Name: Multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Poznaj multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy. Ta metoda łączy bioluminescencyjne obrazowanie światła rozproszonego z mikro-CT, umożliwiając badaczom śledzenie dynamiki kolonizacji bakteryjnej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ośrodek obrazowania in vivo w Imperial College został sfinansowany przez MRC.

<ol><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547(2011).</li>
<li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li>
<li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+specificity%2C+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li>
<li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+a+%27hyperinfectious%27+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li>
<li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li>
<li>Collins, J. W., et al. Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCollins%2C+JW+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. , 10-1099 (2012).</li>
<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li>
<li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence%2C+expression%2C+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li>
<li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).</li>
<li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940(2012).</li>
<li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li>
<li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL%2F6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li>
<li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li>
<li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+the+Tir%3ANck+and+Tir%3AIRTKS%2FIRSp53+signalling+pathways+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li>
<li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22ContrastMedia+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li>
<li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li>
<li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice%3A+life+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol.+Relat.+Stud.+Phys.+Chem.+Med%22%5BJournal%5D)">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li>
<li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li>
</ol>

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu jest sponsorowany przez PerkinElmer.
Autorzy Kevin P, Francis, Jeff Meganck i Chaincy Kuo są pracownikami firmy Caliper- A PerkinElmer.
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Procedurach Naukowych dla Zwierząt z 1986 r. i zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję ds. Oceny Etyki.

Film 4D przedstawiający infekcję bakteryjną stanowi przydatne narzędzie do szybkiej i łatwej wizualizacji i interpretacji dużych ilości danych obrazowania multimodalnego. Technika ta ułatwia szczegółową analizę tego, w jaki sposób infekcja rozprzestrzenia się przez pojedynczą mysz i może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób delecja genów gospodarza lub bakterii lub określone strategie interwencyjne wpływają na obciążenie, dystrybucję i lokalizację bakterii podczas badania podłużnego7. Filmy te stanowią również użyteczne pomoce dydaktyczne i środki do rozpowszechniania informacji wśród społeczeństwa.
W tym protokole istnieje kilka krytycznych etapów, które mogą wpłynąć na jakość danych uzyskanych z obrazowania DLIT-μCT i możliwość skompilowania filmu 4D infekcji. Najważniejszą częścią tego protokołu jest udane i jednorodne zakażenie myszy C. rodentium. Istotne jest, aby myszy użyte do badania miały masę 18-20 g, a inokulum bakteryjne było świeżo przygotowane i zawierało około 5 x 109 jtk, jak opisano wcześniej2,3. Przed zakażeniem myszy ważne jest, aby sprawdzić, czy inokulum jest bioluminescencyjne za pomocą Spectrum CT, a po przygotowaniu inokulum musi być stale homogenizowane przed pobraniem każdej myszy, aby zapewnić, że myszy otrzymają podobne dawki zakaźne. Obrazowanie myszy za pomocą DLIT-μCT zostało zoptymalizowane w taki sposób, że funkcja automatycznej ekspozycji w oprogramowaniu Living Image 4.3.1 automatycznie określa zoptymalizowane parametry obrazowania, aby sygnał był znacznie powyżej szumu. Jednak funkcja automatycznej ekspozycji opiera się na ustawieniach i parametrach zdefiniowanych przez użytkownika, które należy zmodyfikować zgodnie z opisem w procedurze. Niezastosowanie się do tego spowoduje słabe obrazy z małą liczbą zebranych fotonów, które nie powodują oczywistego postępu infekcji, ponieważ fabryczne ustawienia Spectrum CT dla automatycznej ekspozycji są zaprogramowane do obrazowania guzów wykazujących ekspresję lucyferazy świetlika. Rekonstrukcje wykonane przy użyciu 560-620 nm dają najlepszą zgodność między danymi symulowanymi a zmierzonymi, a zatem są bardziej wiarygodnymi danymi, które można uwzględnić w rekonstrukcji.
Ograniczeniem stosowania DLIT-μCT jest to, że promieniowanie jonizujące ze skanu μCT powoduje subletalne uszkodzenia radiacyjne, które kumulują się w badaniu podłużnym18. Subletalna ekspozycja na promieniowanie może osłabić odpowiedź immunologiczną, spowodować uszkodzenie DNA i apoptozę w narządach wewnętrznych19. Ostatecznie, skumulowane subletalne uszkodzenia promieniowania mogą spowodować śmierć, jeśli LD50/30 dla promieniowania jonizującego zostanie przekroczone, które wynosi od 5 do 7 Gy w zależności od szczepu myszy i wieku użytych myszy18,20,21. Chociaż niektóre uszkodzenia molekularne spowodowane promieniowaniem jonizującym mogą się goić, ponieważ nadrzędną zasadą jest konserwatywne oszacowanie dawki, zwykle nie jest to uwzględniane w planowaniu badań. Zamiast tego celem jest pozostanie jak najdalej poniżej tych limitów, przy jednoczesnym osiągnięciu celów badania. Jest to szczególnie ważne w tym badaniu ze względu na normalną odpowiedź immunologiczną na infekcję, częstotliwość obrazowania oraz fakt, że zwierzęta transgeniczne, z układem odpornościowym lub silnie zakażone mogą być bardziej podatne na promieniowanie jonizujące.
Planując eksperyment w celu wygenerowania filmu 4D infekcji, ważne jest, aby wziąć pod uwagę długość eksperymentu, liczbę skanów μCT wymaganych w tym okresie oraz LD50/30 dla promieniowania jonizującego dla używanego szczepu myszy. Innym potencjalnym ograniczeniem DLIT-μCT jest siła ekspresji reporterowej w stosowanym szczepie bakteryjnym, ponieważ wpłynie to na limity wykrywalności bakterii i czas obrazowania. Zdecydowanie zaleca się, aby badacze używali zwalidowanych szczepów bakteryjnych, które są w pełni zjadliwe, ale zoptymalizowane pod kątem maksymalnej ekspresji operonu luksa , jak wykazano wcześniej dla BLI2,3.
Jednym z zastrzeżeń do obecnego projektu obrazowania 4D jest to, że każdy film składa się z indywidualnych skanów DLIT-μCT, które mają różne skalowanie fotonów. Może to sprawić, że obrazy będą trudne do interpretacji, jeśli zmiany w lokalizacji ognisk BL lub ich intensywności są subtelne lub jeśli występuje jedno intensywne ognisko BL otoczone wieloma słabymi ogniskami. Dlatego w przypadku wizualizacji podłużnych ważne jest, aby paski kolorów były spójne we wszystkich punktach czasu.
Koncepcja filmu 4D infekcji może być zastosowana do każdego odpowiednio oznakowanego patogenu bakteryjnego. Przyszły rozwój tej techniki będzie miał na celu wykorzystanie tomografii obrazowania fluorescencyjnego (FLIT) oraz DLIT w celu ułatwienia badania reakcji gospodarza na infekcję przy użyciu kombinacji bioluminescencyjnych patogenów bakteryjnych i wstrzykiwanych fluorescencyjnych sond bliskiej podczerwieni w celu zbadania odpowiedzi gospodarza na infekcję. Oprócz tego w tym protokole opisujemy tylko wykorzystanie bakterii bioluminescencyjnych do tworzenia filmów 4D infekcji. Jednak w niektórych przypadkach może być konieczne użycie bakterii znakowanych fluorescencyjnie, na przykład oznaczonych iRFP, aby reporter bioluminescencji mógł być wykorzystany do badania genetyki gospodarza podczas infekcji. Co ważne, zastosowanie obrazowania multimodalnego łączącego DLIT/FLIT-μCT pozwoli nam na nieinwazyjne badanie wielu parametrów podczas infekcji bakteryjnej, co znacząco przyczyni się do ograniczenia, udoskonalenia i zastąpienia wykorzystywania zwierząt w badaniach naukowych, zgodnie z założeniami inicjatywy NC3R (<a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a>).

Małe modele zwierzęce, w szczególności te wykorzystujące myszy, są rutynowo używane do badania patogenezy bakteryjnej lub testowania strategii interwencji w przypadku infekcji, takich jak antybiotyki, probiotyki, prebiotyki i szczepionki1-7. Głównymi odczytami doświadczalnymi z zakażeń małych zwierząt są obciążenie patogenem, przestrzenna i czasowa lokalizacja infekcji oraz zmiany w odpowiedzi immunologicznej zakażonego organizmu. Obrazowanie optyczne in vivo jest cennym narzędziem do badań nad chorobami zakaźnymi i może być wykorzystywane do monitorowania wielu odczytów eksperymentalnych poprzez wykorzystanie genów reporterowych (lucyferazy, białek fluorescencyjnych, beta-laktamazy itp.), barwników fluorescencyjnych, nanocząstek lub sond chemiluminescencyjnych ukierunkowanych na białko, proces biologiczny lub mikroorganizm6.
Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) to metoda obrazowania optycznego używana do monitorowania kolonizacji małych zwierząt, takich jak myszy i szczury, przez bakterie chorobotwórcze3,6,8,9. Myszy są zakażone rekombinowanymi bakteriami wyrażającymi lucyferazy, takimi jak operon luxCDABE z Photorhabdus luminescens. Bakterie te można następnie wykryć poprzez wytwarzanie światła za pomocą systemu obrazowania in vivo opartego na CCD3,6,9. Co ważne, tylko metabolicznie aktywne mikroorganizmy są bioluminescencyjne (BL), co oznacza, że za pomocą tej metodologii wykrywane są tylko żywotne komórki bakteryjne 10,11. Korzystając z 2D BLI, lokalizacja źródła BL jest wnioskowana na podstawie powierzchni zwierzęcia, w którym emitowany jest sygnał8. Dokładna lokalizacja anatomiczna ognisk BL in vivo musi zostać określona poprzez analizę ex vivo narządów3,6,9 W przeciwieństwie do tego, kompozytowa tomografia obrazowania 3D w świetle rozproszonym (DLIT) może być wykorzystana do skompilowania ilościowej rekonstrukcji 3D źródła BL12. DLIT jest wykonywany poprzez zbieranie obrazów BL wykonanych przy użyciu zdefiniowanych wąskopasmowych filtrów optycznych, a następnie wprowadzanie ich do algorytmu rekonstrukcji 3D rozproszonej tomografii optycznej1,7,12,13.
Obecnie, obrazowanie multimodalne jest jedyną dostępną metodologią, która pozwala uzyskać prawdziwą nieinwazyjną anatomiczną lokalizację ognisk bioluminescencyjnych in vivo bez potrzeby analizy ex vivo. Ostatnio zastosowaliśmy kombinację DLIT zarejestrowanego jednocześnie z obrazowaniem μCT w celu oceny dynamiki kolonizacji Citrobacter rodentium (C. rodentium) po profilaktycznym leczeniu bakterią probiotyczną7. C. rodentium jest mysim patogenem jelitowym stosowanym do modelowania zakażenia człowieka enteropatogennym i enterkrwotocznym Escherichia coli14. Zakażenie C. rodentium powoduje zapalenie jelita grubego, zwykle związane z łagodną utratą masy ciała, biegunką, spolaryzowaną odpowiedzią immunologiczną Th1 i wyraźnymi zmianami patologicznymi, w tym przerostem krypty okrężnicy oraz przyczepianiem i zacieraniem zmian14. Ponadto patogeneza C. rodentium została dokładnie przebadana przy użyciu BLI, a jej dynamika kolonizacji u myszy C57BL/6J jest dobrze udokumentowana, co czyni tę bakterię idealnym mikroorganizmem modelowym do stosowania w obrazowaniu multimodalnym3,4,7.
Ten protokół jest pierwszym, który przedstawia metodologię zintegrowanego obrazowania DLIT-μCT infekcji bakteryjnej przy użyciu pojedynczej platformy obrazowania multimodalności, IVIS Spectrum CT, oraz generowania filmu 4D pokazującego prawdziwą dynamikę tej infekcji w sposób nieinwazyjny.

<table><tbody><tr><td>Bioluminescencyjny C. rodentium</td><td>Frankel lab</td><td>ICC180</td><td>Wiles et al., 2004</td></tr><tr><td></td><td>Veet Boots</td><td></td><td>Optymalny czas depilacji to 7 min. Depilacja działa lepiej, jeśli krem jest dobrze wcierany.</td></tr><tr><td>Izofluoran (100% v/v)</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tlen medyczny</td><td>BOC Medyczna</td><td></td><td>butla rozmiaru F. <silny>Uwaga: </mocny> wymagany jest odpowiedni regulator.</td></tr><tr><td>Bulion Luria Bertani</td><td>Merck</td><td>1.10285.0500</td><td>25 g w 1L Woda demineralizowana.</td></tr><tr><td>Luria Bertani agar</td><td>Merck</td><td>1.10283.0500</td><td>37 g w 1L Woda demineralizowana.</td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Sigma (Fluka)</td><td>60615</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml Polipropylenowe stożkowe probówki Falcon</td><td>BD (Falcon)</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Universals</td><td>Corning (Gosselin)</td><td>E5633-063</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD (Plastipak)</td><td>300013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Doustna igła dozująca (16G x 75 mm) zakrzywiona</td><td>Vet Tech</td><td>DE005</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrobanki (kriowalne)</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>PL.170/Y</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suwmiarka CT IVIS Spectrum</td><td>- firma PerkinElmer</td><td>133577 Rev A/ Spectrum CT&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Suwmiarka UPS 6kVA</td><td>- firma</td><td></td> PerkinElmer<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>System anestezjologiczny XGI-8</td><td>Caliper- firma PerkinElmer</td><td>118918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>XAF-8 Suwmiarka z filtrem anestezjologicznym</td> - <td>firma PerkinElmer</td><td>118999/00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Żywy obraz v4.3.1 SP1</td><td>Caliper- a PerkinElmer Company</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inkubator laboratoryjny</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 44</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"> </td></tr></tbody></table>

multimodalne obrazowanie 4d zakażeń citrobacter rodentium u myszy

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Ten protokół przedstawia kroki wymagane do długotrwałego monitorowania bioluminescencyjnej infekcji bakteryjnej za pomocą kompozytowej tomografii 3D w świetle rozproszonym ze zintegrowanym μCT (DLIT-μCT) i późniejszego wykorzystania tych danych do wygenerowania czterowymiarowego (4D) filmu cyklu infekcji. Aby opracować filmy o infekcjach 4D i zwalidować obrazowanie DLIT-μCT do badań nad infekcjami bakteryjnymi za pomocą tomografii komputerowej IVIS Spectrum, zastosowaliśmy zakażenie bioluminescencyjnym C. rodentium, które powoduje samoograniczające się zapalenie jelita grubego u myszy. W tym protokole przedstawiamy zakażenie myszy bioluminescencyjnym C. rodentium i nieinwazyjne monitorowanie kolonizacji za pomocą codziennego obrazowania DLIT-μCT i liczenia bakterii z kału przez 8 dni.
Użycie IVIS Spectrum CT ułatwia bezproblemową korejestrację skanów optycznych i μCT przy użyciu jednej platformy obrazowania. Metoda μCT o niskiej dawce umożliwia obrazowanie myszy w wielu punktach czasowych podczas infekcji, zapewniając szczegółową anatomiczną lokalizację bioluminescencyjnych ognisk bakteryjnych w 3D bez powodowania artefaktów z powodu skumulowanego promieniowania. Co ważne, filmy 4D z zakażonymi myszami stanowią potężne narzędzie analityczne do monitorowania dynamiki kolonizacji bakteryjnej in vivo.

Zakażenie myszy C57BL/6J dawką 5 x 109 cfu C. rodentium jest dobrze opisanym modelem infekcji bakteryjnej, która prowadzi do samoograniczającego się zakażenia przewodu pokarmowego, osiągającego szczyt między 6. a 8. dniem po zakażeniu i trwającego od 3 do 4 tygodni2,14. Zakażenie jest ograniczone do światła jelita przez mysi układ odpornościowy, w konsekwencji czego bakterie są stale wydalane z kałem. Kolonizację myszy przez C. rodentium można monitorować nieinwazyjnie poprzez bezpośrednie zliczanie bakterii z kału lub za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego 2,3.
Niniejszy manuskrypt opisuje zoptymalizowany protokół obrazowania multimodalnego 3D i 4D C. rodentium u myszy w celu monitorowania ładunku bakteryjnego i lokalizacji podczas infekcji. Wyniki przedstawione na Ryc. 1 demonstrują kontrole niezbędne do prawidłowego obrazowania 4D. Przed zainfekowaniem myszy konieczne jest upewnienie się, że zastosowany inokulum bakteryjny jest bioluminescencyjny (Ryc. 1A) oraz że po podaniu bioluminescencyjnego C. rodentium przez zgłębnik dożołądkowy sygnał jest obserwowalny w żołądku zwierzęcia, a nie w płucach (Ryc. 1B)16.
Oprócz monitorowania kolonizacji bakteryjnej za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, dobrą praktyką jest ilościowe oznaczenie liczby bakterii w kałach, co służy jako pośredni pomiar kolonizacji błony śluzowej przewodu pokarmowego przez bakterie. Rycina 2 przedstawia typowe obciążenie bakteryjne w kałach pobranych od 8 myszy C57BL6/J, które zostały zainfekowane dawką ~5 x 109 cfu ICC180 i monitorowane przez 8 dni P.I. Kolonizacja wzrasta od 2. dnia P.I. aż do 6-7. dnia, kiedy infekcja osiąga szczyt na poziomie ~5 x 1010 cfu/g, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami2,3,17.
Aby podkreślić znaczenie oceny rozprzestrzeniania się infekcji u pojedynczej myszy, Rysunki 1b i 3 oraz Wideo 1 zostały przygotowane na podstawie tej samej myszy po zakażeniu C. rodentium, zgodnie z powyższym opisem. Codziennie przeprowadzano DLIT-μCT w celu oceny przestrzennego rozkładu bakterii bioluminescencyjnych u tej myszy, wykorzystując szkielet jako punkt odniesienia anatomicznego. Rysunek 3 przedstawia rekonstrukcję DLIT-μCT myszy C57BL/6J zakażonej szczepem ICC180 w trzech kluczowych punktach czasowych po zakażeniu (P.I.). W 3. dniu P.I. w okrężnicy można zaobserwować niewielkie ogniska bioluminescencyjne, które do 5. dnia P.I. wykazują umiarkowany wzrost intensywności bioluminescencji przy niewielkich zmianach w rozkładzie przestrzennym. W 7. dniu P.I. zaobserwowano znaczny wzrost bioluminescencji, a ogniska bioluminescencyjne rozprzestrzeniły się na całą okrężnicę.
Wideo 1 stanowi kompilację rekonstrukcji 3D DLIT- μCT z dni 1–8 p.i. z użyciem ICC180 i ilustruje obecność C. rodentium w bliższym odcinku przewodu pokarmowego między 1. a 2. dniem p.i., a następnie rozprzestrzenianie się bakterii do okrężnicy w 3. dniu p.i. Od 4. do 6. dnia p.i. liczba bakterii w okrężnicy wzrasta, osiągając szczyt w 7. dniu p.i., kiedy ogniska bakteryjne obejmują całą okrężnicę. W 8. dniu p.i. w bliższym i dalszym odcinku okrężnicy obecne są tylko dwa wyraźne ogniska bakteryjne. Możliwość przeglądania pełnej rekonstrukcji 3D dla każdego punktu czasowego w kolejności chronologicznej stanowi potężne narzędzie do analizy interakcji między gospodarzem a patogenem i jest łatwiejsza w interpretacji niż statyczny obraz 3D z tego samego zestawu danych.
<img alt="Obrazowanie bioluminescencyjne; A: Probówka; B: Mysz; Skala kolorów wskazująca poziomy promieniowania; Wyniki eksperymentu." src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Dwuwymiarowe obrazowanie bioluminescencyjne A) inokulum bioluminescencyjnego C. rodentium ICC180 oraz B) myszy po podaniu doustnym 200 μl inokulum. Grot strzałki (&gt;) wskazuje bioluminescencyjne C. rodentium w żołądku.
<img alt="Wykres wzrostu kolonizacji bakteryjnej, skala logarytmiczna CFU, analiza danych w dniach po infekcji." src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2">
Rysunek 2. Dynamika kolonizacji przez C. rodentium. Ilościowe oznaczenie jednostek tworzących kolonie C. rodentium w kale przez 8 dni po zakażeniu.
<img alt="Obrazowanie spektroskopowe gryzonia pokazujące śledzenie iniekcji hydrożelu w czasie, wykres analizy." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Tomografia obrazowania światła rozproszonego-skan μCT zakażenia bioluminescencyjnym C. rodentium u jednej myszy monitorowanej w 3., 5. i 7. dniu po zakażeniu (P.I.). Grot strzałki (&gt;) ilustruje kolonizację okrężnicy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycina</a>.
Wideo 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.</a> Film 4D z infekcji C. rodentium u jednej myszy monitorowanej od dnia 1. do 8. p.i.

Obrazowanie multimodalne jest cennym podejściem do badania kolonizacji bakteryjnej w małych modelach zwierzęcych. Protokół ten przedstawia zakażenie myszy bioluminescencyjnym Citrobacter rodentium i podłużne monitorowanie kolonizacji bakteryjnej za pomocą kompozytowej tomografii obrazowania 3D w świetle rozproszonym z obrazowaniem μCT w celu stworzenia filmu 4D infekcji C. rodentium.

Multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie cyklu infekcji zero DUM przy użyciu kompozycyjnej tomografii obrazowania światła rozproszonego z zintegrowanym mikro-CT, aby stworzyć czterowymiarowy film z przebiegu infekcji. Jest to realizowane poprzez przygotowanie bioluminescencyjnego inokulum bakteryjnego, a w drugim kroku procedury następuje zakażenie myszy poprzez zgastrykowanie zero dunum.Następnie zainfekowane myszy są codziennie obrazowane przy użyciu mikro-CT D, a końcowymi etapami są rekonstrukcja trójwymiarowych danych z mikro-CT D oraz ich zestawienie w formie filmu 4D z cyklu infekcji. Ostatecznie wyniki mogą wykazać zmiany w rozkładzie i lokalizacji ładunku bakteryjnego dzięki obrazowaniu multimodalnemu 4D zainfekowanych myszy. Dr James Collins.Podoktorant z mojego laboratorium zaprezentuje dzisiaj tę procedurę. Późnym popołudniem, w dniu poprzedzającym infekcję, należy wyłożyć z zamrażarki krioprobówkę szczepu IC 180 Pseudomonas aeruginosa w celu rozmrożenia. Po rozmrożeniu przenieść jedno krioziarno bakterii do 15 ml LB z kanamycyną, a następnie inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 220 RPM. Równocześnie należy inkubować 15 ml niezaszczepionego LB jako kontrolę pod kątem zanieczyszczenia medium do następnego ranka.Jeśli kontrola zaszczepiona UN nie jest mętna, przenieś zaszczepioną kulturę do probówki o pojemności 50 ml i odwiruj ją z prędkością 4 000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Rozpuść osad w objętości PBS i powtórz wirowanie. Następnie dokładnie resuspenduj komórki w 1,5 ml PBS, aby przygotować inokulum bakteryjne. Aby zweryfikować bioluminescencję kultury ICC 180 oraz oszacować liczbę bakterii, wykonaj obrazowanie kultury w spektrum ivus CT, wykorzystując obrazowanie bioluminescencji z otwartym filtrem oraz ustawienie auto w programie Living Image 4.3 0.1 wizard.Zostało to opisane szczegółowo w wcześniej opublikowanym filmie. Aby zademonstrować zakażanie myszy bioluminescencyjnymi gryzoniami, zakażymy jedną mysz, a drugą wykorzystamy do infekcji pozorowanej z użyciem PBS. Przed przeprowadzeniem zakażenia znieczul mysz 3% isof fluorine za pomocą systemu anestezji XGI eight, aby zapewnić humanitarne unieruchomienie do czasu pełnego zadziałania znieczulenia.Wymieszaj inokulum bakteryjne i pobierz do strzykawki do gavage'u doustnego określoną liczbę bakterii w 0,2 ml. Następnie złap pierwszą mysz przeznaczoną do zakażenia, mocno chwytając ją za kark. Należy pamiętać, że przed obrazowaniem myszy zostały poddane depilacji przy użyciu kremu depilacyjnego, zgodnie z opisem w artykule tekstowym; wprowadź igłę w kierunku podniebienia, nad językiem, w dół przełyku i wstrzyknij inokulum bakteryjne do żołądka.W przypadku wystąpienia oporu nie należy wprowadzać igły na siłę, ponieważ spowoduje to podanie inokulum do płuc; należy wówczas delikatnie ponownie wprowadzić igłę. Następnie, jeśli mysz ma trudności z oddychaniem lub poruszaniem się, należy ją poddać eutanazji w ramach grupy infekcji pozorowanej. W celu potwierdzenia prawidłowego wykonania zgłębnika podaj myszy 0,2 milliliters PBS.Wykonaj obrazowanie myszy w spektrum IVIS za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego z otwartym filtrem, korzystając z ustawienia automatycznego w systemie Living Image. Zgodnie z opisem w sekcji 4.3 0.1 kreatora obrazowania, system Delight micro CT obejmuje optyczne obrazowanie Delight zintegrowane z mikrotomografią komputerową (micro CT) o niskiej dawce promieniowania. Ponieważ dawka kumuluje się w organizmach zwierząt podczas każdej sesji obrazowania, dążymy do utrzymania jej na możliwie najniższym, rozsądnym poziomie.Ze względu na te obawy, myszy należy uśmiercić przy pierwszych oznakach szkodliwych objawów lub po zakończeniu okresu obrazowania mikro-CT. W tym badaniu należy zoptymalizować parametry funkcji automatycznej ekspozycji w programie Living Image 4.3 0.1 w celu obrazowania lucyferazy bakteryjnej in vivo. Najpierw wybierz Edit, następnie Preferences, potem Acquisition, a następnie Auto Exposure Window.Następnie należy wybrać wartości zakresu, a potem czas eksperymentu w sekundach i ustawić wartość maksymalną na 300 sekund. Na koniec należy wybrać minimalną liczbę zliczeń celu, a następnie luminescencję i ustawić tę wartość na 10 000 zliczeń. Po zakończeniu tych czynności system został zainicjowany, znieczulenie przygotowane, a blokady bezpieczeństwa aparatury rentgenowskiej sprawdzone.Przystąp do znieczulenia myszy. Użyj systemu znieczulania XGI eight z przepływem tlenu wynoszącym 2 l/min oraz 3% izofluranu. Gdy mysz będzie gotowa do obrazowania, otwórz kreator obrazowania w oprogramowaniu.Narzędzie to automatycznie optymalizuje kilka parametrów, aby zapewnić jak najlepszy stosunek sygnału do szumu dla każdego wybranego filtra emisji. Gdy kreator obrazowania o to poprosi, należy dołączyć filtry emisji 565, 686, 800 i 620 nm. Następnie upewnij się, że wybrany jest skan micro CT myszy, i kliknij acquire, aby rozpocząć obrazowanie.Po umieszczeniu znieczulonej myszy z powrotem w klatce, należy wyjąć platformę obrazującą jedną mysz z systemu spectrum CT i zdezynfekować platformę dla zwierząt przy użyciu 1% tri gene. Uwaga: jeśli platforma dla zwierząt jest silnie zabrudzona, piankową podkładkę można wymienić. Obrazowanie myszy należy kontynuować codziennie do ośmiu dni po infekcji, aby uzyskać podłużne dane obrazowe.Dłuższe okresy badania zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia artefaktów wynikających z kumulatywnej ekspozycji na promieniowanie. Aby uzyskać wysokiej jakości, powtarzalne rekonstrukcje mikro-CT w trzech poziomach dawki (DD), wymagane jest wykonanie kilku kroków. Po pierwsze, otwórz oprogramowanie Living Image, wersję 4.3 0.1, i wybierz opcję Browse (Przeglądaj) w oknie przeglądania.Otwórz folder zawierający pliki mikro-CT delight, klikając przycisk load. Otwórz plik mikro-CT DLI w przeglądarce obrazów żywych. Na przykład: zobacz deum w siódmym dniu po zakażeniu.W palecie narzędzi wybierz topografię powierzchni (surface topography), a następnie mysz naga (nude mouse). Dostosuj próg, a następnie kliknij generuj powierzchnię (generate surface). Jeśli rekonstrukcja powierzchni przebiegnie pomyślnie, w oknie widoku 3D wyświetli się obrys powierzchni.Aby wyświetlić przetworzony skan mikro-CT w oknie widoku 3D, należy ukryć obrys powierzchni lub zmniejszyć jej nieprzezroczystość. Obie opcje są dostępne po uprzednim wybraniu narzędzi optycznych 3D (3D optical tools). Następnie należy odznaczyć opcję wyświetlania obiektu powierzchniowego (display surface object) lub dostosować suwak nieprzezroczystości, aby uzyskać szczegółową lokalizację anatomiczną rekonstrukcji trzech źródeł światła DD.W odniesieniu do szkieletu zwierzęcia, zmień trójwymiarowe dane wolumetryczne. Aby wyświetlić szkielet z optymalnym kontrastem, kliknij narzędzia 3D multimodality i przesuń suwak histogramu w prawo, aż wyraźnie widoczne będą tylko kości. Następnie, jeśli nie zostały jeszcze wybrane, kliknij logarithmic histogram, reverse coloring gradient, illumination quality oraz de-noise.W razie potrzeby przytnij obraz, aby usunąć niepożądane struktury z rekonstrukcji 3D; z palety narzędzi wybierz rekonstrukcję 3D D light. Upewnij się, że wybrane są jedynie filtry 565, 860 oraz 620 nm. Następnie kliknij start.Otwiera to okno podglądu danych z sygnałami bioluminescencji filtrowanymi spektralnie z myszy obrazowanej w 2D. Sygnały te są automatycznie progowane przez oprogramowanie, ale w razie potrzeby można je dostosować ręcznie za pomocą kart u dołu menu. Próg określa minimalną intensywność danych, która zostanie uwzględniona jako dane w rekonstrukcji.Następnie z palety narzędzi wybierz opcję rekonstrukcji 3D D light micro CT i sprawdź właściwości optyczne. Po kliknięciu karty właściwości (properties), właściwości tkanki powinny być ustawione na tkankę myszy (mouse tissue), a widmo źródła na bakterie (bacteria). Teraz kliknij przycisk rekonstruuj (reconstruct), aby przeprowadzić rekonstrukcję D light.Rzeczywista lokalizacja sygnału świetlnego D, zaznaczona czerwonym okręgiem, znajduje się w obrębie obręczy miednicznej. Jest to łatwiejsze do zinterpretowania podczas obrotu obrazu w filmie. Aby wygenerować trójwymiarowy film micro CT dla DLI, przejdź do menu narzędzi, wybierz wstępnie zdefiniowane animacje 3D, oś przeciwną do ruchu wskazówek zegara, a następnie całkowity czas trwania.Ustaw tę wartość na 10 sekund lub 25 klatek na sekundę. Po prawidłowym skonfigurowaniu ustawień animacji 3D należy nacisnąć przycisk nagrywania i zapisać rekonstrukcje 3D z mikrotomografii komputerowej DLI jako pliki VI. Kluczowe jest wykonanie tych rekonstrukcji przy użyciu identycznych ustawień, aby były one porównywalne.Ważne jest również, aby przygotować filmy z taką samą liczbą klatek na sekundę oraz całkowitym czasem trwania. W przeciwnym razie synchronizacja 40 filmów nie będzie jednorodna. Na komputerze otwórz program Windows Live Movie Maker i utwórz nowy plik.Wstaw rekonstrukcje mikro-tomografii komputerowej (micro CT) DLI w kolejności chronologicznej, zaczynając od pierwszego dnia po zakażeniu. Używając karty narzędzi, dodaj podpisy na początku każdego filmu, wybierając odpowiedni film, następnie zakładkę główną i opcję dodaj podpis. Tekst w podpisie można sformatować za pomocą paska narzędzi, a położenie podpisu jest regulowane.Teraz dodaj stronę tytułową, klikając Home, a następnie Title. Wpisz tytuł w polu tekstowym, korzystając z paska narzędzi do formatowania tekstu. Następnie zapisz projekt jako plik MMP.Jest to niezbędne, jeśli chcesz wprowadzić poprawki do filmu. Na koniec zapisz film jako plik WMV z menu programu do tworzenia filmów, wybierając opcję „zapisz film”; cztery komputerowe opcje sterowania są kluczowe dla zachowania prawidłowej techniki. Przed zakażeniem myszy upewniono się, że użyty inokulum bakteryjne jest bioluminescencyjne.Po podaniu doustnym bioluminescencyjnych gryzoni, sprawdzono, czy sygnał jest widoczny w żołądku zwierzęcia (oznaczonym białą grotą strzałki) oraz czy nie występuje w płucach. Ta sama mysz zostanie przedstawiona w kolejnych przykładach indywidualnej infekcji. Zero denture jest patogenem zewnątrzkomórkowym, który podczas zaprezentowanej infekcji pozostaje ograniczony do światła jelita.W ten sposób są one wydalane z kałem, który został poddany analizie, wykazując, że kolonizacja wzrasta od drugiego do szóstego lub siódmego dnia, kiedy to infekcja osiąga codzienne maksimum. Do oceny przestrzennego rozkładu bakterii bioluminescencyjnych u tej myszy, z wykorzystaniem szkieletu jako punktu odniesienia anatomicznego, zastosowano mikro-tomografię komputerową (CT) w świetle widzialnym. W trzecim dniu po infekcji w jelicie grubym zaobserwowano małe ogniska bioluminescencji, wskazane niebieską strzałką.Ogniska te wykazywały umiarkowany wzrost intensywności bioluminescencji w piątym dniu po zakażeniu; przy niewielkich zmianach w rozkładzie przestrzennym w siódmym dniu po zakażeniu odnotowano znaczny wzrost bioluminescencji, a bioluminescencyjne ogniska rozprzestrzeniły się na cały okrężnicę. Trzy rekonstrukcje mikro-CT DD z dni od pierwszego do ósmego po zakażeniu ilustrują rozprzestrzenianie się infekcji sero deum. Infekcja bakteryjna rozpoczyna się jako wyraźne ogniska w proksymalnym odcinku przewodu pokarmowego.W trzecim dniu infekcja rozprzestrzenia się na jelito grube. W ciągu kolejnych kilku dni ogniska infekcji rozszerzają się dalej, zwiększając swój rozmiar i liczbę. Infekcja osiąga szczyt w siódmym dniu.Następnie w ósmym dniu kolonie zredukowały się do dwóch odrębnych ognisk bakteryjnych w bliższym i dalszym odcinku okrężnicy. Technologia ta umożliwi badaczom analizę mechanizmów kolonizacji bakteryjnej i infekcji w czasie rzeczywistym oraz zbadanie skuteczności strategii interwencyjnych.

4d-multimodality-imaging-of-citrobacter-rodentium-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

4D Wielomodalne Obrazowanie Zakażeń Citrobacter rodentium U Myszy

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Źródło: Valentine, M. E. i in., Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa oraz testowanie tłumienia zjadliwości w prostym modelu infekcji myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje zastosowanie podejścia obrazowania opartego na bioluminescencji do monitorowania zakażenia bakteryjnego w modelu żywej myszy. Sekwencyjne obrazowanie bioluminescencyjne i rentgenowskie umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym oraz anatomiczną lokalizację infekcji rozprzestrzeniającej...

Obrazowanie w czasie rzeczywistym infekcji bakteryjnej w modelu myszy z użyciem bioluminescencji

Źródło: Luyts, N. i inni. Podłużna kontrola infekcji dróg moczowych i ich leczenia u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencji. J. Vis. Exp. (2021).Ten film pokazuje indukcję i śledzenie infekcji dróg moczowych w modelu mysim z wykorzystaniem bioluminescencyjnego E. coli wstrzykniętego do pęcherza, gdzie zachodzi adhezja, inwazja i replikacja wewnątrzkomórkowa bakterii. Światło emitowane z bioluminescencyjnego operonu służy jako wskaźnik w czasie rzeczywistym obciążenia bakteryjnego podczas...

Wizualizacja infekcji dróg moczowych w modelu myszy z wykorzystaniem bioluminescencji

Zakażenie gryzoniami Citrobacter stanowi cenny model do badania infekcji bakteryjnych jelit, jak również odpowiedzi immunologicznych gospodarza i zapalenia jelita grubego u myszy. Protokół ten określa pomiar integralności bariery, obciążenia patogenem i uszkodzeń histologicznych, co pozwala na dokładne scharakteryzowanie udziału patogenu i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego u myszy.

Mysi model Citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego

Ten protokół przedstawia mysi model zakażenia Clostridium difficile (CDI) cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu, R20291. Nacisk na kliniczne monitorowanie choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w całym CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole.

Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Opisujemy obrazowanie optyczne myszy zakażonych Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) za pomocą fluorescencji enzymu reporterowego (REF). Protokół ten ułatwia czułe i swoiste wykrywanie M. tuberculosis w przedklinicznych modelach zwierzęcych do celów patogenezy, terapii i badań nad szczepionkami.

Obrazowanie Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy. Ta metoda łączy bioluminescencyjne obrazowanie światła rozproszonego z mikro-CT, umożliwiając badaczom śledzenie dynamiki kolonizacji bakteryjnej w czasie rzeczywistym.

Multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy

Przeglądaj więcej filmów