Name: Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Poznaj metodę monitorowania ponownego fałdowania białek w komórkach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu sprzężonego białka lucyferazy z GFP. Technika łączy mikroskopię fluorescencyjną z testami enzymatycznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant z National Institutes of Health (NIGMS-074696) dla K.A.M. oraz American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship dla J.L.A. Dziękujemy również Johnowi Gloverowi z Uniwersytetu w Toronto za dostarczenie źródłowego plazmidu FFL-GFP.

1. Budowa szczepów zawierających plazmid FFL-GFP
Do tego badania użyto szczepu Saccharomyces cerevisiae BY4741 (MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) wraz ze szczepem delecyjnym HSP104 z kolekcji drożdży knockout (Open Biosystems/Thermo Scientific). Delecję potwierdzono przy użyciu przeciwciała swoistego dla Hsp104 do analizy Western blot.
FFL-GFP został wyrażony z p426MET25-FFL-GFP, skonstruowany z plazmidu źródłowego opartego na LEU2 uzyskanego z laboratorium Glovera na Uniwersytecie w Toronto 17 i możliwego do uzyskania na żądanie do autorów. Ekspresja białka fuzyjnego plazmidu FFL-GFP jest kontrolowana przez promotor tłumiony metioniną MET25. Plazmid został przekształcony w każdy szczep za pomocą protokołu zaadaptowanego z Gietz i wsp., 1995:
<ol>
 <li>Odwirować 25 ml komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z prędkością 4 400 obr./min przez 2 minuty, przemyć 500 μl podwójnie destylowanegoH20 (ddH2O) i odrzucić supernat.</li>
 <li>Zawieś komórki w 250 μl TE/LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M octan litu). Inkubować w temperaturze 30 °C bez mieszania przez 20 minut.</li>
 <li>Przenieś 50 μl kompetentnych komórek do nowej probówki wraz z 5 ml (50 μg) DNA nośnika i 5 μl (0,1-5 μg) plazmidowego DNA. Dodać 300 μl PEG/TE/LiAc (tak samo jak TE/LiAc plus 40% glikolu polietylenowego) do tej mieszaniny i inkubować komórki w temperaturze 30 °C przez kolejne 30 minut.</li>
 <li>Dodać 1/10 objętości (v/v) DMSO (36 μl) do tej mieszaniny i szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 6 min.</li>
 <li>Odwirować mieszaninę przy 6 000 obr./min przez 30 sekund i usunąć supernat. Zawiesić komórki w 100 μl sterylnego ddH20 i umieścić komórki na płytkach na syntetycznych kompletnych pożywkach pozbawionych uracylu (SC-URA).</li>
</ol>
2. Indukcja FFL-GFP
FFL-GFP jest indukowany, gdy komórki są w fazie logarytmicznej, więc większość białka przed szokiem cieplnym jest tworzona na nowo, aby uniknąć białek, które ostatecznie agregowały się z czasem z powodu niedoskonałości komórkowych związanych ze starzeniem.
<ol>
 <li>Dzień 1: Inkubować komórki w 5 ml SC-URA w temperaturze 30 °C, obracając O/N.</li>
 <li>Dzień 2: Zmierz OD600 i zaszczep świeże kultury w 5 ml SC-URAOD 600 ~ 0,2.</li>
 <li>Inkubować kultury z rotacją w temperaturze 30 °C, aż osiągną fazę logarytmiczną OD600 ~ 0,8-1,0.</li>
 <li>Odwirować komórki w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml z prędkością 4 400 obr./min przez 3 min, zdekantować i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl ddH20; przenieść roztwór do probówki do mikrowirówki.</li>
 <li>Odwirować z prędkością 6 000 obr./min i odrzucić supernację.</li>
 <li>Zawiesić komórki w 5 ml SC-URA-MET. Komórki powinny być inkubowane obracając się w tym pożywce przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C.</li>
 <li>Odwirować komórki i powtórzyć płukanie w ddH20 i odrzucić supernację.</li>
 <li>Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywce SC-URA zawierającej 100 μg/ml cykloheksymidu w celu zahamowania ekspresji białka i natychmiast przejść do Kroku 3.</li>
</ol>
3. Enzymatyczny test odzyskiwania FFL-GFP
Ten test jest ilościowym podejściem do określania poziomów aktywnego enzymu w populacji.
<ol>
 <li>Przygotowanie do tego testu:
 <ol class="lroman">
 <li>Zmierzyć OD600 dla każdej próbki.</li>
 <li>Przygotuj niezbędną ilość potrzebnej D-lucyferyny w oparciu o liczbę próbek i pożądaną liczbę powtórzeń plus około 1,200 μl na rurkę. Końcowe stężenie D-lucyferyny wynosi ~23 μg na 100 μl komórek. Początkowo rozpuszcza się go w wodzie o stężeniu roztworu podstawowego 7,5 mg/ml i rozcieńcza do 455 μg/ml w SC przed eksperymentem. Na rycinie 2 przeanalizowano trzy powtórzenia dla każdej próbki, w wyniku czego użyto łącznie 2,4 ml D-lucyferyny.</li>
