Wstęp do mikroskopii świetlnej

Mikroskop świetlny jest instrumentem służącym do powiększania badanych preparatów. Mikroskopy świetlne stanowią nieocenione narzędzie analityczne, które umożliwia badaczom oglądanie obiektów z powiększeniem do 1000 razy w stosunku do ich pierwotnego rozmiaru. Jak przekonacie się w dalszej części, mikroskop świetlny działa w oparciu o kilka bardzo podstawowych zasad, a jego zastosowania w wizualizacji preparatów laboratoryjnych są niemal nieograniczone.

Jak wynika z nazwy, mikroskop świetlny wymaga źródła światła, które emituje promienie mogące zostać skupione przez soczewkę kondensora na preparacie.

Światło oświetlające badany obiekt trafia do soczewki nazywanej obiektywem, która tworzy powiększony obraz odwrócony, czyli obrócony do góry nogami. Okular dodatkowo powiększa obraz, który następnie trafia do oka. W torze optycznym można wprowadzić dodatkowe elementy optyczne w celu odwrócenia obrazu, aby oko widziało go w prawidłowej orientacji. Mikroskopy wykorzystujące wiele soczewek, takie jak ten przedstawiony tutaj, nazywane są mikroskopami złożonymi.

W mikroskopie złożonym całkowite powiększenie oblicza się mnożąc powiększenie obiektywu przez powiększenie okularu. Przy obiektywie 40X i okularze 10X całkowite powiększenie wynosi 400X.

Aby pomóc w oszacowaniu rozmiaru obiektów pod mikroskopem, można zastosować siatkę okularową, czyli skalę rzutowaną na obraz. Przy większym powiększeniu kreski na siatce okularowej reprezentują mniejsze odległości niż przy mniejszych powiększeniach.

Oprócz powiększenia innym aspektem optyki mikroskopowej jest rozdzielczość. Rozdzielczość odnosi się do najmniejszej rozróżnialnej odległości między dwoma obiektami obserwowanymi pod mikroskopem. W miarę jak kształty tych znaków stają się coraz wyraźniejsze, a rozdzielczość rośnie, najmniejsza obserwowalna odległość między nimi maleje.

Główne elementy mikroskopu świetlnego obejmują obiektywy, okulary, stolik z uchwytem do preparatów, źródło światła, przysłonę pola, kondensator z przysłoną oraz pokrętła regulacji ostrości wstępnej i precyzyjnej.

Obiektywy odpowiadają za większość powiększenia i rozdzielczości mikroskopu. Są one zamontowane na obrotowej rewolwerze w taki sposób, że podczas zmiany obiektywów płaszczyzna ogniskowania pozostaje niezmienna – właściwość tę nazywa się parafokalnością. Na obiektywie może znajdować się oznaczenie powiększenia, apertury numerycznej (N.A.), rodzaju wymaganego medium imersyjnego, grubości szkiełka nakrywkowego, którego należy użyć podczas montowania próbek, oraz odległości roboczej – czyli dystansu od czoła soczewki do płaszczyzny ogniskowania w preparacie.

Apertura numeryczna, oznaczana jako N.A., jest miarą zdolności obiektywu mikroskopowego do zbierania światła. Obiektywy o wysokiej N.A. pozwalają na przejście światła pod kątami skośnymi, podczas gdy obiektywy o niskiej N.A. wymagają światła bardziej bezpośredniego. Rozdzielczość obiektywu można obliczyć na podstawie apertury numerycznej, znając długość fali światła.

Źródło światła, przysłona pola, przysłona kondensatora i kondensator odpowiadają za wytwarzanie światła i dostarczanie go do próbki.

Źródłem światła jest zazwyczaj niskonapięciowa żarówka halogenowa, której można regulować natężenie światła.

Światło przechodzi następnie przez zestaw filtrów do przysłony pola, która kontroluje obszar preparatu poddawany oświetleniu.

Kolejnym elementem jest kondensator, który skupia jasne światło na preparacie; stożek oświetlenia wokół preparatu jest kontrolowany przez kondensator i musi być dostosowany w zależności od użytego obiektywu.

Aby rozpocząć pracę z mikroskopem świetlnym, umieść na stoliku mikroskopu preparat zawierający obszar zainteresowania, wycentruj go bezpośrednio nad obiektywem i przymocuj za pomocą uchwytów stolika.

Następnie włącz źródło światła i przełącz się na obiektyw o najmniejszym powiększeniu.

Następnie ustaw ostrość obiektywu o małym powiększeniu, przesuwając go w kierunku osi z za pomocą wstępnej regulacji pokrętłem grubego ustawienia, a następnie obracając pokrętłami precyzyjnymi, aby uzyskać ostry obraz obiektu. Należy uważać, aby obiektyw nie uderzył w szkiełko lub stolik, ponieważ mogłoby to uszkodzić soczewkę.

Następnie zlokalizuj obszar zainteresowania, patrząc przez okulary i regulując pokrętła, aby przesunąć preparat w kierunkach x i y. Wielkość pola widzenia drastycznie zmniejszy się podczas przechodzenia z niskiego na wyższe powiększenie.

Wycentrowanie obiektywu o najmniejszym powiększeniu na obszarze zainteresowania przed przejściem na większe powiększenie znacznie zwiększa szanse na odnalezienie pożądanego obiektu.

Po zlokalizowaniu próbki przy małym powiększeniu i ustawieniu ostrości, przełącz się na obiektyw o większym powiększeniu, który będzie wykorzystywany do akwizycji obrazów.

Zoptymalizuj jakość oświetlenia, regulując najpierw przysłonę polową tak, aby sama przysłona znajdowała się tuż poza polem widzenia.

Następnie dostosuj przysłonę kondensora tak, aby ustawienia odpowiadały aperturze numerycznej używanego obiektywu.

Na koniec ponownie ustaw ostrość, tym razem korzystając wyłącznie z pokrętła precyzyjnego.

Teraz można przystąpić do wykonywania zdjęć preparatu.

Mikroskopia świetlna umożliwia wizualizację szerokiego zakresu preparatów, a istnieją różne konfiguracje mikroskopów złożonych, dostosowane do wielu odmiennych zastosowań.

Tutaj widzimy badacza przygotowującego się do pracy z mikroskopem chirurgicznym. Mikroskopy te są zazwyczaj zawieszone na ruchomym ramieniu i są stereoskopowe, co oznacza, że pozwalają na dopływ światła zarówno do obserwatora, jak i do zamontowanej na mikroskopie kamery. Ten mikroskop chirurgiczny jest wykorzystywany podczas procedury przeszczepu nerki u myszy.

W tym fragmencie widać badacza korzystającego z mikroskopu stereoskopowego do wyboru odpowiednich larw drosophila do dalszej sekcji, w celu odsłonięcia mięśni ściany ciała, aby umożliwić badanie złącza nerwowo-mięśniowego.

Tutaj widoczny jest odwrócony mikroskop złożony, z obiektywem znajdującym się poniżej stolika, przygotowywany do techniki mikroiniekcji. Procedura ta, znana jako transfer jąder komórek somatycznych, jest istotną metodą generowania zwierząt transgenicznych oraz tworzenia klonów.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do mikroskopii świetlnej.

W tym filmie omówiliśmy: czym jest mikroskop i jak działa, jego liczne komponenty, sposób ich regulacji oraz metody pozyskiwania wysokiej jakości obrazów. Dziękujemy za oglądanie!