Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest badanie komunikacji międzykomórkowej poprzez kanały połączeń szczelinowych oraz kanały HEMI poprzez kwantyfikację rozprzestrzeniania się międzykomórkowej fali wapniowej wywołanej stymulacją mechaniczną w monowarstwach pierwotnych komórek śródbłonkowych rogówki. Osiąga się to poprzez wyizolowanie w pierwszym kroku pierwotnych komórek śródbłonkowych rogówki ze świeżych byczych oczu. W drugim kroku, od dwóch do trzech dni po wysianiu na szkiełkach z komorami, konfluencyjną monowarstwę komórek obciąża się fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na wapń flu O 4:00 AM. Następnie przykładamy kontrolowany i zlokalizowany bodziec mechaniczny do jednej pojedynczej komórki monowarstwy, aby wywołać międzykomórkową falę wapniową, która jest wizualizowana przy użyciu mikroskopu konfokalnego.

Wyniki pokazują rozprzestrzenianie się międzykomórkowej fali wapniowej. Ostatecznie zastosowano inhibicję kanałów połączeń szczelinowych oraz hemikanałów, aby wyjaśnić właściwości i regulację różnych izoform koneksyn i paneksyn tworzących kanały połączeń szczelinowych oraz hemikanały. Główną zaletą indukcji międzykomórkowej propagacji fali wapniowej poprzez stymulację mechaniczną jest to, że zapewnia ona prostą i niezawodną metodę badania wkładu i właściwości kanałów łączących w sposób nieinwazyjny.

Ponadto metoda ta opiera się na fizjologicznych cząsteczkach sygnalizacyjnych i kaskadach obecnych w badanych systemach komórkowych. Wreszcie jest ona łatwo adaptowalna do różnych systemów komórkowych, w tym do komórek pierwotnych i modeli komórkowych ektopowo eksponujących określone izoformy koneksyn lub PanIN. Metody te mogą dostarczyć informacji na temat funkcji i dynamicznej regulacji kanałów połączeń szczelnych oraz hemikanałów opartych na koneksynach i PanIN poprzez zastosowanie wyciszania endogennych izoform koneksyn lub PanIN za pomocą siRNA oraz poprzez zastosowanie selektywnych inhibitorów kanałów połączeń szczelnych i hemikanałów.

System ten zdecydowanie nie ogranicza się wyłącznie do komórek nabłonka rogówki. Jest on dostosowany do praktycznie każdego typu komórek, a także do bardziej złożonych tkanek. W tej procedurze wykorzystuje się świeżo pobrane oko krowy w wieku nieprzekraczającym 18 miesięcy, pobrane nie później niż pięć minut po śmierci zwierzęcia.

Próbkę transportowano do laboratorium w zrównoważonym roztworze soli Earla oraz 1% roztworze jodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw przenieś oko do szalki Petriego o wymiarach 100 mm na 20 mm. Następnie opłucz oko za pomocą EBSS zawierającego 1% jodu.

Następnie wysterylizuj go roztworem zawierającym 70% etanol i od tego momentu pracuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ostrożnie wypreparuj rogówkę z oka i umieść ją w płytce Petriego o wymiarach 35 mm na 10 mm zawierającej EBSS, tak aby warstwa komórek nabłonkowych była skierowana do góry.

Ostrożnie usuń wszelką pozostałą tkankę tęczówki wciąż przylegającą do rogówki. W razie potrzeby przenieś rogówkę do innego naczynia z EBSS warstwą komórek śródbłonkowych skierowaną do góry, a następnie dwa razy wypłucz EBSS. Następnie umieść rogówkę warstwą śródbłonka skierowaną do góry w naczyniu typu klepsydra i przykryj pożywką wzrostową.

Aby wypłukać, usunąć medium za pomocą pipety ssącej. Nanieść 300 µL roztworu trypsyny o stężeniu 0,5 g/L na warstwę śródbłonka rogówki. Umieścić klepsydrę zawierającą rogówkę w przykrytej płytce Petriego i przenieść do inkubatora na 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

Po wyjęciu klepsydry, delikatnie zeskrobiono komórki śródbłonka z rogówki za pomocą wypalanej, haczykowatej pipety pasterowskiej wykonanej ze szkła. Odsączono roztwór zawierający komórki śródbłonka i dodano go do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm², zawierającej 4 mL pożywki hodowlanej. Następnie na rogówkę naniesiono 300 µL pożywki wzrostowej.

Powtórz proces skrobania i dodaj roztwór zawierający komórki śródbłonka do kolby hodowlanej. Powtórz ten krok jeszcze raz, a następnie umieść kolby hodowlane zawierające komórki śródbłonka rogówki w pożywce wzrostowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po dwóch dniach dodaj 6 mL pożywki hodowlanej i odnawiaj pożywkę wzrostową co drugi dzień.

Komórki powinny osiągnąć konfluencję w ciągu od siedmiu do 10 dni od izolacji do pasażu. Najpierw odessać medium hodowlane, a następnie dwukrotnie przepłukać EBSS. Następnie dodać do komórek dwa mililitry roztworu trypsyny i umieścić kolbę w inkubatorze na trzy do czterech minut.

Następnie należy dodać 12 ml pożywki hodowlanej i trzykrotnie przepłukać zawiesinę za pomocą pipety, aby rozproszyć komórki. Następnie należy policzyć komórki, używając hematocytometru lub automatycznego licznika komórek. Do dwóch szkiełek do hodowli z dołkami należy przenieść po 165 000 komórek.

Następnie przygotować kwadratowe kolby hodowlane o powierzchni 75 cm² do nowego pasażu przy gęstości 6 250 komórek na cm², dodać świeżą pożywkę hodowlaną do całkowitej objętości 25 ml i umieścić kolby oraz szkiełka do komór w inkubatorze. Pożywkę należy odświeżać co dwa dni; konfluencji warstwy komórkowej powinno się osiągnąć w ciągu trzech do czterech dni. Najpierw załadować komórki w szkiełku do komór z 10 µM Fluo-4 AM w roztworze soli fosforanowej (PBS) przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy delikatnym wstrząsaniu. Podczas inkubacji komórek z Fluo-4 AM, podłączyć szklaną mikropipetę o średnicy końcówki poniżej 1 µm do nanopozycjonera piezoelektrycznego i połączyć go z wzmacniaczem zamontowanym na mikromanipulatorze.

Ustaw napięcie nanopozycjonera w zakresie od 0.2 do 1.5 V. Usuń roztwór flu 4:00 AM. Następnie pięciokrotnie przemyj komórki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), a potem inkubuj komórki w PBS przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej przed wykonaniem pomiaru.

Wzbudź próbkę przy użyciu lasera argonowego o długości fali 488 nanometrów, stosując dzielnik wiązki HFT 48. Zbieraj emisję fluorescencji przy 530 nanometrach za pomocą filtru emisyjnego długoprzepustowego LP 5 0 5, z otworem pinhole ustawionym na minimum; w tym celu należy użyć obiektywu imersyjnego olejowego 40 x. Umieść szkiełko z komorą na stole mikroskopu konfokalnego i odnajdź obszar z konfluencją komórek.

Następnie przesuń mikromanipulator, aby ustawić szklaną mikropipetę tak, by dotykała błony komórkowej pod kątem 45 stopni. Obsługując mikromanipulator, należy krótko dotknąć szklaną mikropipetą mniej niż 1% błony pojedynczej komórki, wywołując jednosekundową stymulację mechaniczną komórki. Następnie zmierz zmiany przestrzenne w stężeniu jonów wapnia po stymulacji mechanicznej za pomocą mikroskopu konfokalnego, gromadząc i przechowując obrazy.

Na koniec, za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego, wyznacz wielokątny obszar zainteresowania (ROI), aby określić całkowitą powierzchnię komórek wykazujących odpowiedź. Przejściowe stężenia wapnia indukowane stymulacją mechaniczną w komórkach śródbłonka rogówki bydlęcej w warunkach kontrolnych przedstawiono w różnych punktach czasowych na reprezentatywnych obrazach fluorescencyjnych w pseudokolorach; intensywność fluorescencji przed stymulacją pokazano na pierwszym obrazie. Biała strzałka na drugim obrazie wskazuje komórkę poddaną stymulacji mechanicznej.

Fala wapniowa rozprzestrzenia się na sześć sąsiednich warstw komórek, a całkowita powierzchnia komórek objęta falą daje aktywny obszar o wielkości 62 870 µm². Wykres liniowy przedstawia przebieg czasowy znormalizowanej wartości fluorescencji lub NF w mechanicznie stymulowanej komórce oznaczonej jako ms oraz średnią wartość NF w sąsiednich warstwach komórek od jednej do pięciu, oznaczonych na wykresie jako MB 1 do MB 5. Obrazy te szczegółowo ukazują istotne zmiany w rozprzestrzenianiu się międzykomórkowych fal wapniowych po zastosowaniu egzogennych nukleotydów na wykresie po lewej oraz po zastosowaniu inhibitorów ektonukleotydazy na wykresie po prawej; dokładniej rzecz ujmując, wykres po lewej wykazuje znaczący spadek aktywnego obszaru po potraktowaniu bydlęcych komórek endotelialnych rogówki egzogennymi Aras Aase 6 i Aase 7, które hydrolizowały ATP i ADP, hamując tym samym perykrynną drogę komunikacji międzykomórkowej.

Gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,001 w obecności w porównaniu do braku ace. Wykres po prawej stronie pokazuje znaczący wzrost powierzchni aktywnej po potraktowaniu BCEC selektywnym inhibitorem nukleotydów zewnątrzkomórkowych, A RL 6 7 1 56, co wzmacnia ścieżkę komunikacji międzykomórkowej typu perykrynowego. Gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,001 w obecności w porównaniu do braku a RL po opanowaniu metody.

Przy prawidłowym przeprowadzeniu, technika ta zajmuje od pięciu do 10 minut dla jednego eksperymentu w jednym wariancie. Wykonanie całej serii doświadczeń umożliwiającej porównanie różnych warunków zajmuje jeden dzień w celu wyciągnięcia wniosków statystycznych. Należy zastosować niezależne eksperymenty przeprowadzone w różne dni i na różnych partiach izolowanych komórek.

Pomiar i kwantyfikacja propagacji wewnątrzkomórkowych fal wapniowych pozwalają na identyfikację i charakterystykę regulacji biologii komórki w odniesieniu do różnych izoform połączeń, takich jak kanały przestwokomórkowe (gap junctions) oraz hemikanały. Chciałbym również podkreślić, że metoda ta nie jest samodzielna, lecz powinna być uzupełniona o inne podejścia molekularne i funkcjonalne, począwszy od transferu barwników, poprzez pomiar uwalniania ATP, aż po elektrofizjologię.