Name: Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Poznaj metodę transdukcji adenowirusowej naiwnych limfocytów T CD4 w celu badania różnicowania komórek Treg. Technika umożliwia przejściową ekspresję genów bez wpływu na żywotność komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Lirui Du za skonstruowanie wektora pCAGAdDU oraz Oliverowi Gorce za dostarczenie protokołu fiksacji.

1. Klonowanie interesującego genu do wektora wejściowego
<ol>
	<li>Sklonuj interesujący nas gen do wektora wejściowego. W tej procedurze można zastosować amplifikację genu metodą PCR, a następnie ligację końców do wektora sprzężonego z topoizomerazą (np. pENTR/D-TOPO) lub klonowanie za pośrednictwem enzymu restrykcyjnego.</li>
</ol>
2. Przenoszenie interesującego genu do wektora docelowego pCAGAdDu
<ol>
	<li>Przenieś interesujący nas gen z wektora wejściowego do wektora docelowego za pomocą rekombinacji LR (np. Gateway LR Clonase II Enzyme Mix). Spowoduje to utworzenie wektora ekspresji adenowirusa (ryc. 1).</li>
	<li>Linearyzuje 10 μg adenowirusowego wektora ekspresyjnego w trawieniu restrykcyjnym PacI, wytrąca DNA i ponownie zawiesza je w wodzie w stężeniu 3 μg na 100 μl. Linearyzacja uwalnia odwrócone powtórzenia wirusa (ITR), które są wymagane do replikacji i enkapsydacji wirusowego DNA w cząsteczki wirusa.</li>
</ol>
3. Generacja pierwotnego lizatu wirusa
<ol>
	<li>Zasiać 1 x 105 HEK293A komórek w 2 ml pożywki do hodowli komórkowych (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) w jednym dołku na 6-dołkowej płytce i inkubować komórki przez 6-14 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 10% CO2 , aby mogły przylegać. Komórki powinny wtedy znajdować się w około 50% zbieżności.</li>
	<li>Lipofekcja: Przenieść 6 μl odczynnika jetPEI do 94 μl 50 μM NaCl, krótko odwirować. Dodaj zmieszany roztwór do 100 μl zlinearyzowanego wektora adenowirusowego podczas wirowania i inkubuj tę mieszankę transfekcyjną przez 15 - 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Wykonaj wszystkie poniższe kroki w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa biologicznego dla infekcji adenowirusem!
<ol start="3">
	<li>Dozować roztwór kroplami do studzienki zawierającej HEK293A komórki i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 10% CO2 . W przypadku korzystania z markera fluorescencyjnego należy ocenić wizualnie skuteczność transfekcji po 12 - 36 godzinach za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Dodawać 0,5 ml świeżej pożywki co 3 dni.</li>
	<li>Sprawdzaj co 2-3 dni pod mikroskopem świetlnym lub fluorescencyjnym pod kątem efektów cytopatycznych (CPE), czyli obszarów z powiększonymi i zaokrąglonymi komórkami, które zaczynają się odklejać. Świadczy to o efektywnym generowaniu wirusów. Po wystąpieniu szerszych stref CPE (ryc. 3), minie od 24 do 72 godzin, zanim wszystkie komórki zostaną zainfekowane.</li>
	<li>Gdy wszystkie komórki wykazują oznaki CPE, ale przed całkowitym oderwaniem komórek, należy je delikatnie pipetować i przenieść komórki z supernatantem (SN, 3 - 5 ml) do probówki z polistyrenu o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Zamrozić komórki w SN na suchym lodzie przez 15 - 20 minut, a następnie szybko je rozmrozić w temperaturze 37 °C, aby rozerwać komórki. Powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania (F/TC) jeszcze dwa razy. Pierwotny lizat wirusa należy przechowywać na lodzie do wykorzystania w ciągu jednego dnia lub zamrozić w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Każdy dodatkowy F/TC zmniejszy miano wirusa o 30 - 50%.</li>
</ol>
4. Amplifikacja wirusa
<ol>
	<li>Wysiewaj i hoduj HEK293A komórki do 90% zbiegu na 14 cm naczyniu do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Zainfekuj komórki połową lizatu wirusa pierwotnego (1,5 - 2,5 ml) i inkubuj komórki przez co najmniej 36 godzin. Następnie należy zainfekować prawie wszystkie komórki, co można określić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W celu ponownej amplifikacji już amplifikowanego (tj. bardziej skoncentrowanego) szczepu wirusa, należy zainfekować HEK293A przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 50 (patrz 6.3).</li>
	<li>Komórki powinny być zbierane, gdy wszystkie wykazują CPE, ale przed oderwaniem. Przy wydajnej produkcji wirusa stan ten osiąga się w ciągu 48 godzin po zakażeniu. (Jeśli trwa to do jednego tygodnia, należy rozważyć kolejną rundę amplifikacji poprzez zwiększenie ilości adenowirusa używanego do infekcji opisanej w 4.2.)</li>
	<li>Odłączyć komórki za pomocą delikatnego pipetowania i przenieść komórki oraz SN do probówki polistyrenowej o pojemności 50 ml. Wirować komórki w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć SN i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki lub SN (ok. 1 ml).</li>
	<li>Wykonać 3 F/TC, aby rozbić komórki i odwirować przy 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zdjąć SN zawierający cząstki wirusa (tj. skoncentrowany lizat wirusa) i poddzielić podwielokrotność lizatu wirusa w celu przechowania go w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Wyznaczanie miana wirusa
<ol>
	<li>Zasiać 105 komórek A549 w każdym dołku w 5 dołkach 12-dołkowej płytki w 1 ml pożywki i pozostawić komórki do przylegania przez 6 godzin.</li>
	<li>Użyć 1 μl skoncentrowanego adenowirusa (rozmrożonego na lodzie) do wykonania seryjnego rozcieńczenia w pożywce (1:5 000, 1:10 000, 1:50 000, 1:100 000) i dodać 10 μl do dołka. Pozostaw jedną studzienkę niezainfekowaną, aby wyregulować bramkowanie w cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Po 36 godzinach zdjąć SN, przemyć PBS i odłączyć komórki (np. przez trypsynizację). Ze względu na zagrożenie biologiczne zaleca się utrwalenie komórek w 100 μl 4% paraformaldehydu w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej i jednorazowe przemycie PBS.</li>
	<li>Wykonaj analizę FACS ekspresji markera infekcji. Wykres "Zastosowany μl lizatu wirusowego" w stosunku do bezwzględnej liczby zakażonych komórek (ryc. 4). Określić liniowy zakres infekcji i obliczyć miano na ml nierozcieńczonego wirusa z krzywej wzorcowej w zakresie liniowym, przyjmując x = 1 000 μl.</li>
</ol>
6. Zakażenie limfocytami T
<ol>
	<li>Wyizolować naiwne/spoczynkowe limfocyty T CD4 z DO11.10 tg; Myszy CARΔ1 tg przy użyciu sortowania MACS (Naive CD4 + T Cell Isolation Kit II) lub sortowania FACS (CD4 + CD25- CD62L + CD44-).</li>
	<li>W przypadku eksperymentów na małą skalę należy odpipetować odpowiednią objętość lizatu wirusowego, aby osiągnąć MOI 50 do jednego dołka 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.</li>
	<li>Dodać do 4 x 105 limfocytów T w końcowej objętości infekcji 50 μl w pożywce z komórek T (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyrugronian, 1x NEAA, 1x Witamina MEM Essential, 1x L-glutamina, 1:250 000 Merkaptoetanol, 10 mM HEPES). 
	Przykład: 
	Do zakażenia limfocytów T 3 x 105 stosuje się MOI wynoszący 50; Miano wirusa wynosi 3 x 109 ml-1 
	Objętość wirusa = MOI x liczba limfocytów T / miano wirusa = 50 x (3 x 105) / (3 x 109 ml-1) = 0,005 ml</li>
</ol>
Uwaga: dla infekcji większą liczbą komórek, zwiększ skalę za pomocą MOI 50 w objętości infekcji 165 μl na 106 naiwnych limfocytów T w probówce z polistyrenu z luźnym kubkiem (do 3 ml na probówkę).
<ol start="4">
	<li>Inkubować komórki przez 90 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zdjąć SN, ponownie zawiesić w 200 μl PBS. Ponownie odwirować i zdjąć SN.</li>
</ol>
(Opcjonalnie: komórki mogą być ponownie umyte, aby skuteczniej usunąć wirusa)
<ol start="6">
	<li>Zawiesić komórki w pożywce z 200 μl limfocytów T bez stymulacji przeciwciał i bez IL-2 lub innych cytokin, a następnie odpoczywać przez 40 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 , aby umożliwić ekspresję interesującego genu przed aktywacją.</li>
</ol>
7. Aktywacja i polaryzacja limfocytów T
<ol>
	<li>Odpipetować objętość kulek sprzężonych z anty-CD3 i anty-CD28, która jest równa liczbie komórek (np. 4 x 105) do małego kubka na odczynnik, dodać 10-krotną objętość PBS i umieścić je na magnesie na 2 minuty. Zdjąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w pożywce polaryzującej o objętości 200 μl (dla Treg: pożywka z limfocytów T + 1 ng/ml TGFβ, 100 U/ml IL-2).</li>
 </ol>
	Uwaga: Komórki mogą być również aktywowane za pomocą naczyń do hodowli tkankowych pokrytych przeciwciałami anty-CD28 i anty-CD3, lub w sposób specyficzny dla receptora limfocytów T DO11.10 za pomocą napromieniowanych splenocytów BALB/c pulsowanych antygenem peptydowym albuminy jaja kurzego 323-339.
 <ol start="2">
	<li>Odwirować odpoczynkowane komórki jak poprzednio, zdjąć SN i ponownie zawiesić komórki w 200 μl pożywki polaryzacyjnej zawierającej kulki sprzężone z przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 bez zmiany pożywki.</li>
</ol>
8. Utrwalanie i barwienie limfocytów T w cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Umyć komórki: Odwirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zdjąć SN, ponownie zawiesić w 200 μl PBS. Ponownie odwirować i zdjąć SN. Wykonaj odpowiednio wszystkie poniższe kroki prania.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 100 μl roztworu do barwienia martwych komórek, dającego się utrwalić, i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki, ponownie zawiesić w 100 μl PBS, dodać 100 μl 4% paraformaldehydu w PBS, inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki, zawieś je ponownie w 200 μl lodowatego 70% metanolu w PBS i inkubuj przez 30 minut na lodzie.</li>
</ol>
Uwaga: Komórki mogą być od teraz leczone bez ryzyka biologicznego!
<ol start="5">	
 <li>Przygotować 60 μl mieszanki wzorcowej z 60 μl PBS + 10 μg/ml bloku Fc (anty-FCR3 w celu zablokowania niespecyficznego wiązania). Umyć komórki, zawiesić je ponownie w 40 μl PBS + anty-FCR3 i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 20 μl PBS + anty-FCR3 zawierającego 1 μg przeciwciała anty-Foxp3 sprzężonego z PE, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie w PBS i przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym.</li>
</ol>

<ol><li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li>
<li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+CD25%28%2B%29CD4%28%2B%29+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li>
<li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li>
<li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li>
<li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li>
<li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li>
<li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li>
<li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Peripheral+CD4%2BCD25-+Naive+T+Cells+to+CD4%2BCD25%2B+Regulatory+T+Cells+by+TGF-%CE%B2+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li>
<li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314(2012).</li>
<li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+%28TCR%29+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li>
<li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency%2C+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+%28MEA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415(2012).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307(2010).</li>
<li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li>
<li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+expression+of+the+coxsackie%2Fadenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li>
<li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie%2Fadenovirus+receptor+transgenic+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4(2002).</li>
<li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li>
<li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li>
<li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li>
<li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+structural%2C+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li>
<li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li>
<li>Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li>
<li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+bic%2FmicroRNA-155+for+Normal+Immune+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li>
<li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Dicer+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li>
<li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-%CE%B3+Production+in+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Wytwarzanie i miareczkowanie wirusów
Dla uzyskania optymalnych wyników transfekcji najważniejsza wydaje się jakość i ilość linearyzowanego wektora. Nie zaobserwowaliśmy negatywnego wpływu początkowego przerostu kultury na produkcję lizatu pierwotnego, ponieważ infekcja szybko postępuje, gdy nastąpi efektywna produkcja wirusa. Jednak na produkcję wirusa przez komórki HEK293A mogą wpływać długie wstawki, które zmniejszają wydajność. Okazało się, że niektóre otwarte ramki odczytu zakłócają produkcję...

Tregi są kluczowe dla utrzymania tolerancji immunologicznej i tłumienia nadmiernych odpowiedzi immunologicznych. Tregi hamują aktywację limfocytów T osób postronnych. W konsekwencji ablacja limfocytów Treg prowadzi do śmiertelnej autoimmunizacji i samozniszczenia napędzanego przez aktywowane limfocyty T1. Tregi rozwijają się w grasicy podczas negatywnej selekcji pojedynczych dodatnich prekursorów CD4, ale mogą również różnicować się na obrzeżach od naiwnych limfocytów T CD4 po stymulacji antygenem w niskich dawkach z nieoptymalną kostymulacją 1,2. Tregi grasicy wydają się hamować autoimmunizację tkanek przed własnymi antygenami, podczas gdy obwodowe Tregi są zaangażowane w zapewnianie tolerancji w jelitach lub płucach. Te indukowane limfocyty Treg silnie zapobiegają aktywacji limfocytów T po rozpoznaniu obcych antygenów w błonie śluzowej, w tym antygenów środowiskowych z żywności i powietrza, bakterii komensalnych i alergenów 3,4. Ponadto limfocyty Treg mają kluczowe znaczenie dla ustalenia matczynej tolerancji na peptydy płodowe 5 i zapobiegania chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi 6. W tym samym czasie limfocyty Treg pośredniczą również w niepożądanych skutkach poprzez osłabienie nadzoru immunologicznego nad komórkami nowotworowymi 7,8. Cechą charakterystyczną limfocytów Treg jest ekspresja czynnika transkrypcyjnego Foxp3 określającego podzbiór, czynnika transkrypcyjnego zawierającego domenę widełkową, który jest niezbędny i wystarczający do nadania funkcji Treg 9,10. Znane są pewne szlaki sygnałowe, które mogą indukować ekspresję Foxp3. Jednak procesy molekularne, które kontrolują, regulują lub modulują różnicowanie limfocytów Treg w odpowiedzi na wyzwalanie receptora limfocytów T, są mniej dobrze poznane.
Treg mogą być bardzo skutecznie indukowane in vitro poprzez stymulację naiwnych limfocytów T CD4 przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 w obecności TGFβ i IL-2 11. Ponieważ pojawiające się limfocyty Treg są funkcjonalne in vivo, manipulacja cząsteczkami, które promują różnicowanie limfocytów Treg, niesie ze sobą ogromny potencjał dla przyszłych terapii, na przykład leczenia astmy, choroby Leśniowskiego-Crohna i transplantacji 11,12. I odwrotnie, terapeutyczna modulacja cząsteczek w celu zablokowania różnicowania Treg może przynieść korzyści w przyszłych podejściach do skojarzonego leczenia pacjentów z nowotworami.
Testy różnicowania in vitro odegrały kluczową rolę w opisie zmian molekularnych związanych z różnicowaniem podzbiorów limfocytów T. W chwili obecnej eksperymentalne próby poszukiwania lub badań przesiewowych produktów genowych, które kontrolują różnicowanie limfocytów T, są utrudnione przez fakt, że najpowszechniejsze metody ektopowej ekspresji genów zawodzą w naiwnych limfocytach T. Na przykład elektroporacja i transdukcja retrowirusowa są skuteczne tylko w aktywowanych limfocytach T. W przeciwieństwie do początkowych oczekiwań, transdukcja lentiwirusowa, która jest zwykle skuteczna w komórkach w stanie spoczynku, wymaga wstępnej aktywacji naiwnych limfocytów T przez cytokiny13. Co więcej, transfer cDNA lub mRNA podczas elektroporacji wiąże się z depolaryzacją błony plazmatycznej, która sama w sobie nadaje cechy aktywacji limfocytów T, a nawet może mobilizować sygnalizację Ca2 + i aktywować białka NFAT (niepublikowana obserwacja i odnośnik 14). Podobnie, w przypadku transdukcji retrowirusowej, naiwne limfocyty T muszą być aktywowane przez 18 - 40 godzin. W tym czasie dochodzi do rozpadu błony jądrowej w trakcie podziału komórki i pozwala na późniejszą integrację genomową wektora retrowirusowego 15. Metody te nie są zatem w stanie zająć się wczesną regulacją molekularną początkowego spotkania limfocytów T z antygenem, co jest decydującą fazą różnicowania limfocytów T pomocniczych.
Transdukcja adenowirusowa jest znana z tego, że nadaje przejściową ekspresję genów ektopowych w wielu typach komórek ludzkich, które wyrażają ludzki receptor adenowirusa Coxsackie (CAR). Przebiega bez konieczności aktywacji komórek lub progresji cyklu komórkowego. Ekspresja powierzchniowa CAR jest niezbędna do skutecznego przyłączania i internalizacji wirusa, a transgeniczna ekspresja skróconej wersji CARΔ1 pod promotorem specyficznym dla limfocytów T sprawia, że mysie tymocyty i limfocyty T są podatne na infekcję adenowirusową 16. Co ważne, transgen nie zmienia rozwoju tymocytów ani różnicowania in vitro naiwnych limfocytów T CD4 w różne podzbiory (dane nie pokazane; odnośnik 17). Transdukcja limfocytów T za pośrednictwem adenowirusa była wcześniej stosowana do nadekspresji 17,18 i podejść knock-down 19,20. Transgeniczne limfocyty T można oczyścić z dostępnego w handlu DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. i ref. 17). Co ważne, transdukcja adenowirusowa pozwala na wysoką ekspresję interesującego genu w naiwnych limfocytach T bez wywoływania oczywistych oznak aktywacji. Limfocyty T pozostają naiwne (CD44 niskie, CD62Lwysokie) i spoczynkowe (CD25-, CD69-) po zakażeniu i mogą być aktywowane i różnicowane w Treg podobnie jak komórki niezakażone.
 
Produkcja rekombinowanych adenowirusów może być osiągnięta po transfekcji komórek HEK293A z plazmidami adenowirusowymi (Rysunek 1). Plazmidy te zazwyczaj zawierają ludzki genom adenowirusa typu 5 z usuniętymi genami E1 i E3, co powoduje, że rekombinowane adenowirusy są niekompetentne do replikacji 21. HEK293A komórki uzupełniają niedobór replikacji, ponieważ zostały uwiecznione poprzez stabilną integrację ściętego adenowirusa 22. Ponieważ wektory adenowirusowe są duże (~40 kb) i w związku z tym nie nadają się do tradycyjnego klonowania za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych, zastosowaliśmy system Gateway. Interesujący gen jest początkowo klonowany do mniejszego wektora wejściowego, z którego można go łatwo przenieść do wektora docelowego adenowirusa za pośrednictwem reakcji rekombinacji lambda (LR) 23. Skonstruowaliśmy wektor pCAGAdDu, łącząc promotor CAG (promotor aktyny kurczaka i wzmacniacz CMV) z kasetą ekspresyjną zawierającą miejsca LR flankujące prokariotyczny marker selekcyjny ccdB 24 . Ta kaseta ekspresyjna jest połączona z wewnętrznym elementem miejsca wejścia rybosomu (IRES), który umożliwia koekspresję białka zielonej fluorescencji wzmocnionego markerem infekcji eukariotycznej (eGFP), które jest połączone z sekwencją zawierającą sygnał poli(A) bydlęcego hormonu wzrostu. Wybraliśmy sekwencje cis-regulatorowe CAG, ponieważ okazało się, że prototypowy promotor CMV jest wysoce zależny od aktywacji, a zatem niekorzystny dla ekspresji genów w naiwnych limfocytach T.
Tutaj udostępniamy protokół skutecznego różnicowania Treg in vitro oraz metodę transdukcji naiwnych limfocytów T CD4 bez aktywacji (Rysunek 2). Metoda umożliwia ektopową ekspresję genów lub zahamowanie poprzedzającego różnicowania limfocytów T CD4 w stanie naiwnym. Pozwala to na przetestowanie wpływu nadmiernie eksprymowanego genu podczas wczesnych zdarzeń sygnalizacyjnych po początkowej stymulacji TCR do momentu zaangażowania podzbioru limfocytów T. Nasze eksperymenty walidacyjne stanowią również podstawę do ustalenia podobnego zastosowania adenowirusa w różnicowaniu innych podzbiorów limfocytów T, takich jak komórki Th1, Th2, Th9, Th17, Th22 lub Tfh.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do klonowania pENTR/D-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Mieszanka enzymów</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R057S</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus-transfekcja</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A Linia komórkowa</td><td>Invitrogen</td><td>R705-07</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>14 cm naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Nunc</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta; 1) 1Jdgr</td><td>Taconic Farms</td><td>Model Nr. 4285</td><td></td></tr><tr><td>Naiwny zestaw do izolacji komórek T CD4 + II</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN Biotech</td><td>1502-P110704</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>NaPyrgronian</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>NEAA 100x</td><td>Lonza</td><td>BE13-114E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>MEM Niezbędna mieszanka witamin (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-607C</td><td></td></tr><tr><td>Mysi aktywator T Dynabeads CD3 / CD28 do ekspansji i aktywacji komórek</td><td>Invitrogen</td><td>114-56D</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TGF-beta 1</td><td>R& D Systems</td><td>240B</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (18 x 106IE)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do naprawy niebieskich barwników martwych komórek</td><td>Invitrogen</td><td>L-23105</td><td></td></tr><tr><td>Mysz BD Fc BlockT</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Mmu-miR-155 Test mikroRNA TaqMan</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4427975</tr><tr><td>Sondy LightCycler 480 Master</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>04902343001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan Roche</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr></tbody></table>

transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów t cd4 w celu zbadania różnicowania limfocytów treg

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Limfocyty T regulatorowe (Treg) są niezbędne do zapewnienia odporności na siebie oraz na niektóre obce antygeny. Tregi mogą być generowane z naiwnych limfocytów T CD4 in vitro z TCR- i kostymulacją w obecności TGFβ i IL-2. Ma to ogromny potencjał dla przyszłych terapii, jednak cząsteczki i szlaki sygnałowe, które kontrolują różnicowanie, są w dużej mierze nieznane.
Pierwotne limfocyty T mogą być manipulowane poprzez ektopową ekspresję genów, ale powszechne metody nie są w stanie ukierunkowanym na najważniejszy naiwny stan limfocytu T przed rozpoznaniem pierwotnego antygenu. Tutaj przedstawiamy protokół ekspresji genów ektopowych w naiwnych limfocytach T CD4 in vitro przed indukcją różnicowania Treg. Stosuje transdukcję z adenowirusem z niedoborem replikacji i wyjaśnia jego powstawanie i produkcję. Adenowirus może zajmować duże insercje (do 7 kb) i może być wyposażony w promotory w celu osiągnięcia wysokiej i przejściowej nadekspresji w limfocytach T. Skutecznie transdukuje naiwne mysie limfocyty T, jeśli wyrażają one transgeniczny receptor adenowirusa Coxsackie (CAR). Co ważne, po zakażeniu limfocyty T pozostają naiwne (CD44 niskie, CD62Lwysokie) i spoczynkowe (CD25-, CD69-) i mogą być aktywowane i różnicowane w limfocyty Treg podobnie jak komórki niezakażone. Metoda ta umożliwia więc manipulację różnicowaniem limfocytów T CD4 od samego początku. Zapewnia, że ektopowa ekspresja genów jest już na miejscu, gdy wczesne zdarzenia sygnalizacyjne początkowej stymulacji TCR indukują zmiany komórkowe, które ostatecznie prowadzą do różnicowania Treg.

Produkcja wirusa
Aby uzyskać wysokie miana wirusa, kluczowy jest moment zbioru komórek HEK293A podczas pierwotnej produkcji wirusa lub jego amplifikacji. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne i w kontraście fazowym z wizualnymi oznakami produkcji wirusa przedstawiono na Rysunku 3. CPE zaobserwowano 10 dni po transfekcji komórek HEK293A kontrolnym wektorem pCAGAdDu bez wkładki. CPE charakteryzują się pojawieniem obszarów z powiększonymi i zaokrąglonymi komórkami, które zaczynają ...

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Niniejszy protokół przedstawia schemat produkcji zakaźnych cząsteczek adenowirusowych, które są wykorzystywane do transdukcji genu zainteresowania do naiwnych limfocytów T, co prowadzi do ektopowej ekspresji transgenu lub różnicowania w regulatorowe limfocyty T (tregs). W pierwszej kolejności gen zainteresowania jest klonowany do adenowirusowego wektora docelowego. Następnie wektor jest wprowadzany do linii komórkowej producenta adenowirusów HC 2 93 A, w wyniku czego generowane są zakaźne cząsteczki adenowirusowe.Otrzymane wirusy są wykorzystywane do zakażenia naiwnych limfocytów T myszy transgenem receptora adenowirusa. Następnie komórki są poddawane okresowi spoczynku, aby zapewnić ekspresję interesującego genu. W przypadku naiwnych limfocytów T, komórki te są aktywowane w warunkach polaryzujących w celu indukcji różnicowania w limfocyty Treg.Następnie komórki są utrwalane i barwione do analizy cytometrycznej. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące ekspresję markera różnicowania Treg, Fox P3 oraz markera infekcji GFP, na którą może wpływać nadekspresja badanego genu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transdukcja genowa za pomocą retrowirusów, jest możliwość nadekspresji badanego genu w naiwnych limfocytach T.Skutkuje to wysokim poziomem nadekspresji w momencie aktywacji limfocytów T. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny regulacyjnych limfocytów T. Na przykład w kwestii potranskrypcyjnej regulacji genów, która leży u podstaw kształtowania się tożsamości komórek T-Rex.Protokół należy rozpocząć od sklonowania genu zainteresowania do wektora wejściowego. Gen zainteresowania namnożony metodą PCR jest tępym i zostaje ligowany do wektora sprzężonego z topoizomerazą P enter D topo. Następnie gen zainteresowania jest przenoszony poprzez rekombinację LR do wektora docelowego P kakadu.Zawiera on geny adenowirusowe oraz wewnętrzną stronę wejścia rybosomalnego, czyli iris, po której następuje otwarta ramka odczytu GFP, aby stworzyć adenowirusowy wektor ekspresyjny z markerem infekcji. Następnie 10 µg adenowirusowego wektora ekspresyjnego poddaje się linearyzacji. Po trawieniu restrykcyjnym w jednej probówce (PAC), DNA jest wytrącane, a następnie zawieszone ponownie w wodzie w stężeniu 3 µg na 100 µL.Linearyzacja uwalnia wirusowe powtórzenia inwersyjne lub ITR, które są niezbędne do replikacji i enkapsydacji wirusowego DNA w cząsteczki wirusa. Wszystkie poniższe kroki powinny być wykonywane w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa biologicznego dla infekcji adenowirusami. Aby przygotować zlinearyzowany wektor do kotransfekcji, przenieś 6 µL odczynnika jet PEI do 94 µL 50 µM chlorku sodu i wymieszaj w wortexie.Następnie, podczas mieszania w wirówce typu vortex, dodaj zmieszany roztwór do 100 µL zlinearyzowanego wektora adenowirusowego. Inkubuj tę mieszaninę do transfekcji przez 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij z inkubatora płytki sześcio-dołkowe z komórkami HEC 2 9 3 A, które osiągnęły 50% konfluencji.Do studziek zawierających komórki HEC 2 9 3 A dozuj roztwór kroplami, a następnie inkubuj je w temperaturze 37 °C i przy 10% carbon dioxide. Co trzy dni dodawaj 0,5 mL świeżej pożywki, wykorzystując ekspresję GFP jako marker infekcji. Co dwa do trzech dni oceniaj wizualnie wydajność transfekcji za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego; sprawdzaj obecność efektów cytopatycznych, objawiających się obszarami z powiększonymi i zaokrąglonymi komórkami, które zaczynają się odrywać.Świadczy to o efektywnej generacji wirusa. Po pojawieniu się szerszych stref efektów cytopatycznych, wszystkie komórki zostaną zainfekowane w ciągu 24 do 72 godzin. Gdy wszystkie komórki wykazują oznaki efektów cytopatycznych, ale przed całkowitym odklejeniem się komórek, należy zebrać komórki poprzez delikatne pipetowanie i przenieść je wraz z supernatanten do 15 milliliter polistyrenowej probówki.Aby doprowadzić do rozpadu komórek, zamrozić zawiesiny na suchym lodzie przez 15 do 20 minut, a następnie szybko je rozmrozić w temperaturze 37 °C. Powtórzyć ten cykl zamrażania i rozmrażania jeszcze dwa razy. Zawiesinę z rozbitych komórek określa się odtąd jako pierwotny lizat wirusowy.Wszystkie lizaty wirusowe należy przechowywać w lodzie. Jeśli nie zostaną one wykorzystane w ciągu jednego dnia, w celu długoterminowego przechowywania należy je zamrozić w temperaturze -80°C. Należy pamiętać, że każdy dodatkowy cykl zamrażania i rozmrażania zmniejszy miano wirusa o 30 do 50%. Aby namnożyć pierwotny lizat wirusowy, należy zainfekować komórki HC 2 93 A, hodowane do 90% konfluencji na 15 naczyniach hodowlanych, połową pierwotnego lizatu wirusowego i inkubować przez co najmniej 36 godzin.Po 36 godzinach należy sprawdzić infekcję za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; prawie wszystkie komórki powinny być zainfekowane. Gdy wszystkie komórki wykażą efekty cytopatyczne, ale nie będą jeszcze odrywać się od podłoża, należy zebrać komórki poprzez delikatne pipetowanie w celu wydajnej produkcji wirusa. Stan ten zostaje osiągnięty w ciągu 48 godzin od infekcji; następnie należy przenieść komórki wraz z supernatantem do polistyrenowej probówki o pojemności 50 ml.Odwiruj komórki z prędkością 300 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu usuń nadsącz i resuspenduj osad w odpowiedniej objętości pożywki. Objętość jednego mililitra powinna zapewnić miano w zakresie od 10¹⁰ na mililitr.Przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania, tak jak wcześniej, aby rozbić komórki. Następnie odwiruj próbki przy 900 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu ostrożnie przenieś nadsącz, który od teraz określany jest jako lizat wirusa skoncentrowanego, do probówki kriogenicznej.Przygotuj alikwoty dla wielokrotnych infekcji i przechowuj je w temperaturze -80 °C. Na koniec określ miano wirusa za pomocą analizy FACS ekspresji markerów infekcji w komórkach 5 4 9. Zgodnie z instrukcjami zawartymi w załączonym dokumencie, ta część protokołu w przypadku eksperymentów w małej skali jest wykonywana z użyciem naiwnych spoczynkowych komórek CD4+ T izolowanych z myszy transgenicznych D 1110 car delta one.Do jednego dołka 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem pipetuj odpowiednią objętość lizatu wirusowego, aby uzyskać MOI wynoszące 50. Dodaj do 4 × 10⁵ limfocytów T w końcowej objętości infekcji wynoszącej 50 µL.Pożywka medium. Taka konfiguracja umożliwia równoległe podejścia eksperymentalne. Inkubować komórki przez 90 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% carbon dioxide.Po inkubacji odwiruj komórki z prędkością 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej; po wirowaniu resuspenduj je w 200 µL PBS, ponownie odwiruj i usuń nadsącz. Resuspenduj komórki w 200 µL pożywki dla limfocytów T bez przeciwciał stymulujących, bez IL-2 oraz innych cytokin. Następnie pozostaw komórki na 40 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2, aby umożliwić ekspresję interesującego genu przed aktywacją. Aby aktywować i spolaryzować limfocyty T, pipetuj kuleczki sprzężone z anty-CD3 i anty-CD28 do małego naczynia na odczynniki. Liczba kuleczek powinna być równa liczbie komórek; następnie dodaj dziesięciokrotną objętość PBS i pozostaw je na magnesie przez dwie minuty.Następnie należy usunąć supernatant i zresuspender komórki. Zawiesić kuleczki w 200 µL medium polaryzującego i odwirować osadzone komórki przy 300 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu usunąć supernatant i resuspender komórki w 200 µL medium polaryzującego zawierającego kuleczki sprzężone z przeciwciałem. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 bez wymiany medium. Protokół barwienia i fiksacji opisano tutaj w skrócie.W pierwszej kolejności komórki przemywa się w PBS i inkubuje z roztworem do barwienia martwych komórek (fixable dead cell staining solution). Po kolejnym etapie przemywania komórki utrwalane są w paraformaldehydzie, po czym – ze względu na utrwalenie – można z nimi pracować bez zachowania środków ostrożności związanych z biosafety dla adenowirusów; następnie komórki ponownie przemywa się i poddaje permeabilizacji metanolem. Po kolejnym etapie przemywania komórki inkubuje się z przeciwciałem anty-FcR III w celu zablokowania niespecyficznego wiązania.Na koniec komórki inkubuje się z przeciwciałami anty-FCR3 oraz anty-FoxP3 sprzężonymi z PE. Istnieje ryzyko utraty wielu komórek podczas procedury fiksacji i barwienia ze względu na wielokrotne etapy płukania; aby uniknąć strat, należy upewnić się, że nadsadewkę usuwa się bezpośrednio po wirowaniu, nie naruszając osadu końcówką pipety. Po zabarwieniu komórki należy przepłukać dwukrotnie w PBS, a następnie poddać analizie w cytometrze przepływowym.Czytnik 96-dołkowy w cytometrze przepływowym umożliwia przeprowadzenie infekcji, różnicowania, fiksacji i barwienia limfocytów T w tej samej płytce 96-dołkowej, co zapewnia wydajny proces pracy przy równoległych analizach wielu warunków, jednak analizę można przeprowadzić również w standardowych probówkach FACS, aby ocenić wpływ infekcji adenowirusem na żywotność limfocytów T i różnicowanie treg. Naiwne limfocyty T oczyszczone z myszy transgenicznych DO 1110 car delta one zainfekowano kontrolnym adenowirusem przy różnych MOIs i aktywowano w warunkach polaryzacji treg. Ufiksowane i zabarwione komórki analizowano metodą cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji markera infekcji.Włączenie GFP barwnika do martwych komórek oraz markera różnicowania FOX P3, jak pokazano tutaj. Zwiększenie MOI z 1 do 50 skutkuje wyższym odsetkiem zainfekowanych komórek.Ponieważ ani żywotność, ani różnicowanie Treg nie zostały zaburzone, ustalono, czy infekcja adenowirusami wpływa na stan aktywacji limfocytów T. W komórkach zainfekowanych i niezakazifkowanych przeanalizowano ekspresję markerów aktywacji i spoczynku za pomocą cytometrii przepływowej, jak przedstawiono tutaj. Ekspresja tych markerów była nieodróżnialna w komórkach zainfekowanych i niezakazifkowanych w sytuacji, gdy komórki te zostały następnie aktywowane w warunkach polaryzacji Treg.Wzrost poziomu markerów aktywacji oraz spadek poziomu markerów naiwnych limfocytów T był bardzo podobny w komórkach zainfekowanych i niezainfekowanych, rozpatrywanych łącznie. Dane te wskazują, że infekcja limfocytów T w stanie naiwnym nie zakłóca ich późniejszej aktywacji. Aby przetestować poziom nadekspresji osiągnięty za pomocą opisanego protokołu transdukcji adenowirusowej, naiwne limfocyty T zainfekowano adenowirusem kodującym microRNA 155 lub adenowirusem kontrolnym przy MOI wynoszącym 50; komórki pozostawiono w spoczynku przez 40 h, aktywowano przez 40 h lub pozostawiono w spoczynku przez 40 h, a następnie poddano aktywacji przez 40 h. Przeprowadzono syntezę cDNA, a ekspresję microRNA 155 określono w stosunku do snoRNA 202.Za pomocą ilościowego PCR wykazano, że poziomy nadekspresji microRNA 1 55 w naiwnych limfocytach T po 40-godzinnym spoczynku odpowiadają endogennym poziomom ekspresji microRNA 1 55. Po 40 godzinach aktywacji limfocytów T, aktywacja tych komórek nadal indukuje zależną od aktywacji nadekspresję microRNA 1 55.Niniejszy materiał demonstruje wysoki poziom nadekspresji w naiwnych limfocytach T za pomocą adenowirusa, ponad endogenną ekspresję mikroRNA indukowaną aktywacją. Po opanowaniu procedury klonowania, generowanie wirusa i infekcja limfocytów T mogą zostać zakończone w ciągu czterech tygodni. Wirus, po wygenerowaniu, może być przechowywany długoterminowo lub namnożony ponownie w ciągu trzech dni.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnej kontroli wszystkich eksperymentów przy użyciu pustego wektora oraz o uprzednim ustaleniu wpływu samej infekcji adenowirusowej na badany proces. Proszę mieć na uwadze, że infekcja adenowirusowa i nadekspresja mają charakter przejściowy i trwają jedynie od pięciu do siedmiu dni.

adenoviral-transduction-naive-cd4-t-cells-to-study-treg

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przeniesienie adenowirusowe na niedoświadczone komórki CD4 T w celu badania różnicowania Treg

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Tutaj opisujemy protokół analizy fenotypu limfocytów regulatorowych T (T reg) wyizolowanych od naiwnych i przewlekłych myszy zakażonych wirusem limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Ponadto zapewniamy proces oceny aktywności supresyjnej limfocytówT reg.

Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

Wiele eksperymentalnych systemów zostało wykorzystanych do zrozumienia mechanizmów regulujących rozwój i funkcję limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano podejście genetyczne wykorzystujące transdukcję retrowirusową, które jest ekonomiczne, efektywne czasowo, a co najważniejsze, bardzo pouczające w identyfikacji szlaków regulacyjnych.

Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

Ten protokół opisuje powtarzalne wytwarzanie i fenotypowanie ludzkich indukowanych regulatorowych limfocytów T (iTreg) z naiwnych limfocytów T CD4+ in vitro. Różne protokoły indukcji FOXP3 pozwalają na badanie określonych fenotypów iTreg uzyskanych za pomocą odpowiednich protokołów.

In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β

Ten protokół opisuje różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4+ w patogenne komórki Th17 in vitro. W szczególności, w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrowej cytometrii przepływowej, można uzyskać 90% czystość patogennych komórek Th17 z naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu tej metody różnicowania.

Różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów T CD4 + w patogenne komórki Th17 u myszy

Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV

Przedstawiamy protokół retrowirusowej transdukcji przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T od transgenicznych myszy Cas9, zapewniając efektywną alternatywę dla edycji genów w badaniu różnicowania Th17.

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

Poznaj metodę transdukcji adenowirusowej naiwnych limfocytów T CD4 w celu badania różnicowania komórek Treg. Technika umożliwia przejściową ekspresję genów bez wpływu na żywotność komórek.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Przeglądaj więcej filmów