 <li>Czytnik płytek programowych do oznaczania luminescencji błyskowej (zaadaptowany z BioTek Gen5 "Luminescence Flash Assay with Injection"; w przypadku innych przyrządów postępuj zgodnie z instrukcjami producenta)
 <ol class="lalpha">
 <li>Ustaw temperaturę na 30 °C</li>
 <li>Ustaw czytnik płytek, aby dodać D-lucyferynę, wstrząśnij i przeczytaj każdą studzienkę indywidualnie.</li>
 <li>Odczyt luminescencji (odczyt punktu końcowego, czas integracji 5 sekund, poziom czułości 180)</li>
 <li>Aby przeprowadzić test odzyskiwania między każdym odczytem, potrząsaj przez 5 minut, opóźnij 20 minut i potrząśnij przez dodatkowe 5 minut.</li>
 <li>Dozować 50 μl D-lucyferyny z wstrzykiwacza.</li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Luminescencja przed szokiem termicznym jest mierzona natychmiast po dodaniu komórek do pożywki zawierającej cykloheksymid w celu zatrzymania syntezy białek.
 <ol class="lroman">
 <li>Przenieść 100 μl komórek dla każdej próbki z żądaną liczbą powtórzeń do stałej białej płytki 96-dołkowej.</li>
 <li>Kontrole powinny zawierać ślepą próbę wody i komórki zawierające pusty wektor.</li>
 <li>Rozpocznij odczyt zgodnie ze specyfikacjami wymienionymi powyżej.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>W celu denaturacji ugrupowania FFL FFL-GFP należy inkubować 5 ml kultury w szklanej probówce hodowlanej w temperaturze 42 °C, wytrząsając przez 25 minut.</li>
 <li>Odczyty luminescencji w teście odzyskiwania rozpoczynają się natychmiast po wyjęciu komórek z inkubatora, co stanowi punkt zerowy. Mierz luminescencję tak samo, jak opisano powyżej dla pierwszego punktu czasowego i co 30 minut przez 90 minut.</li>
 <li>Znormalizuj próbki do wartości luminescencji szoku cieplnego, które zostały dostosowane na podstawie OD600 (podziel wartości szoku cieplnego przez OD600).</li>
</ol>
4. Mikroskopia fluorescencyjna
Ten test jest półilościową metodą określania rozpuszczalności agregatów w czasie w populacji komórek.
<ol>
 <li>Indukcja jest taka sama, jak opisano w sekcji 2, krokach 1-8 protokołów.</li>
 <li>Przyjmuje się te same punkty czasowe, jak opisano powyżej (sekcja 3, etap 4), ale w przypadku mikroskopii należy zebrać 1 ml komórek w momencie szoku cieplnego i w każdym punkcie czasowym odzyskiwania, a następnie inkubować próbki obracające się w temperaturze 30 °C w probówce hodowlanej.</li>
 <li>wizualizacja:
 <ol class="lroman">
 <li>Odwirować 1 ml komórek przy 6 000 obr./min przez 30 sekund i usunąć supernat.</li>
 <li>Zawiesić osad komórkowy w 2 μl ddH2O.</li>
 <li>Zmieszać 2 μl komórek plus 2 μl 2% niskotopliwej agarozy na szkiełku podstawowym i dodać szkiełko nakrywkowe. Aby uzyskać pojedynczą płaszczyznę komórek, należy lekko przycisnąć palec do środka szkiełka nakrywkowego i obracać do momentu, aż szkiełko nakrywkowe będzie trudne do przesunięcia.</li>
 <li>Komórki są wizualizowane za pomocą 100-krotnego obiektywu olejowego na mikroskopie fluorescencyjnym; użyj DIC do wizualizacji komórek i filtra FITC do wizualizacji fluorescencji GFP.</li>
 <li>Zrób wiele zdjęć dla każdego szczepu w każdym punkcie czasowym w celu oceny ilościowej. Pola na zdjęcia powinny zawierać ~15-30 komórek do ilościowej analizy poeksperymentalnej.</li>
 <li>Aby obliczyć procent komórek zawierających agregacje, policz łącznie 50-100 komórek i podziel liczbę komórek zawierających agregacje.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. Mikroskopia jednokomórkowa
Ta metoda służy do śledzenia rozpuszczania pojedynczych agregatów w pojedynczej komórce w czasie.
<ol>
 <li>Indukować ekspresję FFL-GFP zgodnie z opisem w sekcji 2, kroki 1-8.</li>
 <li>Po szoku cieplnym odwirować komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z prędkością 4 400 obr./min przez 2 min.</li>
 <li>Przemyć komórki 500 μl wody i ponownie zawiesić w 20 μl ddH2O.</li>
 <li>Dla każdego szczepu należy wyciąć odcinek płytki agarowej SC-URA o wymiarach 5x5 mm i używając powierzchni, która stykała się z szalką Petriego, odpipetować 4 μl komórek i rozprowadzić na powierzchni agaru końcówką pipety. Odstawić na ~1 min.</li>
 <li>Za pomocą pęsety umieść część kostki agaru zadrukowaną w dół na szklanym naczyniu nr 0 o średnicy ~55 mm i lekko dociśnij.</li>
 <li>wizualizacja:
 <ol class="lroman">
 <li>Patrz i-iii w sekcji 4.</li>
 <li>Ustaw współrzędne dla 2-4 punktów ogniskowych dla każdego szczepu w zależności od gęstości hodowli.</li>
 <li>Ustaw aparat tak, aby robił zdjęcia ze stosem Z o odpowiednim zakresie (-/+ 15 μm przy grubości warstwy 0,5-1,0 μm) co 5 minut przez okres 90 minut.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>

<ol><li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li>
<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li>
<li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc%2FSS-DNA%2FPEG+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li>
<li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104%2C+Hsp70%2C+and+Hsp40%3A+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li>
<li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li>
<li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li>
<li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li>
<li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+bioluminescence%3A+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li>
<li>Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorimoto%2C+RI+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22">Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol</a>. 76, 91-99 (2011).</li>
<li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li>
<li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li>
<li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li>
<li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+%28GFPuv%29+at+various+pH+values%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li>
<li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li>
<li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+disaggregase+machinery%3A+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319(2011).</li>
<li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li>
<li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hsp70+subfamily%2C+Ssa%2C+in+protein+folding+in+yeast+cells%2C+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li>
<li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones%3A+budding+yeast+%28Saccharomyces+cerevisiae%29+as+a+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W artykule wykorzystano modelowe białko FFL-GFP, aby wykazać, że drożdżowa disaggregazaza Hsp104 przyczynia się do re-solubilizacji i naprawy białek. Testy enzymatyczne i mikroskopia w różny sposób badały stan tego samego białka substratowego w celu określenia wydajności ponownego fałdowania i wydajności. Wyniki testów odzysku enzymatycznego sugerują, że nie tylko maksymalne odzysk w zmutowanym szczepie hsp104D jest nieefektywny, ale początkowa wielkość rozwijającego się stresu była większa w zmutowanym szczepie...

