Name: Miareczkowanie biochemiczne glikogenu in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-24T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Naucz się miareczkowania glikogenu in vitro w próbkach komórkowych. Ta metoda biochemiczna wykorzystuje hydrolizę alfa-amylazą i pomiar fluorescencji do dokładnej ilościowej analizy poziomów glikogenu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni doktorowi Thierry'emu Pourcherowi za umożliwienie nam korzystania ze spektrometru fluorescencji i za jego pomoc. Laboratorium jest finansowane przez Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe labellisée), Association pour la Recherche contre le Cancer, Institut National du Cancer (INCa), Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (program UE 7PR), Centre A. Lacassagne, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale oraz Uniwersytet w Nicei (<a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a>). Dziękujemy dr M Christiane Brahimi-Horn za krytyczną lekturę i korektę redakcyjną.

Biochemiczne miareczkowanie glikogenu
1. Liza komórek
<ol>
	<li>Komórki nasienne w stężeniu 0,5-2 x 106 na naczynie o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Leczenie: inkubacja komórek przez 24, 48 lub 72 godziny w niskim stężeniu tlenu (hipoksja) w beztlenowej stacji roboczej Bug-Box (Ruskinn Technology Biotrace International Plc, Bridgend, Wielka Brytania) ustawionej na 1% lub 0,1% O2, 94% lub 94,9% N2 i 5% CO2. Równolegle inkubować komórki w normoksji (21%O2, 5% CO2). Zmieniaj pożywkę (pożywkę zawierającą glukozę 25 mM) co 24 godziny, aby zminimalizować wahania stężenia glukozy w czasie eksperymentu.</li>
	<li>Po zabiegu przemyj komórki 2x PBS, aby usunąć ślady glukozy z pożywki hodowlanej. Zeskrob komórki w zimnym PBS.</li>
	<li>Odwirować roztwór z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut, wyrzucić supernatant i raz przemyć osad PBS. Granulat można zamrozić w temperaturze -20 °C przed kontynuowaniem.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100 μl wody destylowanej. Dodać 100 μl buforu do hydrolizy glikogenu dostarczonego z zestawem do oznaczania glikogenu (Abcam). Gotować lizat w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu dezaktywacji enzymów.</li>
	<li>Wirować i odwirowywać lizat z prędkością 13 000 obr./min przez 10 minut, aby usunąć nierozpuszczalne produkty. Zachować supernatant.</li>
	<li>Aby znormalizować poziom glikogenu do zawartości białka między próbkami, kwantyfikacja białek może być przeprowadzona za pomocą 25-35 μl supernatantu za pomocą testu kwasu bicunchoninowego (BCA-Interchim).</li>
</ol>
Część lizatu może być użyta do pomiaru stężenia wolnego glukozy wewnątrz komórek.
2. Hydroliza glikogenu
<ol>
	<li>Zmieszać 50 μl supernatantu (etap 1) z 1 μl mieszanki enzymów hydrolizujących. Ta mieszanina zawiera glukoamylazę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować krzywą wzorcową, rozcieńczając wzorcowy glikogen (2 mg/ml) dostarczony z zestawem do roztworu 10 μg/ml w buforze do hydrolizy. Następnie przygotuj sześć oddzielnych probówek z 0, 4, 8, 12, 16 i 20 μl wzorca 10 μg/ml i dostosuj każdą probówkę do końcowej objętości 50 μl z buforem hydrolitycznym, aby uzyskać stężenie glikogenu 0, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16 i 0,2 μg/ml. Dodać 1 μl mieszanki enzymów hydrolizy do wzorców i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Stężenie glukozy w tle linii komórkowej, podane przez wartość stężenia wolnej glukozy, musi zostać odjęte od wartości całkowitego stężenia glukozy (glukoza z hydrolizy glikogenu + wolna glukoza), aby określić poziom glikogenu w komórce.
3. Rozwój i odczyt fluorescencji
<ol>
	<li>Dla każdego warunku przygotuj jedną probówkę (probówkę 1) do pomiaru stężenia wolnej glukozy i dwie probówki (probówki 2 i 3) do pomiaru całkowitego stężenia glukozy (każda probówka z inną objętością hydrolizowanego glikogenu).</li>
	<li>Dodać 15 μl supernatantu wyekstrahowanego na końcu etapu 1 w probówce 1. Dodać 35 μl buforu do hydrolizy do uzyskania końcowej objętości 50 μl. Uzyskana fluorescencja da stężenie wolnej glukozy.</li>
	<li>Dodać X μl hydrolizowanego glikogenu (otrzymanego w kroku 2) do probówki 2. Doprowadzić do końcowej objętości 50 μl. Objętość próbki (X μl) należy dostosować do gęstości komórek i/lub typu komórki w celu uzyskania wartości fluorescencji, które nie przekraczają stężeń krzywej kalibracyjnej.</li>
	<li>Dodać 2X μl hydrolizowanego glikogenu do probówki 3. Doprowadzić do końcowej objętości 50 μl.</li>
	<li>Przygotuj roztwór rozwojowy dla próbek i wzorców, mieszając dla każdej probówki 48,7 μl buforu rozwojowego, 1 μl mieszanki enzymów rozwojowych i 0,3 μl sondy OxiRed (dostarczanej w zestawie do oznaczania glikogenu). Na przykład dla 2 warunków przygotuj mieszankę na 12 probówek (6 dla wzorców, 2 dla wolnej glukozy i 4 dla całkowitej fluorescencji glukozy).</li>
	<li>Dodaj 50 μl tej mieszanki do każdej probówki i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Zmierzyć fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 535 nm, długości fali emisji 587 nm zgodnie z zaleceniami i szczelinie 3 nm dla wzbudzenia i emisji.</li>
</ol>

<ol><li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li>
<li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li>
<li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li>
<li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li>
<li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+liver+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%3A+some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li>
<li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li>
<li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li>
<li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Fluorescent+glycogen%22+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li>
<li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheehan%2C+DCH+%22Theory+and+practice+of+histotechnology%22">Theory and practice of histotechnology</a>. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).</li>
<li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Kokubyo+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Biochemiczne miareczkowanie glikogenu in vitro pozwala na dokładne ilościowe określenie zawartości glikogenu w komórkach. W porównaniu z niektórymi innymi technikami (PAS, immunofluorescencja przeciwciałem glikogenowym itp.), miareczkowanie to jest bardzo specyficzne, czułe i powtarzalne. Co więcej, metoda jest wygodna, ponieważ nie wymaga radioaktywności, ale spektrometru fluorescencyjnego. Jednak ta technika jest czysto ilościowa i nie dostarcza informacji o dystrybucji glikogenu w komórce.
<p cla...

Glikogen to wielorozgałęziony polimer reszt glukozy, który jest obecny w cytoplazmie wielu typów komórek. Jest to jedna z głównych form magazynowania energii w komórkach i odgrywa ważną rolę w metabolizmie glukozy. Większość komórek ssaków jest w stanie wytwarzać i przechowywać glikogen, który może być szybko rozkładany do glukozy, aby promować glikolizę i produkcję ATP podczas stresu metabolicznego. Hepatocyty wytwarzają ogromne ilości glikogenu w celu regulacji poziomu cukru we krwi, zapewniając w ten sposób ciągły dopływ glukozy do organizmu. Natomiast stężenie glikogenu w innych komórkach (mięśniach, czerwonych krwinkach itp.) jest stosunkowo niskie. Jednak lokalnie ilości te są wystarczające, aby zapewnić energię w krótkim okresie, gdy komórki są nagle wystawione na działanie środowiska pozbawionego składników odżywczych.
Synteza i rozkład glikogenu przebiegają w ten sam sposób we wszystkich tkankach (Rysunek 1). Po pierwsze, glukoza dostaje się do komórek przez transportery glukozy (GLUT) i jest szybko przekształcana z glukozo-6-fosforanu (G6P) w glukozo-1-fosforan (G1P) przez fosfoglukutazę. G1P jest następnie modyfikowany do glukozy UDP, a węgiel C1 glukozy UDP jest przyłączany do reszty tyrozynowej glikogeniny, białka kotwiczącego glikogenu. Cząsteczka ta, uważana za starter glikogenu, jest rozszerzana przez przyłączenie glukozy UDP do końcowej glukozy za pomocą α(1→4) wiązania za pomocą syntazy glikogenu. Wreszcie, gdy powstaje łańcuch liniowy składający się z ponad 11 reszt glukozy, enzym rozgałęziający przenosi końcowy oligosacharyd utworzony przez co najmniej 6 reszt glukozy do innej glukozy w pobliskim łańcuchu za pośrednictwem wiązania α(1→6). Powtórzenie tego procesu daje masywną strukturę fraktalną zawierającą gałęzie, które tworzą helisę o stężeniu 6,5 glukozy na obrót. Glikogen może być odwrotnie hydrolizowany do glukozy przez skoordynowane działanie enzymów rozgałęziających, które hydrolizują α(1→6) związana i glikogenowa fosforylaza, która hydrolizuje α(1→4) glikozyd związany między ostatnią resztą glukozy gałęzi a cząsteczką glikogenu. Ta reakcja zwana glikogenolizą jest aktywowana przez zwiększanie poziomu AMP (odzwierciedlającego zużycie ATP) i hamowana przez glukozę i ATP2,3.
Za pomocą mikroskopii elektronowej, cząsteczki glikogenu zostały opisane w wielu typach komórek jako β wolne cząstki (lub monocząsteczki glikogenu) o średnicy 15-30 nm. W określonych typach komórek, takich jak hepatocyty, cząstki β mogą być łączone w kompleks, tworząc rozety, znane również jako cząstki α, które różnią się średnicą od 80 nm do maksymalnie 200 nm4. Sposób, w jaki te β cząstki są wiązane, tworząc większe skupiska α cząstek, wciąż nie jest w pełni wyjaśniony. Niektóre dowody wskazują na to, że cząstki β mogą być wiązane wiązaniem kowalencyjnym5, wiązaniem wodorowym, a nawet poprzez interakcje białko-białko6. Ilość glikogenu przechowywanego w komórkach zależy od wielu parametrów: (I) ilości glikogeniny w komórce, która inicjuje syntezę glikogenu; (II) aktywność syntazy glikogenu i fosforylazy regulowanej przez fosforylację/defosforylację białek; (III) stężenie glukozy w komórkach, które zależy od kilku parametrów, takich jak dostarczanie glukozy z układu naczyniowego i wychwyt glukozy przez komórki. Zapasy glikogenu są ściśle regulowane przez allosteryczną regulację hormonów biosyntetycznych przez metabolity pośrednie, przez hormony regulujące metabolizm energetyczny oraz przez szlaki sygnałowe wyczuwające składniki odżywcze7.
Ważne jest, aby móc określić ilościowo glikogen w próbkach biologicznych, aby lepiej zrozumieć znaczenie metabolizmu glikogenu na całym ciele i poziomie komórkowym. Opisujemy tutaj precyzyjny, powtarzalny i wygodny test biochemiczny in vitro dla glikogenu. Technika ta opiera się na ilościowym określeniu fluorescencji glukozy przed i po specyficznej hydrolizie glikogenu.
Istnieją inne metody szacowania poziomu glikogenu w komórkach, ale większość z nich nie jest ilościowa. Jedna z pierwszych opisanych technik oznaczania ilościowego glikogenu w komórkach opierała się na pomiarze [14C]-glukozy wbudowywanej w glikogen8,9. Zastosowanie promieniotwórczości sprawia, że proces ten jest trudniejszy do opanowania, ale ma tę zaletę, że zapewnia szybkość wprowadzania glukozy do glikogenu i rozróżnia rozkład reszt glukozy na zewnętrznych gałęziach i w rdzeniu cząsteczki (wymaga to również dodatkowej β-amylolizy i etapu chromatograficznego). Inna technika została opracowana niedawno i opiera się na włączeniu 2-NBDG (2-{N-[7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo]amino}-2-deoksyglukozy), fluorescencyjnej pochodnej 2-deoksyglukozy, do glikogenu10. Zmierzona intensywność fluorescencji odzwierciedla ilość wytwarzanego glikogenu i może być mierzona za pomocą czytnika fluorescencji. Rozkład fluorescencji w komórce można również ocenić za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Wśród innych technik nieilościowych, barwienie kwasem okresowym i Schiffem (PAS) jest prawdopodobnie najbardziej powszechne. Może być stosowany do wykrywania glikogenu w utrwalonych komórkach, skrawkach tkanek w parafinie lub zamrożonych. Ta technika histologiczna barwi niespecyficznie polisacharydy, glikolipidy, glikoproteiny, celulozę i obojętne mucyny na fioletowo. Swoistość tego testu można zwiększyć poprzez potraktowanie nieruchomych komórek lub skrawków tkanek diastazą, która specyficznie trawi glikogen. Następnie poziom glikogenu można oszacować jakościowo, porównując próbki niezhydrolizowane (wszystkie makrocząsteczki modyfikowane węglowodanami) z próbkami zhydrolizowanymi (makrocząsteczki zmodyfikowane węglowodanami z wyjątkiem glikogenu). Barwienie PAS i analiza mikroskopowa, w przeciwieństwie do testów biochemicznych glikogenu, dostarcza informacji dotyczących rozmieszczenia glikogenu w komórce, który może być dyfundowany lub skoncentrowany w określonej części komórki. Jednakże, mimo że barwienie PAS szacuje różnice w akumulacji glikogenu między różnymi warunkami, nie jest ilościowe11.
Monoklonalne mysie przeciwciało pierwotnie wytworzone przy użyciu chrząstki kłykciowej żuchwy, ponieważ antygen ten okazał się reagować z glikogenem w komórkach i z oczyszczonym glikogenem in vitro12. Ponieważ przeciwciało to specyficznie rozpoznaje łańcuchy cukrowe związane z glikogenem, jest użytecznym narzędziem do wykrywania glikogenu za pomocą immunohistochemii w bardziej specyficzny sposób niż barwienie PAS.
Mikroskopia elektronowa to kolejna technika, która pozwala na wizualizację ziaren glikogenu w komórkach i ocenę stopnia magazynowania glikogenu. W rzeczywistości cząstki β glikogenu są łatwo rozpoznawalne za pomocą mikroskopii elektronowej jako gęste granulkielektronów 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966.047</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania glikogenu</td><td>Abcam</td><td>ab65620</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Spektrometr fluorescencyjny</td><td>PerkinElmer</td><td>LS 50B</td><td></td></tr></tbody></table>

miareczkowanie biochemiczne glikogenu in vitro

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glikogen jest głównym energetycznym polimerem glukozy u kręgowców i odgrywa kluczową rolę w metabolizmie całego ciała, jak również w metabolizmie komórkowym. Istnieje już wiele metod wykrywania glikogenu, ale tylko kilka z nich ma charakter ilościowy. Opisujemy tutaj metodę z wykorzystaniem zestawu do oznaczania glikogenu Abcam, która opiera się na specyficznej degradacji glikogenu do glukozy przez glukoamylazę. Glukoza jest następnie specyficznie utleniana do produktu, który reaguje z sondą OxiRed w celu wytworzenia fluorescencji. Miareczkowanie jest dokładne, czułe i można je przeprowadzić na ekstraktach komórkowych lub skrawkach tkanek. Jednak w przeciwieństwie do innych technik nie daje informacji o rozmieszczeniu glikogenu w komórce. Jako przykład tej techniki opisujemy tutaj miareczkowanie glikogenu w dwóch liniach komórkowych, fibroblastach płuc chomika chińskiego CCL39 i ludzkim raku jelita grubego LS174, inkubowanych w normoksji (21%O2) w porównaniu z hipoksją (1%O2). Postawiliśmy hipotezę, że niedotlenienie jest sygnałem, który przygotowuje komórki do syntezy i przechowywania glikogenu w celu przetrwania1.

Niski poziom tlenu (hipoksja) w guzach sygnalizuje komórkom nowotworowym potrzebę gromadzenia energii w celu radzenia sobie z późniejszym niedoborem składników odżywczych, aby przetrwać. Ponieważ glikogen jest głównym polimerem energetycznym glukozy w komórkach ssaków, zbadaliśmy regulację magazynowania glikogenu w warunkach hipoksji. Obliczenia i standaryzacja stężenia glikogenu w lizatach komórkowych muszą być wykonane na surowych danych fluorescencji, jak pokazano w Tabelach 1, 2 i <s...

Opisujemy tutaj dokładną, powtarzalną i wygodną biochemiczną metodę miareczkowania glikogenu in vitro. Technika ta wykorzystuje zestaw do oznaczania glikogenu Abcam i opiera się na sukcesywnej hydrolizie glikogenu do glukozy i miareczkowaniu glukozy przez fluorescencję.

Miareczkowanie biochemiczne glikogenu in vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Ogólnym celem tej procedury jest miareczkowanie glikogenu in vitro w próbkach komórkowych. Osiąga się to poprzez pierwszą lizę komórek w wyniku mechanicznego rozerwania. Drugim krokiem jest hydroliza glikogenu za pomocą alfa-amylazy w celu uzyskania glukozy.Następnie glukoza jest utleniana, tworząc formę fluorescencyjną. Ostatnim krokiem jest pomiar fluorescencji. Ostatecznie biochemiczne miareczkowanie glikogenu służy do wykazania zmian w zawartości glikogenu w komórkach.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że jest konkurencyjna, czuła, dokładna i bardzo specyficzna. Aby rozpocząć tę procedurę, komórki nasienne w stężeniu od 0,5 do 2 milionów na naczynie o średnicy 100 milimetrów. Inkubuj komórki przez 24, 48 lub 72 godziny w hipoksji w beztlenowej stacji roboczej ustawionej na 1% tlenu, 94% azotu i 5% dwutlenku węgla.Równolegle inkubuj kolejny zestaw komórek w normoksji dla każdego warunku tlenowego. Zmieniaj 25-milimolową pożywkę zawierającą glukozę co 24 godziny, aby zminimalizować wahania stężenia glukozy podczas eksperymentu po zabiegu. Przemyć komórki dwukrotnie PBS, aby usunąć ślady glukozy z pożywki hodowlanej.Następnie zeskrob komórki w zimnej wirówce PBS, roztworze PBS przy 1000 obr./min przez pięć minut. Odrzucić sklarowany osad i przemyć osad raz PBS. Następnie ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach wody destylowanej i dodać 100 mikrolitrów buforu hydrolizy glikogenu uzyskanego z zestawu do oznaczania glikogenu.Gotuj lizat w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby dezaktywować enzymy. Gdy lizat zostanie schłodzony do temperatury pokojowej, wirować i odwirować. Lizat 13 000 razy.Grawitacyjnie przez 10 minut, aby usunąć nierozpuszczalne produkty. Następnie odłóż sklarowany sklaranty, aby znormalizować poziom glikogenu do zawartości białka między próbkami. Oznacz ilościowo białka za pomocą 25 do 35 mikrolitrów supernatantu za pomocą testu kwasu bsicowego.Po tym zmieszaniu 50 mikrolitrów supernatantu z poprzednich etapów z jednym mikrolitrem mieszanki enzymów hydrolizy. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej i odstawić do przygotowania wzorca krzywej kalibracyjnej, rozcieńczyć wzorcowy zestaw glikogenu buforem hydrolizy, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikrogramów na mililitr. Następnie dodaj 0, 4, 8, 12, 16 i 20 mikrolitrów z 10 mikrogramów na mililitr.Standardowo do sześciu oddzielnych probówek rozcieńczyć każdy wzorzec buforem hydrolizy, aby uzyskać końcową objętość 50 mikrolitrów i stężenie glikogenu odpowiednio 0,04, 0,08, 0,12, 0,16 i 0,2 mikrograma na mililitr. Dodać jeden mikrolitr mieszanki enzymów hydrolizy do wzorców i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej dla każdego stanu tlenu. Oznacz probówkę pierwszą jako stężenie wolnej glukozy, a probówki drugą i trzecią jako całkowite stężenie glukozy.Następnie dodać 15 mikrolitrów wyekstrahowanego supernatantu do pierwszej probówki, a następnie 35 mikrolitrów buforu hydrolizy, aby uzyskać końcową objętość 50 mikrolitrów. Fluorescencja odpowiadająca stężeniu wolnej glukozy zostanie zmierzona później. Dodaj cztery mikrolitry zhydrolizowanego glikogenu do probówki drugiej i dostosuj do końcowej objętości 50 mikrolitrów z buforem do hydrolizy.Aby utrzymać wartości fluorescencji w zakresie stężeń krzywej kalibracyjnej, dodaj dwa mikrolitry hydrolizowanego glikogenu do trzeciej probówki i dostosuj do końcowej objętości 50 mikrolitrów z buforem do hydrolizy. Następnie przygotuj roztwór rozwojowy dla wszystkich próbek i wzorców, mieszając 48,7 mikrolitrów bufora rozwojowego, jeden mikrolitr mieszanki enzymów rozwojowych i 0,3 mikrolitra sondy Oxy Redd. Dla każdej próbki wzorcowej dodać 50 mikrolitrów tej mieszanki do każdej probówki i inkubować w ciemności przez 30 minut.W temperaturze pokojowej do pomiaru fluorescencji ustaw szczelinę na trzy nanometry dla wzbudzenia i emisji, a następnie zmierz fluorescencję. Badano regulację magazynowania i niedotlenienia glikogenu, ponieważ glikogen jest głównym energetycznym polimerem glukozy w komórkach ssaków. Obliczenia i standaryzację stężenia glikogenu w stanach komórkowych przeprowadzono na surowych danych fluorescencji.Jak pokazano na podstawie pomiarów fluorescencyjnych, obliczono całkowite stężenie wolnej glukozy. Na podstawie tych wyników określono ilość glukozy pochodzącej z glikogenu. Test biochemiczny glikogenu potwierdził, że agregaty gęstości elektronowej obserwowane na mikrofotografiach elektronowych komórek ccl 39 były cząstkami glikogenu.Akumulacja glikogenu i niedotlenienie zależy od czynnika transkrypcyjnego. Pierwszy czynnik indukowany hipoksją, główny czynnik transkrypcyjny zaangażowany w adaptację komórkową do niedotlenienia w różnych liniach komórkowych nowotworowych i nienowotworowych przechowywanych glikogen, może być szybko metabolizowany przez komórkę w mniej niż sześć godzin. Ponadto zastosowanie glikogenu chroni przed śmiercią komórek w warunkach głodu glukozy Po tej procedurze.Można również wykonać metody takie jak mikroskopia elektronowa i okresowe barwienie kwasem, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak dystrybucja glikogenu w komórkach.

biochemical-titration-of-glycogen-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Biochemiczna Tytulacja Glikogenu In vitro

Ten film opisuje test spektrofotometryczny do szacowania aktywności syntazy glikogenu. Metoda polega na zmniejszaniu się absorbancji NADH w czasie i wskazuje na aktywność syntazy glikogenu.

Test spektrofotometryczny w celu określenia aktywności syntazy glikogenu

W tym filmie opisujemy jakościowy test spektrofotometryczny, aby określić zakres rozgałęzień w próbce glikogenu o niescharakteryzowanej strukturze. Porównanie maksimów absorbancji próbki niescharakteryzowanej z maksimum polisacharydów o znanych strukturach rozgałęzionych wskazuje na obecność rozgałęzień w próbce niescharakteryzowanej.

Test rozgałęzień glikogenu w celu zmierzenia stopnia rozgałęzienia glikogenu

Barwienie Schiffa kwasem okresowym to technika, która wizualizuje zawartość polisacharydów w tkankach. W artykule przedstawiono protokół barwienia Schiffa kwasem okresowym przystosowany do stosowania na komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej oczyszczonych z ludzkiej krwi żylnej. Takie próbki są wzbogacone o limfocyty i inne białe krwinki układu odpornościowego.

Wykrywanie glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą barwienia Schiffa kwasem okresowym

Tutaj prezentujemy wiarygodny i łatwy test do pomiaru zawartości glikogenu w komórkach sinic. Procedura polega na wytrącaniu, selektywnej depolimeryzacji i wykrywaniu pozostałości glukozy. Metoda ta jest odpowiednia zarówno dla szczepów dzikich, jak i genetycznie modyfikowanych i może ułatwić inżynierię metaboliczną sinic.

Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

Techniki pomiaru aktywności kluczowych enzymów metabolizmu glikogenu są prezentowane przy użyciu prostego spektrofotometru działającego w zakresie widzialnym.

Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego

Optymalne stężenie sacharozy zostało określone do ekstrakcji glikogenu wątrobowego za pomocą wirowania w gradicynie gęstości sacharozy. Korzystne okazało się dodanie 10-minutowego etapu wrzenia w celu zahamowania enzymów rozkładających glikogen.

Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

Test tkań zwierzęcych wykorzystuje detekcję scyntylacji jądrowej do określenia aktywności enzymatycznej syntazy glikogenu poprzez pomiar włączenia radioaktywnie znakowanej glukozy do glikogenu.

Ocena radiochemiczna aktywności enzymu syntazy glikogenowej w tkankach zwierzęcych

W tym filmie prezentujemy alternatywną metodę wykrywania i mianowania wirusów przy użyciu enzymatycznej techniki wykrywania antygenów, znanej jako test immunoperoksydazowy. Pokażemy, jak pobierać próbki wirusowe, przygotować komórki do testów, a następnie przeprowadzić test immunoperoksydazowy z wykorzystaniem rozcieńczeń seryjnych w celu oznaczenia miana wirusa.

Miareczkowanie ludzkich koronawirusów z wykorzystaniem testu immunoperoksydazowego

Po uformowaniu się rurki neuralnej neuroepithelium ulega zwężeniu i fałdowaniu, podczas gdy rurka wypełnia się embrionalnym płynem mózgowo-rdzeniowym (eCSF), tworząc embrionalne komory mózgu. Opracowaliśmy tę technikę wstrzykiwania do komór, aby lepiej wizualizować wypełnioną płynem przestrzeń w kontraście do kształtu neuroepithelium w żywym embrionie.

Iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego

Przedstawiono ogólny protokół wykorzystania izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do monitorowania termodynamiki wiązania w układach biologicznych o umiarkowanym powinowactwie wiązania.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

Naucz się miareczkowania glikogenu in vitro w próbkach komórkowych. Ta metoda biochemiczna wykorzystuje hydrolizę alfa-amylazą i pomiar fluorescencji do dokładnej ilościowej analizy poziomów glikogenu.

Miareczkowanie biochemiczne glikogenu in vitro

Przeglądaj więcej filmów