Medical Research Council of Australia).

Tutaj pokazujemy zastosowanie zacisku dynamicznego do oceny wpływu stosunku i względnego czasu pobudzenia i hamowania na wyjście komórek zwojowych siatkówki. Zacisk dynamiczny wykorzystuje symulacje komputerowe do wprowadzenia fizjologicznie zarejestrowanych lub sztucznych przewodnictw synaptycznych do żywych neuronów. Metodologia ta zapewnia interaktywne narzędzie, za pomocą którego przewodnictwa mogą być modyfikowane i wstrzykiwane do neuronów w celu obliczenia ich wpływu na odpowiedzi neuronalne. Przebiegi przewodnict...

Siatkówka to prawie przezroczysta tkanka nerwowa wyściełająca tylną część oka. W wielu badaniach wykorzystuje się siatkówkę jako model do zbadania pierwszych kroków w przetwarzaniu wzrokowym i mechanizmach sygnalizacji synaptycznej. Ponieważ sieć siatkówkowa w preparacie z całego wierzchowca pozostaje nienaruszona po rozwarstwieniu, stanowi on idealny system do badania interakcji synaptycznych, ponieważ jego reakcje fizjologiczne są bardzo podobne do warunków in vivo. Tak więc, używając izolowanej siatkówki, właściwości jej neuronów mogą być badane za pomocą technik patch clamp (aby zapoznać się z opiniami na temat tej techniki, patrz 6,9,13). Określenie dokładnego udziału określonych obwodów i neuroprzekaźników w odpowiedzi komórek zwojowych jest jednak zwykle utrudnione, ponieważ środki farmakologiczne działają w różnych miejscach.
Fizjologiczne reakcje neuronów siatkówki na światło, naturalny bodziec, można rejestrować za pomocą szklanych pipet wypełnionych płynem wewnątrzkomórkowym. Stosując techniki patch clamp, reakcje neuronalne na stymulację światłem mogą być rejestrowane jako fluktuacje potencjału błonowego (cęgi prądowe) lub jako prądy (cęgi napięciowe). Utrzymując potencjał błony przy różnych napięciach i przeprowadzając analizę przewodności a posteriori, możliwe jest wyizolowanie hamujących i pobudzających wejść synaptycznych 5,12. Tego typu eksperymenty można przeprowadzać w normalnym podłożu kąpielowym i w obecności różnych środków farmakologicznych w celu wyizolowania udziału różnych neuroprzekaźników i receptorów w odpowiedziach neuronalnych. Bogactwo badań z wielu laboratoriów charakteryzowało zależność impulsowego wyjścia oraz bodźców pobudzających i hamujących od właściwości bodźca, takich jak rozmiar, kontrast, częstotliwości przestrzenne i czasowe, kierunek, orientacja i inne zmienne bodźca. Chociaż te podejścia eksperymentalne dostarczają informacji na temat związku między wyjściem impulsowym a wejściami synaptycznymi w funkcji właściwości bodźca, interpretacja udziału określonych typów komórek i ich wejść synaptycznych w pobudliwość komórek nie jest prosta. Wynika to z faktu, że zazwyczaj zarówno bodźce pobudzające, jak i hamujące różnią się w zależności od właściwości bodźca, a zatem nie jest możliwe oszacowanie dokładnego wpływu, jaki zmiany w którymkolwiek z tych wejść mają na skoki neuronów.
Alternatywnym podejściem do obejścia tych ograniczeń jest przeprowadzanie dynamicznych zapisów zaciskowych, które pozwalają na krytyczną ocenę udziału poszczególnych wejść synaptycznych w wyjściu impulsowym. Technika dynamicznego zacisku pozwala na bezpośrednie wstrzyknięcie prądu do ogniwa, a ilość prądu wstrzykiwanego w danym czasie zależy od zarejestrowanego w tym czasie potencjału błony 1,2,3 (w celu przeglądu, patrz 7,14). Jest to zmodyfikowana konfiguracja cęgów prądowych, w której uzyskuje się szybką interakcję sprzężenia zwrotnego w czasie rzeczywistym między rejestrowanym ogniwem a sprzętem składającym się ze specjalistycznego sprzętu, oprogramowania i komputera. Ilość prądu wstrzykiwanego do ogniwa jest odpowiednio obliczana. Stąd zaletą tej metody jest to, że komórka może być stymulowana różnymi kombinacjami przebiegów przewodnictwa, a jej odpowiedź będzie naśladować aktywację receptorów, które pośredniczą w wejściach synaptycznych. Na przykład porównanie odpowiedzi na wstrzyknięcie przewodnictwa pobudzającego i hamującego dla małej plamki z odpowiedzią na wstrzyknięcie przewodnictwa pobudzającego dla małej plamki dostarcza jedynie informacji o wpływie hamowania na odpowiedź komórki. Podobnie, inne kombinacje fizjologicznie zarejestrowanych przewodności mogą być wstrzykiwane jednocześnie, aby ujawnić, w jaki sposób zależne od bodźca zmiany w przewodnictwie pobudzającym i / lub hamującym wpływają na wydajność skoków.
W naszym badaniu, technika dynamicznego zacisku jest używana do pokazania wpływu względnej amplitudy i czasu wejścia synaptycznego na właściwości wypalania komórek zwojowych siatkówki. Jako dane wejściowe wykorzystano różne przewodności uzyskane z doświadczeń fizjologicznych w warunkach kontrolnych lub w obecności środków farmakologicznych. Ponadto wykorzystano sztuczne przewodnictwa oparte na funkcjach alfa w celu zbadania, w jaki sposób sygnały synaptyczne są integrowane przez neurony. Jest to zatem wszechstronna technika, która pozwala na wstrzykiwanie różnych rodzajów przewodnictwa generowanego fizjologicznie, farmakologicznie lub obliczeniowo do tej samej komórki zwojowej, dzięki czemu można dokonać porównania odpowiedzi na te dane wejściowe.

