Name: Szybkie, wysokoprzepustowe oznaczanie amylozy w liofilizowanych próbkach bulw ziemniaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj szybką metodę kolorymetryczną do oznaczania zawartości amylozy w skrobi ziemniaczanej. Technika umożliwia badanie dużych populacji klonów ziemniaka w celu hodowli odmian o lepszych właściwościach odżywczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie tych badań zostało częściowo zapewnione przez USDA-ARS Research Associate Program oraz USDA Crop Germplasm Committee.

1. Oznaczanie amylozy ze skrobi z bulw ziemniaka
<ol>
	<li>Świeże bulwy obrać i pokroić w drobną kostkę.</li>
	<li>Umieść kostki ziemniaczane w małych brązowych torebkach i przechowuj przez noc w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przenieś kostki ziemniaczane do nylonowych torebek i do liofilizacji.</li>
	<li>Po wysuszeniu liofilizowanym zmiel próbkę ziemniaka na proszek za pomocą moździerza i tłuczka lub młynka Wiley.</li>
	<li>Do probówki o pojemności 50 ml dodać 20-30 mg liofilizowanej, zmielonej próbki bulw.</li>
	<li>Przygotować roztwór 45% (w/v) kwasu nadchlorowego (wymieszać 24,4 ml 60% kwasu nadchlorowego i 25,6 ml ultraczystej wody.</li>
	<li>Dodać 500 μl 45% (w/v) kwasu nadchlorowego i wstrząsnąć lub zamieszać, aby rozproszyć granulki skrobi.</li>
	<li>Po czterominutowym okresie inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 16 ml ultraczystej wody do roztworu i wymieszać przez wirowanie.</li>
	<li>Po opadnięciu nierozpuszczalnego materiału na dno probówki (7-10 minut później) przenieś 40 μl roztworu na płytkę do mikromiareczkowania (unikając pipetowania jakichkolwiek cząstek).</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu jodu (2 g KI + 1 g I2 w 900 ml ultraczystej wody) i wymieszać próbkę pipetując.</li>
	<li>Natychmiast odczytać absorbancję przy 550 nm i 620 nm.</li>
	<li>Oznaczyć zawartość procentową amylozy po porównaniu stosunku amylozy do amylopektyny w każdej próbce (absorbancja 620 nm/550 nm) z krzywą wzorcową otrzymaną z roztworów amylozy i amylopektyny w zakresie stężeń. Ta procedura zostanie opisana dalej. Odczytać ślepą próbę (roztwór jodu i kwas nadchlorowy) wraz z próbkami testowymi. Do analiz należy używać pustych danych.</li>
</ol>
2. Krzywa amylozy/amylopektyny
<ol>
	<li>W oddzielnych probówkach odważyć 12,5 mg amylozy i 12,5 mg amylopektyny.</li>
	<li>Dodać do każdej probówki 5 ml 45% (m/v) kwasu nadchlorowego i całkowicie rozpuścić.</li>
	<li>Dla każdego z roztworów (amylozy i amylopektyny) doprowadzić do końcowej objętości 50 ml ultraczystą wodą.</li>
	<li>Wymieszaj 6,25 ml bulionu amylozy z poprzedniego kroku z 18,75 ml ultraczystej wody. W ten sposób otrzymamy 6,25 mg/ml roztworu amylozy.</li>
	<li>Powtórz procedurę dla roztworu amylopektyny.</li>
	<li>Korzystając z roztworów wzorcowych amylozy i amylopektyny z kroków 2.4 i 2.5, przygotuj procentowe wzorce amylozy, które wynoszą 0-100% amylozy (100-0% amylopektyny) do końcowej objętości 5 ml, aby utworzyć krzywą wzorcową w odstępach 10%. 
	Na przykład, aby przygotować: 
	Wzorzec 0% amylozy / 100% amylopektyny, pipeta 5 ml roztworu amylopektyny. 
	Wzorzec 10% amylozy / 90% amylopektyny, połącz 0,5 ml roztworów amylozy i 4,5 ml amylopektyny. 
	Wzorzec 20% amylozy / 80% amylopektyny, połącz 1,0 ml roztworów amylozy i 4,0 ml amylopektyny. 
	Wzorzec 30% amylozy / 70% amylopektyny, połącz 1,5 ml roztworów amylozy i 3,5 ml amylopektyny. 
	Standardowy 40% amylozy / 60% amylopektyny, połącz 2,0 ml roztworów amylozy i 2,0 ml amylopektyny. 
	Wzorzec 50% amylozy / 50% amylopektyny, połącz 2,5 ml roztworów amylozy i 2,5 ml amylopektyny. 
	Standard 60% amylozy / 40% amylopektyny, połącz 3,0 ml amylozy i 2,0 ml amylopektyny i tak dalej).</li>
	<li>Przenieść 40 μl każdej mieszaniny wzorcowej na płytkę do mikromiareczkowania. Jako ślepą próbę należy dołączyć studzienkę z 40 μl 45% (w/v) kwasu nadchlorowego.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu jodu (2 g KI + 1 g I2 w 900 ml ultraczystej wody) i wymieszać każdą próbkę (łącznie z ślepą próbą) przez pipetowanie.</li>
	<li>Natychmiast odczytać absorbancja przy 550 nm i 620 nm i obliczyć stosunek amylozy do amylopektyny dla każdego stężenia.</li>
</ol>

<ol><li>Composition Hoover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((molecular+structure%2C+and+physicochemical+properties+of+tuber+and+root+starches%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr%22%5BJournal%5D)">molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review.</a> Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).</li>
<li>Bertoft, E., Blennow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Potato+Starch%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Potato+Chemistry+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Structure of Potato Starch.</a> Advances in Potato Chemistry and Technology. , 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).</li>
<li>Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+amylose+screening+in+maize+starches+from+exotic+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds.</a> Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).</li>
<li>Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+amylose+determination+methods+and+the+development+of+a+dual+wavelength+iodine+binding+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique.</a> Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).</li>
<li>Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+estimation+of+the+amylose+amylopectin+ratio+in+small+amounts+of+tuber+and+leaf+tissue+of+the+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Potato+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato.</a> Potato Res. 31, 241-246 (1988).</li>
<li>Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShannon%2C+JC+%22Starch%22">Starch</a>. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).</li>
<li>Haase, N. U., Plate, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+potato+starch+in+relation+to+varieties+and+environmental+factors%5BTitle%5D)+AND+%22St%C3%A4rke%22%5BJournal%5D)">Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors.</a> Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).</li>
<li>Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+on+the+size+distribution+and+amylose%2Famylopectin+ratio+in+potato+starch+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Pot.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules.</a> Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).</li>
<li>Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+to+measure+amylose+in+cereal+starches+and+flours+with+concanavalin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereal+Sci%22%5BJournal%5D)">A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A.</a> J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).</li>
<li>Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+amylose+content+of+starches+after+precipitation+of+amylopectin+by+concanavalin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Starch%22%5BJournal%5D)">Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A.</a> Starch. 42, 302-305 (1990).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Zawartość amylozy w bulwach ziemniaka waha się zazwyczaj od 20 do 35%7,8. Jeśli większość wartości wykracza poza ten zakres, należy wziąć pod uwagę następujące możliwe błędy: 1) do budowy krzywej standardowej amylozy/amylopektyny użyto surowych danych zamiast pustych danych; 2) zamiast danych zerowych wykorzystano surowe dane do określenia stosunku amylozy do amylopektyny w próbkach ziemniaków; lub 3) woda użyta do analizy nie była wystarczająco czysta. Zauważyliśmy, że przy użyciu w analizie wody destylowanej...

Około 80% świeżej masy bulwy ziemniaka to woda; prawie cała pozostała sucha masa to skrobia1. Większość skrobi (70%) składa się z amylopektyny, a pozostała część to amyloza. Stosunek amylozy do amylopektyny jest najważniejszą właściwością wpływającą na właściwości fizyczne skrobi. Amyloza jest liniowym łańcuchem glukozy alfa 1-4, podczas gdy amylopektyna jest liniowym łańcuchem alfa 1-4 z gałęziami alfa 1-62. Opracowano metody takie jak wiązanie jodu, różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC), wysokosprawna chromatografia wykluczająca (HPSEC) i interakcje konkanawaliny A do oznaczania skrobi w różnych gatunkach roślin uprawnych3,4. Każdy protokół wymaga specjalnych umiejętności i sprzętu, co utrudnia zwiększenie skali w celu ilościowego oznaczania wielu próbek jednocześnie. Metoda, którą tutaj prezentujemy, to zmodyfikowany protokół firmy Hovenkamp-Hermelink i wsp.5, która jest metodą wiązania jodu o podwójnej długości fali opartą na barwionych granulkach skrobi. Do zalet tej metody w porównaniu z innymi należy oznaczanie amylozy z surowej skrobi bez jej oczyszczania oraz zastosowanie systemu podwójnej długości fali w celu zwiększenia precyzji metody4,6.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny> Odczynniki</td></tr><tr><td>Amyloza </td><td>Sigma</td><td>859656</td><td></td></tr><tr><td>Amylopektyna </td><td>Sigma</td><td>A8515</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nadchlorowy 60%</td><td>Sigma</td><td>311413</td><td>Bardzo niebezpieczny dla skóry i oczu</td></tr><tr><td>Jod</td><td>Sigma</td><td>23214TD</td><td></td></tr><tr><td>Jodek potasu</td><td>Sigma</td><td>08625JE</td><td></td></tr><<tr>td colspan="4"><mocny>Sprzęt</mocny></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Bio Tek</td><td>ELx800</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie, wysokoprzepustowe oznaczanie amylozy w liofilizowanych próbkach bulw ziemniaka

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Ten protokół opisuje metodę kolorymetryczną o wysokiej przepustowości, która opiera się na tworzeniu kompleksu pomiędzy jodem a łańcuchami cząsteczek glukozy w skrobi. Jod tworzy kompleksy zarówno z amylozą, jak i długimi łańcuchami w amylopektynie. Po dodaniu jodu do próbki skrobi maksymalne wchłanianie amylozy i amylopektyny następuje odpowiednio przy 620 i 550 nm. Stosunek amylozy do amylopektyny można oszacować na podstawie stosunku wartości absorbancji 620 i 550 nm i porównać je z krzywą standardową, w której określone znane stężenia są wykreślane w stosunku do wartości absorpcji. Ta wysokowydajna, niedroga metoda jest niezawodna i powtarzalna, umożliwiając ocenę dużych populacji klonów ziemniaków.

Krzywa wzorcowa sporządzona na podstawie danych po odjęciu tła dla roztworów o różnych stężeniach amylozy/amylopektyny wykazuje przybliżone stosunki absorbancji w zakresie od 0,7 do 1,6 (Tabela 1). Linia trendu regresji liniowej uzyskana z tych danych jest następnie wykorzystywana do wyznaczenia zawartości amylozy w liofilizowanych próbkach ziemniaka (Rysunek 1).
Środowisko produkcji roślin ma pewien wpływ na zawartość amylozy w bulwach ziemniaka7. ...

Szybkie, wysokoprzepustowe oznaczanie amylozy w liofilizowanych próbkach bulw ziemniaka

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Ogólnym celem tej procedury jest wysokoprzepustowe oznaczenie względnych proporcji AMLO oraz amylopektyny. W skrobi z bulw ziemniaka pożądana jest wysoka zawartość skrobi AMLO ze względu na jej niższą strawność. Ziemniaki o wysokiej zawartości skrobi AMLO charakteryzują się niższym indeksem glikemicznym i wyższą zawartością błonnika.Technika ta jest prezentowana przez Philipa Smitha, studenta studiów licencjackich na University of Wisconsin Madison. W naszym laboratorium zajmujemy się hodowlą odmian ziemniaka o wyższej wartości odżywczej. Jednym ze sposobów realizacji tego celu jest zwiększenie zawartości AMLO w skrobi ziemniaczanej.Skrobia o wysokiej zawartości amylopektyny (AMLO) jest bardziej wartościowa odżywczo, ponieważ posiada niższy indeks glikemiczny. W niniejszym badaniu opracowaliśmy procedurę umożliwiającą dość szybką analizę dużej liczby próbek; jest to powtarzalny, wysokoprzepustowy i niedrogi test. Badanie to stanowi modyfikację procedury barwienia jodem. Jest to analiza kolorymetryczna, którą można przeprowadzić z wykorzystaniem płytki 96-dołkowej. W tej metodzie wykorzystuje się świeże bulwy ziemniaka; należy pokroić bulwy w kostkę o boku około 1 cm i odrzucić kawa

rapid-high-throughput-amylose-determination-freeze-dried-potato-tuber

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Szybkie oznaczanie amilozy o wysokiej wydajności w próbkach suszonych mrożonych bulw ziemniaka

Struktura ściany komórkowej roślin i cechy chemiczne są oceniane w celu zidentyfikowania idealnych surowców do produkcji biopaliw i biomateriałów. Standardowe metody mają ograniczenia, gdy są stosowane do dużych zestawów danych. Te wysokoprzepustowe metody obróbki wstępnej, scukrzania enzymatycznego i pirolizy ze spektrometrią mas wiązki molekularnej porównują dużą liczbę próbek biomasy przy skróconym czasie i kosztach eksperymentu.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Analogi trehalozy stają się ważnymi cząsteczkami do zastosowań bio(technicznych)logicznych i biomedycznych. Opisujemy zoptymalizowany protokół enzymatycznej syntezy i oczyszczania analogów trehalozy, który jest prosty, wydajny, szybki i przyjazny dla środowiska. Wykazano jego zastosowanie do szybkiej produkcji i podawania sondy do wykrywania prątków.

Szybka jednoetapowa synteza enzymatyczna i całkowicie wodne oczyszczanie analogów trehalozy

Tutaj prezentujemy wiarygodny i łatwy test do pomiaru zawartości glikogenu w komórkach sinic. Procedura polega na wytrącaniu, selektywnej depolimeryzacji i wykrywaniu pozostałości glukozy. Metoda ta jest odpowiednia zarówno dla szczepów dzikich, jak i genetycznie modyfikowanych i może ułatwić inżynierię metaboliczną sinic.

Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

Protokół opisany tutaj jest metodą pomiaru endoreduplikacji w bulwach ziemniaka (Solanum tuberosum). Obejmuje etapy plazmolizy i ekstrakcji protoplastów w celu zmniejszenia szumów i zanieczyszczeń w dalszej analizie cytometrycznej przepływowej.

Pomiar endoreduplikacji za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych protoplastów bulw

Przedstawiona tutaj jest procedura do powtarzalnego i statystycznie ważnego oznaczania rozkładów wielkości granulek skrobi, oraz do określania ustalonych rozkładów wielkości granulek logarytmicznie za pomocą dwuparametrowej formy multiplikatywnej. Ma zastosowanie do wszystkich analiz wielkości granulek próbek skrobi w skali gramowej do badań naukowych nad roślinami i żywnością.

Analiza i specyfikacja rozkładu wielkości granulek skrobi

Ten artykuł przedstawia zastosowanie PSYCHE i SAPPHIRE-PSYCHE w profilowaniu metabolicznym roślin i zawiera szczegółowe procedury przygotowania próbek i optymalnego zapisu widm NMR Pure Shift. Omówiono przykłady, dzięki którym przyrost rozdzielczości osiągnięty przez rozprzęganie homojądrowe pozwala na pełniejsze zrozumienie systemu.

Magnetyczny rezonans jądrowy z czystym przesunięciem: nowe narzędzie do metabolomiki roślin

Optymalne stężenie sacharozy zostało określone do ekstrakcji glikogenu wątrobowego za pomocą wirowania w gradicynie gęstości sacharozy. Korzystne okazało się dodanie 10-minutowego etapu wrzenia w celu zahamowania enzymów rozkładających glikogen.

Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

W obecnym protokole, technika elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE) jest używana do określenia rozkładu długości łańcucha (CLD) i średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu.

Oznaczanie rozkładu długości łańcucha glukanowego glikogenu metodą elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE)

Zaprojektowaliśmy protokół fenotypowania oparty na obrazach, aby określić morfologiczne i fizjologiczne reakcje na pojedyncze i skojarzone zabiegi upałów, suszy i podlewania. Podejście to umożliwiło identyfikację wczesnych, późnych i regeneracyjnych reakcji na poziomie całego zakładu, w szczególności części nadziemnych, a także podkreśliło konieczność stosowania wielu czujników obrazowania.

Wysokoprzepustowe fenotypowanie oparte na obrazie w celu określenia morfologicznych i fizjologicznych odpowiedzi na pojedyncze i połączone stresy u ziemniaka

Poznaj szybką metodę kolorymetryczną do oznaczania zawartości amylozy w skrobi ziemniaczanej. Technika umożliwia badanie dużych populacji klonów ziemniaka w celu hodowli odmian o lepszych właściwościach odżywczych.

Szybkie, wysokoprzepustowe oznaczanie amylozy w liofilizowanych próbkach bulw ziemniaka

Przeglądaj więcej filmów