1.13: Wprowadzenie do mikroskopii świetlnej

Mikroskop świetlny to przyrząd służący do powiększania próbek badawczych. Mikroskopy świetlne są nieocenionym narzędziem analitycznym, które może umożliwić badaczom oglądanie obiektów w rozmiarze 1000 razy większym niż ich pierwotna wielkość. Jak zobaczysz, mikroskop świetlny działa na kilku bardzo podstawowych zasadach, ale ma prawie nieograniczone zastosowania do wizualizacji próbek w laboratorium.

Jak sama nazwa wskazuje, mikroskop świetlny wymaga źródła światła, które wytwarza światło, które może być skupione na próbce za pomocą soczewki kondensatora.

Światło, które oświetla próbkę, dociera do soczewki zwanej soczewką obiektywu, która tworzy powiększony obraz, który jest odwrócony lub odwrócony do góry nogami. Okular, czyli soczewka okularowa, dodatkowo powiększa obraz, który następnie odbiera oko. Do ścieżki światła można wprowadzić dodatkowe elementy optyczne, aby wyprostować obraz, tak aby oko widziało go we właściwej orientacji. Mikroskopy, które wykorzystują wiele soczewek, takich jak ten, który widzisz tutaj, są określane jako mikroskopy złożone.

W mikroskopie złożonym całkowite powiększenie oblicza się, mnożąc powiększenie soczewki obiektywu przez powiększenie soczewki okularu lub okularu. W przypadku soczewki obiektywowej 40X i soczewki okularowej 10X całkowite powiększenie wynosi 400X.

Aby pomóc oszacować rozmiar obiektów pod mikroskopem, można użyć siatki okularowej, skali rzutowanej na obraz. Przy większym powiększeniu znaczniki w siatce okularu będą reprezentować mniejsze odległości niż podczas oglądania w mniejszych powiększeniach.

Oprócz powiększenia, kolejnym aspektem optyki mikroskopowej jest rozdzielczość. Rozdzielczość odnosi się do najkrótszej możliwej do rozdzielenia odległości między dwoma obiektami w obrębie zakresu. W miarę jak głowy tych postaci stają się coraz wyraźniejsze, a rozdzielczość wzrasta, najkrótsza obserwowalna odległość między nimi maleje.

Główne elementy mikroskopu świetlnego to obiektywy, okulary, stolik na próbkę i uchwyt próbki, źródło światła, membrana polowa, kondensor i apertura oraz pokrętła zgrubnego i precyzyjnego ustawiania ostrości.

Obiektywy są odpowiedzialne za większość powiększenia i rozdzielczości mikroskopu. Są one zamontowane na obrotowej końcówce w taki sposób, że wraz ze zmianą obiektywów płaszczyzna ogniskowej pozostaje taka sama ? Właściwość określana jako parafokalność. Obiektyw może być oznaczony powiększeniem, aperaturą numeryczną lub N.A., rodzajem wymaganego medium immersyjnego, grubością szkiełka nakrywkowego, która powinna być używana podczas mocowania próbek, oraz odległością roboczą - odległością od końcówki soczewki obiektywu do płaszczyzny ogniskowej w próbce.

Apertura numeryczna, ponownie zdefiniowana jako N.A., jest miarą tego, jak dobrze obiektyw mikroskopu może zbierać światło. Obiektywy o wysokiej szerokości geograficznej wymagają światła pod kątem ukośnym, podczas gdy obiektywy o niskiej szerokości wymagają bardziej bezpośredniego światła. Rozdzielczość obiektywu można obliczyć na podstawie apertury numerycznej, biorąc pod uwagę długość fali światła.

Źródło światła, przysłona polowa, apertura i kondensator są odpowiedzialne za wytwarzanie światła i dostarczanie go do próbki.

Źródłem światła jest zazwyczaj niskonapięciowa żarówka halogenowa, którą można regulować w celu kontrolowania natężenia światła.

Światło przechodzi następnie przez różne filtry i trafia do membrany polowej, która kontroluje obszar badanej próbki.

Dalej jest kondensator, który skupia jasne światło na próbce, stożek oświetlenia wokół próbki jest kontrolowany przez kondensator i musi być regulowany w zależności od używanego obiektywu.

Aby rozpocząć korzystanie z mikroskopu świetlnego, umieść próbkę zawierającą interesujący Cię obszar na stoliku mikroskopu, wyśrodkuj ją bezpośrednio nad obiektywem i przymocuj na miejscu za pomocą klipsów stolika.

Następnie włącz źródło światła i przełącz się na obiektyw o najniższej mocy.

Następnie ustaw ostrość obiektywu o małej mocy, przesuwając go w kierunku z za pomocą początkowej regulacji pokrętła regulacji zgrubnej, a następnie obracając pokrętła precyzyjnej regulacji, aby ustawić ostrość obiektu. Uważaj, aby nie uderzyć obiektywem w szkiełko lub stolik, ponieważ może to spowodować uszkodzenie obiektywu.

Następnie zlokalizuj obszar zainteresowania, patrząc przez okulary, jednocześnie regulując pokrętła, aby przesunąć suwak w kierunkach x i y. Rozmiar pola widzenia zmniejszy się drastycznie w miarę przechodzenia od małego powiększenia do większego powiększenia.

Wyśrodkowanie celu o najniższej mocy na obszarze zainteresowania przed przejściem do wyższej mocy znacznie zwiększa szanse na znalezienie pożądanego okazu.

Gdy próbka zostanie zlokalizowana przy niskiej mocy i będzie ostra, przejdź do obiektywu o wyższej mocy, który będzie używany do uzyskiwania obrazów.

Zoptymalizuj jakość oświetlenia, najpierw regulując przysłonę pola tak, aby sama przysłona znajdowała się tuż poza polem widzenia.

Następnie wyreguluj przysłonę kondensatora tak, aby ustawienia odpowiadały aperturze numerycznej używanego obiektywu.

Na koniec ponownie dostosuj ostrość. Tym razem tylko za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji.

Jesteś teraz gotowy do robienia zdjęć swojego okazu.

Mikroskopia świetlna ma potencjał do wizualizacji szerokiej gamy próbek, a różne konfiguracje mikroskopu złożonego można dostosować do wielu różnych zastosowań.

Na zdjęciu widać badacza przygotowującego się do pracy pod mikroskopem chirurgicznym. Mikroskopy te są zazwyczaj zawieszone na ruchomym ramieniu i są stereoskopowe, co oznacza, że przepuszczają światło do widza, a także do kamery zamontowanej na mikroskopie. Ten mikroskop chirurgiczny jest używany w procedurze przeszczepu nerki u myszy.

W tym klipie widzisz badacza przeglądającego mikroskop preparacyjny, podczas wybierania idealnych larw Drosophila do dalszej sekcji , w celu odsłonięcia mięśni ściany ciała, aby można było zbadać połączenie nerwowo-mięśniowe.

Tutaj można zobaczyć odwrócony mikroskop złożony, który ma obiektyw poniżej stolika, przygotowywany do techniki mikroiniekcji. Ta procedura, znana jako transfer jądra komórki somatycznej, jest ważną metodą generowania zwierząt transgenicznych i tworzenia klonów.

Właśnie obejrzałeś JoVE? wprowadzenie do mikroskopii świetlnej.

W tym filmie omówiliśmy: czym jest mikroskop i jak działa, jego wiele elementów, jak dokonywać w nich regulacji i jak uzyskiwać wysokiej jakości obrazy. Dzięki za oglądanie!