<table><tbody><tr><td colspan="4">odczynnik</td></tr><tr><td>Isofluran Inhalacyjny środek znieczulający</td><td>Pharmachem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ames Medium z L-glutaminianem (proszek)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukonian potasu, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES Sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu ( 4,9 mol/l)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-5'-trifosforan (ATP) sól disodowa hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanozyno-5'-trifosforan sól sodowa hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(2-amina&#8211; kwas N,N,N',N',-tetraoctowy</td> Proszek paraformaldehydowy <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 95%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Lucyfer Żółty, Frakcja IgG królika (3 mg / ml)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Koza Anty-Królik IgG (H+L) 2 mg / ml</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne podłoże konserwujące</td><td>BioFX Laboratoria Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Kapilarna szklana rurka z płomieniowo polerowanymi końcami (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Długość = 15 cm)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0794</td><td></td></tr><tr><td>Jednostopniowy szklany mikrofon&#8211; Ściągacz do ręczników</td><td>Narishinge Japan</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 2</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV 0,22 &mu; m Filter Unit</td><td>Millipore Corporation</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna wielokrotnego użytku Luer Lock: 30 G</td><td>Smith Nephew (Australia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pojedynczy podgrzewacz roztworu w linii</td><td>Warner Instruments</td><td>Model SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny automatyczny regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Olympus SZ61</td><td>Olympus Korporacja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus BX50WI: z obiektywem 40X</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0-30 V 2,5 A Zasilacz prądu stałego</td><td>Dick Smith Electronics</td><td>Q1770</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera mikroskopowa ProgResMF fajny</td><td>mikromanipulator Jenoptik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MP-225</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz zaciskowy EPC 8</td>System akwizycji danych <td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>InstruTECH LIH 8+8 Komputer</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: DELL</td><td>Dell Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Komórki zwojowe są neuronami wyjściowymi siatkówki, a ich aktywność odzwierciedla integrację wielu wejść synaptycznych wynikających z określonych obwodów neuronowych. Techniki patch clamp, w konfiguracjach cęgów napięciowych i prądowych, są powszechnie stosowane do badania fizjologicznych właściwości neuronów i charakteryzowania ich wejść synaptycznych. Chociaż zastosowanie tych technik jest bardzo pouczające, stwarzają one różne ograniczenia. Na przykład trudno jest określić ilościowo, w jaki sposób dokładne interakcje bodźców pobudzających i hamujących determinują wynik odpowiedzi. Aby rozwiązać ten problem, zastosowaliśmy zmodyfikowaną technikę cęgów prądowych, zacisk dynamiczny, zwany również zaciskiem przewodnictwa 1, 2, 3 i zbadaliśmy wpływ pobudzających i hamujących wejść synaptycznych na pobudliwość neuronów. Technika ta wymaga wstrzyknięcia prądu do komórki i jest zależna od sprzężenia zwrotnego w czasie rzeczywistym jej potencjału błonowego w tym czasie. Wstrzykiwany prąd jest obliczany na podstawie z góry określonych pobudzających i hamujących przewodnictwa synaptycznego, ich potencjałów odwrócenia i chwilowego potencjału błonowego komórki. Szczegółowe informacje na temat procedur eksperymentalnych, komórek zaciskowych w celu uzyskania konfiguracji całej komórki oraz zastosowania techniki dynamicznego zacisku przedstawiono w tym artykule wideo. Tutaj pokazujemy reakcje komórek zwojowych siatkówki myszy na różne przebiegi przewodnictwa uzyskane z eksperymentów fizjologicznych w warunkach kontrolnych lub w obecności leków. Ponadto pokazujemy zastosowanie sztucznych przewodnictwa pobudzającego i hamującego generowanego za pomocą funkcji alfa do badania odpowiedzi komórek.

Wkład różnych źródeł sygnałów hamujących w odpowiedzi komórek zwojowych wykazano poprzez aplikację różnych przebiegów przewodności. Przebiegi te uzyskano za pomocą bodźców o różnej luminancji w warunkach normalnych oraz w obecności TTX, blokera napięciowo-zależnych kanałów Na+, który hamuje generowanie potencjałów czynnościowych jedynie w podgrupie hamujących interneuronów siatkówki. Rysunek 2A przedstawia reprezentatywną odpowiedź na wstrzyknięcie pobudzających i hamujących przebiegów przewod...

Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie wpływu zmian stosunku oraz względnego czasu wystąpienia pobudzających i hamujących sygnałów synaptycznych na aktywność impulsową neuronów, wykorzystując komórki zwojowe siatkówki jako neurony modelowe. Osiąga się to poprzez rejestrację potencjałów z ciała komórki zwojowej w preparacie całej siatkówki, przy użyciu szklanej pipety wypełnionej roztworem wewnątrzkomórkowym o składzie jonowym zbliżonym do fizjologicznego oraz barwnikiem Lucifer yellow w celu morfologicznej identyfikacji typu komórki. W drugim kroku, z wykorzystaniem metody dynamic clamp, do ciała komórki wstrzykuje się zestaw przebiegów fali przewodnictwa pobudzającego i hamującego, co wywołuje zmianę potencjału błonowego jako odpowiedź. Następnie do ciała komórki wstrzykuje się różne przebiegi przewodnictwa uzyskane w eksperymentach fizjologicznych w warunkach kontrolnych lub w obecności leków, aby uzyskać odpowiadające im odpowiedzi neuronalne.Wyniki pokazują wpływ zmian stosunku pobudzenia i hamowania na aktywność impulsacyjną komórek zwojowych siatkówki, w oparciu o wstrzykiwanie prądów składających się z przewodnictw pobudzających i hamujących za pomocą rejestr

implementing-dynamic-clamp-with-synaptic-artificial-conductances

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Implementacja dynamicznego zacisku z synaptycznymi i sztucznymi przewodzeniami w komórkach zwojowych siatkówki mysiego oka

W tym filmie demonstrujemy, jak wprowadzić przewodnictwo do neuronu dopaminergicznego rejestrowanego w konfiguracji whole-cell w skrawkach mózgu szczura. Technika ta nazywa się dynamic clamp.

Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura z wykorzystaniem techniki dynamicznej elektrodynamicznej kontroli prądu (dynamic clamp)

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Ten film demonstruje technikę całokomórkowego patch-clamp do elektrofizjologicznego zapisu z płaskiej siatkówki myszy. Cienka szklana pipeta z elektrodą służy do zbliżania się do gwiazdotwórczych komórek amakrynowych (SAC) w siatkówce. Po uformowaniu uszczelki stosuje się ssanie w celu pęknięcia membrany i utworzenia konfiguracji zacisku krosowego całej komórki. Na koniec mierzy się przepływ jonów przez receptory synaptyczne SAC za pomocą konfiguracji.

Ustanawianie opaski krosowej całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z siatkówki myszy z płaskim mocowaniem

Ten film demonstruje rejestrację wywołanych światłem reakcji postsynaptycznych w dostosowanym do ciemności preparacie tkanki siatkówki myszy. Wycinek siatkówki umieszcza się w komorze rejestrującej, a pipeta rejestrująca służy do ustalenia ciągłości elektrycznej z komórką zwojową siatkówki. Impulsy świetlne są stosowane do generowania pobudzających potencjałów postsynaptycznych w komórkach zwojowych, które są rejestrowane przez pipetę.

Wywołane światłem reakcje postsynaptyczne w neuronach wycinków siatkówki myszy

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Protokoły zamkniętej pętli stają się coraz bardziej powszechne we współczesnej elektrofizjologii. Przedstawiamy prosty, wszechstronny i niedrogi sposób wykonywania złożonych protokołów elektrofizjologicznych w korowych neuronach piramidowych in vitro, przy użyciu komputera stacjonarnego i cyfrowej płytki akwizycyjnej.

Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Tutaj prezentujemy protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu zawierających jądro kolankowate boczne oraz badania elektrofizjologicznego funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych. Protokół ten zapewnia skuteczny sposób badania synaps z wysokim i niskim prawdopodobieństwem uwalniania w tych samych ostrych wycinkach mózgu.

Badania elektrofizjologiczne funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych

Podsumowujemy przepływ pracy, aby obliczeniowo modelować zachowanie neuronu siatkówki w odpowiedzi na stymulację elektryczną. Model obliczeniowy jest wszechstronny i obejmuje etapy automatyzacji, które są przydatne w symulowaniu szeregu scenariuszy fizjologicznych i przewidywaniu wyników przyszłych badań in vivo/in vitro.

Modelowanie obliczeniowe neuronów siatkówki do badań nad protezami wzrokowymi - podstawowe podejścia

Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa może ustalić związki przyczynowe między deficytami wyładowania neuronów a dysfunkcją kanału jonowego. Opisujemy metody i protokoły dynamicznego zaciskania w myszowych neuronach Purkinjego w móźku, zwracając uwagę na przydatne zasoby i kwestie techniczne. W badaniu reprezentatywnym dodaliśmy modelowaną przewodność sodu do neuronów Tsc1-/- Purkinje, aby zapobiec powtarzalnemu wyładowaniu.

Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

Poznaj technikę dynamicznego zacisku w komórkach zwojowych siatkówki myszy, umożliwiającą badanie wpływu pobudzających i hamujących wejść synaptycznych na aktywność neuronów.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów