FlyBar: podawanie muchom alkoholu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar zachowań indukowanych alkoholem u Drosophila, z wykorzystaniem niedrogiego i łatwego w montażu zestawu, który dobrze nadaje się dla studentów prowadzących badania lub naukowców rozpoczynających pracę w dziedzinie badań nad rytmami okołodobowymi. Cel ten jest realizowany poprzez wstępny montaż poprzeczki dla much, co umożliwia jednoczesne porównywanie wielu grup much.

Kolejnym krokiem procedury jest hodowla muszek drosophila w określonych cyklach światła i ciemności oraz zebranie much w tym samym wieku do eksperymentu. Następnie muchy są poddawane działaniu określonych stężeń par alkoholu, a zebrane zostają odpowiednie dane. Ostatecznie pomiar utraty odruchu pisania lub sedacji może wykazać różnice w wrażliwości na alkohol między grupami, wynikające z pory dnia lub uwarunkowań genetycznych.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy obserwacji są trudne do opanowania ze względu na wyzwania związane z monitorowaniem zachowania, słabe czerwone światło oraz konieczność ustalenia, które muchy utraciły odruch pisania, a które nie. W pierwszej kolejności należy zmontować drążek do much. Rozpocznij od montażu przepływu powietrza.

Podłącz krótki odcinek elastycznego wężyka silikonowego do punktu poboru powietrza w budynku lub do napowietrzacza akwariowego, aby zapewnić przepływ powietrza. Rozdziel strumień powietrza za pomocą łącznika w kształcie litery Y. Pierwszą odnogę podłącz do regulatora.

Będzie ono kontrolować całkowitą ilość powietrza przepływającego przez system. Drugi odgałęźnik należy podłączyć do szybkozłącza. Pozwoli to na przerywanie strumienia powietrza w razie potrzeby bez wpływu na skalibrowany przepływ.

Dodaj złączyko Y i podłącz każdą z odgałęziających się rurek do regulatora przepływu powietrza. Następnie podłącz każdy regulator do miernika przepływu powietrza. Teraz potnij szklane pipety o pojemności jednego mililitra i wytop w każdej sekcji kąt prosty.

Będą one pełnić funkcję sztywnych rurek kolankowych w układzie. Wprowadź prostą pipetę szklaną służącą jako wlot powietrza przez jeden otwór i wysuń ją w ciecz do poziomu 1 cm nad dno. Przez drugi otwór wprowadź szklany odcinek kolankowy, aż znajdzie się on tuż wewnątrz butelki.

Użyj tych wylotów, aby połączyć przepływ powietrza z każdej butelki za pomocą łącznika w kształcie litery Y. Za pomocą elastycznych rurek podłącz przepływomierze do prostego odcinka pipety. Będą one pełnić funkcję wlotów powietrza do dwóch butelek z roztworami.

Wodę lub alkohol, obie butelki z roztworem, należy umieścić w łaźni wodnej ustawionej na temperaturę o dwa stopnie wyższą od temperatury otoczenia. Butelki należy zamknąć gumowymi korkami z dwoma otworami z rurkami silikonowymi. Drugi koniec rozgałęzienia w kształcie Y należy podłączyć do butelki z gumowym korkiem z dwoma otworami.

Strumień powietrza z tej kolby mieszającej będzie dostarczał odparowany alkohol i wodę do fiolek obserwacyjnych. Podziel strumień powietrza wylotowego z kolby mieszającej dwa lub trzy razy, aby uzyskać cztery lub osiem mniejszych strumieni powietrza. Po jednym dla każdej fiolki obserwacyjnej.

Nadal należy używać rurek silikonowych. Fiolki obserwacyjne to puste fiolki do muszek, zamknięte gumowym korkiem z dwoma otworami – wlotem i wylotem dla par alkoholu. W otwory korka włożono rurki szklane.

Końce szklanej rurki należy przykryć siatką. Siatkę należy przymocować za pomocą krótkiego odcinka elastycznej rurki plastikowej. Wsunąć tę rurkę przez pierwszy otwór, aż sięgnie do około połowy długości fiolki.

W razie potrzeby należy użyć taśmy teflonowej, aby uzyskać szczelne dopasowanie. Wsunąć drugą szklaną rurkę z siatką, aż zrówna się ona z wewnętrzną krawędzią gumowego korka. Wymieszać odpowiednie frakcje dwóch strumieni powietrza przepuszczanych przez alkohol lub wodę.

Należy stale monitorować ciśnienie powietrza i w razie potrzeby wprowadzać korekty, aby utrzymać pożądany skład mieszaniny alkoholu i pary wodnej w butelce mieszającej. W tego typu eksperymentach należy zawsze zapewnić odpowiednią wentylację pomieszczenia. Aby zminimalizować różnice między powtórzeniami, należy zwrócić szczególną uwagę na warunki hodowli much.

Muchy muszą być hodowane w warunkach niskiego zagęszczenia z bardzo dokładną synchronizacją, aby osobniki w tym samym wieku i z tej samej kohorty mogły być testowane względem siebie. Pod koniec dnia zbierz świeżo wyklułe zwierzęta i przechowuj je przez 24 godziny w probówkach z niewielką ilością pożywki o wysokim stężeniu agaru w tym samym czasie.

Następnego dnia podziel zebrane muchy na kohorty liczące około 30 osobników za pomocą aspiratora i przenieś je do świeżych fiolek, aby zbadać okołodobową modulację zachowania. Przygotuj wystarczającą liczbę kohort, aby przetestować każdy warunek w sześciu równomiernie rozłożonych punktach czasowych w dniu badania, w celu zweryfikowania okołodobowej modulacji zachowania. Przez dwa dni przed testami utrzymuj muchy w stałej ciemności w temperaturze 25 °C.

Niezależnie od projektu eksperymentalnego, na co najmniej godzinę przed testem behawioralnym przenieść muchy do pomieszczenia eksperymentalnego oświetlonego wyłącznie słabym czerwonym światłem. Doświadczenia należy przeprowadzać przy słabym czerwonym świetle, aby stymulacja świetlna nie zaburzyła wyników. Przed rozpoczęciem eksperymentu przepuścić powietrze przez system przez co najmniej 10 minut i skalibrować przepływy powietrza.

Pod probówkami obserwacyjnymi umieść arkusz białego papieru, aby zwiększyć widoczność much dzięki dodatkowemu kontrastowi. Po ustabilizowaniu się przepływu powietrza odłącz szybkozłączkę i wprowadź kohortę 30 much do każdej probówki obserwacyjnej.

Podczas każdego uruchomienia listwy do muszek przetestuj każdy warunek eksperymentalny. Zwiększy to powtarzalność eksperymentu i zminimalizuje wpływ zmienności dobowej. Po załadowaniu wszystkich fiolek obserwacyjnych ponownie podłącz przepływ powietrza i uruchom minutniki.

Użyj jednego stopera do śledzenia całkowitego czasu ekspozycji na alkohol, a drugiego do odmierzania pięciominutowych odstępów w trakcie badania. Monitoruj przepływy powietrza i wprowadzaj niezbędne korekty, aby pozostały one stałe. Zazwyczaj przepływy powietrza stabilizują się co pięć minut przy użyciu lampy z czerwonym światłem.

Policz liczbę much, które utraciły odruch pisania. Lampę należy umieścić w odległości co najmniej 12 cali od fiolek. Mocno uderz w fiolkę i policz, ile much nie zdołało „zapisać się” w ciągu około czterech sekund.

Muchy te mogą nadal poruszać odnóżami i skrzydłami, ale nie będą w stanie samodzielnie obrócić się do pozycji pionowej. Jeśli mucha nie porusza żadną z kończyn, oznacza to, że jest całkowicie znieczulona. Można to ocenić jako kryterium odrębne od braku odruchu wriggling.

Sesja potrwa około godziny; na jej koniec należy policzyć całkowitą liczbę much w każdej probówce, stosując opisany protokół. Zmierzono modulację rytmu okołodobowego w wrażliwości na alkohol. Brak odruchu pisania mierzono w sześciu punktach czasowych podczas drugiego dnia ciemności u szczepu Canton S; pora dnia miała istotny wpływ na czas.

Połowie much nie udało się zapisać. Procent much z kantonów znieczulonych po 40 minutach działaniem 30% alkoholu. Opary mierzono w CT 5 w ciągu dnia oraz w CT 17 w nocy.

Stwierdzono, że w ciągu dnia subiektywnego znacznie mniej much uległo sedacji w porównaniu do nocy. Zastosowanie szeregów czasowych wykazało różnice w odruchu pisania i sedacji podczas porównania much Canton S z muchami posiadającymi mutację white 1 1 1 8. W tle genetycznym Canton S muchy white 1 1 1 8 wykazały lepszy odruch pisania w odpowiedzi na opary etanolu niż muchy Canton S. Różnice między mutantami white 1 1 1 8 a muchami typu dzikiego stwierdzono również w tempie sedacji.

Różnica ta wynika najprawdopodobniej ze zmienionego poziomu wrogów biogennych przy mutacji white 1 1 1 8. W związku z tym konieczne jest kontrolowanie reakcji behawioralnych wynikających z mutacji white 1 1 1 8, która występuje w wielu liniach transgenicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak podawać alkohol muchom przy użyciu fly barn.

Niezbędne jest, aby muchy zbierano w sposób metodyczny, a obserwacje prowadzone w słabym czerwonym świetle były w maksymalnym stopniu zestandaryzowane.