Name: Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Poznaj technikę obrazowania in vivo do monitorowania replikacji wirusa cytomegalii u noworodków myszy. Ta metoda umożliwia śledzenie dynamiki zakażenia w układzie nerwowym i jamie otrzewnowej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Lee Tuddenhamowi (IBMC, Strasburg) za amplifikację i miareczkowanie MCMV-Luc oraz Thomasowi Baumertowi (INSERM U748, Strasburg) za zgodę na korzystanie z obiektu dla zwierząt Instytutu Wirusologii. Potwierdza się wsparcie finansowe ze strony INSERM, Université de Strasbourg i Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01). Doceniany jest również początkowy udział Sonii Beroud i Laetitii Lelieur w ich projekcie magisterskim.

1. Przygotowanie zawiesiny wirusowej
<ol>
	<li>Otrzymaj szczep Smitha lucyferazy eksprymującej MCMV (MCMV-Luc 15) z laboratorium Ulricha Koszninowskiego. W tym rekombinancie gen lucyferazy jest wstawiany do locus ie2 genomu MCMV.</li>
	<li>Aby amplifikować MCMV-Luc, należy zainfekować mysią linię komórek zrębu szpiku kostnego (M2-10B4, ATCC #CRL-1972) MCMV przy różnej wielokrotności infekcji (MOI, 0,001 do 1) 16. W tym celu dodać wirusa do hodowanych komórek w pożywce wolnej od surowicy w temperaturze 37 °C. Po godzinie usuń supernatant i zastąp go DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą (FCS). Pięć dni później zebrać pożywkę hodowlaną i przechowywać porcje w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	<li>Miareczkowanie zawiesiny wirusa za pomocą testu płytki nazębnej.
	<ol>
		<li>Podzielić komórki 3T3 (ATCC #CRL-1658) na 24-dołkowej płytce w 40 000 komórek/dołku w 1 ml DMEM uzupełnionym 10% FCS zawierającym penicylinę (200 IU / ml) i steptomycynę (200 mg / ml) i inkubować 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia (10-1 do 10-8) podwielokrotności zawiesiny MCMV w DMEM i zainfekować komórki docelowe (3T3) 200 μl rozcieńczenia po usunięciu pożywki do hodowli komórkowych. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Dodać 1 ml pożywki Top (DMEM 3% FCS, 2% (v/v) gentamycyny, 200 j.m./ml penicyliny, 200 mg/ml streptomycyny, 8 g/l karboksymetylocelulozy) i inkubować przez 5 dni w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Utrwal komórki, dodając 200 μl 10% formaldehydu (rozcieńczanie formaldehydu wodą powinno odbywać się w kapturze chemicznym, aby uniknąć toksycznych inhalacji) do każdej studzienki i inkubując 6 godzin w temperaturze pokojowej. Usunąć pożywkę hodowlaną + utrwalacz, pipetując i dodać 200 μl roztworu do barwienia komórek (1% fioletu krystalicznego (w/v) w 20% etanolu). Przed użyciem rozcieńczyć 1 część 9 częściami wody mili-Q. Inkubować 2 minuty w temperaturze pokojowej, umyć płytkę 3-4 razy mocząc ją w wodzie, pozostawić do wyschnięcia i policzyć liczbę blaszek lornetką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć MCMV-Luc w DMEM, aby uzyskać 50 PFU w 50 μl i pozostawić na lodzie do dalszego użycia. Stosowanie wyższych inokulów wirusowych indukuje śmiertelność, zanim noworodki osiągną wiek 2-3 tygodni. Z naszego doświadczenia wynika, że 500 PFU wywołuje śmiertelność u każdego noworodka od 5 do 7 dni po wstrzyknięciu.</li>
</ol>
2. Wstrzykiwanie noworodków
<ol>
	<li>Gdy noworodki (myszy w wieku od 4 do 20 godzin) są dostępne, manipuluj ściółką i kałem klatki w rękawiczkach przed ostrożnym obchodzeniem się ze szczeniętami, aby uniknąć zanieczyszczenia "obcymi" zapachami, które mogłyby stresować matkę i wywołać odrzucenie młodych.</li>
	<li>Wykonać wstrzyknięcie dootrzewnowe za pomocą strzykawki insulinowej (29 G), jak pokazano na rysunku 1A. Przytrzymaj noworodka skórą grzbietową. Brzuszną stroną do góry wprowadź igłę pod przednią nogę i delikatnie wepchnij ją podskórnie, aby dotrzeć do jamy otrzewnej (nieco poniżej pępka). Obecnie wstrzykujemy 1% błękitu metylenowego rozcieńczonego w DPBS i monitorujemy przeżywalność, aby ćwiczyć technikę przed przeprowadzeniem infekcji wirusowych. Ponieważ błękit metylenowy jest wyraźnie widoczny podczas procesu wstrzykiwania, zalecamy wykonanie tego "treningowego" zastrzyku w pierwszej kolejności, aby zapewnić prawidłowe dostarczenie zawiesiny wirusa do jamy dootrzewnowej.</li>
	<li>Wyeliminuj maleńkie krople krwi, które mogą się pojawić, i umieść noworodka z powrotem w klatce.</li>
</ol>
3. Obrazowanie in vivo
<ol>
	<li>W dniu 7 należy obchodzić się z noworodkami z takimi samymi środkami ostrożności, jak wspomniano wcześniej. Wstrzyknąć dootrzewnowo mieszaninę środków znieczulających (4 mg/ml ketaminy, 0,8 mg/ml ksylazyny) i lucyferyny (0,15 mg/g masy ciała) w 50 μl u każdego zwierzęcia. Średnia masa ciała zwierząt wynosi 1-2 g, a dawka środków znieczulających na zwierzę wynosi: ketamina 40 μg, ksylazyna 8 μg Odczekaj 12-15 minut, aż lucyferyna osiągnie maksymalną emisję. Musi to być wcześniej ustalone i zależy od dostawcy lucyferyny i zastosowanego systemu obrazowania.</li>
	<li>Podczas gdy młode są znieczulane, oznacz je w celu przyszłej identyfikacji i zbierz mały kawałek tkanki, który można następnie wykorzystać do przyszłego genotypowania, jeśli zostaną użyte zmutowane zwierzęta.</li>
	<li>Umieść szczenięta w systemie obrazowania i dokonaj akwizycji światła emitowanego przez całe ciało. Siedem dni po zakażeniu wirus replikuje się w licznych kopiach w narządach docelowych, takich jak wątroba, nerki, płuca i gruczoły ślinowe; Dlatego czas ekspozycji powinien być krótki. W naszym przypadku akwizycja trwa od 10 do 20 sekund (rysunek 1B). Platforma w komorze akwizycyjnej urządzenia do obrazowania musi być podgrzewana, aby uniknąć nadmiernego chłodzenia temperatury ciała znieczulonych zwierząt. Ponadto pomocne jest uzyskanie obrazów o niskiej rozdzielczości kilku zwierząt w ciągu jednej rundy akwizycji, a następnie przesunięcie się w górę platformy bliżej obiektywu aparatu, aby skupić się na jednej części konkretnego zwierzęcia lub wyizolowanym narządzie po sekcji. Oprogramowanie musi umożliwiać szybkie zmiany parametrów (czas ekspozycji, odległość, próbka/soczewka, czułość), kwantyfikację zdefiniowanych obszarów zainteresowania i przyszły eksport obrazów migawkowych.</li>
	<li>Aby uzyskać sygnał świetlny tylko z głowy, przykryj ciało noworodków leżących bocznie grubym, ciemnym papierem, który zamaskuje fotony emitowane na poziomie narządów, w których występuje wysoka replikacja wirusa (wątroba, płuca, gruczoły ślinowe) i wykonuj akwizycję przez 5 do 10 minut (ryc. 1C). Wykonaj przejęcie przeciwnej strony zwierzęcia w tych samych warunkach.</li>
	<li>Ponownie wprowadź młode do klatki i umieść na niej lampę grzewczą, aby uniknąć nadmiernego wychłodzenia znieczulonych noworodków. Regularnie monitoruj rekonwalescencję po znieczuleniu. Przy wskazanej dawce znieczulenie trwa obecnie 30 minut.</li>
	<li>Powtórz tę samą procedurę w dniach 9, 11 i 14. W dniach 11 i 14 należy zmienić dawkę środków znieczulających (6 mg/ml ketaminy, 1,2 mg/ml ksylazyny).</li>
</ol>

<ol><li>Loewendorf, A., Benedict, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+innate+and+adaptive+immune+defenses+by+cytomegalovirus%3A+timing+is+everything%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything.</a> J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).</li>
<li>Lischka, P., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+strategies+to+combat+cytomegalovirus+infections+in+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).</li>
<li>Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+human+cytomegalovirus+a+target+in+cancer+therapy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy?</a> Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).</li>
<li>Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Immunity in neonates.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 87, 207-213 (2002).</li>
<li>Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+immunity%3A+faulty+T-helpers+and+the+shortcomings+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells.</a> Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).</li>
<li>Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responsiveness+in+the+neonatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immune responsiveness in the neonatal period.</a> J. Comp. Pathol. 137, 27-31 (2007).</li>
<li>Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathogenesis+of+congenital+cytomegalovirus+infection%3A+disease+mechanisms+and+prospects+for+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention.</a> Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).</li>
<li>Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cytomegalovirus+infection+on+embryogenesis+and+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Congenit.+Anom.+%28Kyoto%29%22%5BJournal%5D)">Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development.</a> Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).</li>
<li>Sancho-Shimizu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+susceptibility+to+herpes+simplex+virus+1+encephalitis+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans.</a> Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).</li>
<li>Crozat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+MCMV+resistome+by+ENU+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis.</a> Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).</li>
<li>Juanjuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+for+congenital+CMV+infection+and+hearing+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment.</a> Virol. J. 8, 70(2011).</li>
<li>Koontz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+development+of+the+brain+after+focal+herpesvirus+infection+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system.</a> J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).</li>
<li>Bantug, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+lymphocytes+control+murine+cytomegalovirus+replication+in+the+central+nervous+system+of+newborn+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals.</a> J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).</li>
<li>Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+welfare+and+the+3Rs+in+European+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).</li>
<li>Sacher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cell+types+in+cytomegalovirus+infection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).</li>
<li>Lutarewych, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+and+titration+of+murine+cytomegalovirus+in+a+continuous+bone+marrow-derived+stromal+cell+line+%28M2-10B4%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4).</a> J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.	
	Oświadczenie etyczne	
	Zwierzęta utrzymywano w warunkach wolnych od patogenów w placówce opieki nad zwierzętami Institut d'Immunologie et d'Hématologie. Postępowanie z myszami i procedury eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z francuską ustawą o ochronie zwierząt laboratoryjnych. Procedura została zatwierdzona przez service véterinaire de la Préfecture du Bas-Rhin (Francja) pod numerem pozwolenia A-67-345.

Wykorzystując technologię obrazowania in vivo do monitorowania rozprzestrzeniania się MCMV-Luc u noworodków myszy, byliśmy w stanie zaobserwować rozprzestrzenianie się wirusa do mózgu zmutowanych zwierząt, w przeciwieństwie do typu dzikiego. Dalsza sekcja zwierzęcia i obrazowanie ex vivo mózgu potwierdziły obecność wirusa luminescencyjnego w ośrodkowym układzie nerwowym. Ponadto przeprowadziliśmy również immunohistochemię (nie pokazaną) na cienkich odcinkach mózgu z przeciwciałem specyficznym dla wczesn...

Ludzki wirus cytomegalii (HCMV/HHV-5) należy do rodziny β-herpeswirusów. HCMV jest bardzo rozpowszechnionym, oportunistycznym patogenem, który zwykle nabywa się we wczesnym okresie życia jako zakażenie bezobjawowe 1. Podobnie jak wszystkie herpeswirusy, HCMV utrzymuje się przez całe życie gospodarza, którego układ odpornościowy ściśle kontroluje replikację wirusa. Epizody reaktywacji wirusa występują głównie u osób z obniżoną odpornością, takich jak pacjenci po przeszczepie, otrzymujący leki zapobiegające odrzuceniu przeszczepu 2. U dorosłych HCMV jest również powiązany z glejakami 3. Ponadto HCMV jest znaczącym patogenem dla noworodków z niedojrzałą odpornością 4-6. Pierwotne zakażenie u rozwijającego się płodu lub noworodka może mieć poważne konsekwencje. Zakażenie HCMV jest najczęstszą przyczyną infekcyjną wrodzonych wad wrodzonych i zaburzeń wieku dziecięcego w krajach rozwiniętych. Szacuje się, że częstość występowania zakażenia HCMV u noworodków dotyka 0,5-1% wszystkich żywych urodzeń, z czego 5-10% będzie cierpieć na ciężkie objawy, takie jak małogłowie czy hipoplazja móżdżku. Ponadto u 10% zakażonych niemowląt z subkliniczną infekcją wirusową rozwiną się później następstwa prowadzące do upośledzenia umysłowego, utraty słuchu, wad wzroku lub drgawek i epilepsji 7,8.	
	W przeciwieństwie do innych ludzkich herpeswirusów, takich jak Herpes Simplex 1 (HSV-1/HHV-1), które mogą być inokulowane myszom różnymi drogami iniekcji 9, replikacja wirusa cytomegalii jest specyficzna dla gatunku. Ta cecha poważnie utrudniła badania patogenezy HCMV, które są przeprowadzane na różnych modelach zwierzęcych (mysz, szczur, świnka morska, rezus) i ich odpowiednich prawdziwych CMV specyficznych dla gospodarza. Wszystkie CMV wykazują znaczące podobieństwa w wielkości i organizacji genomu, tropizmie tkankowym i regulacji ekspresji genów. Wywołują również podobne patologie u swojego gospodarza. Pomimo różnorodności genomowej między HCMV a mysim wirusem cytomegalii (MCMV) (50% ORF obecnych w ludzkim wirusie jest identyfikowanych w mysim CMV), model mysi okazał się ostatnio korzystny, głównie dlatego, że zmutowane szczepy mogą być testowane pod kątem ich zdolności do kontrolowania replikacji wirusa in vivo. Doprowadziło to do genetycznego badania przesiewowego, które umożliwiło oszacowanie liczby genów myszy ulegających ekspresji w stadium dorosłym, które składają się na "rezystom" tego wirusa 10. Wszystko to wskazuje, że myszy zakażone MCMV stanowią atrakcyjny model do badania interakcji gospodarz-wirus u dorosłych. Badanie wrodzonego zakażenia CMV jest bardziej złożone, ponieważ różnice w organizacji warstwy łożyskowej między człowiekiem a myszami upośledzają transmisję infekcji wirusowej z matki na płód u myszy. Ostatnio bezpośrednie wstrzyknięcie MCMV do łożyska w 12,5 dniu ciąży umożliwiło zakażenie mózgu noworodków myszy, co doprowadziło do upośledzenia słuchu 11. Jednak większość badań wykorzystuje obecnie wstrzyknięcie dootrzewnowe noworodkom w wieku 4-20 godzin, aby zapewnić ogólnoustrojowe rozprzestrzenianie się wirusa, potencjalnie prowadzące do hematogennego zakażenia mózgu, model, który jest bardziej odpowiedni niż wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe. Protokół ten dostarczył ważnych informacji na temat patogenezy CMV, a w szczególności wykazano, że zakażenie MCMV noworodków powoduje replikację wirusa w komórkach neuronalnych i glejowych zlokalizowanych w ogniskach zapalnych, które są naciekane komórkami jednojądrzastymi, takimi jak makrofagi 12. W raporcie opisano również zmienioną morfogenezę móżdżku, której towarzyszy zmniejszona proliferacja i migracja neuronów ziarnistych oraz indukcja wielu genów stymulowanych interferonem. Zasadnicza rola limfocytów T CD8 + w kontroli MCMV w ośrodkowym układzie nerwowym została również zgłoszona przez tę samą grupę 13. Ważnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę podczas analizy patologicznego wpływu drobnoustroju, jest dynamika infekcji. W przypadku MCMV szczególnie ważne jest zbadanie i ilościowe określenie progresji rozprzestrzeniania się wirusa w rozwijającym się mózgu, aby zrozumieć i przewidzieć skalę przyszłych urazów neurobiologicznych. Tradycyjnie, kwantyfikacja postępu infekcji wymaga regularnego składania ofiar z zakażonych zwierząt w celu miana patogenu w tkankach, takich jak mózg, które w inny sposób są niedostępne. Ten rodzaj protokołu jest obecnie kwestionowany przez konieczną poprawę dobrostanu zwierząt i zasady 3R (Reduce, Refine, Replace) 14. Stosowanie technologii obrazowania in vivo może pozwolić na drastyczne zmniejszenie liczby zwierząt, co jest niezbędne w doświadczeniach dotyczących zakażeń in vivo. W tym miejscu przedstawiamy i opisujemy analizę przebiegu czasowego rozprzestrzeniania się wirusa do mózgu po dootrzewnowym wstrzyknięciu MCMV-Luc mysim noworodkom. Korzystając z tych samych zwierząt, śledziliśmy i monitorowaliśmy in vivo miejsca intensywnej replikacji wirusa w okresie 2 tygodni.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3523A</td><td></td></tr><tr><td>Methylen blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319112</td><td></td></tr><tr><td>Igły do insuliny</td><td>VWR</td><td>613-4897</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna/Vetranal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>DUTSCHER</td><td>P0436500</td><td></td></tr><tr><td>Lucyferin</td><td>Caliper</td><td>760504</td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>karboksymetyloceluloza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>krystaliczny fiolet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>IVIS 50</td><td>Caliper/Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Ludzki wirus cytomegalii (HCMV lub HHV-5) jest zagrażającym życiu patogenem u osób z obniżoną odpornością. W przypadku infekcji wrodzonej lub noworodkowej wirus może zakażać i replikować się w rozwijającym się mózgu, co może wywołać poważne uszkodzenia neurologiczne, w tym głuchotę i upośledzenie umysłowe. Pomimo potencjalnego nasilenia objawów, możliwości terapeutyczne są ograniczone ze względu na niedostępność szczepionki i brak specyficznej terapii przeciwwirusowej. Ponadto nadal brakuje precyzyjnego opisu zdarzeń molekularnych zachodzących podczas zakażenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN), ponieważ obserwacje pochodzą głównie z sekcji zwłok zakażonych dzieci. Opracowano kilka modeli zwierzęcych, takich jak CMV makaka rezusa, które dostarczyły ważnych informacji na temat patogenezy CMV w OUN. Jednak pomimo ewolucyjnej bliskości z ludźmi, model ten był ograniczony przez procedurę inokulacji wewnątrzczaszkowej stosowaną do zakażania zwierząt i konsekwentnego wywoływania infekcji OUN. Co więcej, względy etyczne przyczyniły się do opracowania alternatywnych modeli, wśród których zakażenie nowonarodzonych myszy wirusem cytomegalii myszy (MCMV) doprowadziło ostatnio do znacznych postępów. Na przykład dooniesiono, że dootrzewnowe wstrzyknięcie MCMV noworodkom Balb/c prowadzi do infekcji neuronów i komórek glejowych w określonych obszarach mózgu. Odkrycia te sugerują, że eksperymentalna inokulacja myszy może podsumować deficyty wywołane zakażeniem HCMV u dzieci. Niemniej jednak dynamiczna analiza zakażenia MCMV noworodków jest trudna do przeprowadzenia, ponieważ klasyczna metodologia wymaga poświęcenia znacznej liczby zwierząt w różnych punktach czasowych w celu przeanalizowania obciążenia wirusem i/lub parametrów związanych z odpornością. Aby obejść to wąskie gardło i umożliwić przyszłe badania rzadkich zmutowanych zwierząt, zastosowaliśmy technologię obrazowania in vivo w celu przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie rozprzestrzeniania się wirusa w mózgu po obwodowym wstrzyknięciu rekombinowanego MCMV eksprymującego lucyferazy do noworodków C57Bl / 6.

Reprezentatywny eksperyment przedstawiono na Rysunku 1. Po podaniu wewnątrzbrzusznym 50 PFU MCMV-Luc (Panel A pokazuje analogiczną iniekcję wykonaną z użyciem błękitu metylenowego w celu wizualizacji podskórnej drogi wprowadzenia igły), noworodki znieczulono i podano im jednocześnie 0,3 mg substratu lucyferazy (Luciferin, Caliper). Piętnaście minut później zwierzęta ułożono stroną brzuszną do góry w komorze akwizycyjnej urządzenia IVIS 50 (In Vivo Imaging System, Caliper), a światło emitowane przez cały ...

Zakażenie noworodków ludzkim wirusem cytomegalii (HCMV) stanowi ważną przyczynę upośledzenia umysłowego, jednak zdarzenia molekularne prowadzące do patogenezy wywołanej przez wirusa są nadal słabo poznane. Aby zbadać dynamikę infekcji mózgu, dostosowaliśmy obrazowanie in vivo całych zwierząt do przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie noworodków zakażonych wirusem rekombinowanym lucyferazy.

Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykonanie obrazowania in vivo noworodków myszy w celu zbadania rozprzestrzeniania się luminescencyjnego cytomegalowirusa. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie odpowiedniego rozcieńczenia wirusa z roztworu zapasowego, a następnie wstrzyknięcie luminescencyjnego MCMV do jamy otrzewnej noworodków.W określonych punktach czasowych po wstrzyknięciu. Szczęta są poddawane znieczuleniu i otrzymują wstrzyknięcie Lucifera przed obrazowaniem in vivo. Ostatecznie obrazowanie in vivo służy do wykazania i ilościowego określenia replikacji oraz rozprzestrzeniania się wirusa w jamie otrzewnej i ośrodkowym układzie nerwowym.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak filtracja wirusów z narządów po uśpieniu zakażonych zwierząt, jest mniejsze zużycie czasu i zasobów. Procedurę zaprezentuje pan Il Macan, technik z mojego laboratorium. W poniższym badaniu wykorzystano szczep MCMV wykazujący ekspresję lucyferazy, otrzymany z laboratorium Ulricha Kowskiego.Aby namnożyć szczep, dodaj wirusa do hodowli komórkowych w medium beztłuszczowym w temperaturze 37 °C. Po godzinie usuń supernatant i zastąp go DMEM uzupełnionym o 10% płodowego surowicy cielęcej. Po pięciu dniach hodowlę zbiera się, a alikwoty przechowuje w temperaturze -80 °C.Do czasu dalszego użycia. Po oznaczeniu miana zawiesiny wirusa za pomocą testu plackowego, rozcień próbkę do 50 pfu w 50 µL DMEM i przechowuj na lodzie do momentu wykonania wstrzyknięć noworodkom w wieku od 4 do 20 godzin. Przed kontaktem z szczeniętami manipuluj miotem i odchodami w rękawiczkach.Aby uniknąć wprowadzenia obcych zapachów, które mogłyby zestresować matkę, w celu wykonania iniekcji próbnej napełnij strzykawkę insulinową 1% methylene blue rozcieńczonym w DPBS. Po przygotowaniu chwyć noworodka za skórę grzbietową, tak jak pokazano tutaj, z brzuchem skierowanym do góry. Wprowadź igłę pod jedną z tylnych kończyn i delikatnie przesuń ją podskórnie do jamny otrzewnowej.Gdy końcówka igły znajdzie się w odpowiedniej pozycji, wstrzyknij zaznaczoną na niebiesko ilość metylu. Następnie powoli wycofaj igłę i usuń krew z miejsca wstrzyknięcia. Po zakończeniu zabiegu przenieś noworodka z powrotem do klatki macierzystej. Po udanym wykonaniu wstrzyknięcia próbnego powtórz tę procedurę z wcześniej przygotowaną zawiesiną wirusową.Obrazy wykonuje się siedem dni po wstrzyknięciu, obchodząc się z noworodkami ostrożnie, zgodnie z wcześniejszym opisem. Każdego z nich wstrzykuje się mieszaninę środków znieczulających oraz Lucyferyny, a następnie oczekuje od 12 do 15 minut, aż Lucyferyna osiągnie maksymalną emisję; należy upewnić się, że platforma w komorze akwizycyjnej urządzenia obrazującego jest podgrzewana w celu utrzymania prawidłowej temperatury ciała. Po znieczuleniu i oznakowaniu szczeniąt w celu identyfikacji, są one gotowe do umieszczenia w systemie obrazowania.W pierwszej kolejności należy przeprowadzić akwizycję światła emitowanego przez całe ciało. Ponieważ wirus zreplikował się w kilku narządach docelowych, czas ekspozycji powinien być krótki. W tym przypadku akwizycję przeprowadza się przez 10 do 20 sekund.Warto jest uzyskać obrazy o niskiej rozdzielczości dla kilku zwierząt w jednej serii akwizycji, a następnie przesunąć platformę bliżej, aby skupić się na jednej części konkretnego zwierzęcia lub wyizolowanym organie po sekcji. Aby uzyskać sygnał świetlny wyłącznie z głowy, należy przykryć resztę ciała grubym, ciemnym papierem, który zmaskuje fotony, przeprowadzić akwizycję przez okres od 5 do 10 minut, a następnie powtórzyć tę procedurę dla przeciwległej strony zwierzęcia w tych samych warunkach.Po wykonaniu obrazowania należy przenieść szczenięta do ogrzewanej klatki, aby utrzymać temperaturę ich ciała podczas anestezji. Obrazy te zostały wykonane w 7., 9., 11. i 14. dniu po infekcji; ogólny miano wirusa w organizmie zwierzęcia wydaje się spadać w czasie. W tym przykładzie ciało jest przykryte, pozostawiając odsłoniętą głowę.Ujawniło to dyskretny punkt na wysokości lewego ucha, którego intensywność wzrasta między 7. a 14. dniem, co sugeruje, że rozprzestrzenianie się MCMV do mózgu można dynamicznie obserwować in vivo. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące dokładnej lokalizacji wirusa w mózgu.

use-vivo-imaging-to-monitor-progression-experimental-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie in vivo Obrazowania do Monitorowania Postępu Eksperymentalnego Zakażenia Noworodków Wirusem Cytomegalii Myszy

Współistnienie infekcji wirusem grypy A jest jednym z czynników uwikłanych w indukcję inwazyjnej choroby pneumokokowej podczas bezobjawowego nosicielstwa Streptococcus pneumoniae. W niniejszej pracy opisujemy metodę infekcji mieszanej z wykorzystaniem myszy noworodkowych w celu zbadania synergizmu między tymi dwoma patogenami dróg oddechowych.

Wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do badania synergizmu pomiędzy Streptococcus pneumoniae a wirusem grypy typu A u młodych myszy

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli...

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Źródło: Seman, B. G. i in. Model obrazowania noworodków sepsy bakteryjnej Gram-ujemnej. J. Vis. Exp. (2020)Film prezentuje model noworodkowej myszy do badania infekcji ogólnoustrojowej z użyciem zamkniętych bakterii bioluminescencyjnych. Noworodki są wstrzykiwane wysokodawkowymi lub niskodawkowymi zawiesinami bakteryjnymi i zwracane matce na opiekę poporodową. Otoczone bakterie unikają wczesnego wykrywania odpornościowego, rozprzestrzeniają się systemowo i są wizualizowane w czasie za pomocą...

Modelowanie infekcji u noworodkowych myszy z użyciem kapsulowanych bioluminescencyjnych bakterii

Ten film demonstruje proces wstrzykiwania do komory mózgowej w celu zbadania dystrybucji mysiego wirusa cytomegalii (MCMV) w mózgu noworodka myszy. MCMV, zaprojektowany do ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) zapewniającego widoczność, jest wstrzykiwany do bocznej komory mózgu szczeniaka myszy. Wstrzyknięty wirus krąży w płynie mózgowo-rdzeniowym, infekując komórki w okolicy okołokomorowej, w tym w strefie brzeżnej, splocie naczyniówkowym i strefie podkomorowej.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe w celu analizy dystrybucji mysiego wirusa cytomegalii w mózgu noworodka myszy

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Tutaj opisujemy prostą metodę domózgowego i wewnątrznaczyniowego wstrzykiwania cząsteczek wirusa lub fluorescencyjnych mikrogranulek do mózgu noworodka myszy. Wzorzec lokalizacji wirusa i nanocząstek można wykryć za pomocą oceny mikroskopowej lub hybrydyzacji in situ.

Domózgowo-komorowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusowych i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka

Zakażenie noworodków myszy bioluminescencyjnym E. coli O1:K1:H7 powoduje infekcję septyczną ze znacznym zapaleniem płuc i patologią płuc. W tym miejscu opisano procedury modelowania i dalszego badania sepsy noworodków za pomocą podłużnego obrazowania przyżyciowego równolegle z wyliczaniem ogólnoustrojowych obciążeń bakteryjnych, profilowaniem stanu zapalnego i histopatologią płuc.

Noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej Gram-ujemnej

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Ten protokół pokazuje wstrzyknięcie do żyły skroniowej w celu dostarczenia dożylnego komórek raka u dzieci noworodkom myszy, umożliwiając precyzyjne, możliwe do powtórzenia modelowanie wczesnych reakcji immunologicznych przeciwko rakiem. Metoda ta umożliwia ocenę wpływu interwencji, takich jak immunomodulacja czy terapia, kiedy są one zastosowane w okresie noworodkowym.

Model noworodka dożylnego przeszczepu do oceny działań odpornościowych we wczesnym okresie życia przeciwko komórkom nowotworowym

Poznaj technikę obrazowania in vivo do monitorowania replikacji wirusa cytomegalii u noworodków myszy. Ta metoda umożliwia śledzenie dynamiki zakażenia w układzie nerwowym i jamie otrzewnowej w czasie rzeczywistym.

Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Przeglądaj więcej filmów