Name: Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj metodę badania propagacji fal wapniowych w monowarstwach komórek śródbłonka rogówki bydła przy użyciu stymulacji mechanicznej i mikroskopii konfokalnej. Technika pozwala analizować komunikację międzykomórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace badawcze prowadzone w laboratorium były wspierane przez granty Fundacji Badawczej - Flandria (FWO; numery grantów G.0545.08 i G.0298.11), Interuniversity Attraction Poles Program (Belgijska Polityka Naukowa; numer grantu P6/28 i P7/13) i są częścią społeczności badawczej wspieranej przez FWO. CDH jest adiunktem Fundacji Badawczej we Flandrii (FWO). Autorzy są bardzo wdzięczni wszystkim obecnym i byłym członkom Laboratorium Sygnalizacji Molekularnej i Komórkowej (KU Leuven), dr SP Srinivasowi (Indiana University School of Optometry, USA), laboratorium dr Leybaerta (Uniwersytet w Gandawie) i dr Vinkenowi (VUB), którzy zapewnili pomocne dyskusje, zoptymalizowali procedury lub byli zaangażowani w rozwój narzędzi do badania półkanałów koneksyny.

1. Izolacja komórek śródbłonka rogówki
Zanim zaczniesz: Wyizoluj komórki z świeżych oczu, uzyskanych z lokalnej rzeźni, jak najszybciej po wyłuszczeniu oka. Upewnij się, że oko zostało wyłuszczone od krowy w wieku maksymalnie 18 miesięcy, pięć minut po sekcji zwłok i zakonserwowane w Earle's Balanced Salt Solution - 1% roztworze jodu w temperaturze 4 °C w celu transportu do laboratorium.
<ol>
 <li>Wyjmij oko z Earle's Balanced Salt Solution - 1% roztworu jodu i umieść je na szalce Petriego (100 x 20 mm).</li>
 <li>Wysterylizuj oko roztworem zawierającym 70% etanolu i przepłucz zrównoważonym roztworem soli Earle's zawierającym 1% jodu.</li>
 <li>Od tego kroku pracuj w sterylnym kapturze. Ostrożnie wypreparuj rogówkę z oka i umieść ją na szalce Petriego (35 x 10 mm) zawierającej zrównoważony roztwór soli Earle'a, z warstwą komórek nabłonka skierowaną do góry. W razie potrzeby ostrożnie usuń pozostałą tkankę tęczówki, która nadal jest przyczepiona do rogówki.</li>
 <li>Przenieś rogówkę do innego Zbilansowanego Roztworu Soli Earle'a zawierającego szalkę Petriego z warstwą komórek śródbłonka skierowaną do góry i spłucz dwukrotnie Zrównoważonym Roztworem Soli Earle'a.</li>
 <li>Przenieś rogówkę z warstwą śródbłonka skierowaną do góry do klepsydry, która jest naczyniem w kształcie miseczki, i przykryj ją pożywką wzrostową. Pożywka składa się z modyfikowanej pożywki Dulbecco's Eagle's Medium zawierającej 25 mM glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 6,6% L-glutaminy, 2,5 μg/ml amfoterycyny-B i 1% mieszaniny antybiotykowo-przeciwgrzybiczej zawierającej 10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B.</li>
 <li>Usunąć pożywkę za pomocą pipety ssącej.</li>
 <li>Nanieś 300 μl roztworu trypsyny (0,5 g/l) na warstwę śródbłonka rogówki (wszystkie etapy zawierające trypsynę są wykonywane przy użyciu tego samego stężenia).</li>
 <li>Umieścić klepsydrę zawierającą rogówkę na przykrytej szalce Petriego i umieścić w inkubatorze na 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
 <li>Delikatnie zeskrob komórki śródbłonka z rogówki za pomocą wypolerowanej na ogniowo szklanej pipety Pasteura w kształcie haczyka w sterylnym kapturze.</li>
 <li>Odessać roztwór zawierający komórki śródbłonka i dodać go do kolb hodowlanych (25cm2) zawierających 4 ml pożywki hodowlanej.</li>
 <li>Nałożyć 300 μl pożywki wzrostowej na rogówkę i powtórzyć skrobanie, a następnie dodać roztwór zawierający komórki śródbłonka do kolby hodowlanej.</li>
 <li>Powtórz ten ostatni krok (1.11) jeszcze raz.</li>
 <li>Umieścić kolby hodowlane zawierające komórki śródbłonka rogówki w pożywce wzrostowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
 <li>Po dwóch dniach dodać 6 ml pożywki hodowlanej.</li>
 <li>Odświeżaj podłoże co drugi dzień.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
 <li>Usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć komórki zrównoważonym roztworem soli Earle'a, po osiągnięciu konfluencji (w ciągu około 10 dni po izolacji).</li>
 <li>Dodać 1,5 ml roztworu trypsyny do komórek, aby je oddzielić i umieścić kolbę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 3 do 4 minut.</li>
 <li>Dodać 12 ml pożywki wzrostowej. Trzykrotnie odpipetować pożywkę do środka i z powrotem, aby rozproszyć komórki i policzyć komórki.</li>
 <li>Wysiewaj komórki o zmiennej frakcji w zależności od gęstości komórek i umieść je w inkubatorze. Przygotuj dwa szkiełka o dobrze komorowych komórkach (o powierzchni 4,2 cm2) z liczbą komórek 165 000 komórek (gęstość komórek 39 286 na cm2). Przygotować kolby hodowlane o średnicy 80cm2 do nowego przejścia o gęstości 6,250 nacm2 i dodać świeżą pożywkę do całkowitej objętości 25 ml.</li>
 <li>Odświeżaj podłoże co dwa dni.</li>
 <li>Zbieg warstwy komórkowej osiąga się po 3 do 4 dniach. Używanie komórek do eksperymentów.</li>
 <li>Po osiągnięciu zbiegu warstwy komórkowej w kolbach powtórz kroki od 2.1 do 2.6. Do eksperymentów można wykorzystać hodowle komórkowe do pasażu 2.</li>
</ol>
3. Mechaniczna stymulacja do wywoływania fali wapniowej
<ol>
 <li>Załadować komórki do szkiełka z komorą za pomocą 10 μM Fluo-4 AM w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez 30 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
 <li>Usunąć roztwór Fluo-4 AM, przemyć komórki pięciokrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, inkubować komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i pozostawić komórki na co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej przed pomiarem.</li>
 <li>Wzbudzić przy 488 nm za pomocą lasera argonowego i użyć rozdzielacza wiązki HFT 488, zebrać emisję fluorescencji przy 530 nm za pomocą długoprzepustowego filtra emisyjnego LP 505, ustawić otwór na minimum. Użyj obiektywu 40X z olejkiem (Air, 1.2 N.A.). W eksperymentach z ARL-67156 używaj obiektywu 10X (Air, 0.3 N.A.).</li>
 <li>Wyszukaj pole, w którym komórki zlewają się na mikroskopie konfokalnym.</li>
 <li>Ustawić pipetę tak, aby znajdowała się pod kątem 45° w stosunku do szkiełka z komorą i dotykała błony komórkowej. Sprowokuj krótką (≈ 1 sek.) mechaniczną stymulację pojedynczej komórki. Stymulacja mechaniczna polega na ostrym, krótkotrwałym odkształceniu komórki poprzez krótkie dotknięcie mniej niż 1% błony komórkowej szklaną mikropipetą (średnica końcówki <1 μm) sprzężoną z piezoelektrycznym nanopozycjonerem kryształowym, obsługiwanym przez wzmacniacz zamontowany na mikromanipulatorze. Szklane mikropipety są wykonane ze ściągaczem do mikroelektrod. Upewnij się, że nanopozycjoner jest zasilany napięciem od 0,2 do 1,5 V podczas stymulacji mechanicznej. Napięcie wyższe niż 1,5 V może spowodować uszkodzenie ogniwa. Dla każdego typu i stanu ogniwa optymalne napięcie do stymulacji mechanicznej bez uszkodzenia ogniwa musi być dokładnie określone, stosując szereg napięć zaczynających się od niskiego (0,2 V) do wysokiego (1,5 V) napięcia. Napięcie jest miarą siły stymulacji, ponieważ napięcie to określa naprężenia mechaniczne i odkształcenia wywierane na błonę komórkową. Siłę stymulacji mechanicznej można obliczyć, mnożąc naprężenie mechaniczne przez powierzchnię. Ponieważ zarówno powierzchnia (<3,14 μm2), jak i naprężenia mechaniczne są bardzo niskie, siła stymulacji mechanicznej jest niska. (Zauważ, że gdy komórka jest uszkodzona, fluorescencja wycieka z komórki i komórka staje się ciemna).</li>
 <li>Zmierz zmiany przestrzenne w [Ca2+]i po stymulacji mechanicznej za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
 <li>Zbieraj i przechowuj obrazy.</li>
 <li>Narysuj wielokątny obszar zainteresowania, aby zdefiniować całkowitą powierzchnię reagujących komórek (obszar aktywny, AA) za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym manuskrypcie opisujemy prostą metodę pomiaru międzykomórkowej propagacji fali Ca2 + w monowarstwach pierwotnych komórek śródbłonka rogówki bydła poprzez zapewnienie miejscowej i kontrolowanej stymulacji mechanicznej za pomocą mikropipety. Komórki stymulowane mechanicznie reagują lokalnym wzrostem wewnątrzkomórkowego IP3 i Ca2 +, z których oba są niezbędnymi wewnątrzkomórkowymi cząsteczkami sygnałowymi, które napędzają międzykomórkową propagację fali Ca2 + 11,67...

Komunikacja i sygnalizacja międzykomórkowa są niezbędne do koordynacji procesów fizjologicznych w odpowiedzi na agonistów zewnątrzkomórkowych na poziomie tkanek i całego narządu 1,2 . Najbardziej bezpośredni sposób komunikacji międzykomórkowej powstaje w wyniku występowania połączeń szczelinowych. Połączenia szczelinowe to blaszki kanałów połączeń szczelinowych, które są kanałami białkowymi utworzonymi przez dokowanie głową w głowę dwóch półkanałów koneksynowych (Cx) sąsiednich komórek 3,4 (ryc. 1). Złącza szczelinowe umożliwiają przejście małych cząsteczek sygnałowych o masie cząsteczkowej mniejszej niż 1,5 kDa, w tym Ca2 + lub IP3 5, powodując i modulując uwalnianie Ca2 + z wewnątrzkomórkowych magazynów sąsiednich komórek 6 (Figura 2). Kanały połączeń szczelinowych są ściśle regulowane przez wewnątrz- i międzycząsteczkowe interakcje białek oraz przez procesy sygnalizacji komórkowej, takie jak modyfikacja redoks i fosforylacja7. GJ ułatwiają skoordynowaną odpowiedź połączonych komórek, działając w ten sposób jako syncytium chemiczne i elektryczne. Na przykład rozprzestrzenianie się potencjału czynnościowego serca przez miocyty przedsionkowe i komorowe odbywa się za pośrednictwem kanałów GJ opartych na Cx 85. Cxs pełnią nie tylko rolę kanałów ze złączami szczelinowymi, ale także tworzą niesparowane półkanały, funkcjonując w ten sposób jako kanały w błonach podobnie jak zwykłe kanały jonowe 8-10 (ryc. 1). Półkanały uczestniczą w sygnalizacji parakrynnej między sąsiednimi komórkami, kontrolując wymianę jonów i cząsteczek sygnałowych między środowiskiem wewnątrz- i zewnątrzkomórkowym.
W wielu typach komórek (takich jak komórki nabłonkowe, osteoblasty, astrocyty, komórki śródbłonka, itp.) i narządach (takich jak mózg, wątroba, siatkówka, ślimak i układ krwionośny), międzykomórkowe fale Ca2+ są fundamentalne dla koordynacji odpowiedzi wielokomórkowych 11. Wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2 + w określonej komórce nie ogranicza się do tej komórki, ale rozprzestrzenia się do otaczających sąsiednich komórek, tworząc w ten sposób międzykomórkową falę Ca2 + 12,13 . Te międzykomórkowe fale Ca2 + są ważne dla normalnej fizjologicznej regulacji warstw komórkowych jako syncytium, a ich rozregulowanie jest związane z procesami patofizjologicznymi 11. W śródbłonku i nabłonku rogówki różne grupy 14-24, w tym nasza własna 25-33, badały mechanizmy i role komunikacji międzykomórkowej. W komórkach niepobudliwych, takich jak komórki śródbłonka rogówki, występują dwa odrębne tryby komunikacji międzykomórkowej 28,29 , a mianowicie komunikacja międzykomórkowa w szczelinie i parakrynna komunikacja międzykomórkowa. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym polega na bezpośredniej wymianie cząsteczek sygnałowych za pośrednictwem połączeń szczelinowych 7. Komunikacja międzykomórkowa w szczelinie ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy tkanek, kontrolowania proliferacji komórek i ustanowienia zsynchronizowanej odpowiedzi na stres zewnątrzkomórkowy 10,34,35 . W wielu patologiach sprzężenie połączeń szczelinowych jest zmniejszone z powodu wadliwego Cxs, a tym samym wpływa na komunikację międzykomórkową węzła szczelinowego 36. Podkreśla to znaczenie i wpływ komunikacji międzykomórkowej w organizmach wielokomórkowych. W przeciwieństwie do komunikacji międzykomórkowej w szczelinie, parakrynna komunikacja międzykomórkowa nie jest zależna od ułożenia komórka-komórka, ponieważ obejmuje uwalnianie rozproszonych przekaźników zewnątrzkomórkowych (ryc. 2). Różne rodzaje cząsteczek sygnałowych są uwalniane w przestrzeni zewnątrzkomórkowej przez komórki sygnalizacyjne. Cząsteczka jest następnie transportowana do komórki docelowej, gdzie jest wykrywana przez określone białko receptorowe. Następnie kompleks receptor-sygnał indukuje odpowiedź komórkową, która kończy się usunięciem sygnału, inaktywacją lub odczulaniem. Uwolnione lipofilowe zewnątrzkomórkowe przekaźniki sygnalizacyjne przenikają przez błonę i działają na receptory wewnątrzkomórkowe. W przeciwieństwie do tego, hydrofilowi przekaźniki nie przechodzą przez błonę plazmatyczną reagującej komórki, ale działają jak ligand, który wiąże się z białkami receptorowymi o ekspresji powierzchniowej, które następnie przekazują sygnał do środowiska wewnątrzkomórkowego. W procesie tym uczestniczą trzy główne rodziny białek receptorów powierzchniowych komórek: połączone z kanałem jonowym, połączone z enzymem i połączone z białkiem G. Uwolniona cząsteczka przekaźnikowa może działać na receptory tej samej komórki (autokrynne), na komórki docelowe w bliskim sąsiedztwie (parakrynne) lub na odległe komórki docelowe, które wymagają układu krążenia (endokrynologiczne).
W wielu typach komórek, w tym w śródbłonku rogówki 28,29, ATP jest jednym z głównych hydrofilowych, parakrynnych czynników, które napędzają rozprzestrzenianie się międzykomórkowych fal Ca2+ 37-40. Podczas deformacji mechanicznej, niedotlenienia, stanu zapalnego lub stymulacji różnymi czynnikami, ATP może być uwalniany ze zdrowych komórek 41-44 w odpowiedzi na naprężenie ścinające, rozciąganie lub pęcznienie osmotyczne 44,45. Postulowano różne mechanizmy uwalniania ATP, w tym egzocytozę pęcherzykową 44 i mnóstwo mechanizmów transportu, takich jak transportery kasety wiążącej ATP (ABC), plazmomalne kanały anionowe zależne od napięcia plazmalnego 46, kanały receptora P2X7 47,48, a także półkanały koneksyny 49-52 i półkanały aneksyny 43,49,53. Zewnątrzkomórkowe ATP może być szybko hydrolizowane do ADP, AMP i adenozyny 54,55 przez ektonukleotydazy, które są obecne w środowisku zewnątrzkomórkowym. Uwalniany zewnątrzkomórkowo ATP i jego metabolit ADP 56 rozprzestrzeniają się poprzez dyfuzję. Późniejsze oddziaływanie tych nukleotydów z receptorami purynergicznymi w sąsiednich komórkach jest związane z propagacją międzykomórkowych fal Ca2 + 28,37,51. Występują dwie różne klasy receptorów purynergicznych: adenozyna jest głównym naturalnym ligandem dla purynoceptorów P1, podczas gdy nukleotydy purynowe (ATP, ADP) i pirymidynowe (UTP, UDP) działają na większość purynoceptorów P2 57.
Komunikacja międzykomórkowa może być badana różnymi metodami, takimi jak ładowanie skrobania, transfer barwnika, lokalne odblokowywanie agonistów takich jak IP3 i Ca2+, stymulacja mechaniczna, itp. Tutaj opisujemy badanie propagacji fal Ca2+ wywołanych mechaniczną stymulacją pojedynczej komórki. Zaletą badania propagacji fali Ca2+ za pomocą stymulacji mechanicznej jest to, że zapewnia łatwe narzędzie do ilościowego określenia rozprzestrzeniania się fali Ca2+ w czasie i umożliwia ilościowe porównanie różnych zabiegów wstępnych komórek. W śródbłonku rogówki te międzykomórkowe fale Ca2 + umożliwiają skoordynowaną odpowiedź z monowarstwy, działając w ten sposób jako możliwy mechanizm obronny nieregeneracyjnego śródbłonka rogówki, pomagając śródbłonkowi wytrzymać naprężenia zewnątrzkomórkowe podczas operacji wewnątrzgałkowej lub po ekspozycji na mediatory stanu zapalnego podczas odrzucenia immunologicznego lub zapalenia błony naczyniowej oka 58,59 .

<table><tbody><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>Sondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Niemcy)</td><td>38060-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)</td><td>Sondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (Glutamax)</td><td>Sondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Amphoterycyna-B</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Niemcy)</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina antybiotykowo-przeciwgrzybicza</td><td>Sondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DulbeccoSondy</td><td>molekularne PBS Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>14190-091</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Sondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>F14217</td><td></td></tr><tr><td>ARL-67156 (6-N,N-dietylo-b,g-dibromometyleno-D-ATP) </td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Niemcy)</td><td>A265</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VI</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Niemcy)</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VII</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Niemcy)</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td><td>Niestandardowa synteza</td><td></td><td></td>peptydów</tr><tr><td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td><td>Niestandardowa synteza</td><td></td><td></td>peptydów</tr><tr><td>Peptyd kontrolny (SRGGEKNVFIV)</td><td>Niestandardowa synteza</td><td></td><td></td>peptydów</tr><tr><td>siRNA1 Cx43 (sens: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdTT) </td><td>Wyżarzone siRNA zakupiono w Eurogentec (Luik, Belgia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA2 Cx43 (sens: 5'CAAUUCUUCCUGGCAAUdTdT) </td><td>Wyżarzone siRNA zostało zakupione w Eurogentec (Luik, Belgia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanie siRNA: zaszyfrowana sekwencja siCx43-1 (sens: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdTTT) </td><td>Wyżarzone siRNA zostało zakupione w Eurogentec (Luik, Belgia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td><td>Thermo Electron (Ulm, Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td><td>Thermo Electron (Ulm, Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane dwukomorowe</td><td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Dania)</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny </td><td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Niemcy)</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Piez&#8211; elektryczny nanopozycjoner kryształowy (Piezo Flexure NanoPositioner)</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>P-280</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz HVPZT</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>E463 Wzmacniacz</td><td></td>HVPZT</tr><tr><td>Szklane rurki (zamiennik szkła 3,5 nanolitra)</td><td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Floryda, USA</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Micr&#8211; ściągacz do ręczników </td><td>Zeitz Instrumente (München, Niemcy)</td><td>WZ DMZ-Ściągacz</td><td></td> uniwersalny</tr></tbody></table>

propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Komunikacja międzykomórkowa jest niezbędna do koordynacji procesów fizjologicznych między komórkami w różnych organach i tkankach, w tym w mózgu, wątrobie, siatkówce, ślimaku i naczyniach krwionośnych. W warunkach eksperymentalnych międzykomórkowe fale Ca2 + mogą być wywoływane przez zastosowanie bodźca mechanicznego do pojedynczej komórki. Prowadzi to do uwolnienia wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych IP3 i Ca2 +, które inicjują koncentryczną propagację fali Ca2 + z mechanicznie stymulowanej komórki do sąsiednich komórek. Główne szlaki molekularne, które kontrolują międzykomórkową propagację fali Ca2 +, są zapewniane przez kanały połączeń szczelinowych poprzez bezpośredni transfer IP3 oraz przez półkanały poprzez uwalnianie ATP. Identyfikacja i charakterystyka właściwości i regulacji różnych izoform koneksyny i pannexyny jako kanałów połączeń szczelinowych i półkanałów jest możliwa dzięki ilościowemu określeniu rozprzestrzeniania się międzykomórkowej fali Ca2 +, siRNA oraz zastosowaniu inhibitorów kanałów i półkanałów połączeń szczelinowych. W tym miejscu opisano metodę pomiaru międzykomórkowego zawałka Ca2+ w monowarstwach pierwotnych komórek śródbłonka rogówki obciążonych Fluo4-AM w odpowiedzi na kontrolowany i zlokalizowany bodziec mechaniczny wywołany ostrym, krótkotrwałym odkształceniem komórki w wyniku dotknięcia błony komórkowej szklaną mikropipetą sterowaną mikromanipulatorem o średnicy końcówki mniejszej niż 1 μm. Opisujemy również izolację pierwotnych komórek śródbłonka rogówki bydła i jej zastosowanie jako systemu modelowego do oceny aktywności półkanału Cx43 jako siły napędowej dla międzykomórkowych fal Ca2 + poprzez uwalnianie ATP. Na koniec omówiono zastosowanie, zalety, ograniczenia i alternatywy tej metody w kontekście badań kanałów złączy szczelinowych i półkanałów.

Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i wymogami organów regulacyjnych, a prezentowany protokół jest realizowany pod nadzorem i za zgodą komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt Uniwersytetu KU Leuven.
W komórkach endotelialnych rogówki bydlęcej (BCEC) eksponowane są funkcjonalne połączenia szczelinowe, a zarówno międzykomórkowa komunikacja poprzez połączenia szczelinowe, jak i komunikacja paracryna znacząco przyczyniają się do kom...

Międzykomórkowe fale Ca2+ są napędzane przez kanały połączeń szczelinowych i półkanały. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru międzykomórkowych fal Ca2 + w monowarstwach komórkowych w odpowiedzi na lokalny bodziec mechaniczny pojedynczej komórki oraz jej zastosowanie do badania właściwości i regulacji kanałów połączeń szczelinowych i półkanałów.

Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest badanie komunikacji międzykomórkowej poprzez kanały połączeń szczelinowych oraz kanały HEMI poprzez kwantyfikację rozprzestrzeniania się międzykomórkowej fali wapniowej wywołanej stymulacją mechaniczną w monowarstwach pierwotnych komórek śródbłonkowych rogówki. Osiąga się to poprzez wyizolowanie w pierwszym kroku pierwotnych komórek śródbłonkowych rogówki ze świeżych byczych oczu. W drugim kroku, od dwóch do trzech dni po wysianiu na szkiełkach z komorami, konfluencyjną monowarstwę komórek obciąża się fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na wapń flu O 4:00 AM. Następnie przykładamy kontrolowany i zlokalizowany bodziec mechaniczny do jednej pojedynczej komórki monowarstwy, aby wywołać międzykomórkową falę wapniową, która jest wizualizowana przy użyciu mikroskopu konfokalnego.Wyniki pokazują rozprzestrzenianie się międzykomórkowej fali wapniowej. Ostatecznie zastosowano inhibicję kanałów połączeń szczelinowych oraz hemikanałów, aby wyjaśnić właściwości i regulację różnych izoform koneksyn i paneksyn tworzących kanały połączeń szczelinowych oraz hemikanały. Główną zaletą indukcji międzykomórkowej propagacji fali wapniowej poprzez stymulację mechaniczną jest to, że zapewnia ona prostą i niezawodną metodę badania wkładu i właściwości kanałów łączących w sposób nieinwazyjny.Ponadto metoda ta opiera się na fizjologicznych cząsteczkach sygnalizacyjnych i kaskadach obecnych w badanych systemach komórkowych. Wreszcie jest ona łatwo adaptowalna do różnych systemów komórkowych, w tym do komórek pierwotnych i modeli komórkowych ektopowo eksponujących określone izoformy koneksyn lub PanIN. Metody te mogą dostarczyć informacji na temat funkcji i dynamicznej regulacji kanałów połączeń szczelnych oraz hemikanałów opartych na koneksynach i PanIN poprzez zastosowanie wyciszania endogennych izoform koneksyn lub PanIN za pomocą siRNA oraz poprzez zastosowanie selektywnych inhibitorów kanałów połączeń szczelnych i hemikanałów.System ten zdecydowanie nie ogranicza się wyłącznie do komórek nabłonka rogówki. Jest on dostosowany do praktycznie każdego typu komórek, a także do bardziej złożonych tkanek. W tej procedurze wykorzystuje się świeżo pobrane oko krowy w wieku nieprzekraczającym 18 miesięcy, pobrane nie później niż pięć minut po śmierci zwierzęcia.Próbkę transportowano do laboratorium w zrównoważonym roztworze soli Earla oraz 1% roztworze jodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw przenieś oko do szalki Petriego o wymiarach 100 mm na 20 mm. Następnie opłucz oko za pomocą EBSS zawierającego 1% jodu.Następnie wysterylizuj go roztworem zawierającym 70% etanol i od tego momentu pracuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ostrożnie wypreparuj rogówkę z oka i umieść ją w płytce Petriego o wymiarach 35 mm na 10 mm zawierającej EBSS, tak aby warstwa komórek nabłonkowych była skierowana do góry.Ostrożnie usuń wszelką pozostałą tkankę tęczówki wciąż przylegającą do rogówki. W razie potrzeby przenieś rogówkę do innego naczynia z EBSS warstwą komórek śródbłonkowych skierowaną do góry, a następnie dwa razy wypłucz EBSS. Następnie umieść rogówkę warstwą śródbłonka skierowaną do góry w naczyniu typu klepsydra i przykryj pożywką wzrostową.Aby wypłukać, usunąć medium za pomocą pipety ssącej. Nanieść 300 µL roztworu trypsyny o stężeniu 0,5 g/L na warstwę śródbłonka rogówki. Umieścić klepsydrę zawierającą rogówkę w przykrytej płytce Petriego i przenieść do inkubatora na 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Po wyjęciu klepsydry, delikatnie zeskrobiono komórki śródbłonka z rogówki za pomocą wypalanej, haczykowatej pipety pasterowskiej wykonanej ze szkła. Odsączono roztwór zawierający komórki śródbłonka i dodano go do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm², zawierającej 4 mL pożywki hodowlanej. Następnie na rogówkę naniesiono 300 µL pożywki wzrostowej.Powtórz proces skrobania i dodaj roztwór zawierający komórki śródbłonka do kolby hodowlanej. Powtórz ten krok jeszcze raz, a następnie umieść kolby hodowlane zawierające komórki śródbłonka rogówki w pożywce wzrostowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po dwóch dniach dodaj 6 mL pożywki hodowlanej i odnawiaj pożywkę wzrostową co drugi dzień.Komórki powinny osiągnąć konfluencję w ciągu od siedmiu do 10 dni od izolacji do pasażu. Najpierw odessać medium hodowlane, a następnie dwukrotnie przepłukać EBSS. Następnie dodać do komórek dwa mililitry roztworu trypsyny i umieścić kolbę w inkubatorze na trzy do czterech minut.Następnie należy dodać 12 ml pożywki hodowlanej i trzykrotnie przepłukać zawiesinę za pomocą pipety, aby rozproszyć komórki. Następnie należy policzyć komórki, używając hematocytometru lub automatycznego licznika komórek. Do dwóch szkiełek do hodowli z dołkami należy przenieść po 165 000 komórek.Następnie przygotować kwadratowe kolby hodowlane o powierzchni 75 cm² do nowego pasażu przy gęstości 6 250 komórek na cm², dodać świeżą pożywkę hodowlaną do całkowitej objętości 25 ml i umieścić kolby oraz szkiełka do komór w inkubatorze. Pożywkę należy odświeżać co dwa dni; konfluencji warstwy komórkowej powinno się osiągnąć w ciągu trzech do czterech dni. Najpierw załadować komórki w szkiełku do komór z 10 µM Fluo-4 AM w roztworze soli fosforanowej (PBS) przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy delikatnym wstrząsaniu. Podczas inkubacji komórek z Fluo-4 AM, podłączyć szklaną mikropipetę o średnicy końcówki poniżej 1 µm do nanopozycjonera piezoelektrycznego i połączyć go z wzmacniaczem zamontowanym na mikromanipulatorze.Ustaw napięcie nanopozycjonera w zakresie od 0.2 do 1.5 V. Usuń roztwór flu 4:00 AM. Następnie pięciokrotnie przemyj komórki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), a potem inkubuj komórki w PBS przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej przed wykonaniem pomiaru.Wzbudź próbkę przy użyciu lasera argonowego o długości fali 488 nanometrów, stosując dzielnik wiązki HFT 48. Zbieraj emisję fluorescencji przy 530 nanometrach za pomocą filtru emisyjnego długoprzepustowego LP 5 0 5, z otworem pinhole ustawionym na minimum; w tym celu należy użyć obiektywu imersyjnego olejowego 40 x. Umieść szkiełko z komorą na stole mikroskopu konfokalnego i odnajdź obszar z konfluencją komórek.Następnie przesuń mikromanipulator, aby ustawić szklaną mikropipetę tak, by dotykała błony komórkowej pod kątem 45 stopni. Obsługując mikromanipulator, należy krótko dotknąć szklaną mikropipetą mniej niż 1% błony pojedynczej komórki, wywołując jednosekundową stymulację mechaniczną komórki. Następnie zmierz zmiany przestrzenne w stężeniu jonów wapnia po stymulacji mechanicznej za pomocą mikroskopu konfokalnego, gromadząc i przechowując obrazy.Na koniec, za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego, wyznacz wielokątny obszar zainteresowania (ROI), aby określić całkowitą powierzchnię komórek wykazujących odpowiedź. Przejściowe stężenia wapnia indukowane stymulacją mechaniczną w komórkach śródbłonka rogówki bydlęcej w warunkach kontrolnych przedstawiono w różnych punktach czasowych na reprezentatywnych obrazach fluorescencyjnych w pseudokolorach; intensywność fluorescencji przed stymulacją pokazano na pierwszym obrazie. Biała strzałka na drugim obrazie wskazuje komórkę poddaną stymulacji mechanicznej.Fala wapniowa rozprzestrzenia się na sześć sąsiednich warstw komórek, a całkowita powierzchnia komórek objęta falą daje aktywny obszar o wielkości 62 870 µm². Wykres liniowy przedstawia przebieg czasowy znormalizowanej wartości fluorescencji lub NF w mechanicznie stymulowanej komórce oznaczonej jako ms oraz średnią wartość NF w sąsiednich warstwach komórek od jednej do pięciu, oznaczonych na wykresie jako MB 1 do MB 5. Obrazy te szczegółowo ukazują istotne zmiany w rozprzestrzenianiu się międzykomórkowych fal wapniowych po zastosowaniu egzogennych nukleotydów na wykresie po lewej oraz po zastosowaniu inhibitorów ektonukleotydazy na wykresie po prawej; dokładniej rzecz ujmując, wykres po lewej wykazuje znaczący spadek aktywnego obszaru po potraktowaniu bydlęcych komórek endotelialnych rogówki egzogennymi Aras Aase 6 i Aase 7, które hydrolizowały ATP i ADP, hamując tym samym perykrynną drogę komunikacji międzykomórkowej.Gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,001 w obecności w porównaniu do braku ace. Wykres po prawej stronie pokazuje znaczący wzrost powierzchni aktywnej po potraktowaniu BCEC selektywnym inhibitorem nukleotydów zewnątrzkomórkowych, A RL 6 7 1 56, co wzmacnia ścieżkę komunikacji międzykomórkowej typu perykrynowego. Gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,001 w obecności w porównaniu do braku a RL po opanowaniu metody.Przy prawidłowym przeprowadzeniu, technika ta zajmuje od pięciu do 10 minut dla jednego eksperymentu w jednym wariancie. Wykonanie całej serii doświadczeń umożliwiającej porównanie różnych warunków zajmuje jeden dzień w celu wyciągnięcia wniosków statystycznych. Należy zastosować niezależne eksperymenty przeprowadzone w różne dni i na różnych partiach izolowanych komórek.Pomiar i kwantyfikacja propagacji wewnątrzkomórkowych fal wapniowych pozwalają na identyfikację i charakterystykę regulacji biologii komórki w odniesieniu do różnych izoform połączeń, takich jak kanały przestwokomórkowe (gap junctions) oraz hemikanały. Chciałbym również podkreślić, że metoda ta nie jest samodzielna, lecz powinna być uzupełniona o inne podejścia molekularne i funkcjonalne, począwszy od transferu barwników, poprzez pomiar uwalniania ATP, aż po elektrofizjologię.

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Propagacja fal wapniowych indukowanych stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: Przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

Ten artykuł opisuje technikę używaną do wykonywania dwukanałowego mapowania optycznego w monowarstwach hodowlanych komórek przedsionkowych HL-1. Ten unikalny protokół umożliwia jednoczesną wizualizację zarówno aktywności wapnia (Ca), jak i napięcia (Vm) w tym samym obszarze w celu szczegółowego wykrywania i analizy właściwości elektrofizjologicznych monowarstw kultur.

Dwukanałowe mapowanie optyczne napięcia i wapnia w monowarstwie miocytów przedsionkowych HL-1 z hodowlą

Korzystając z mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) o wysokiej rozdzielczości, obserwuje się ex vivo bicie ruchliwych rzęsek wyściółki znajdujących się w komorach mózgu myszy za pomocą obrazowania na żywo. Technika ta pozwala na rejestrację unikalnej częstotliwości i kąta dudnienia rzęsek, a także ich właściwości stymulacyjnych wewnątrzkomórkowych oscylacji wapnia.

Obrazowanie na żywo rzęsek wyściółki w bocznych komorach mózgu myszy

Bakteryjne kanały mechanowrażliwe mogą być używane jako przetworniki mechanoelektryczne w urządzeniach biomolekularnych.  Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB), inspirowane komórkami elementami budulcowymi takich urządzeń, stanowią nowe platformy do włączania i stymulowania kanałów mechanowrażliwych.  W tym miejscu demonstrujemy nową metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach, umożliwiającą badanie kanałów mechanoczułych pod wpływem stymulacji mechanicznej.

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Pierwotna hodowla bydlęcych komórek śródbłonka rogówki została wykorzystana do zbadania mechanizmu przejścia śródbłonka rogówki na mezenchym. Ponadto wykorzystano model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować przejście śródbłonka rogówki i mezenchymów in vivo.

Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Tutaj prezentujemy protokół odłączania komórek śródbłonka rogówki (CEC) od błony Descemeta (DM) za pomocą lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) jako model choroby ex vivo dla keratopatii pęcherzowej (BK).

Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Ten protokół opisuje kluczowe kroki wymagane do założenia i wyhodowania hodowli komórek śródbłonka rogówki z eksplantatów tkanek ludzkich lub owczych. Przedstawiono również metodę subhodowli komórek śródbłonka rogówki na biomateriałach błoniastych.

Wzrost warstw komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec na błonach biomateriałowych

Ten protokół opisuje użycie nanoprzewodów krzemowych do wewnątrzkomórkowej optycznej biomodulacji komórki w prosty i łatwy do wykonania sposób. Technika ta jest wysoce elastyczna i może być stosowana zarówno do zastosowań in vitro, jak i in vivo.

Nanodruty krzemowe i stymulacja optyczna do badań wewnątrz- i międzykomórkowego sprzężenia elektrycznego

Protezy siatkówki mają zdolność generowania percepcji wzrokowej. Aby przyspieszyć rozwój nowych protez, potrzebne są metody ex vivo do testowania urządzeń przed implantacją. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej.

Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Poznaj metodę badania propagacji fal wapniowych w monowarstwach komórek śródbłonka rogówki bydła przy użyciu stymulacji mechanicznej i mikroskopii konfokalnej. Technika pozwala analizować komunikację międzykomórkową.

Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła (Wideo) | JoVE Journal

Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

Przeglądaj więcej filmów