U ludzi choroby neurodegeneracyjne, w tym choroby Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona, zostały powiązane z nieprawidłowym fałdowaniem i agregacją białek 10. Komórki wykorzystują molekularne białka opiekuńcze, aby zapobiec kinetycznemu uwięzieniu białek komórkowych w nieprawidłowo sfałdowanych nieaktywnych strukturach 6. Białka opiekuńcze uczestniczą w skomplikowanych sieciach interakcji w komórce, ale nie jest do końca zrozumiałe, w jaki sposób suma tych interakcji przyczynia się do proteostazy organizmu. Jednym z głównych białek opiekuńczych odpowiedzialnych za większość fałdowania białek cytozolowych jest rodzina białek szoku cieplnego o sile 70 kD (Hsp70) 19. Wykazano, że u drożdży utrata Hsp70 zmniejsza zdolność do fałdowania powstającego heterologicznie wyrażonego FFL i ponownego składania endogennego białka, transkarbamoylazy ornityny, in vivo 18, 7. Możliwość analizy fałdowania z rozdzielczością zbliżoną do rzeczywistej ułatwi zrozumienie, w jaki sposób dodatkowe czynniki komórkowe przyczyniają się do tego procesu zależnego od Hsp70. Ponadto reakcje fałdowania/ponownego fałdowania mogą nie być całkowicie zależne od tych białek przyczyniających się do jego składowania, dlatego testy muszą być wystarczająco czułe, aby wykryć zarówno duże, jak i małe zmiany w kinetyce i wydajności.
Dezagregagaza komórek drożdży, Hsp104, odgrywa istotną rolę w naprawie zagregowanych, nieprawidłowo sfałdowanych białek. Chociaż homologi Hsp104 zostały zidentyfikowane u grzybów i roślin, rodzina ta wydaje się być nieobecna u metazoanów. Zaproponowano, aby inne białka opiekuńcze, takie jak te z rodziny Hsp110, wykonywały niektóre ze znanych czynności Hsp104 u ssaków16. Hsp104 to AAA+, heksameryczny kompleks białkowy, który działa w drożdżach w celu przebudowy agregatów białkowych, przyczyniając się do ponownego fałdowania i naprawy 13. Hsp104, wraz z drożdżami Hsp70, Ssa1 i drożdżami Hsp40, Ydj1, jest wymagany do odzysku zdenaturowanego FFL w komórkach drożdży 5, 8. Wykazano również, że małe białko szoku cieplnego, Hsp26, jest wymagane do dezagregacji FFL 2 za pośrednictwem Hsp104.
FFL to dwudomenowe białko, które wiąże substrat lucyferynę w miejscu aktywnym i po zmianie konformacyjnej, która wymaga ATP i tlenu, dekarboksyluje substrat uwalniając oksylucyferynę, dwutlenek węgla (CO2), monofosforan adenozyny (AMP) i światło 11, 9, 3. Dostępny na rynku substrat FFL, D-lucyferyna, powoduje emisję światła w zakresie 550-570 nm, którą można wykryć za pomocą luminometru 15. FFL jest wyjątkowo wrażliwy na denaturację w wyniku obróbki chemicznej lub cieplnej i kruszywa szybko po rozłożeniu. Pod wpływem temperatur w zakresie 39-45 °C FFL jest odwracalnie rozkładany i inaktywowany 12. W przeciwieństwie do tego, GFP i jego pochodne są wysoce odporne na naprężenia związane z rozwijaniem białek 14. Dlatego fuzja tych dwóch białek pozwala FFL funkcjonować jako eksperymentalnie labilne ugrupowanie zdolne do kierowania funkcjonalnego GFP do złogów wewnątrzkomórkowych, które można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zarówno na poziomie populacji, jak i pojedynczej komórki. Zastosowanie testu enzymatycznego w półautomatycznym czytniku płytek wielomodowych w połączeniu z mikroskopią automatyczną pozwala na bezprecedensową jednoczesną ocenę kinetyki i wydajności reakcji ponownego fałdowania. Ponadto łatwa genetyka molekularna modelowego eukarionta Saccharomyces cerevisiae umożliwia zarówno precyzyjną manipulację siecią kontroli jakości białek, jak i możliwość opracowania opartych na odkryciach podejść w celu identyfikacji nowych czynników przyczyniających się do odpowiedzi komórkowej na stres i proteostazy.
W tym badaniu, szczepy delecyjne typu dzikiego (WT) i HSP104 wyrażające FFL-GFP są poddawane szokowi cieplnemu denaturacji białek. Ponowne fałdowanie FFL-GFP jest monitorowane zarówno za pomocą testu enzymatycznego, jak i mikroskopii jako odczyt zastępczy dla naprawy wyrażonego proteomu w czasie rekonwalescencji. W porównaniu z komórkami WT pokazujemy, że szczep delecji Hsp104 jest ~ 60% mniej wydajny w ponownym fałdowaniu FFL-GFP, co potwierdza wcześniejsze odkrycia ustalające rolę Hsp104 w reaktywacji zdenaturowanego FFL 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>Synergy MX Czytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC Konfokalny mikroskop odwrócony</td><td>Olympus, Tokio Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumitrac 200 białe płytki 96-dołkowe</td><td>USA Oprogramowanie</td> do mikroskopii cyfrowej Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>(LiAc) Octan litu</td><td>Sigma</td><td>L6883</td><td></td></tr><tr><td>PEG (glikol polietylenowy)</td><td>Fisher</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Malinckrodt</td><td>4948</td><td></td></tr><tr><td>SC</td><td>Sunrise</td><td>1300-030</td><td></td></tr><tr><td>SC-URA</td><td>Sunrise</td><td>1306-030</td><td></td></tr><tr><td>cykloheksymid</td><td>Acros Organics</td><td>357420050</td><td></td></tr><tr><td>D-lucyferyna</td><td>Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>niskotopliwa agaroza</td><td>NuSieve</td><td>50082</td><td></td></tr><tr><td>olejek immersyjny</td><td>Cargille</td><td>16484</td><td></td></tr></tbody></table>

sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostaza, zdefiniowana jako połączone procesy fałdowania/biogenezy białek, ponownego fałdowania/naprawy i degradacji, jest delikatną równowagą komórkową, która musi być utrzymana, aby uniknąć szkodliwych konsekwencji 1. Czynniki zewnętrzne lub wewnętrzne, które zaburzają tę równowagę, mogą prowadzić do agregacji białek, toksyczności i śmierci komórki. U ludzi jest to główny czynnik przyczyniający się do objawów związanych z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroby Huntingtona, Parkinsona i Alzheimera 10. Dlatego tak ważne jest, aby zidentyfikować białka zaangażowane w utrzymanie proteostazy w celu opracowania metod leczenia tych wyniszczających chorób. W artykule opisano techniki monitorowania fałdowania białek in vivo w rozdzielczości zbliżonej do rzeczywistej przy użyciu modelowego białka lucyferazy świetlika połączonego z białkiem zielonej fluorescencji (FFL-GFP). FFL-GFP jest unikalnym modelowym białkiem chimerycznym, ponieważ ugrupowanie FFL jest niezwykle wrażliwe na nieprawidłowe fałdowanie i agregację wywołane stresem, co dezaktywuje enzym 12. Aktywność lucyferazy jest monitorowana za pomocą testu enzymatycznego, a ugrupowanie GFP zapewnia metodę wizualizacji rozpuszczalnego lub zagregowanego FFL za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii. Te sprzężone metody obejmują dwa równoległe i technicznie niezależne podejścia do analizy zarówno ponownego fałdowania, jak i funkcjonalnej reaktywacji enzymu po stresie. Odzyskiwanie aktywności może być bezpośrednio skorelowane z kinetyką dezagregacji i ponownego rozpuszczania, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób czynniki kontroli jakości białek, takie jak białka opiekuńcze, współpracują ze sobą, aby pełnić te funkcje. Ponadto delecje lub mutacje genów można wykorzystać do zbadania udziału określonych białek lub podjednostek białkowych w tym procesie. W tym artykule badamy wkład disaggregazy białkowej Hsp104 13, o której wiadomo, że współpracuje z systemem ponownego fałdowania Hsp40/70 / czynnika wymiany nukleotydów (NEF) 5, w ponownym fałdowaniu białek, aby potwierdzić to podejście.

Drożdże są zależne od dysagregazy Hsp104 w celu efektywnego ponownego zwijania białek zdenaturowanych termicznie. Aktywność FFL-GFP monitorowano po 25 min szoku termicznego, wykorzystując szybki test luminescencyjny (luminescence flash assay) Rysunek 1. Wyniki tego zautomatyzowanego testu przedstawione na Rysunku 2 wykazały stopniowy wzrost aktywności w ciągu 90 min, co ostatecznie doprowadziło do odzyskania &gt;80% aktywności w komórkach WT. Szczep hsp104Δ odzyskał 19% pierwotn...

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae. Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie resolubilizacji i refoldingu białka in vivo w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz testów enzymatycznych. Osiąga się to poprzez wstępną transformację komórek plazmidem zawierającym lucyferazę świetlikową połączoną z zielonym białkiem fluorescencyjnym (F-F-L-G-F-P). Drugim krokiem jest indukcja ekspresji białka F-F-L-G-F-P, a następnie zastosowanie cykloheksymidu w celu zatrzymania produkcji białka.Następnie należy zmierzyć aktywność lucyferazy przed denaturacją termiczną oraz w określonym czasie po jej wystąpieniu. Ostatnim krokiem jest wizualizacja komórek w celu określenia rozpuszczalności białka F-F-L-G-F-P. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną oraz testy enzymatyczne do ilościowego określenia wydajności reaktywacji modelowego rozfałdowanego enzymu w wielu szczepach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak analiza punktu końcowego, jest możliwość skorelowania aktywności białka ze stanem agregacji w czasie. Aby określić związek między tymi dwoma zjawiskami, metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu hom

coupled-assays-for-monitoring-protein-refolding-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Połączone testy do monitorowania odskładania białek w Saccharomyces cerevisiae

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

W tym protokole opisana jest metoda pomiaru ponownego fałdowania białek wewnątrzkomórkowych po szoku cieplnym. Metoda ta może być stosowana do badania fałd, takich jak molekularne białka opiekuńcze i ich kofaktory lub związki, które mogą wpływać na ich aktywność. Aktywność lucyferazy świetlika jest używana jako reporter do pomiaru aktywności ponownego fałdowania białka opiekuńczego.

Test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego

Ten film opisuje test degradacji dla nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą leczenia cykloheksymidem wraz z frakcjonowaniem detergentem. Metoda ta pomaga w badaniu dynamiki nieprawidłowo sfałdowanych białek i odkrywaniu dogłębnych mechanizmów obrotu białkami.

Test degradacji białek podatnych na nieprawidłowe fałdowanie: technika monitorowania nieprawidłowo sfałdowanej degradacji białek przy użyciu obróbki cykloheksymidem i frakcjonowania detergentem

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół in vitro reasocijacji oczyszczonych, solo wymytych podjednostek rybosomalnych eukariotycznych do analizy powstawania cząstek 80S. Metoda ta została zilustrowana analizą podjednostek rybosomalnych wyizolowanych z dzikiego szczepu Saccharomyces cerevisiae oraz zmutowanego szczepu niedoborowego białka rybosomalnego eL24.

In vitro Test reasocjacyjny do pomiaru powstawania cząstek rybosomalnych z lat 80. z wykorzystaniem podjednostek rybosomalnych wymytych solą

Poznaj metodę monitorowania ponownego fałdowania białek w komórkach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu sprzężonego białka lucyferazy z GFP. Technika łączy mikroskopię fluorescencyjną z testami enzymatycznymi.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów