Name: FlyBar: podawanie muchom alkoholu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj metodę FlyBar do pomiaru zachowań indukowanych alkoholem u Drosophila melanogaster. Protokół pozwala badać wpływ rytmów okołodobowych na wrażliwość na alkohol w warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tych badań zostało zapewnione przez Program in Neuroscience Award od Florida State University College of Medicine oraz wsparcie ze strony Wydziału Nauk Biologicznych FSU. Dodatkowe fundusze zostały zapewnione przez Grant-in-Aid z Funduszu Badawczego Producentów Napojów Alkoholowych.

1. Montaż FlyBara
Uzasadnienie i opis: System jest przeznaczony do podawania muchom kontrolowanego procentu oparów alkoholu. Uwaga: Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd konfiguracji FlyBar, jak opisano poniżej, w trzech etapach (montaż przepływu powietrza, ustawienie butelek z alkoholem i wodą oraz montaż fiolek obserwacyjnych). Krótko mówiąc, stały przepływ powietrza jest dzielony na dwie frakcje, które są bąbelkowane odpowiednio przez alkohol i wodę, mieszane i podawane do 4 fiolek obserwacyjnych.
<ol>
	<li>Montaż nawiewu
		<ol>
			<li>Podłącz krótki kawałek elastycznej silikonowej rurki do powietrza budowlanego lub aeratora akwariowego, aby wygenerować stały przepływ powietrza i podziel za pomocą łącznika Y. Podłącz pierwszą gałąź do regulatora przepływu powietrza, który kontroluje całkowitą ilość powietrza przepływającego przez system (zwykle 1,000 ml/min dla 4 fiolek obserwacyjnych).</li>
			<li>Włóż szybkozłączkę do drugiej rurki, aby strumień powietrza mógł zostać przerwany na początku eksperymentu bez wpływu na skalibrowany przepływ powietrza. Dodaj łącznik Y i podłącz każdą rurkę rozgałęziającą do regulatora przepływu powietrza.</li>
			<li>Podłącz rurkę do regulatorów przepływu powietrza, a następnie podłącz dwa mierniki przepływu powietrza.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Ustawienie butelek z alkoholem i wodą
		<ol>
			<li>Dodaj elastyczną rurkę do wyjścia przepływomierzy przepływu powietrza i włóż cienką szklaną rurkę (odcinki szklanych pipet o pojemności 1 ml) z zagięciem pod kątem 90° na końcu każdej długości rurki. Będzie to służyć jako przepływ powietrza wlotowego do butelek z wodą i alkoholem.</li>
			<li>Umieść gumowe korki z 2 otworami w butelkach wypełnionych alkoholem i wodą. Utrzymuj obie butelki w stałej temperaturze o 2° C wyższej niż temperatura otoczenia w łaźni wodnej. W naszych eksperymentach pomieszczenie środowiskowe jest utrzymywane w temperaturze 25 °C, podczas gdy łaźnia wodna ma temperaturę 27 °C.</li>
			<li>Włóż prostą szklaną pipetę do wlotu powietrza przez gumowy korek i wsuń płyn do około 1 cm od dna butelki.</li>
			<li>Włóż kolankową część szklanej pipety do pozostałego otworu w gumowym korku, aż koniec szklanki zrówna się z dnem korka wewnątrz butelki. Włóż ten wylot powietrza do innej długości rurki.</li>
			<li>Ponownie połącz strumienie powietrza za pomocą łącznika Y i użyj innej długości silikonowej rurki, aby skierować przepływ powietrza przez pustą kolbę do mieszania lub butelkę z wygiętymi szklanymi sekcjami pipet włożonymi przez gumowy korek z dwoma otworami. Użyj innej długości rurki silikonowej do wylotu zmieszanego strumienia powietrza.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Montaż fiolki obserwacyjnej
		<ol>
			<li>Podziel strumień powietrza wylotowego wychodzący z kolby mieszającej 2-3 razy, aby uzyskać 4 lub 8 mniejszych strumieni powietrza, tak aby w każdym eksperymencie można było użyć wielu fiolek obserwacyjnych. Podłącz elastyczną silikonową rurkę do fiolek obserwacyjnych.</li>
			<li>Ustawić fiolki obserwacyjne przy użyciu pustych fiolek zamkniętych gumowym korkiem zawierającym dwa otwory, przez które szklane rurki zapewniają wlot i wylot oparów alkoholu.</li>
			<li>Przykryj koniec pierwszej szklanej rurki siatką i przytrzymaj siatkę na miejscu za pomocą małego kawałka elastycznej plastikowej rurki. Włożyć tę probówkę przez pierwszy otwór, aż wysunie się do około połowy długości fiolki. W razie potrzeby użyj taśmy teflonowej, aby uzyskać dokładne dopasowanie.</li>
			<li>Włóż drugą szklaną rurkę również z końcem przykrytym siatką, aż zrówna się z wewnętrzną krawędzią gumowego korka.</li>
			<li>Umieść fiolki poziomo na białym kawałku papieru, aby zmaksymalizować kontrast z muchami w przyćmionych czerwonych światłach.</li>
			<li>Wymieszaj odpowiednie frakcje strumienia powietrza przepuszczonego przez alkohol i strumienia powietrza przepuszczonego przez wodę. Stale monitoruj ciśnienie powietrza i w razie potrzeby dokonuj regulacji, aby utrzymać pożądane mieszanie strumieni powietrza. 
				Uwaga: Ciągłe przeprowadzanie kilku testów Fly Bar równolegle lub nawet jednego testu w małym pomieszczeniu może prowadzić do zauważalnego gromadzenia się oparów alkoholu. Aby uniknąć ciągłego wydzielania się oparów alkoholu, które potencjalnie mogą wpływać na badacza w zamkniętym pomieszczeniu, należy wprowadzić odpowiedni system, który odpowiednio usunie opary alkoholu powstające podczas eksperymentu. Aby usunąć opary alkoholu, podłącz 6-12-calowy kawałek rurki do drugiej szklanej rurki wystającej z każdej fiolki, zwiąż je i skieruj do systemu lejkowo-próżniowego. Badacze powinni również zadbać o to, aby pomieszczenie do badań eksperymentalnych było odpowiednio wentylowane.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt doświadczalnych
Uzasadnienie i opis: Właściwa hodowla i hodowla much zmniejszy zmienność danych. Osiąga się to poprzez standaryzację i minimalizację stresu doświadczanego przez muchy. Z tego powodu nie stosuje się znieczulenia (CO2 lub alternatywne) podczas żadnego z poniższych etapów protokołu. Co więcej, muchy powinny być dopasowane pod względem wieku w eksperymentach i punktach czasowych, aby zminimalizować zmienność, co jest standardem w przypadku innych analiz behawioralnych, w tym eksperymentów dotyczących uczenia się i pamięci.
Różne warunki jasne:ciemne mogą być wykorzystane do zbadania funkcji zegara okołodobowego w behawioralnej reakcji na etanol. Aby określić, czy istnieje rytm dobowy, można przeprowadzić eksperymenty w zdefiniowanym cyklu LD w celu zmierzenia wydajności w określonych czasach Zeitgebera (ZT). ZT 0 reprezentuje świt i jest zdefiniowany jako czas świecenia świateł w cyklach LD, podczas gdy ZT 12 to czas wyłączania świateł w cyklu LD o godzinie 12:12. W stałych warunkach czas okołodobowy (CT) mierzy czas zwierzęcia przy braku sygnałów środowiskowych, tj. czas swobodnego biegu, i jest związany z poprzednim cyklem porywania LD. U dzikich Drosophila CT odzwierciedla poprzednie ZT przez pierwsze kilka dni w stałych warunkach, ponieważ swobodnie biegnący okres okołodobowy i rytmy wynoszą ~ 24 godziny. Aby zmierzyć modulację okołodobową i wyeliminować ostry wpływ światła na zachowanie, muchy są przyzwyczajane do cykli światło: ciemność, a następnie przenoszone do stałych ciemnych warunków (DD) przed eksperymentami. Eksperymenty okołodobowe są przeprowadzane drugiego dnia DD w celu zmierzenia wydajności w określonych czasach okołodobowych (CT).
U Drosophila, warunki ciągłego światła (LL) skutkują dysfunkcją okołodobową z tłumionymi lub zniesionymi oscylacjami molekularnymi podstawowych genów okołodobowych i zakłóceniem behawioralnych rytmów okołodobowych, czego dowodem jest arytmiczna aktywność lokomotoryczna18-21 i arytmiczna pamięć krótkotrwała17. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem badań okołodobowych i można go uprościć w przypadku innych eksperymentów. Wszystkie eksperymenty okołodobowe są przeprowadzane przy użyciu przyćmionego światła czerwonego (czerwone światło otoczenia nad głową < 1 luks na blacie stołu; małe czerwone światła używane w odległości 12 cali od rur ~ 1 luks światła).
<ol>
	<li>Hodować muchy w temperaturze 25 °C w godzinach 12:12 w warunkach porywania światła i ciemności (LD).</li>
	<li>Zebrać świeżo zamknięte muchy pod koniec okresu dziennego w dniu 1 i przechowywać je przez 24 godziny w warunkach LD w fiolkach zawierających niewielką ilość pokarmu o wysokim stężeniu agaru, aby zminimalizować lepkość pokarmu. Uwaga: Aby zapewnić zbieranie zdrowych, normalnie rozwiniętych much, należy używać wyłącznie much zebranych w ciągu pierwszych dni po rozpoczęciu eklozji w butelce hodowlanej.</li>
	<li>Zebrać partie około 30 (25-35) much za pomocą aspiratora w dniu 2 pod koniec okresu świetlnego i przenieść do świeżych fiolek do przechowywania.</li>
	<li>Użyj silnego źródła światła, aby skierować muchy na drugi koniec fiolki. W tym zakresie dokładna liczba much w każdej fiolce nie jest krytyczna, ponieważ obserwacje behawioralne są zgłaszane w procentach, a całkowita liczba much jest liczona na końcu każdego eksperymentu.</li>
	<li>Utrzymywać muchy w warunkach DD w temperaturze 25 °C przez dwa dni.</li>
	<li>W dniu eksperymentu należy umieścić wszystkie muchy trzymane w innych warunkach lub inkubatorach innych niż pomieszczenie do zachowania eksperymentalnego w pomieszczeniu na co najmniej 1 godzinę przed eksperymentem. Aklimatyzacja zmniejsza zmienność spowodowaną zmianami temperatury lub wilgotności.</li>
	<li>Wykonuj obserwacje w sześciu punktach czasowych dziennie (CT 1, 5, 9, 13, 17 i 21) w celu zbadania okołodobowej modulacji zachowania.</li>
	<li>Porównuj wiele punktów czasowych w ramach jednego zestawu eksperymentów behawioralnych, aby zwiększyć solidność projektu eksperymentu i zminimalizować zmienność specyficzną dla pojedynczego eksperymentu. Na przykład obserwacje CT 1 i CT 13 można uzyskać jednocześnie, jeśli do porywania używane są dwa inkubatory o przeciwnych harmonogramach światła i ciemności. 
		Uwaga: Powyższa procedura opisuje przygotowanie zwierząt doświadczalnych do testów przeprowadzanych w warunkach okołodobowych i stałej ciemności. Różne warunki światła i ciemności można wykorzystać do zbadania funkcji zegara w behawioralnych reakcjach na alkohol. Aby określić, czy istnieje rytm dobowy, eksperymenty można przeprowadzić w cyklu LD w celu zmierzenia wydajności w określonych czasach Zeitgeber (ZT). Dodatkowo, protokół może być stosowany w przypadku much hodowanych w stałych warunkach oświetleniowych do eksperymentów testujących dysfunkcję okołodobową. W przypadku alternatywnych protokołów, które testują muchy trzymane w warunkach oświetleniowych, testy behawioralne powinny być nadal wykonywane w ciemnych warunkach. Muchy należy przenieść w ciemność na 1 godzinę przed eksperymentem, aby zminimalizować zmienność behawioralną spowodowaną ostrym wpływem światła na zachowanie.</li>
</ol>
3. Obserwacje behawioralne
Uzasadnienie i opis: Poniższy protokół podawania alkoholu jest zoptymalizowany pod kątem obserwacji w warunkach słabego czerwonego światła. Dwa miary behawioralne LoRR i sedacja reprezentują dwa odrębne punkty upojenia muchowego. LoRR reprezentuje późny punkt upojenia alkoholowego obejmujący utratę kontroli motorycznej i posturalnej, podczas gdy sedacja mierzy bardzo późny punkt końcowy zatrucia. Genotyp lub modulacja okołodobowa mogą wpływać na te dwa wskaźniki w różny sposób; W związku z tym można chcieć zbadać jedno i drugie. Krótko mówiąc, muchy są ładowane do fiolek, liczba much wykazujących LoRR lub sedację jest oceniana co 5 minut podczas ekspozycji na opary alkoholu, a całkowita liczba much jest liczona na koniec eksperymentu.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu przepuść powietrze przez system (powietrze przepuszczane przez butelki z wodą i alkoholem) przez co najmniej 10 minut i wykorzystaj ten czas na kalibrację przepływów powietrza.</li>
	<li>Odłącz szybkozłączkę, aby zatrzymać przepływ powietrza. Załaduj muchy do fiolek, ponownie podłącz przepływ powietrza i uruchom timery. Uwaga: Jeśli w fiolkach do trzymania pozostaną niereagujące muchy lub martwe muchy, może to wskazywać na warunki stresowe. Ogólnie rzecz biorąc, warunki te można złagodzić poprzez umieszczenie mniejszej liczby much w fiolkach lub zmniejszenie lepkości pokarmu przy użyciu nieco wyższego stężenia agaru podczas przygotowywania posiłków. Aby uzyskać optymalne analizy behawioralne i minimalną zmienność między eksperymentami, muchy powinny być zdrowe przed eksperymentami.</li>
	<li>Aby uzyskać dokładne odmierzanie czasu, użyj jednego timera, aby śledzić całkowity czas ekspozycji na alkohol i użyj drugiego timera odliczającego, aby oznaczyć 5-minutowe interwały.</li>
	<li>Umieść kawałek białego papieru pod fiolkami, aby zwiększyć kontrast i widoczność lotu, szczególnie w warunkach słabego czerwonego światła.</li>
	Podczas <li>eksperymentu regularnie sprawdzaj przepływ powietrza, aby utrzymać stały poziom. Ogólnie rzecz biorąc, gdy przepływy powietrza się ustabilizują, pozostają stabilne przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Policz liczbę much, które utraciły odruch prostowania raz na 5 minut przez okres 1 godziny. Ponieważ wrażliwość na alkohol różni się w zależności od genotypu i tła genetycznego, pożądane może być przeprowadzanie częstszych ocen lub prowadzenie eksperymentu przez dłuższy okres czasu.</li>
	<li>Lekko podnieść fiolkę z powierzchni i skierować światło latarki z czerwonym światłem w stronę papieru znajdującego się za fiolką. Trzymaj ręczne czerwone latarki w odległości co najmniej 12 cali od eksperymentalnej fiolki, aby utrzymać poziom światła nie większy niż 1 luks dla wszystkich eksperymentów w warunkach słabego czerwonego światła.</li>
	<li>Zmierz poziom światła za pomocą światłomierza, aby ustalić standardy dla wszystkich eksperymentów.</li>
	<li>Określ liczbę much, które utraciły odruch prostowania, mocno stukając w fiolkę i policz, ile much nie jest w stanie wyprostować się w ciągu około 4 sekund. Muchy, które wykazują LoRR, mogą nadal poruszać nogami i skrzydłami, ale nie mogą się obrócić w pozycji pionowej.</li>
	<li>Na koniec sesji policz całkowitą liczbę much w każdej fiolce. 
		Uwaga: Czasami pojedyncza mucha może zostać złapana między korkiem a bokiem podczas ładowania much do fiolek doświadczalnych. Ponieważ odbywa się to w ciemności, może nie być łatwo zauważone, dlatego konieczne jest policzenie całkowitej liczby much na końcu eksperymentu, aby poprawnie obliczyć procenty.</li>
</ol>
Dodatkowo, ta procedura może być również używana do pomiaru sedacji much, co reprezentuje inny behawioralny punkt końcowy. Podczas gdy muchy w sedacji straciły prawy odruch, sedacja wymaga większej ekspozycji na alkohol. Behawioralnie uspokojenie może charakteryzować się całkowitym brakiem widocznej aktywności motorycznej, a muchy pozostają nieruchome w fiolce po mocnym stuknięciu w fiolkę. W celu uspokojenia należy policzyć liczbę much, które pozostają w bezruchu bez machania nogami po mocnym stuknięciu w fiolkę. Dodatkowo fiolkę można obracać na boki, aby określić, czy poszczególne muchy nadal zachowują odruch chwytania.
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Określić procentową zawartość LoRR za każdym razem, gdy jest ona oceniana na podstawie całkowitej liczby much w każdej fiolce.</li>
	<li>Oszacuj różnice między okołodobowymi punktami czasowymi lub szczepami, obliczając 50% LoRR dla każdej próbki, która mieści się w liniowej części krzywej esicy (patrz rysunek 2 poniżej).</li>
	<li>Alternatywne statystyki:
		<ol>
			<li>Jeśli planowane są porównania między genotypami, pożądane jest przeanalizowanie całego przebiegu czasowego za pomocą powtarzanych pomiarów ANOVA i określenie zakresu punktów czasowych, w których różnice są znaczące, za pomocą testów post-hoc (Rysunek 3). W przypadku tych testów preferujemy użycie wartości a równej 0,001. Pozwala to na ocenę różnic w poszczególnych czasach ekspozycji, a także różnic między genotypami w nachyleniu krzywej.</li>
			<li>Różnice w czułości dla można określić dla określonych czasów ekspozycji na alkohol dla określonej reakcji, takiej jak sedacja, na podstawie liniowej części wykresu (ryc. 4).</li>
			<li>Różnice między szczepami lub okołodobowymi punktami czasowymi można oszacować za pomocą standardowych statystyk F i testów post-hoc.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Linde, K., Lyons, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+acute+alcohol+sensitivity+but+not+acute+tolerance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiol.+Int%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila.</a> Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).</li>
<li>Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+alcohol+reward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for alcohol reward.</a> Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).</li>
<li>Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+deprivation+increases+ethanol+intake+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila.</a> Science. 335, 1351-1355 (2012).</li>
<li>Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fruit+fly%3A+A+model+organism+to+study+the+genetics+of+alcohol+abuse+and+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction.</a> Cell. 93, 909-912 (1998).</li>
<li>Guarnieri, D. J., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%2C+a+genetic+model+system+for+alcohol+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research.</a> International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).</li>
<li>Scholz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intoxicated+fly+brains%3A+Neurons+mediating+ethanol-induced+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors.</a> J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).</li>
<li>Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+ethanol-induced+locomotor+stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila.</a> J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).</li>
<li>Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+genes+for+alcohol+dependence%3A+Animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).</li>
<li>Singh, C. M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+acute+ethanol-induced+behaviors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila.</a> Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).</li>
<li>Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+central+ethanol+sensitivity+by+the+mPer2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene.</a> Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).</li>
<li>Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+acamprosate+modulation+of+elevated+ethanol+drinking+in+mPer2+clock+gene+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiol.+Int%22%5BJournal%5D)">Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice.</a> Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).</li>
<li>Sinclair, J. D., Geller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+consumption+by+rats+under+different+lighting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ethanol consumption by rats under different lighting conditions.</a> Science. 175, 1143-1144 (1972).</li>
<li>Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+in+consumption+of+the+first+drink+of+the+day+in+alcohol-dependent+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiol.+Int%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons.</a> Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).</li>
<li>Kapfhamer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taok2+controls+behavioral+response+to+ethanol+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+brain%2C+and+behavior%22%5BJournal%5D)">Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice.</a> Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).</li>
<li>Lasek, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+conserved+role+for+anaplastic+lymphoma+kinase+in+behavioral+responses+to+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol.</a> PLoS One. 6, 226-236 (2011).</li>
<li>Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmo+genes+regulate+behavioral+responses+to+ethanol+in+Drosophila+melanogaster+and+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).</li>
<li>Lyons, L. C., Roman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+short-term+memory+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of short-term memory in Drosophila.</a> Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).</li>
<li>Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+period-altered+circadian-rhythm+mutants+of+Drosophila+in+ligh-dark+cycles+%28Diptera+Drosophilidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Behav%22%5BJournal%5D)">Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae).</a> J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).</li>
<li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+behavior+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li>
<li>Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+period+mutations+and+light+on+the+activity+rhythms+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).</li>
<li>Yoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+cycles+drive+Drosophila+circadian+oscillation+in+constant+light+that+otherwise+induces+behavioural+arrhythmicity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).</li>
<li>Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+chronic%3A+two+distinct+forms+of+ethanol+tolerance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila.</a> Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).</li>
<li>Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ethanol+tolerance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional ethanol tolerance in Drosophila.</a> Neuron. 28, 261-271 (2000).</li>
<li>Kong, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-regulated+genes+that+contribute+to+ethanol+sensitivity+and+rapid+tolerance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.</a> Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).</li>
<li>Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ABC+transporter+mutants+white%2C+brown+and+scarlet+have+altered+contents+and+distribution+of+biogenic+amines+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain.</a> J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).</li>
<li>Sitaraman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+is+necessary+for+place+memory+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Serotonin is necessary for place memory in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).</li>
<li>Bainton, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+modulates+acute+responses+to+cocaine%2C+nicotine+and+ethanol+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila.</a> Current Biology. 10, 187-194 (2000).</li>
<li>Kong, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+dopamine+neurons+target+the+D1-like+dopamine+receptor+DopR+in+the+central+complex+to+promote+ethanol-stimulated+locomotion+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. Deaths: Final data for 2007. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention: National Center for Health Statistics. (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Center+on+Addiction+and+Substance+Abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Shoveling+up+II%3A+The+impact+of+substance+abuse+on+federal%2C+state+and+local+budgets%22%5BJournal%5D)">The National Center on Addiction and Substance Abuse.</a> Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , Columbia University. (2009).</li>
<li>NIAAA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimated+economic+costs+of+alcohol+abuse+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States.</a> , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="www.medtext.com/hdcn.htm">www.medtext.com/hdcn.htm</a> (1992).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+ethanol+consumption+in+Drosophila+models+features+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction.</a> Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addiction-like+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Communicative+%26+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Addiction-like behavior in Drosophila.</a> Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).</li>
<li>Rodan, A. R., Rothenfluh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+behavioral+alcohol+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila.</a> International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Young, M. W. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoothroyd%2C+CE+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22">Annals of the New York Academy of Sciences</a>. Pfaff, D. W., Kieffer, B. 1129, Blackwell Publishing. 350-357 (2008).</li>
<li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Current Biology. 18, 84-93 (2008).</li>
<li>Sheeba, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+circadian+pacemaker+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit.</a> J. Genet. 87, 485-493 (2008).</li>
<li>Cohan, F. M., Graf, J. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latitudinal+cline+in+Drosophila+melanogaster+for+knockdown+resistance+to+ethanol+fumes+and+for+rates+of+response+to+selection+for+further+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance.</a> Evolution. , 278-293 (1985).</li>
<li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+intoxication+in+Drosophila%3A+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93, 997-1007 (1998).</li>
<li>Berger, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+sensitivity+and+tolerance+in+long-term+memory+mutants+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster.</a> Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).</li>
<li>Pohl, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Genes+Differentially+Affect+Tolerance+to+Ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22in+Drosophila.+Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol.</a> in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).</li>
<li>Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+for+evoked+locomotor+behavior+in+Drosophila+reveals+a+role+for+integrins+in+ethanol+sensitivity+and+rapid+ethanol+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).</li>
<li>Rothenfluh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+behavioral+responses+to+ethanol+are+regulated+by+alternate+RhoGAP18B+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms.</a> Cell. 127, (1016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Koszty nadużywania alkoholu i alkoholizmu dla społeczeństwa są ogromne, zarówno pod względem kosztów ludzkich29 , jak i ekonomicznych30,31. Drosophila jako model oferuje szybki i wszechstronny system do szybkiego badania reakcji behawioralnych dużej liczby osób i jako taki jest szeroko stosowany zarówno w badaniach nad alkoholem5,7,32-34 , jak i okołodobowym35-37.
Tutaj opisaliśmy prosty protokół kontrolowanego podawania oparów alkoholu doro...

Drosophila melanogaster wykazuje dwufazowe reakcje behawioralne na alkohol1, które są analogiczne do ludzkich reakcji na ten narkotyk2,3. Po początkowej ekspozycji na niskie stężenia alkoholu, muchy wykazują zwiększoną aktywność lokomotoryczną, zastąpioną brakiem koordynacji ruchowej, utratą kontroli postawy i odruchów prostowania (utrata odruchu prostowania: LoRR) i sedacją (całkowity brak aktywności motorycznej w odpowiedzi na stymulację mechaniczną) w miarę postępu ekspozycji na alkohol4-9. Endogenny zegar okołodobowy jest silnym modulatorem wrażliwości i toksyczności na alkohol, co zaobserwowano u myszy10,11, szczurów12 i ludzi13. Ostatnie postępy w badaniach nad Drosophila wykazały, że zegar okołodobowy moduluje ostrą wrażliwość na alkohol, ale nie tolerancję na alkohol1. Potężne podejścia genetyczne dostępne u Drosophila dzięki badaniom mutantów i transgenicznym manipulacjom przestrzennej i czasowej ekspresji genów zapewniają system, który umożliwia szybki postęp w identyfikacji mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw złożonych zachowań. Wykorzystanie Drosophila jako narzędzia badawczego pozwoliło na znaczne postępy w zrozumieniu neurobiologii alkoholu, które można szybko przełożyć na ssaki14-16. Aby ułatwić zrozumienie mechanizmów molekularnych, za pomocą których zegar okołodobowy moduluje wrażliwość na alkohol i jednolicie mierzyć reakcje behawioralne w różnych punktach czasowych okołodobowych, wymagany jest protokół podawania alkoholu odpowiedni do stosowania w warunkach słabego czerwonego światła. W przypadku Drosophila alkohol może być podawany poprzez suplementację diety w przypadku przewlekłego narażenia lub niezawodnie poprzez podawanie alkoholu w postaci pary w przypadku ostrego narażenia. W tym miejscu opisujemy protokół podawania alkoholu odpowiedni do oceny okołodobowej modulacji odruchu utraty prawa (LoRR)1, a także sedacji.

Muchy są porywane w 12 godzinnych cyklach LD w stałej temperaturze, a następnie przenoszone do kontrolowanego reżimu świetlnego na 2-5 dni, w zależności od pytania eksperymentalnego. Muchy są wystawione na działanie oparów etanolu w urządzeniu znanym jako FlyBar. W tym urządzeniu kontrolowane ilości powietrza są przepuszczane przez wodę i alkohol; Opary są następnie mieszane i kierowane do fiolki zawierającej muchy. Co 5 minut muchy są oceniane za liczbę, która nie wykazuje odruchów prostowania lub uległa uspokojeniu. Wartości procentowe LoRR dla każdego punktu czasowego są obliczane i porównywane między punktami czasu okołodobowego lub między szczepami much. Prostota i niezawodność dostarczania alkoholu za pomocą FlyBar w połączeniu z opcjami analizy behawioralnej zapewnia znaczące korzyści w eksperymentach okołodobowych przeprowadzanych w ciemnych warunkach.

<table><tbody><tr><td>Alkohol 190 proof</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aeratory</td><td>Lokalny sklep</td><td></td> zoologiczny Używamy rurki <td>silikonowej Whisper 60</td></tr><tr><td>1/8 "</td><td>VWR</td><td>408060-0030</td><td></td></tr><tr><td>120&deg; Łącznik Y</td><td>VWR</td><td>82017-256</td><td></td></tr><tr><td>Szybkozłączki</td><td>VWR</td><td>46600-048</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski do rur z tworzywa sztucznego Produkty</td><td>Bell-art</td><td>132250000</td><td>Albo ten, albo następny</td></tr><tr><td>Miniaturowy regulator powietrza</td><td>McMaster-Carr</td><td>8727K11</td><td>Ten lub poprzedni</td></tr><tr><td>Wspornik montażowy miniaturowego regulatora powietrza</td><td>McMaster-Carr</td><td>9891K66</td><td></td></tr><tr><td>Przepływomierz Gilmont rozmiar 12</td><td>VWR</td><td>29895-242</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski narzędziowe</td><td>McMaster-Carr</td><td>1722A43</td><td>Do trzymania fiolki przepływomierzy</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89092-722</td><td></td></tr><tr><td>Gumowy korek z dwoma otworami</td><td>VWR</td><td>59585-186</td><td>Pasuje do fiolek</td></tr><tr><td>5 mm Rurki ze szkła pyrexowego</td><td>Trikinetics</td><td>PGT5x65</td><td>Najlepiej pasuje do poprzedniej zatyczki</td></tr><tr><td>Taśma teflonowa</td>Sklep <td></td><td>z narzędziami</td><td>Aby w razie potrzeby uzyskać dokładne dopasowanie korków</td></tr><tr><td>Gumowy korek z dwoma otworami</td><td>VWR</td><td>59582-122</td><td>Pasuje do naszych butelek</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety szklane</td><td>VWR</td><td>53283-768</td><td>Przytnij na długość i zginaj przez ogrzewanie</td></tr><tr><td>Bardzo cienka siatka nylonowa</td><td>VWR</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>żarówki 15 W</td> Sklep <td></td><td>z narzędziami</td><td>Czerwone światło</td></tr> <tr><td>nad głowąFotograficzne czerwone bezpieczne filtry</td><td></td><td></td> świetlne <td>Czerwone światło nad głową</td></tr><tr><td>Mini latarki z czerwonymi filtrami</td><td>Mag-light</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

flybar: podawanie muchom alkoholu

The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Muszki owocowe (Drosophila melanogaster) są sprawdzonym modelem zarówno dla badań nad alkoholem, jak i biologii okołodobowej. Ostatnio wykazaliśmy, że zegar okołodobowy moduluje wrażliwość na alkohol, ale nie kształtowanie tolerancji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nasz protokół. Alkohol podaje się muchom za pomocą FlyBar. W tej konfiguracji nasycona para alkoholu jest mieszana z nawilżonym powietrzem w ustalonych proporcjach i podawana muchom w czterech rurkach jednocześnie. Muchy są hodowane w znormalizowanych warunkach w celu zminimalizowania różnic między powtórzeniami. Do eksperymentów wykorzystuje się trzydniowe muszki o różnych genotypach lub zabiegach, najlepiej poprzez dopasowanie muszek o dwóch różnych punktach czasowych (np. CT 5 i CT 17), co umożliwia bezpośrednie porównania. Podczas eksperymentu muchy są wystawiane na działanie przez 1 godzinę określonego procentu par alkoholu, a liczba much, które wykazują odruch utraty prostowania (LoRR) lub sedacji, jest liczona co 5 minut. Dane mogą być analizowane przy użyciu trzech różnych podejść statystycznych. Pierwszym z nich jest określenie czasu, w którym 50% much straciło odruch prostowania i użycie analizy wariancji (ANOVA) w celu określenia, czy istnieją znaczące różnice między punktami czasowymi. Drugim jest określenie odsetka much, które wykazują LoRR po określonej liczbie minut, a następnie analiza ANOVA. Ostatnią metodą jest analiza całych szeregów czasowych przy użyciu statystyki wielowymiarowej. Protokół może być również stosowany do eksperymentów niezwiązanych z okołodobą lub porównań między genotypami.

Modulacja okołodobowa wrażliwości na alkohol z wykorzystaniem 50% LoRR jako markera.
Reprezentatywny przykład wykazujący dobową modulację wrażliwości na alkohol w ciągu dnia przedstawiono na Rysunku 2. LoRR mierzono w sześciu punktach czasowych podczas 2nd dnia DD u myszy Canton-S, a dla każdego punktu czasowego wyznaczono 50% LoRR. Analiza wykazała istotny wpływ pory dnia (ANOVA: F5,45=7.39, p&lt;0.001, N=6-10 na punkt czasowy). Test Fishera LSD...

Drosophila stała się znaczącym modelowym systemem do analizowania komórkowych i molekularnych podstaw behawioralnych reakcji na alkohol. W tym miejscu przedstawiamy protokół zbierania danych dotyczących wrażliwości na alkohol w kontekście okołodobowym, który można łatwo zastosować w innych eksperymentach i dobrze nadaje się do badań licencjackich.

FlyBar: podawanie muchom alkoholu

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar zachowań indukowanych alkoholem u Drosophila, z wykorzystaniem niedrogiego i łatwego w montażu zestawu, który dobrze nadaje się dla studentów prowadzących badania lub naukowców rozpoczynających pracę w dziedzinie badań nad rytmami okołodobowymi. Cel ten jest realizowany poprzez wstępny montaż poprzeczki dla much, co umożliwia jednoczesne porównywanie wielu grup much.Kolejnym krokiem procedury jest hodowla muszek drosophila w określonych cyklach światła i ciemności oraz zebranie much w tym samym wieku do eksperymentu. Następnie muchy są poddawane działaniu określonych stężeń par alkoholu, a zebrane zostają odpowiednie dane. Ostatecznie pomiar utraty odruchu pisania lub sedacji może wykazać różnice w wrażliwości na alkohol między grupami, wynikające z pory dnia lub uwarunkowań genetycznych.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy obserwacji są trudne do opanowania ze względu na wyzwania związane z monitorowaniem zachowania, słabe czerwone światło oraz konieczność ustalenia, które muchy utraciły odruch pisania, a które nie. W pierwszej kolejności należy zmontować drążek do much. Rozpocznij od montażu przepływu powietrza.Podłącz krótki odcinek elastycznego wężyka silikonowego do punktu poboru powietrza w budynku lub do napowietrzacza akwariowego, aby zapewnić przepływ powietrza. Rozdziel strumień powietrza za pomocą łącznika w kształcie litery Y. Pierwszą odnogę podłącz do regulatora.Będzie ono kontrolować całkowitą ilość powietrza przepływającego przez system. Drugi odgałęźnik należy podłączyć do szybkozłącza. Pozwoli to na przerywanie strumienia powietrza w razie potrzeby bez wpływu na skalibrowany przepływ.Dodaj złączyko Y i podłącz każdą z odgałęziających się rurek do regulatora przepływu powietrza. Następnie podłącz każdy regulator do miernika przepływu powietrza. Teraz potnij szklane pipety o pojemności jednego mililitra i wytop w każdej sekcji kąt prosty.Będą one pełnić funkcję sztywnych rurek kolankowych w układzie. Wprowadź prostą pipetę szklaną służącą jako wlot powietrza przez jeden otwór i wysuń ją w ciecz do poziomu 1 cm nad dno. Przez drugi otwór wprowadź szklany odcinek kolankowy, aż znajdzie się on tuż wewnątrz butelki.Użyj tych wylotów, aby połączyć przepływ powietrza z każdej butelki za pomocą łącznika w kształcie litery Y. Za pomocą elastycznych rurek podłącz przepływomierze do prostego odcinka pipety. Będą one pełnić funkcję wlotów powietrza do dwóch butelek z roztworami.Wodę lub alkohol, obie butelki z roztworem, należy umieścić w łaźni wodnej ustawionej na temperaturę o dwa stopnie wyższą od temperatury otoczenia. Butelki należy zamknąć gumowymi korkami z dwoma otworami z rurkami silikonowymi. Drugi koniec rozgałęzienia w kształcie Y należy podłączyć do butelki z gumowym korkiem z dwoma otworami.Strumień powietrza z tej kolby mieszającej będzie dostarczał odparowany alkohol i wodę do fiolek obserwacyjnych. Podziel strumień powietrza wylotowego z kolby mieszającej dwa lub trzy razy, aby uzyskać cztery lub osiem mniejszych strumieni powietrza. Po jednym dla każdej fiolki obserwacyjnej.Nadal należy używać rurek silikonowych. Fiolki obserwacyjne to puste fiolki do muszek, zamknięte gumowym korkiem z dwoma otworami – wlotem i wylotem dla par alkoholu. W otwory korka włożono rurki szklane.Końce szklanej rurki należy przykryć siatką. Siatkę należy przymocować za pomocą krótkiego odcinka elastycznej rurki plastikowej. Wsunąć tę rurkę przez pierwszy otwór, aż sięgnie do około połowy długości fiolki.W razie potrzeby należy użyć taśmy teflonowej, aby uzyskać szczelne dopasowanie. Wsunąć drugą szklaną rurkę z siatką, aż zrówna się ona z wewnętrzną krawędzią gumowego korka. Wymieszać odpowiednie frakcje dwóch strumieni powietrza przepuszczanych przez alkohol lub wodę.Należy stale monitorować ciśnienie powietrza i w razie potrzeby wprowadzać korekty, aby utrzymać pożądany skład mieszaniny alkoholu i pary wodnej w butelce mieszającej. W tego typu eksperymentach należy zawsze zapewnić odpowiednią wentylację pomieszczenia. Aby zminimalizować różnice między powtórzeniami, należy zwrócić szczególną uwagę na warunki hodowli much.Muchy muszą być hodowane w warunkach niskiego zagęszczenia z bardzo dokładną synchronizacją, aby osobniki w tym samym wieku i z tej samej kohorty mogły być testowane względem siebie. Pod koniec dnia zbierz świeżo wyklułe zwierzęta i przechowuj je przez 24 godziny w probówkach z niewielką ilością pożywki o wysokim stężeniu agaru w tym samym czasie.Następnego dnia podziel zebrane muchy na kohorty liczące około 30 osobników za pomocą aspiratora i przenieś je do świeżych fiolek, aby zbadać okołodobową modulację zachowania. Przygotuj wystarczającą liczbę kohort, aby przetestować każdy warunek w sześciu równomiernie rozłożonych punktach czasowych w dniu badania, w celu zweryfikowania okołodobowej modulacji zachowania. Przez dwa dni przed testami utrzymuj muchy w stałej ciemności w temperaturze 25 °C.Niezależnie od projektu eksperymentalnego, na co najmniej godzinę przed testem behawioralnym przenieść muchy do pomieszczenia eksperymentalnego oświetlonego wyłącznie słabym czerwonym światłem. Doświadczenia należy przeprowadzać przy słabym czerwonym świetle, aby stymulacja świetlna nie zaburzyła wyników. Przed rozpoczęciem eksperymentu przepuścić powietrze przez system przez co najmniej 10 minut i skalibrować przepływy powietrza.Pod probówkami obserwacyjnymi umieść arkusz białego papieru, aby zwiększyć widoczność much dzięki dodatkowemu kontrastowi. Po ustabilizowaniu się przepływu powietrza odłącz szybkozłączkę i wprowadź kohortę 30 much do każdej probówki obserwacyjnej.Podczas każdego uruchomienia listwy do muszek przetestuj każdy warunek eksperymentalny. Zwiększy to powtarzalność eksperymentu i zminimalizuje wpływ zmienności dobowej. Po załadowaniu wszystkich fiolek obserwacyjnych ponownie podłącz przepływ powietrza i uruchom minutniki.Użyj jednego stopera do śledzenia całkowitego czasu ekspozycji na alkohol, a drugiego do odmierzania pięciominutowych odstępów w trakcie badania. Monitoruj przepływy powietrza i wprowadzaj niezbędne korekty, aby pozostały one stałe. Zazwyczaj przepływy powietrza stabilizują się co pięć minut przy użyciu lampy z czerwonym światłem.Policz liczbę much, które utraciły odruch pisania. Lampę należy umieścić w odległości co najmniej 12 cali od fiolek. Mocno uderz w fiolkę i policz, ile much nie zdołało „zapisać się” w ciągu około czterech sekund.Muchy te mogą nadal poruszać odnóżami i skrzydłami, ale nie będą w stanie samodzielnie obrócić się do pozycji pionowej. Jeśli mucha nie porusza żadną z kończyn, oznacza to, że jest całkowicie znieczulona. Można to ocenić jako kryterium odrębne od braku odruchu wriggling.Sesja potrwa około godziny; na jej koniec należy policzyć całkowitą liczbę much w każdej probówce, stosując opisany protokół. Zmierzono modulację rytmu okołodobowego w wrażliwości na alkohol. Brak odruchu pisania mierzono w sześciu punktach czasowych podczas drugiego dnia ciemności u szczepu Canton S; pora dnia miała istotny wpływ na czas.Połowie much nie udało się zapisać. Procent much z kantonów znieczulonych po 40 minutach działaniem 30% alkoholu. Opary mierzono w CT 5 w ciągu dnia oraz w CT 17 w nocy.Stwierdzono, że w ciągu dnia subiektywnego znacznie mniej much uległo sedacji w porównaniu do nocy. Zastosowanie szeregów czasowych wykazało różnice w odruchu pisania i sedacji podczas porównania much Canton S z muchami posiadającymi mutację white 1 1 1 8. W tle genetycznym Canton S muchy white 1 1 1 8 wykazały lepszy odruch pisania w odpowiedzi na opary etanolu niż muchy Canton S. Różnice między mutantami white 1 1 1 8 a muchami typu dzikiego stwierdzono również w tempie sedacji.Różnica ta wynika najprawdopodobniej ze zmienionego poziomu wrogów biogennych przy mutacji white 1 1 1 8. W związku z tym konieczne jest kontrolowanie reakcji behawioralnych wynikających z mutacji white 1 1 1 8, która występuje w wielu liniach transgenicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak podawać alkohol muchom przy użyciu fly barn.Niezbędne jest, aby muchy zbierano w sposób metodyczny, a obserwacje prowadzone w słabym czerwonym świetle były w maksymalnym stopniu zestandaryzowane.

the-flybar-administering-alcohol-to-flies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

The FlyBar: Podawanie alkoholu muchom

Opisano prosty test służący do pomiaru działania sedatywnego etanolu na muszki Drosophila, oparty na utracie odruchu prostowania.

Prosty sposób pomiaru wrażliwości much na etanol

Ten film opisuje, jak wykonać zastrzyk żywym dorosłym muchom i zawiera przykładowy protokół, w którym oznaczone cząstki i błękit trypanowy są wstrzykiwane do brzuchów muchy w celu zbadania fagocytozy.

Wstrzyknięcie dorosłych much Drosophila: metoda dostarczania związku lub etykiety

Ten film pokazuje nano-wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do jamy ciała muchy, co powoduje namnażanie się bakterii i infekcję. Odpowiedź immunologiczna muchy usuwa niektóre bakterie, podczas gdy inne uciekają przed klirensem immunologicznym i przeżywają w żywicielu, powodując infekcję.

Zakażenie much zawiesiną bakteryjną za pomocą nanowstrzykiwacza

Ten film demonstruje technikę infekowania Drosophila poprzez wprowadzenie bakterii chorobotwórczej bezpośrednio do ich jamy ciała. Metoda ta omija bariery nabłonkowe i inne pasywne mechanizmy obronne, pozwalając na indukcję infekcji ogólnoustrojowej. Po zakażeniu wynikającą z zakażenia odpowiedź immunologiczną ocenia się poprzez monitorowanie śmiertelności much i przeprowadzanie dalszych testów.

Technika septycznego nakłuwania szpilek w celu wprowadzenia ogólnoustrojowej infekcji bakteryjnej u much

Proste testy do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u Drosophila ułatwiają wykorzystanie tego organizmu modelowego do badania tych ważnych zachowań związanych z etanolem. W tym miejscu opisano stosunkowo prosty, skalowalny test do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u much.

Niedrogi, skalowalny test behawioralny do pomiaru wrażliwości i szybkiej tolerancji sedacji etanolem u Drosophila

Tutaj opisano użycie kilku domowych narzędzi do przenoszenia, schładzania i zabijania dorosłych Drosophila, a także do czyszczenia szklanych fiolek z kulturami i zbierania jaj. Narzędzia te są łatwe do wykonania i są dość skuteczne w radzeniu sobie z Drosophila.

Proste domowe narzędzia do radzenia sobie z muszkami owocowymi - Drosophila melanogaster

Obecne metody pomiaru wrażliwości na alkohol u Drosophila są przeznaczone do testowania grup much. Przedstawiamy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much. Metoda nie wymaga specjalistycznych narzędzi i może być wykonywana w dowolnym laboratorium przy użyciu powszechnie stosowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa metoda pomiaru czasu sedacji alkoholowej u poszczególnych osobników Drosophila melanogaster

Test Flypub mierzy zachowanie, jakie muszka owocowa Drosophila melanogaster przejawia pod wpływem etanolu. Test może być łatwo opanowany przez eksperymentatorów na wszystkich poziomach i stosowany do różnych odparowanych bodźców, ułatwiając badania nad nadużywaniem substancji i uzależnieniami.

Flypub do badania odhamowania behawioralnego i uwrażliwienia wywołanego etanolem

Muszka owocowa (Drosophila melanogaster) jest szeroko stosowana do badań biologicznych i toksykologicznych. Aby zwiększyć użyteczność much, opracowaliśmy instrument, seryjną matrycę anestezjologiczną, która jednocześnie wystawia wiele próbek much na działanie lotnych środków znieczulających ogólnie (VGA), umożliwiając zbadanie skutków ubocznych (toksycznych i ochronnych) VGA.

Szeregowy zestaw anestezjologiczny do wysokoprzepustowego badania czynników lotnych z użyciem Drosophila melanogaster

Ten artykuł przedstawia laboratoryjne utrzymanie (w tym krycie i karmienie) muchówki niższej Bradysia (Sciara) coprophila.

Utrzymanie laboratoryjne muchówki dolnej Bradysia (Sciara) coprophila: nowy/stary wyłaniający się organizm modelowy

Poznaj metodę FlyBar do pomiaru zachowań indukowanych alkoholem u Drosophila melanogaster. Protokół pozwala badać wpływ rytmów okołodobowych na wrażliwość na alkohol w warunkach laboratoryjnych.

FlyBar: podawanie muchom alkoholu

Przeglądaj więcej filmów